电生理实验论文（共9篇）
电生理实验论文 篇1
心房颤动(Atrial fibrillation,AF)的发生包括诱发心律失常的触发因素和使其维持的心房电生理基础[1,2],以导管射频消融治疗为基础的异位兴奋灶触发机制不能完全解释AF的发生与维持,心房肌必须具有存在发生和维持AF的电生理基质[3,4]。本研究使用单相动作电位技术[5](Monophasic Action Potential,MAP)对在体犬左、右心房肌复极的电生理特性进行研究,旨在探讨阵发性房颤发生与维持机制。
1 材料与方法
1.1 实验对象
成年健康杂种犬14只(大连医科大学动物实验室提供),雌雄不限,体重(14±3.4)kg。戊巴比妥30mg/kg腹腔注射麻醉,将犬仰卧位固定于导管床上,并行气管插管,实验过程维持血氧饱和度95%,必要时连接呼吸机,呼吸频率为(14～16)次/分,调节通气量保持PH值维持在7.35～7.45之间。
1.2 仪器设备
乏极化银-氯化银MAP/起搏联合电极导管。程序心脏电刺激仪(Bitronic UHS型)。多导生理仪(美国Prucka)滤波范围(0～500)Hz以上。介入治疗室INOVA2000STATION工作站(美国GE)。
1.3 实验步骤
经双侧股静脉及一侧颈内静脉穿刺放置3根鞘管,分别置入3根标测电极导管,根据需要包括冠状窦电极、高位右房(right atrium,RA)电极及MAP电极。经右股静脉鞘管,将MAP电极送入RA。电极送入心房内垂直接触高位RA,然后给导管轻轻加压,此时心电图上出现快速的双向反折,表明探查电极已与心内膜接触,继续给导管加压,MAP逐渐增大,经2～6跳后达到稳定后记录基础状态下RA满意的MAP(满意的MAP图形要求基线平稳、振幅5mv、前后波折<20%MAP幅度)。MAP记录的滤波频率为(0.05～500)Hz,心房双极电图为(30～500)Hz。
1.4 试验方案
对14只犬在高位右房以起搏电压为2倍于舒张期阈值[均值为(3±1.8)v],脉宽1.0ms,进行心房起搏(S1S1)。以300ms的S1S1间期发放50个刺激后,以10ms为步长逐渐递减,诱发房颤或不能1:1夺获心房。每次起搏间有1分钟的起搏间歇期。然后在基础心律20跳之后,S1S2间期从300ms开始,每8个基础刺激之后加入一个期前刺激,以低于S1S1(10～20)ms行S1S2早搏刺激,以10ms进行性递减直到到达心房有效不应期(atrial effective refractory period,ERP)并同时记录MAP。每次的S2激后有5s的SIS1起搏间隔。行房间隔穿刺将MAP记录电极导管置入左房(left atrium,LA)后壁,记录基础状态下LA满意的MAP。进行冠状窦起搏,重复上述试验方案。
1.5 观测指标
1.5.1 心房MAP及电生理指标
使用多导生理仪(Prucka)记录MAP信号和冠状窦双极电极并在实验完成后进行细致分析。所有的MAP记录由两个观察者互相独立进行人工分析。(1)复极达90%时的动作电位时程(APD90),测量S1S1刺激时连续三个MAP,取平均值。(2)ERP为以2倍的舒张期阈值的刺激,不能产生局部夺获的最长耦联间期。(3)心房相对不应期(atrial relative refractory period,RRP)为刺激区开始出现传导延迟的最长耦联间期。出现刺激局部传导延迟的最长S1S2间期来确定RRP。
1.5.2 RAF在S1S2的早搏刺激后,发生2个以上的连续心房活动。
从心房刺激到RAF第一个激动的间期(相邻MAP起始部位的间期)必须小于250 ms。
1.5.3 起搏诱发APD电交替(APD alternans)
当进行性起搏间期(S1S1)缩短的程度达到了某一值可以产生下一次除极的动作电位时程的缩短,因此在连续的心房间MAP形态和间期有交替变化,称为APD电交替现象。
1.5.4 AF的发作
将AF定义为多变的MAP多形性、心房S1S2间期的不规律和在体表心电图出现颤动波的大于Is的无规律的心房活动。
1.6 统计方法
计量资料以表示,两样本均数比较采用Student't检验,两样本率的比较采用卡方检验,以P<0.05为差异具有显著性。
2 结果
2.1 左、右心房肌复极特征
心房肌MAP的形态近似三角形,第2相短,第3相坡度小。MAP振幅平均(6.98±1.76)mv,右心房(RA)各点平均振幅及复极时程大于左心房(LA),见表1。左心房APD90小于右心房(157.4±43.5 vs 170.9±37.9,P<0.05)。
*P<0.05,LA-左心房,RA-右心房
2.2 左、右心房肌RAF的诱发
心房S1S2间期递减至(130±32)ms时,14只犬中共诱发出15阵RAF,LA诱发出11阵[(134±37)ms,(4±2.2)个],RA诱发出4阵[(128±31)ms,(3±1.6)个]。LA的RAF发生率明显多于RA (11/14 vs 4/14)。LA的RAF诱发的耦联间期及RAF激动波个数大于RA,但无统计学差异。
2.3 左、右心房肌APD电交替
心房S1S1超速起搏刺激在(162±25)ms产生APD时限和幅度的交替,14只犬共记录13阵电交替(158±23)ms,其中左房8阵,右房5阵。此外,左房诱发电交替的CL明显长于右房[(165±21)ms vs(143±23)ms,P<0.05]。
2.4 左、右心房肌房颤的诱发
S1S1刺激及S1S2刺激时共诱发出61阵房颤,其中左房刺激发作38阵,明显多于右房23阵(P<0.05)。房颤发作时MAP图形各异,除极变慢并变形、幅度不一,复极相在复极达不同水平时被随后的除极提早终止,连续MAP间舒张间期多消失。
3 讨论
迄今为止,房颤的发生机制一直是电生理研究的热点与难点,研究显示肺静脉能够触发和驱动房颤。然而,并非所有的房性心律失常都能触发AF,心房必须具有AF发生和维持的电生理基质[6,7,8]。本研究使用单相动作电位技术对犬左、右心房复极的电生理特性进行研究,以探讨房颤发生的基质。
本研究发现犬LA与RA存在的电生理特性不同,LA的复极时程和不应期较短。异位快速的触发激动传到心房肌时,左、右心房肌在同一时刻的复极化程度具有显著差异,易于形成折返,是发生与维持房颤的一个重要决定因素。其离子基础可能是钾电流的密度分布依赖心房肌细胞的部位而不同[9]。左心房的心肌细胞快速延迟性整流钾电流IKr的密度较高,缩短APD及ERP,因此导致左房更容易形成稳定的折返环,参与房颤的发生和维持。
RAF作为心房肌易损性的重要电生理特征与AF的发生相关[10,11]。本研究多数AF发作前可记录到RAF,LA的RAF发生率与AF的诱发率均高于RA,提示LA的易损性较RA高,可能对AF的发生起着关键的作用,推测LA与RA在AF的发生和维持机制不完全相同,LA主要由左房后壁作为颤动活动的起源灶,由此发生颤动波扩布到整个心房[12]。而RA由于天然存在的分隔造成了解剖和功能的障碍限制了波动的数量和自由方向,AF的进一步维持主要通过大量的微折返和LA起源的驱动波[13]。一些犬的持续性房颤模型研究也发现左房的房颤波周长较右房短,随机游走的子波和有规律的折返波在左房的波峰数多于右房,推测左房是房颤发作时的驱动心房[11]。
电交替表现为心脏搏动的时限和幅度的逐搏交替变化,它产生于细胞水平单相动作电位交替。发生机制即电交替与细胞复极恢复的区域性离散相关。本研究对在体犬的的左、右房在快起搏频率下可记录到动作电位复极时相形态和间期的交替变化,随着心肌结构的异质性,左房更容易发生APD电交替和房颤。心房肌电交替代表心房复极电活动的不稳定,其机制与心房肌从一个去极化水平到另外一个的不适当电恢复有关,结合左、右房间复极活动的不均一性,提供了房颤发生的电生理基质。复极交替在空间上明显增加不应期离散,增加产生波裂和诱发折返的能力,是产生单向阻滞和折返从而诱发房颤的基础[4,5]。
总之,房颤的发生包括诱发心律失常的触发因素(trigger)和使其维持的基质(substrate)。异位局灶快速冲动发放引起房性早搏,是房颤最常见的触发因素,触发激动传到心房肌时,MAP记录的左、右心房肌的复极不均一的电生理特性,可能导致左、右心房易损性的不同,是AF发生的基质。
电生理实验论文 篇2
一电刺激。
二生物放大器正确选择，植物性神经冲动幅度多为50-100μV。不同组织，应采用不同的参 数。如 ECG：振幅0.1-2mV，灵敏度0.5-1mV，时间常数0.1-1.0s，高频滤波1KHz 植物性神经冲动：振幅50-150μV，灵敏度25-100μV，时间常数0.01-0.1s，高频滤波3-5KHz 中枢神经元单位放电振幅100-300μV, 灵敏度50-100μV，时间常数0.01-0.1s，高频滤波5-10KHz
三玻璃微电极
常用尖端0.5-5μm，向细胞内插入时，需小于0.5μm（细胞直径的1/10~1/100），且尖端的倾斜度应相当缓和，一般微电极可分为金属微电极和玻璃微电极两类。
金属微电极，现多用镀铂钨丝电极（platinum-plated tungsten electrode），在钨丝上镀铂，可极大改善电极的电学特性，噪声可大大降低，加之机械强度大，适合长期体外记录(paré D，Gaudreau H.Projection cells and interneurons of the lateral and basolateral amygdala: distinct firing patterns and differential relation to the thera and delta rhythms in conscious cats.J Neursci, 1996,16(10):3334-3350 现要也常用镀银碳纤维电极。玻璃微电极记录易受机械位移的影响，加之尖端的电解质会漏出或堵塞，不适合半小时以上的长时间记录，玻璃微电极可分单管和多管微电极。
毛坯管在国外多用Pyrex管，国内多用GG-17和95料玻管。细胞外记录多采用外径1.5-2mm玻璃，细胞内记录则采用外径1mm细玻管，内外径之比约为2:3或5:6，长6-8cm。拉制前必须经过清洁处理。
清洁液：用等量的(250ml)王水(可反复应用)。一般毛坯管捆成把放入清洁液中1-2h，取出自来水冲洗20-30min，再放入无水酒精中洗涤，再放入盛满蒸馏水烧杯中加热煮沸10min，倒去蒸馏水，再换新蒸馏水反复3次，再放入烤箱中烤干，备用，切不可用市售的洗涤剂，以防降低电极充灌液的表面张力而影响冲灌。
充灌液常用3mol/L KCl，为避免Cl-扩散，也可用2mol/L醋酸钾或柠檬酸钾充灌，也有人用 0.5-1mol/L NaCl(低浓度)充灌可降低噪音。细胞外记录时，最后再用3-4mol/L NaCl +2%旁 胺天蓝溶液定位。在膜片钳中还常加钙螯合剂，如EGTA。阻抗与不同组织相关。
四电生理实验中噪声和干扰的形成和排除。(一)来源。
1干扰信号与生物电生理信号的鉴别。准确区分生物电信号与干扰的伪迹是电生理实验的先决条件。
2来源。主要有三个方面
其一。物理性干扰。1)静电和电磁的干扰实验室附近高压电，室内日光灯可产生50Hz的静电干扰，尤其是交流电，尤其是50Hz频率干扰最大(电子设备为50Hz)。其特点是幅度大，波形规则。
2)噪声干扰电子元件本身产生杂乱无章电压和电流称噪声，一般与放大器内部元件的质量与性能有关。
其二。接地不良。1)地线电阻应小。2)仪器故障。产生漏电电流，在地线上形成电位差，产生干扰。3)地线行走过程中打圈，形成线圈，易接受电场和磁场的干扰。4)各仪器设备应采用一点接地的方式，若采用多点接地，形成大地回路，也会引起干扰。5)地线过长与电源线形成交流环路。6)误用市电三孔中性线作为大地线(中性线上有4-5A电流)。
其三。生理性干扰。1)大脑电活动时，眨眼、眼球运动均对脑电具有干扰作用。2)实验中环境温度过低，动物寒战、抖动，引起肌电的发放而干扰记录，或因呼吸运动引起记录部位机械位移引起干扰信号。3)心电干扰，频率与心电一致。(二)排除。
1物理性干扰。1)屏蔽法用于低频电和静电干扰，屏蔽线分布电容较大，线与线之间不可平行排列，更不可为了美观而将多线扎在一起，这会加大分布电容，易偶合高频干扰噪声。2)远离法。3)改变位置法。依电流方向相反，产生反向磁场的原理，改变各个仪器的位置或放大器输入的方位，会使干扰磁场抵消，微电极放大器探头阻抗高，易引入干扰，实验前可反复调整其方向和位置。4)微电极记录时尽量减少微电极本身的阻抗，减少输入阻抗及干扰信号在这个阻抗上形成干扰电压降，微电极到探头的连线<5cm。5)用监听器监听噪声，以便及时排除。
2仪器质量，尽量改进。接地不良。地线应尽量短粗，不能与电源线平行或打圈，不 要接在电源线的中性线 上，地线单独埋设，埋置处应较潮湿，附近无大型变压电动机，并在坑内加些食盐。4检查各仪器 是否漏电。
5慢生物电变化时用乏极化电极，实验对象宜安静，勿受振动。
(三)刺激伪迹过大及防止。1)尽量减少刺激脉冲的波宽和强度。2)在动物体或标本上，尽量延长刺激部位 的距离，在刺激电极 和引导电极之间加一接地电极，此电极离引导电极愈近，刺激伪迹就越小采用变换刺激极性，结合叠加处理，可抵消伪迹。
注微电极中高浓度充灌液易蒸发，造成电极回路的开路，因此常在微电极插入Ag-AgCl丝或铂金丝后，在微电极尾部开口处涂上一层凡士林，防止水分蒸发。
动物麻醉和制动下，体温会下降，故应保温调节，加温维持肛温36-38℃.记录脊髓背角或腹角神经元将脊柱前后拉直以减小呼吸运动造成的位移。记录脑神经元应在表面用温热石蜡制成一油槽，防止血管博动和呼吸运动的影响。
五细胞内微电极记录
多用幼年离体标本，其原因1)幼年动物骨骼骨化不完全，结缔组织少，神经组织易于分离，标本耐缺氧能力强，有的标本可存活数小时至数天，但标本也可能发育不完全，如背根和脑干到脊髓的投射纤维要到三周动物才完全。神经纤维髓鞘化不全，其药理作用与成年动物也不同。从实验角度上讲，脊髓背腹根短，不利于电生理刺激记录。小鼠一般应小于15g，制备标本才 有可能成功，而这样小鼠背腹根神经节不利于电生理实验。最适合的动物是金黄地鼠(hamster)，介于大小鼠之间，制备标本活性很好，可能与其冬眠习性有关，而且其脊髓背腹根长达20-25mm，利于电生理记录。动物选择仍依实验而定，同一标本，不同中枢结构对缺氧耐受力也不同。金黄地鼠，若观察脊髓背角神经元活动，可用150-160g体重的鼠均可，但要研究腹角神经元，则体重不宜超过30g。离体标本的灌流注，如ACSF。其中缓冲液成分有两种，一是重碳酸盐(bicarbonate)温度低(4℃)，配方有利于降低组织兴奋性。二是磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液其优点是接近于 人体环境。各种缓冲液一般都先配母液，临用前一天，或临用前稀释
脑片膜片钳实验方法
脑片膜片钳实验方法 文献综述一 1966年，Yamamoto和McIlwain首次在脑片上记录了电生理活动(1966a, b)，证实了脑组织在体外也能存活，并保持很好的活性状态。此后，该方法在生理学研究中的应用越来越广泛，并为中枢神经系统生理和药理学领域突飞猛进的发展奠定了基础。1989年，Blanton将脑片电生理记录与细胞的膜片钳记录结合起来，建立了脑片膜片钳记录技术，这为在细胞水平研究中枢神经系统离子通道或受体在神经环路中的生理和药理学作用及其机制提供了可能性。
在脑片电生理记录中，实验者可以按不同的实验目的直接准确地改变脑片灌流液的成份和条 件，如温度、酸度和渗透压、通氧状态、以及离子通道或细胞信号转导通路的阻断剂等另外，实验者还能借助显微镜准确地放置记录电极和刺激电极，同时，可借助一些特殊的加药装置，将一定浓度的药物加到整个脑片或是脑片上的特定区域上，研究电信号沿神经环路的传递规律。在电生理学实验结束后，活性较好的脑片还可用于生物化学或解剖学的分析。这些优点使实验者能获得准确的神经生理学的研究结果，也是其应用较在位大脑广泛的原因所在。
海马脑片是中枢神经系统研究中应用最为广泛标本之一。其原因有以下几点:
1、海马与脑的其它部位相对隔离，较易剥离，且剥离后受到的损伤较小
2、海马具有高度分化的片层结构，一方面，海马神经环路在片层中的分布有一定的空间规律，如锥体细胞胞体分布在锥体细胞层，而雪氏侧支突触分布于辐射层，且海马中存在一个三突触联系的回路，即穿通纤维-齿状回颗粒细胞层、苔状纤维-CA3区锥体细胞层、雪氏侧支-CA1区锥体细胞层等，因此，在海马中可以较准确地记录到特定神经元或突触的反应另一方面，这种板层结构有利于解释在某一部位记录到的细胞外场电位的意义。这些都使海马成为电生理学研究的理想标本。本文对海马脑片膜片钳的操作规程及注意事项总结如下。
一、海马脑片的制备
脑片制备中，海马分离应在断头后10分钟内完成，5~6分钟为宜。在分离海马时，还应注意不要扭转或撕扯海马，更不要损伤海马。分离海马的速度和质量是保证海马脑片制备成功的关键所在。
评价脑片活性最简单的方法是记录脑片上的群峰。在一个状态良好的脑片上记录到的群峰在一个很宽的刺激强度范围内始终是单峰的。出现多个群峰往往提示抑制性突触功能已受损，这是脑片最早的病理生理学改变。如果仅存在突触前纤维群峰(Fiber Volley, FV)，或FV峰大于突触后反应，这提示脑片活性极差，有活性的突触已所剩无几，为激发突触反应需要更多的突触前纤维参与，需中止实验。在活性较好的脑片中，FV峰几乎探测不到，或远远小于突触后反应。
有时会莫名其妙地出现一些问题，突触标本中突触后神经元看上去状态良好，但做了很多天甚至几周都没有得到有用的数据。在这种情况下，须要耐心地思考失败的原因，并设法解决。首先，应该检查溶液，用其它实验室制备的标本或更换实验动物。对于脑片的制备而言，切片机出现的机械故障会损坏脑片的质量。总之，在实验的全过程中能尽量注意每一个细节问题，出现问题后反复尝试，实验就会容易起来。
二、海马脑片的膜片钳记录
1、将刺激电极放置在含突触前纤维脑片区域附近
在突触传递的研究中，应该同时记录突触前和突触后神经元的电信号，虽然，并不是所有突触前神经元胞体的动作电位均可传导至突触(Vincent, 1996)。由于在突触前和突触后两个神经元上同时做膜片钳记录较困难，因此，需要用其它的方法来诱发突触前动作电位的发放。用刺激电极可在单个或多个突触前细胞或轴突诱发动作电位。另外，还可以用局部施加神经 递质的方法来诱导动作电位，如用短促的压力、离子电泳或笼锁谷氨酸光解等方法将谷氨酸加到突触前胞体或轴突上，可以诱导出多个动作电位。
用电极刺激 在神经元培养皿中，可以用连接了电源(通常是膜片钳放大器)的微电极直接刺激突触前神经元。在这种情况下，通常需要用负压吸引使突触前的细胞贴紧刺激电极，防止刺激电流的逸出。通过膜片钳放大器给脉冲刺激的优点是，它可以记录到突触前细胞被激活的胞外电信号(Role, 1987)。从培养的神经元和脑片上找到有突触联系的一对神经元是很困难的，但在神经元培养中有单个神经元的Autapic突触就会方便许多。
可以用膜片钳电极或尖端较细的一对钨电极给突触前轴突纤维施加电压脉冲。用电极刺激可将Ag/AgCl电极置于孵育槽中与其构成一电流回路。刺激电流一定要与膜片钳放大器记录电路隔离开，以防止刺激电流漏入记录电极中，而使刺激尾迹变得很大。为此，施加刺激需要一个未接地的隔离器。隔离器可以用外界脉冲刺激或计算机来控制。另外，还需要将刺激尾迹缩小到最小，以排除其对突触信号起始段的干扰。为达到该目的，需将刺激电路的回路电极置于合适的位置或用膜片钳放大器提高串联电阻补偿的效率。
刺激电极的位置 通常将刺激微电极或刺激电极置于突触前轴突通过的部位。但有时突触前轴突在制备脑片时即被去除。如果脑片制备时局部神经环路被破坏，实验中就很难成功地记录到突触后电流。实际上，切脑片的角度是保存局部神经环路最重要的因素之一，合适的角度既可使突触后神经元保存完好，也可保留部分较长的突触前纤维用于电刺激。用胞外电极刺激激活的神经纤维较多，而且，每次刺激激活的纤维数目也会不同。如果实验目的是将不同的传导通路分开，那么，必须要证明两个刺激电极激活的纤维各不相同。
2、全细胞记录
用可视化膜片钳寻找清楚、且表面光滑、折光性较好的突触后神经元。在加了正压后，将记录电极移入脑片视野中，并接近事先选好的神经元，然后，调整电极与神经元的相对位置，利用负压形成稳定的高阻封接。用短簇的脉冲负压使细胞破膜，稳定2~3分钟，观察封接测试波形起始段与基线间的差值是否在100pA以内，封接电阻是否大于200M，如果是，且较 稳定，再迅速补偿串联电阻和慢电容，舍弃串联电阻大于30M的细胞，且在记录过程中监测串联电阻的变化，当变化大于20%时，中止记录。如果细胞状态不好，就马上重新制备脑片，以提高实验效率。
3、判断突触前纤维
在记录电刺激的突触反应时，可以验证刺激电极是否放置在突触前神经元或轴突上，在实验中，如果记录不到突触反应，说明刺激电极位置不正确，这时可以稍微移动刺激电极的位置。如果还记录不到，这可能还与组织片活性较差有关，可以更换组织片或改进切片角度加以解决。电刺激方波时程一般设定为0.1~0.2ms，恒流条件下刺激强度一般为0.1~3mA，恒压 条件下刺激强度为5~40V.4、突触反应的判断及其波幅稳定性的评价
突触信号的判断 突触信号样的假象波有三个来源。第一、邻近纤维的活动使静止细胞产生电压波动第二、如果恒流刺激强度过大，电流就可被注入突触后神经元，使其产生失活时间类似EPSP或EPSC的信号，其信号幅度随刺激强度的变化而变化第三、直接刺激突触后神经元诱导出突触样的动作电位，这种反应紧接着刺激尾迹发生，没有翻转电位，使突触后 神经元膜电位超极化和向记录电极内液中加入10mM的QX-314，均可避免突触后神经元产生动作电位。但QX-314可阻断多种突触激活的通道(Otis, 1993)，在某些情况下它还可以增加漏电流。
多突触激活 通常情况下，刺激电流可激活多个突触前纤维，在突触后可记录到多种突触信号。因此，有必要用一些选择性阻断剂阻断一些不在研究范围内的突触活动。而且，刺激一束纤维，通常可激活多个同种的突触前纤维。不同的刺激强度下，被激活的突触前纤维数目不同，从而引起的突触反应也会不同。因此，要仔细调节刺激部位和刺激强度以便能刺激到单一的轴突(Stevens, 1995;Zhang, 1994a)。
胞内刺激突触前细胞是刺激单个轴突最好且最稳定的方法。甚至在单个突触前神经元被激活后，在突触后记录到的反应也是由多种神经递质共同作用的结果。多突触活动是突触活动的叠加效应，这包括去极化和超级化反应。在一些标本中，这是不可避免的。通常可用药物阻断不在研究范围内的突触活动。提高灌流液中钙镁等二价阳离子的浓度至5mM，以增加动作电位的阈值，就可以有效地减少多突触活动。通常情况下，突触反应是否来自单突触可以根据如下条件来判断潜伏时在0.5~1.5ms的范围内，高频刺激时突触反应立即消失，突触 反应的上升支和下降支较平滑，且无长潜伏时成份(Berry, 1976)。
电刺激引起的突触反应波幅在一定范围内的波动是一种正常现象，但记录过程中有电流衰减发生，当记录过程中电流衰减大于10~15%，就必须中止实验。如果电流衰减不可避免，就需记录较长时间确定电流衰减的速度。低频刺激(0.1~1Hz)下，记录几分钟，观察突触反应波幅的相对稳定性。
电极内液成份与受体敏感性 在形成全细胞记录后，胞内成份会被电极内液成份所稀释而发生改变，但在10分钟内即可达到平衡。因此，要记录G蛋白耦联受体的活性时，应向电极内液中加入10~100uM 的GTP(Trussell, 1987)。离子通道耦联的NMDA和GABAA受体的特性在全细胞记录过程中也会随时间的变化而衰减。在记录时可用多种方法来避免或减小其衰减，如提高电极内液EGTA的浓度或用BAPTA等快速络合剂代替EGTA，使胞内钙浓度远远低于1μM；向电极内液中加入mM级的ATP；采用穿孔膜片钳记录等。另外，电极的串联电阻小于10MΩ或突触距胞体较近时受体的敏感性会很快下降。
电压钳制是否准确 在电压钳制不足的情况下，记录突触后电流，虽然，可以为突触药理学和突触效能的活动依赖性的改变提供很有用的信息，但这些数据不能用于突触后电流幅度和时程的准确估计。那么，我们如何判断每次记录时电压钳制的质量呢？如果突触后电流来自树突远端，那么，该突触后电流的钳制质量就较低(Silver, 1996)。另外，还有一些判断钳制质量的方法，如突触电流的上升时间较长(如AMPA受体电流的上升时间大于1ms)；在某一突触后电流的翻转电位下可见到双相的突触后电流等。
评价电压钳制质量最常用的方法就是在一次记录后，绘制上升时间对下降时间曲线图。如果上升和下降时间被树突过滤过，则该曲线呈正相关关系，上升或下降时间与幅度间就会呈负相关关系。总之，上升时间受树突过滤的影响要远远大于下降时间。因此，如果随上升时间的变化，下降时间变化较小，这种情况下的下降时间是可靠(Hestrin, 1990)。需要注意的是，上升时间与下降时间相关性较差并不足以判断电压钳制的质量。Johnston等对树突上突触反应的钳制效果做了深入的讨论(Brown and Johnston, 1983;Spruston, 1993)。Husser(1997)等建议用突触电导随钳制电位的变化来检测树突突触反应的幅度和动力学特性。
在突触后电流较大时也存在钳制的偏差。这时，由电极串联电阻引起的电压降会影响到突触后电流的幅度和形状。若想验证是否存在这个问题，可以向灌流液中加入少许受体的高亲和力的阻断剂，观察突触后电流的时程是否会随其峰值的下降而变化，因为，受体的阻断不会改变其动力学特性(Otis, 1996;Zhang, 1994b)另外，可以改变串联电阻补偿的水平，观 察在不同的补偿水平下突触后电流会不会改变(Llano, 1991;Takahashi, 1995)。在许多情况下，有可能在发现偏差后更正突触后电流的下降时间。值得注意的是，串联电阻可以带来其它的偏差，如对波形的滤波效应。盲法膜片钳记录中，串联电阻通常要大于10MΩ，因此，这种影响是不可避免的。但可以用公式1/(2pRseriesCM)计算记录系统的过滤水平，确定突触后电流峰值和形状受影响的程度。
5、突触反应的记录
现在许多实验室都开始应用膜片钳技术记录培养神经元间、组织片中和异体移植组织中的突触传递。与尖电极记录相比，它具有明显的优势。如，记录的成功率较高，较高的信噪比，能较准确地钳制胞电位等。膜片钳甚至可以应用于在位突触活动的记录(Covey, 1996)。
记录自发突触后反应 自发的突触后反应有两个来源。一是局部神经环路中动作电位发放引起的递质释放，另一个是突触囊泡中递质的自发释放，后者被称为微突触反应(miniature synaptic event)。由于动作电位依赖性的自发突触反应幅度与微突触反应差别并不大，因此没有必要将两者区分开来。为记录到很纯的微突触反应，可以用TTX来阻断动作电位依赖性 自发突触反应，另外，去除灌流液中的钙或向其中加入钙通道阻断剂镉，即可以阻断电刺激诱发的递质释放。但如果多个囊泡在同一个突触末梢中同步释放，则以上两种方法的效果就不同了(Korn, 1994)。
自发性突触活动的发放频率通常小于几Hz。发育期标本上，自发性突触活动的频率就非常低(Edwards, 1990)，因此，需要记录较长时间才能获得足够用于分析的突触反应。如果自发性突触反应的频率很高，多个突触的反应就会重叠在一起，就不能通过上升或下降支的时间来判断是单个突触反应或是多个突触反应的叠加，从而，给数据分析带来许多麻烦。突触反应的频率受温度的影响较大(Fatt, 1952)，因此，在特定的实验中，可以通过调节灌流液的温度来调整合适的突触反应频率。局部施加去极化或超极化溶液也可以诱发自发突触活动(Bekkers, 1992;Tang, 1994)。在一些标本中，在刺激诱发的突触反应之后，自发性突触反应的频率会显著增高，在含有锶的灌流液中尤其如此(Dodge, 1969;Goda, 1994)。这一事实可用于检测与特定突触活动相关的量子大小(Otis, 1996)。
数据采集 突触反应可用计算机软件通过特定的采集卡采集到计算机硬盘上。记录电刺激的突触活动时，还须用计算机产生一个TTL脉冲以激活刺激器，并由隔离器经刺激电极刺激突触前纤维。
所需的数据量 电刺激所诱导的突触信号的记录中，其数据量取决于信噪比和信号的变异度。对电刺激诱导的全细胞电流记录而言，高信噪比不是问题，但在记录自发突触信号时，信噪比就变得比较重要了。实验前最好做预实验，估计获得准确的均数所需记录的信号数。当然，也应了解给定的刺激频率下突触信号的稳定性。对于电刺激诱导的突触信号，其峰值的变异 系数较小，因此，以0.1Hz的刺激频率记录5~10次就足够了。对于自发性突触信号来说，信号峰值的变异度较大，通常大于20%，为得到较可靠的结果往往需要记录100个以上的信号。实际上，要得出准确的变异，往往需要记录成百上千次信号，这也是得到较可靠的信号峰值分布规律的必要条件。在低频刺激下记录突触信号时，要控制系统误差，使记录保持稳定，须要制备活性较好的标本，并要有配套的稳定的实验条件。精确的测量控制是保证实验数据可靠性的基础，而且，每次实验都要对其进行严格的评价。
6、突触反应的分析
(1)刺激诱发的突触反应的分析
突触反应的大小和形状 突触电流和电位的检测指标有潜伏时(latency)、峰值(amplitude)、10~90%上升时间(10~90% rise time)、1/2峰值时的波宽(half width)、失活的指数拟合时间常数(exponential decay curve)(图1)。潜伏时是刺激尾迹(stimulus artifact)的起始时间到突触电流或电位峰值的5%间的时间间隔(Zhang, 1994a)，潜伏时包括几部分的延迟突触前轴突发放和传播动作电位的时间、神经末梢去极化到递质释放的突触延迟、递质扩散到突触后并引起受体激活的时间。由于递质扩散和受体激活的速度相当快，因此，突触延迟是突触前神经末梢发放动作电位和出现突触后反应间的时间间隔(Isaacson, 1995;Katz, 1965;Zhang, 1994a)。
突触反应的幅度是其峰值与反应前基线间的差值。信噪比较低时，须要计算突触反应前多个点和突触反应峰值前后多个点的均值，然后，以它们间的差值作为突触反应的幅度。上升时间用从峰值的10%到90%的时间描述较为准确。由于潜伏时的存在，很难判断突触反应开始的时间和到达峰值的时间。当刺激尾迹严重地干扰了突触反应起始的判断时，也可以用20 ~80%上升段的时间来描述上升时间。突触反应时程可以用以下几种方法来描述：
1、1/2峰值间的时间，它包括了上升时间和下降时间；
2、突触反应的下降支经多种指数拟合(如单指数拟合、双指数拟合和多指数拟合)产生一个或多个时间常数(decay time constant)。
图2自发突触反应的分析。A将膜电位钳制于-70 mV时记录的微小兴奋性突触后电流B 多个微小兴奋性突触后电流升支相重合的叠加图及其波幅的直方图。
双脉冲易化(paired pulse facilitation, PPF)，即以较短的间隔重复刺激突触前纤维两次，第二次刺激诱发的突触反应大于第一次刺激的现象，这是一种突触前现象，它可反映突触前递质释放概率的变化。
最小刺激诱发的突触反应 记录最小刺激(仅能激活一个或少数几个突触前纤维的刺激)诱发的突触反应可用于估计量子的大小，这种刺激有时可以诱发突触反应(success)，而有时则不能(failure)，其诱导出的突触反应的均值可用于估计单个量子的大小。
可分析电刺激诱发的突触反应的软件 有许多常规软件均可用于突触反应的分析，如Axon公司开发的pClAMP软件包，WaveMetrics公司开发的Igor Pro等，均可用于电刺激诱发的突触反应的分析。
(2)自发性突触反应的分析
突触反应的检测 目前有三种方法判断自发性突触反应(Hwang，1999)。第一、峰值超过即定阈值，该方法受基线波动的影响较大，这可以通过基线加以弥补第二、峰值相对于基线的变化量超过阈值，它受高频噪声的干扰较大，而且，很难设定一个合适的阈值，为克服这些不足，可以在处理时对原始数据进行滤波处理，除去高频噪声第三、与即定的波形模板进行比较，然后，判断是否突触反应，该方法对符合模板的突触反应具有很高的敏感性，但在设定模板前，必须知道所要研究的突触反应的一系列参数的范围，如果模板设计不合理，将大大降低探测的敏感性，而且这种方式尤其不适于有信号重叠或多个突触成份数据的分析。
PCLAMP 9.0对自发突触反应的分析基于波形模板，只要模板设计得当，探测概率也较高。另外，Copenhagen等用Igor Pro开发了一个分析程序minifit.ipf。该程序对第二种方法做了一些改进，分三步探测突触反应。第一步，粗筛可能的突触反应，包括它们的起始时间和峰值时间第二步，用突触反应起始与峰值间的差值计算可能的突触反应的波幅，去除波幅 小于阈值的波形第三步，对起始点之前数点和峰值时间后的多个点取平均值，以排除噪声的影响，并计算两者间的差值对突触反应的峰值做更精确的估计，如果该波幅低于阈值，与会从数据库中被删除。除波幅阈值的判断标准外，该程序还还引入了上升时间、下降时间和波形时程范围等描述波形模板的参数来进一步判断突触反应。该程序还可用于测量突触反应的生物物理学特征。它可计算10~90%上升时间，描述突触反应的上升相的动力学。该程序调用了Levenberg-Marquardt非线性曲线拟合函数对突触反应的下降相做单指数或双指数拟合，通过双指数拟合与单指数拟合的比较检验，计算其失活时间常数。该程序还提供了一个非常有用的功能，就是将所有记录到的非连续的突触反应以上升支的中点为基础相叠加，做逐点平均，这样，既可以降低噪声，也可以计算其动力学特征参数。
总之，脑片膜片钳记录成功的前提是制备活性较好的脑片，记录条件优化后，实验的稳定性、可重复性和准确性均较高，在神经科学领域应用较为广泛。许多神经毒物可影响中枢神经系统的突触传递功能，脑片膜片钳技术将为实时、准确、高效地研究这些毒物作用的机制提供可靠的技术支持。
脑片技术(1)准备样品。
(2)取大鼠，断头，在60s内快速将脑取出并置于含95%氧和5%二氧化碳的冰冷生理盐水中冷却3-5min用清洁、锋利的解剖刀清除软膜等组织，在此过程中避免挤压和使脑变形的动作。(3)用氰丙烯酸盐胶(Cynoacrylate glue)将其按所需方向固定于切片装置的皿槽中，并放一块琼脂。即刻用冰水倾倒其上直到浸埋为止。保持脑组织在低温状态下以减小由于缺氧而损伤是至关重要的，并持续通气。
(4)用振动切片机切成400μm厚的切片，将切片移至内含32-35℃生理盐水的记录槽内，水中持续通以95%氧和5%二氧化碳气
(5)脑片放于5% CO2和95%O2饱和的Krebs碱性缓冲液5ml，在37℃下孵育5-15min平衡。(6)在35℃生理盐水中孵育30-60min后开始记录电活动(也有不进入这步，而直接在SS中孵育30min以上。
不用任何消化酶、避免酶损伤离子通道。一般脑片多用于膜片钳记录和脑片在位的原位分子杂交。
(1)膜片钳技术 常用方式有：吹打清洁后封接；盲插封接。第一种方法是用带有正压记录的记录微电极吹掉靶细胞周围的神经纤维网之后，再与细胞膜进行封接。这一过程是在红外微分干涉相差显微镜直视下进行。这种方法可在较大神经元上记录，也可在较小的神经元上记录，甚至可在一个神经元的不同部位插上不同电极。可以选择不同的细胞类型进行封接。但盲插法只要一般解剖显微镜即可，不需清洁，又可免去吹打对细胞及突触结构的伤害。但它不能选择细胞。目前已将膜片钳技术发展到与碳纤电极相结合的优点。可以检测到单个囊泡的释放。而膜电容监测方法难以测到胞吐和胞饮的过程。而碳纤电极原理是电化学方法，检测碳纤电极的前端加上可使被检测物质快速氧化的电压(如600-800mV)，使电极端面周围产生很强的电场，当可被氧化的物质接近这个电场时，就会被氧化释放电子到碳纤电极从而产生电流。
根据测量的需要，通常在碳纤电极上加上恒 定电压和周期电压。采用恒定电压的安培测量法具有最高的时间分辨率，而采用周期电压的快循环电压测定法(如采用周期三角波)则可区分被氧化物质类别。一般碳纤电极为5-10μm，电极一端与放大器相连，周围部分的浴液必需绝缘。碳纤电极必需牢固固定,以保持刚性减小振动。而且碳纤电极的电流放大器必需要有足够的带宽(3-5KHz)，一般膜片钳放大器能满足要求。普通的碳纤电极主要插于玻璃毛细管中用玻璃电极拉制器搠制。可用胶粘接碳纤维和玻璃管以保证二者紧密结合。但碳纤电极也有一个缺点即是记录的是细胞局部活动而非全细胞。
(2)脑片杂交。
(3)脑片标记，使突触摄入放射性标记神经递质或前体，然后神经脑片摄入，使神经末梢递质贮存库被选择性标记。在37℃孵育30-60min，然后用灌流液冲洗脑片，将脑片移入小室中灌流。灌流小室由直径5mm的玻管制面，两 端用塞子，调整塞子位置，使小室内的体积为0.25-0.3ml。两头为流入管和流出管，为使脑片去极化，可加入一根铂金丝作为刺激电极。每小室中移入2-5片脑片，用37℃灌流液灌流小室，速度为0.25-0.3ml/min，收集灌流液(每2-5min收集一次，共20-30min)，测定基础释放量。然后用电极刺激或加入不同物质，使之去极化，测定流出液的放射性活性。用液体闪烁记数仪或HPLC电化学检测。℃℃
(4)举例
海马脑片神经元中的K+浓度测定法 先准备好振动切片机，并将所有器械将要接触大鼠脑部位的部分放于4℃的细胞外液中。切片机切片刀先放一块琼脂，后脑组织可用502胶水或其它的胶张贴)成年大鼠，体重120-200g，乙醚麻醉下切开头皮，暴露颅骨，断头取脑。(幼年大鼠更好，则不必切开头皮和麻醉，可直接断头取脑，取脑过程中，不断地加4℃SS，并将枕叶和额叶切除，放于切片机通气的4℃的SS液体中)。取脑后放置于4℃，95%O2，5%CO2混合气体饱和ACSF中净血降温，然后将脑置于用人工脑脊髓液预先湿润的滤纸上，沿正中线分开大脑半球，由脑腹内侧沿皮层边缘剥离双侧海马，在4℃供氧条件下，用刀片垂直于海马长轴，用手切将其切成400-500μm的脑片，将全部脑片置于36℃ACSF中，并不断通入混合气，孵育2h，ACSF pH调节7.3-7.4。(或将脑组织放于振动切片机上，基本控制大致的位置。用切片机切成8片左右，再取其 中较好的几片进行实验，将脑片在SS中将丘脑部分去除，保留皮层和海马，取海马CA1区，可以皮层的嗅沟作为标记。再的取出切片放于孵育液中，通气的孵育30min以上，再打碎所要部分的细胞，进行实验。)
实验时，将孵育脑片置于36℃恒温浴槽内的尼龙网上，液面略高于液气交界面，并不断通入混合气体供氧，气体流量控制在400/分钟，ACSF由蠕动泵以2-4ml/min速度持续灌流。双极不锈刚电极置于CA3区神经纤维 上，刺激电流0.3-1nA，时间为50-150ms，Ag-AgCl作参考电极，一端连碚灌槽，另一端与离子计、示波器接地相连。用多维手动微电极推进器分别将普通及K+选择性微电极刺入神经细胞内。两电极尾部均经Ag-AgCl丝与ISE-1型离子计探头相连，从离子计数字监控表测刺激前后细胞膜电位(Em)、离子电极电位(Ee)及反应离子活度的电位(Ek=Ee-Em)，并将Em, Ee显示于示波器中，实验后将刺激前后电极电位换算成相应神经元K+活度，并加以校正。
在测量时，理想的配置方案是让离子选择性微电极和普通微电极两者同时都在同一神经元中。那么两电极的Em值相同。若不能在同一神经元，则多测几次求其增均值。不过，用双管微电极，则必须用两个放大器。活度测定一般采取校正曲线法。
注意(1)拉制微电极时，颈部不能太长，以便于液膜和内充液的灌注。
(2)电极硅化时，防止硅化层太厚而阻塞尖端。(3)选择电极前，一定要先测量电极的稳定性，选择好的电极。(4)灌注离子交换剂时，若内有气泡，可用手拉伸玻璃针把它引出，但要在放大100倍显微镜下观察进行.(5)钾离子选择性电极使用前，应将电极下端浸入0.1mol/L KCl溶液内，静置1-2h，否则电极可能会出现明显 的电位漂移。(6)为避免电极污染，制成后不宜久放，宜于当天使用。(7)脑薄片制作时，要在冰浴中进行，以减少术中出血。且以快而不损伤组织为原则。注意尽可能剥净脑膜，切片避免薄片变形，破裂或卷曲。(8)人工配制脑脊髓时，溶液用ddH2O及化学试剂新鲜配制。灌流液灌注速度以每分钟灌注更新率达6-10次不宜。
附 离子选择性微电极，即离子敏感性微电极(ISME)，其特点对细胞损伤小，可制成双管微电极。当钾离子选择性微电极插入神经元内，产生电位Ee是反应细胞内K+的电位和细胞膜电位Em之和，即Ee=E+Em。另一普通微电极插入神经元内，可记录到细胞膜电位Em，通过减法器，可得到E=Ee=Em，再通过校正双曲线法，可求得细胞内K+离子活度。
1单管选择性微电极的制作(1)微电极处理 选用硬度高(GG-17)、管壁厚、或电阻率较高的玻璃毛坯，经1:1浓硫酸和浓硝酸浸泡，自来水冲洗，蒸馏水煮沸后烤干备用。用微电极拉制仪拉成小于1μm的微电极。直流电阻为50±10MΩ。
(2)电极尖端疏水化 洁净玻璃表面具有亲水性，故充灌的非水溶性离子交换剂将很快被水相物质所取代。因而，在灌注离子交换剂前，需对电极尖端进行疏水化处理。即硅化。在直径约15cm，高约3cm玻璃盘内放入约10根玻璃微电极。上面加盖，盖上有一小孔。加温到150℃，维持15-30min以烘干电极，在小孔中滴入六甲基二硅烷约300μl，维持在150℃约40-60min，用其蒸气硅烷化。还可将少量15%六甲基二硅烷注射到微电极转窄处。由于存在微丝，硅化溶液会自然充入微电极顶部。注入硅化液的微电极应在室温下静置1h，然后置250℃烘箱同烤1h。加热蒸去未与玻璃键合的硅化液组分。
(3)离子交换剂和内部电解质溶液的灌注 将玻璃电极倒置在金属框中，并放在250℃烘箱烘1h。冷却后，用毛细玻璃管自尾部向硅烷化后的电极尖端注入相应的0.5mol/L KCl，至电极肩部为止。然后将玻璃管自尾部向硅烷化后的电极尖端注入相应的0.5mol/L KCl，至电极肩部为止。然后将玻璃微电极尖端1-2mm浸入Fluka K+-Cocktil 60031 10min左右，树脂可在电极尖端形成100μm左右液柱，最后作尾部灌注时，如果硅化处理良好，树脂注入后略加引导，会自动流向尖端，且树脂与玻璃封接稳定。
(4)尾端处理 为防止水分蒸发，在尾部封以矿物油，然后将Ag-AgCl丝导入。现在一般有固定的玻璃管，不必进行特殊处理了。一般拉微电极，分两步，拉出的微电极尖端细，但尖端不长。一般第一步温度为60.2℃，第二步为37℃。玻管应放直，否则可能拉出的玻管不正。
2双管微电极制作。(1)将两单管毛坯粘在一起或火焰中封在一起。(2)拉成双管微电极(3)在加压下用蒸馏水充注一管，使其防止硅烷化。(4)将别一管顶端于硅酮溶液中浸5-10s，使其从顶端起200-500μm内硅化。(5)加热干燥整个双管电极，从20℃开始至200℃至少烤1h。(6)借助显微镜操纵器将其顶端顶着的瓷物撕开，通常使尖端为2-3μm。(7)用直接注射法，以0.15mol/L NaCl水溶液充注非离子选择管。(8)将电极浸入离子交换树剂内约10-15s，以便液体离子交换剂灌入硅化管顶端。(9)用注射法以0.5mol/L KCl灌注此管的其余部分。(10)尾端封以矿物油。然后将Ag-AgCl丝导入。
3钾离子选择性微电极的保存。经硅化后电极未充液前可保存数天，最好在干燥空气中保存。微电极保存待用时，需将其顶端浸在0.5mol/L KCl中。
4K+选择性微电极校准。每次测定前，要在各种不同浓度KCl(3-300mmol/L)溶液(150mmol/L NaCl作背景)测试各电极的灵敏度。KCl溶液浓度每变10倍，钾离子选择性微电极反映出电位斜率为50-55mV，斜率过低时，弃去不用。
电生理实验论文 篇3
1 材料与方法
1.1 大鼠自由落体脑损伤模型的建立
按Feeney法[2]自由落体致伤原理制成一撞击装置 (军事医学科学院仪器厂) , 使用该装置制作大鼠自由落体脑损伤模型, 撞杆头端直径4.5 mm, 高2.5 mm, 外周导管高为40 cm, 保持90°垂直, 每隔1 cm有一气孔, 以防击锤下落时导管内空气压缩阻力的影响。
1.2 动物分组
选取健康成年雄性Wistar大鼠40只, 体重270 g～290 g, 由山西医科大学实验动物中心提供。随机分为TBI组 (n=30) 和假手术组 (n=10) , TBI组再随机分为3组, 垂直打击造成的轻度组 (n=10) 、中度组 (n=10) 、重度组 (n=10) 。
TBI组动物以戊巴比妥钠 (50～60) mg/kg腹腔注射麻醉后, 于冠状缝后1.5 mm, 中线旁2.5 mm处, 左右分别钻一直径为5 mm的圆形骨窗, 保持硬脑膜完整, 将撞杆头端置右侧骨窗处, 击锤 (重20 g) 沿外周导管分别从10 cm、30 cm高处自由落下冲击撞杆, 造成右顶叶轻度、中度脑挫伤, 另用击锤 (重40 g) 沿外周导管从25 cm高处自由落下冲击撞杆, 造成右顶叶重度脑挫伤, 致伤冲击力分别为0.028N·s、0.048 N·s和0.088 N·s。假手术组仅与TBI组采用相同的开骨窗手术, 不造成脑损伤。
1.3 大鼠丘脑腹后内侧核 (VPM) 痛敏神经元 (PSN) 放电变化的记录
记录VPM核[3]PSN放电时, 采用美国FHC公司生产的尖端直径1 μm～2 μm的钨丝金属电极, 尖端暴露长度为15 μm～40 μm, 阻抗为 (0.1～0.5) mΩ, 部分包裹于不锈钢管套内。该套管前端包裹有绝缘、绝热材料。根据大鼠脑立体定位图谱[4] (The Rat Brain Stereotaxic Coordinates) , 确定VPM的位置, 即中缝旁2.5 mm, 前囟后4.16 mm进针6 mm深, 可达VPM的中央部位。轻、中、重度TBI组及假手术组均采用右侧的骨窗作为打击致伤处, 左侧的骨窗为记录电极插入处。打击后立即进行记录。所有记录均在打击致伤后立即进行, 每只大鼠记录5 min。结果采用RM6240BD多道生理信号采集处理系统 (成都仪器厂) 进行分析处理。
1.4 统计学处理
数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 各组大鼠VPM痛敏神经元的放电次数 (见表1)
与假手术组比较, 1) P<0.01;与轻度TBI组比较, 2) P<0.01;与中度TBI组比较, 3) P<0.01
2.2 各组大鼠VPM痛敏神经元的放电频率 (见表2)
与假手术组比较, 1) P<0.01;与轻度TBI组比较, 2) P<0.01;与中度TBI组比较, 3) P<0.01
3 讨 论
根据致伤后动物表现、病理检查结果证实, 按Feeney法自由落体致伤原理[5]制作的TBI模型, 类似实际生活中常见的闭合性加速性颅脑损伤, 致伤机制单一, 操作简单, 重复性好, 可根据不同需要选择弹簧的长度、不同致伤角度, 制作出不同程度的脑损伤模型, 适于TBI的力学研究, 但不能排除颅骨发育和形态差异造成的影响。
创伤性脑损伤发生时, 损伤组织 (头皮、骨膜、硬膜等) 内痛觉神经末梢在生物学活性物质的作用下发生敏感化, 即正常状态下不能引起兴奋的刺激, 在此状态下可以引起神经末梢兴奋, 产生痛觉;正常状态下可引起兴奋的刺激, 此状态将产生更强烈的神经兴奋, 产生更剧烈的疼痛[6]。
头面部痛觉主要由脊髓丘脑束和三叉神经丘系, 传导至丘脑腹后核, 然后投射到大脑皮层感觉区而被感知, 并通过传出神经纤维和效应器做出反应。丘脑与大脑皮层是痛觉高级中枢, 而丘脑内接受伤害性刺激的特异性核团是腹后外侧核 (VPL) 和VPM, 主要接受脊髓丘脑束, 脊髓颈核束和背柱突触后纤维束的伤害性传入, 所以呈现对侧支配的特点。故本实验采取双侧顶部开骨窗, 右侧进行打击致伤, 左侧进行丘脑VPM放电的记录[7]。
本实验通过记录大鼠VPM痛觉敏感神经元在动物脑外伤后的电生理变化, 假手术组、轻度TBI组、中度TBI组、重度TBI组的放电频率及次数的均数依次增加, 经方差分析各组之间放电频率及次数有统计学意义 (P<0.01) 。本研究结果显示, 随着创伤性脑损伤程度的加重, 其放电次数及频率呈现上升趋势。原因可能是颅脑损伤后, 疼痛不仅是传统意义上的伴随脑损伤的临床症状, 而且可能是加重脑损伤的一个重要原因[8,9,10]。
参考文献
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电生理实验论文 篇4
中华医学会麻醉学分会
王天龙
王国林（负责人）
王保国
王海云
石学银
许幸
孙立
李恩有
陈绍辉
孟令梅
徐世元
郭曲练
黄焕森
梁伟民
韩如泉（执笔人）
裴凌
目 录
一、躯体感觉诱发电位
二、运动诱发电位
三、脑干听觉诱发电位
四、肌电图
五、脑电图
六、附录
神经系统具有通过电化学活动传递信息的独特功能，意识状态改变时（例如昏迷、麻醉），可以通过监测电化学活动评估神经系统功能状态。然而，传统的生理监测（例如血压和血氧）仅能作为反映神经系统功能状态的间接参数。术中神经生理学监测虽然不能取代唤醒试验，但可以发现那些改变神经功能的手术操作或生理学内环境变化，监测处于危险状态的神经系统功能，了解神经传递过程中电生理信号的变化，从而帮助手术医师及时、全面的判断麻醉状态下患者神经功能的完整性，提高手术操作者的术中决策力并最终降低手术致残率。除了手术因素，生理学管理和麻醉药物的选择也会影响神功能。我们应当重视所有团队成员（例如外科医师，麻醉医师和神经电生理监测医师）的努力。
目前，神经处外科手术中常见的电生理监测技术包括：躯体感觉诱发电位（somatosensory evoked potentials，SSEP），运动诱发电位（motor evoked lpotentials，MEP），脑干听觉发电位（auditory brainstem responses，ABRs），肌电图（electromyography，EMG）和脑电图（electroencelphalogram，EEG）等。
一、躯体感觉诱发电位
刺激外周神经引发的感觉冲动经脊髓上传至大脑，在整个传导路上的不同部位放置记录电极，所记录的神经传导信号经监测仪信号放大器放大后的波形就是SSEP。SSEP头皮记录电极的入置基于10-20国际脑电图电极放置系统进行定们（见附图7-1）。
（一）SSEP监测在神经外科术中的应用 术中SSEP监测被广泛应用于多种手术中：
1、脊柱融合术；
2、脊髓肿瘤切除术；
3、动静脉畸切除术；
4、胸腹部动脉瘤修补术；颅内肿瘤切除术；
5、颈动脉内膜剥脱术；
6、颅内动脉瘤夹毕术；
7、术中感觉皮层的定位。
（二）术中SSEP波形释义和监测预警
刺激特定外周神经时，特定记录组合记录到的特定波形以波幅（微伏）和潜伏期（毫秒）进行测量，并以电压（微伏）-时间（毫秒）曲线图表示SSEP。通常，不同波形来源于经通路上不同位点的突触，这些位点就被称为波形的生成元（见表7-1）。在正常成人中，波形的极性以“N”和“P”表示，“N”（Negative）表示向上的波形，”P”(Positive)表示向下的波形，波形之前的距离表示刺激后至波形产生的潜伏期。例如，皮层记录到的刺激正中神经后产生的特征波峰N20（负极波，向上，刺激后20ms可记录到），P22（正极波，向下，刺激后22ms可记录到）定义了波形的波幅（图7-1，图7-2）。
SSEP基线波形是成功的术中SSEP监测的基础，也是辨别术中SSEP变化的基础。包括外科和麻醉影响在内，术中患者内外环境的变化使得SSEP监测过程极具挑战性，使得解释SSEP显著变化得非常复杂。因此，为术中波幅和潜伏期变化提供有依据的预警标准很困难。有研究认为，术中SSEP波幅降低45%～50%，潜伏期延长7%～10%不会引起术后神经功能的变化。然而，就经验而言，在不考虑麻醉和生理学因素的情况下，波幅降低50%或更多，潜伏期延长10%或更多被认为是需要预警并干预的显著性变化。
（三）影响SSEP的生理学因素
1、体温
轻度低温延长皮层SSEP潜伏期，对皮层波幅和皮层下或外周反应的影响很小。低温会导致皮层SSEP消失，皮层下、脊髓和外周反应的潜伏期延长，随着温度的进一步降低这些反应也会消失。
复温可以改善潜伏期但不能完全逆转低温导致的负面反应。轻度高温与皮层和皮层下SSEP潜伏期延长有关，不会影响波幅。局部温度变化也会影响SSEP，例如，由手术暴露或术野低温冲洗引起的手术部位温度变化会影响SSEP。
此外，无论是否输注低温液体，手术室温度过低都会影响SSEP。
2、组织灌注
血压及与其相关的组织灌注变化会影响SSEP。如果低灌注不能满足组织基本的代谢需求，皮层SSEP将会减弱。
正常体温下，当脑灌注低至18ml·min-1·100g-1时SSEP反应减弱，当进一步低至约15ml·min-1·100g-1时皮层SSEP消失。皮层下反应对组织灌注不足不如皮层敏感。
局部因素导致的局部缺血也会影响SSEP。例如，脊髓牵拉，牵引器导致的缺血，体位性缺血，止血带导致的缺血，血管损伤以及血管夹（无论暂时性或永久性）引起的缺血。
血细胞比容的变会会改变血液的携氧能力和粘稠从而影响氧的输送。通常情况下轻度贫血会引起SSEP 波幅增加，但当血细胞比容低至10%～15%时SSEP潜伏期会显著延长，血细胞比容低于10%则会导致波幅降低和潜伏期的进一步延长。
3、血氧水平与通气 PaO2和PaCO2 的变化会影响SSEP。轻度低氧不影响SSEP。术中明显的低氧会引起SSEP波幅的降低。当[PaCO2]升至50mmHg时，高碳酸血证并不会影 响SSEP。过度通气会增加SSEP波幅并轻度延长潜伏期。
4、颅内压 颅内压升高会导致皮层SSEP波幅降低，潜伏期延长。随着颅内压的升高，皮层SSEP会发生压力相关性衰减，颞叶沟回疝形成时会发生皮层下反应的消失。
5、其他生理学变量 包括电解质和葡萄糖，总血容量以及中心静脉压在内的其他大量生理学因素也会影响SSEP。
（四）影响SSEP的麻醉不因素
麻醉药物对SSEP有多种影响，各种麻醉药物对SSEP影响的机制差异很大（例如，有些麻醉药物增强SSEP，而绝大多数抑制SSEP），但是所有麻醉药物均是通过改变改突触或轴突传导功能从而改变神经元兴奋性这一机制发这、挥作用。
1、吸入麻醉药 卤族类吸入麻醉药剂量依赖性的降低SSEP波幅并延长其潜伏期。与皮层下，脊髓或外周神经相比，这种对SSEP的抑制作用在皮层更加显著。氧化亚氮降低皮层SSEP波幅并延长潜伏期，这种作用与卤族类吸入麻醉药和大多数静脉麻醉药有协同作用。
2、静脉麻醉药 一般情况下，静脉麻醉药对SSEP的影响较吸入麻醉药轻。除依托咪酯和氯胺酮外，低剂量的静脉麻醉药对皮层SSEP影响很小，大剂量重复使用时会轻度降低波幅，延长潜伏期。绝大多数静脉麻醉药对皮层下SSEP的影响均可忽略不计。
单次诱导剂量的丙泊酚不影响刺激正中神经后的皮层和皮层下SSEP波幅，但是会轻度延长皮层SSEP潜伏期。丙泊酚诱导和持续输注导致的皮层波幅降低会在输注停止后恢复。丙泊酚对硬膜外诱发电位没有影响。与等效计量的卤族类吸入麻醉药或氧化亚氮比较，丙泊酚对波幅的影响更小。作为全凭静脉麻醉药的一部分，丙泊酚适合于SSEP的术中监测。
依托咪酯会明显增加皮层SSEP波幅并轻度延长其潜伏期。依托咪酯对皮层下SSEP波幅无影响或轻度抑制。依托咪酯已经应用于那些无法进行术中SSEP监测的病例，以改善皮层SSEP，但是依托咪酯具有抑制肾上腺功能的缺点。
氯胺酮增强皮层SSEP波幅，对皮层和皮层下点位的潜伏期没有影响。在SSEP监测过程中氯酮的副作用，包括致幻，半衰期长，次生代谢物的长期存在，拟交感神经效应以及在颅内病理状态下增加颅内压。右旋美托咪定是α2受体兴奋性麻醉药物，对术中SSEP监测的影响轻微。
3、阿片类药物
一般情况下，全身应用阿片类药物会轻度降低皮层SSEP波幅，延长其潜伏期，但是对皮层下和外周电位的影响轻微。单次剂量的阿片类药物较持续静脉输注对SSEP的影响大。因此，阿片类药物的持续输注是术中SSEP监测时麻醉的重要组成部分。瑞芬太尼具有时量半衰期短，起效快的特点。因此经常得以应用。除了哌替啶，椎管内使用阿片类药物对SSEP没有影响。
4、苯二氮类 苯二氮
类药物轻度抑制皮层SSEP。单独使用咪达唑仑对皮层SSEP影响轻微或无影响，N2O潜伏期中度延长，对皮层下和外周SSEP影响轻微或无影响。间断给予或持续静脉输注50～90μg·kg-1·h-1咪达唑仑可以增强全凭静脉麻醉期间的遗忘作用并可改善氯酮引起的致幻作用，从而利于术中SSEP监测。
5、肌松药 全身麻醉过程中使用神经肌肉阻滞药物通常不会直接影响SSEP。但是，神经肌肉阻滞药可以抑制自由肌电和（或）记录点附近肌肉群的干扰，增加信噪比，改善SSEP波形的质量。
（五）推荐麻醉方法
鉴于麻醉药物的药理学作用特点，静脉麻醉药较吸入麻醉经更适合于术中SSEP监测，也可以考虑低浓度的吸入麻醉药和与静脉麻醉药联合应用，但是对于SSEP波幅较小的患者，全凭静脉麻醉更牵连合物术中连续SSEP监测。另外，由于运动诱发电位监测通常与SSEP联合使用，运动诱发电位对吸入麻醉药非常敏感，因此通常需要全凭静脉麻醉。典型的药物组合是丙泊酚和瑞芬术尼，术中不使用肌松药。
二、运动诱发电位
MEP是指用电或磁刺激中枢运动神经（脑功能区或脊髓），在刺激点下方的传出路径或效应器、肌肉记录到的电反应。刺激中枢运动神经主要有经脊髓和经颅刺激两种方法。电刺激脊髓或运动皮质后，在外周肌肉记录到的电位称为复合肌肉动作电位（complound muscular activity potentials，CMAP），CMAP是广泛使用的测量MEP的方法。MEP是最新引入的术中神经生理监测（intraoperative neurophysiologic monitoring，IOM）项目，与SSEP通路定位于不同的区域，不同的皮层血供区，不同的脑干和脊髓部位。运动功能路较SSEP通路对缺血更为敏感。
（一）MEP监测神经外科术中的应用
MEP监测的敏感性为100%，特异性为90%。相对来讲，MEP发生变化并不常见，但是与SSEP相比MEP与术后运动功能的预后具有更好的相关性，因此强烈推荐在下列手术中都应该进行MEP监测：
1、骨骼畸形矫形术；
2、髓内外肿瘤切除术；
3、颅内肿瘤切除术；
4、中枢神经血管损伤手术；
5、卒中和胸腹主动脉瘤修补术预后的评估。
但这并不意味着进行MEP监测就不必采取其他监测技术，对于不同患者，其他监测技术是MEP监测必要补充。
（二）术中MEP监测的预警
制定CAMP变化标准很困难，因为即使是在清硬状态下除此以外有大量的变量需要考虑，全麻时需要考虑的变量更多。最常用的评估MEP反应标准是在固定刺激参数的（刺激数量和强度）情况下诱发相似的肌肉反应。一般认为需要增加刺激强度超过50V，增加刺激次数，或与初始波形比较波幅下降大于80%是显著性改变。有关变化范围的研究是目前的热点问题，无论如何，当CAMP反应消失时需要提醒外科和麻醉医师纠正影响MEP变化的生理学因素。
（三）MEP监测的并发症
MEP监测并非没有风险，并发症包括：皮层灼伤，舌裂伤，心律失常，颌骨骨折和术中知晓。放置牙垫可以减少舌裂伤的发生。
（四）MEP监 测的相对禁忌证 MEP监测的相对禁忌证包括癫痫，皮层损伤，颅骨缺损，高颅压，颅内装置（电极，血管夹和分流管），心脏起搏器或其他植入泵。肌肉酸痛是最易被发现，也是最普通的并发症。放置针状电极可能会引起出血和插入点的擦伤，也有可能感染。这些轻微并发症的发生率非常低。实施运动诱发电位监测时会引起患者的体动，因此诱发MEP前需要与外科医师进行紧密的沟通。目前采用的多脉冲刺激减少了体动的发生，并且有可能在不干扰手术操作的情况进行MEP监测。
（五）影响MEP监测的生理学因素
1、体瘟 体温的降低可以引起MEP潜伏期延长，刺激阈值增加，但是其对振幅的影响呈双向性，随着体温下降，振幅增加，在29℃使达到峰值，随后开始下降，在22℃时消失。中度低温（31～34℃）时会出现MEP波形的改变，32℃以下会出现潜伏期延长，复温至正常体温后MEP恢复正常。
2、缺氧 吸入氧浓度降至10%时，27%MEP波形消失，潜伏期延长，波幅下降。吸入氧浓度降至5.25%时MEP波形消失。
3、低血压 轻度和中度的低血压对MEP没有影响，对于行控制降压的患者平均脉压降运动50mmHg时MEP波幅降低。
4、缺血 脑血流降至16ml·min-1·100g-1以下时会引起MEP波表的变化。主动脉或股动脉夹闭30分钟后可以引起下肢缺血，MEP波幅降低，潜伏期延长。完全的主动脉夹闭2分钟后即可引起脊髓缺血，进而影响MEP。
5、高二氧化碳和低二氧化碳血症 除非呼气末二氧化碳水平极度升高，否则MEP波形变化甚微。当PaCO2达到100mmHg时经颅刺激运动诱发电位会发生变化。呼气末二氧化碳水平13～30mmHg之间MEP不会发生变化。
（六）影响MEP的麻醉学因素
1、吸入麻醉药 卤族吸入麻醉药会对CMAP的波幅产生剂量依赖性抑制，临床使用剂量会增加监测的失败。当七氟烷浓度为0.75MAC时，tcMEPa的波幅受到显著影响。
2、静脉麻醉药 丙泊酚对CMAP的影响呈剂量依赖性抑制。进行运动诱发电位监测时，应当使用成串刺激诱发CMAP时，维持1μg/ml(20～25μg·kg-1min-1)的丙泊酚血浆度并复合阿片类药物或50%N2O为会影响CMAP反应，但是当丙泊酚血浆度为1μg/ml～2μg/ml(25μg·kg-1min-1～50μg·kg-1min-1)时，CMAPL的波幅会被抑制30%～60%。
依托咪酯对经颅刺激诱发的CMAPs的抑制作用很小，0.3mg/kg的常规诱导剂理静注会导致CMALP波幅降低35%，潜伏期没有变化，但是这种抑制是短暂的，仅在单次给药后持续2min～5min。持续输注依托咪酯维持麻醉可以为运动诱发电位监测提供一个良好的条件，有以10μg·kg-1min-1～30μg·kg-1min-1持续输注依托咪酯维持麻醉而不影响运动诱发电位监测的报道。
3、阿片类药物 虽然芬太尼、阿芬太尼、舒芬太尼对MIPs均有抑制作用，使MEP波幅下降，伏期延长，抑制作用大小依次为芬太尼﹥阿芬太尼﹥舒芬太尼，但是低剂量或持续输注阿片类药物对运动诱发电位的影响很小，维持外科麻醉的血药浓度为外科麻醉的血药度的2倍时，诱发电位反应将消失。
4、肌松药 肌松药会导致CMAP波幅大幅降低，在进行运动诱发电位监测时应尽量避免使用肌松药。
（七）掖荐麻醉方法
丙泊酚和瑞芬太尼的全凭静脉麻醉适合于MEP监测的麻醉维持。
三、脑干听觉诱发电位
ABRs是通过声音刺激听神经，听觉传入冲动经耳蜗核，再经上橄榄核，外侧丘系、下丘和内侧膝状体到达大脑听觉皮质途中产生的各种反应电位。
（一）脑干听觉诱发电位监测的适应证
1、听神经瘤；
2、第五对颅神经受压：三叉神经痛；
3、第七对颅神经受压：面痉挛；
4、后颅凹手术；
5、颞叶或顶叶皮质损伤；
6、椎基底动脉瘤。
（二）脑干听觉诱发电位的解释及预警
根据潜伏期和波幅的不同，ABRs可分为三种类型：短潜伏期脑干听觉诱发电位，中潜伏期脑干听觉诱发电位和长潜伏脑干听觉诱发电位。手术监测中常用的短潜伏期脑干听觉诱发电位根据其起源不同分为Ⅰ～Ⅴ波。
正常的ABRs监测应该最少有三个清晰可辨的波形或波峰，虽然ABRs一般包括七个波形（图7-3），但是只有Ⅰ波、Ⅲ波和Ⅴ波常用于术中监测。术中ABRs监测最常见的改变，是在后颅凹置入牵引器后，波Ⅴ潜伏期的延长以及波Ⅰ到波Ⅴ峰间潜伏期的延长。ABRs很多改变（如果变化轻微）是可逆，并被为常规手术操作的一部分。如果波Ⅰ完全消失就可能缘于血管阻塞，痉挛导致耳蜗丧失血供，或是由于外科医生切断了神经所致，继而引起有效听力的丧失。波Ⅴ的改变与预后的关系就不那么明确，传导途径中的去同步化也可能导致波Ⅴ的消失，此时听力可能并不受损害。一般况下，如果波Ⅰ和波Ⅴ都存在，听力一般不受损，但是如果二者都消失，术后听力得以保存的机会很小。
牵拉神经或脑干会导致听神经经颅内部分受到影响，从而引起Ⅰ波和Ⅲ波潜伏期延长，这种变化只在受损神经的同侧发生，波Ⅲ去同步化的程度可以反映损伤的严重性，对听神经的冷盐水灌洗，热烧灼，干燥或使用罂粟碱缓解血管痉挛，也可以引起样的变化。
无论是对脑干的直接损伤还是影响脑干的血流供应或血流量的操作都可以通过ABRs反映听觉通路受损的情况。持续的ABRs波形改变可以预测脑干功能障碍，但即使ABRs的波形没有变化脑干功能也有可能受损，因此推荐采取ABRs与其他监测方法如SSEP，MEP联合监测的方法来监测脑干功能的完整性。多模式监测具有很好的特异性，但在评估脑干功能完整性方面敏感性有限。
（三）脑干听觉诱发电位的影响因素
影响ABR的生理因素包括耳蜗动脉的中断或痉挛，内外耳道听神经远端的撕脱。Ⅰ波或其他波的减少和消失分别可以导致所觉减弱和耳聋。体温对脑干听觉诱发电位的影响十分明显。体温降低可造成反应潜伏期和反应间期明显延长。此外，它同样受到手术室内各种电设备的电干扰。
ABRs一般不容易全身麻醉药物的影响。因此进行ABRs监测时并不需要改变麻醉方法。麻醉药物所引起的潜伏期的短暂延长并不具有临床意义，很容易与技术或生理原因导致的ABRs波形变化加以区分。
四、肌电图
EMG是通过放置针状记录电极到特定的肌肉或其附近，特续评估颅神经和外周神经。EMG不同于其他诱发电位监测，原因在于EMG信号不是通过故意刺激神经传导路某一特定点而产生的，相反，它是记录手术区域内的神经根所支配的肌肉群的自发EMG活动。其目的是探查手术区域肉的神经根是否有损伤。当手术器械触碰到神经根时，要容易观察到其所支配肌肉的EMG活动，小的神经激惹会导致暂时性肌电活动，但很快会消失，强烈的神经刺激会产生持续性肌电活动。
（一）术中肌电图监测的应证
1、颈椎和腰椎等脊柱手术；
2、听神经瘤、桥小脑角区和颅底肿瘤手术。
（二）肌电图监测的一般原则
通常情况下神经没有受到刺激时肌电图应该保持平直或安静，对神经的机械操作可能会导致神经活动。神经活动时间的长度取快于刺激的程度。短时间的刺激一般不会引起永久性损伤，频繁的或持续的刺激可能导致术后神经功能挡风伤。
术中使用手持式单极电刺激探测手术区域，或者使用单极或成对的电刺激器从可能受累的肌群记录肌电活动可以判断颅神经的功能（见表7-2）
（三）特殊神经功能的监测
1、第Ⅴ和第Ⅶ颅神经 面神经支配眼轮匝肌和口轮匝肌，三叉神经支配咀嚼肌（如咬肌和颞肌）。因此如果在这些肌中置入电极，就可以在肿瘤切除的过程中记录肌电图。对三叉神经的电刺激可以形成一个小于6ms的峰值潜伏期，根据这一点也可以判断哪条神经受到刺激。
2、第Ⅲ、第Ⅳ和第Ⅵ颅神经 第Ⅲ、第Ⅳ和第Ⅵ颅神经主要支配眼外肌。因此，在监测面神经和三叉神经功能时，如果监测电极置于或接近这些肌肉的部位，将会监测到支配这些肌肉的神经传导的肌电图。通过监测眼内直肌的功能可以监测第Ⅲ颅神经。监测眼外直肌的功能可以监测第Ⅳ颅神经，第Ⅵ颅神经，第Ⅵ颅神经的功能则主要依靠眼上斜肌的监测。由于空间有限，这些肌肉中只能置于单个的刺激电极，在未手术的另一侧置入参考电极。
3、第Ⅸ、第Ⅹ、第Ⅺ、和第Ⅻ颅神经 第Ⅸ颅神经的运动支功能监测主要依靠使用电极记录软腭的肌电活动。将电极置入声带可以监测第Ⅹ颅神经（迷走神经）的运动支的功能，但是电极的置入方法非常困难。因此，监测迷走神经的功能主要依靠在气管插管上贴附刺激电极与声带相联系，从而获电活动。副神经或第Ⅺ颅神经的功能监测相对非常简单，将电极置入斜方肌获得肌电图即可。将电极置入舌头就可以监测舌下神经或第Ⅺ颅神经的功能。舌下神经非常小但是很重要，因此一旦有任何因素影响了其功能，舌头处的刺激电极引出的肌电活动就会发生变化。进行所有颅神经功能监测时，必须注意肌电刺激的强度，如果强度过大，结果可能过度或造成损伤
（四）影响肌电图监测的因素
除神经肌肉阻滞剂（neuromuscular blockade，NMB）外，麻醉药物及术中其他生理学变化（体温、血压）对EMG几无影响。
五、推荐麻醉方法
EEG是监测脑功能最基本方示，是将脑自发性生物电放大记录而获得的波形图，它反映了在脑皮层锥体细胞产生的突触后电位和树突电位的整合，包括原始脑电图、计算机处理后脑电图和双频谱分析。术中脑电图是一个非常有效的评估脑功能活动的手段，给神经外科医师和麻醉医师以极大的帮助。通常麻醉前记录的是患者清醒、焦虚。、睁眼状态的脑电图，有肌肉紧张和眼球运动干扰，实施全麻诱导后，脑电图速改变，由快波形转为慢波形，并表现为维持地特定的麻醉状态下的形态。
（一）要中脑电图监测的应证
术中正确使用脑电图监测，可及时地了解大脑皮层功能和脑血流的状况，尽量减少脑功能的损伤，主要适证包括：
1、颅内动脉瘤暂时夹闭载瘤动脉
2、脑血管畸形手术
3、颈动脉内膜剥脱术
4、癫痫手术中判断癫痫灶部位
5、心肺转流术
6、颅内外旁路手术操作
7、指导滴定麻醉药物引发的暴发性抑制
（二）脑电图的基本组成
在人类，脑电波根据频率及波幅的不同，可分为α波、β波、θ波、δ波（见表7-3），一般来讲兴奋时脑电波快而波幅小，睡眠时脑电波较慢而波幅大，常见状态下的脑电图波形态如图7-4。正常成年人脑电波通常只有α波和波，而θ波和δ波多为病理波形。
（三）影响脑电图监测的生理学因素
1、脑血流和缺血缺氧 缺血缺氧早期β波短暂活性升高，随后出现高幅低频的θ波和δ波，β波逐渐消失，最后出现低幅的δ波。缺血进展期引起脑是活动抑制，偶发暴发性抑制。术中阻断血管时突然出现的δ波提示手术医师和麻醉医师有脑损害的危险。缺血半影区不足以产生电活动，因此脑电图对该区脑损伤的预示作用差。缺血性脑电图发生越快，不可逆损伤可能性越大。
2、血压 低血压会影响脑代谢，所导致的脑电图的改就通常为全脑性的，即两侧半球的脑电图均呈减慢节律，低电压变化。但应注意，出现阻断一侧颈总或颈内动脉导致一侧供血障碍时，对侧供血不充分，即使血压正常，也可造成局部或一侧脑缺血。特别应注意一侧性的局部变化。
3、体温 脑电图在低温时呈特征性演变，随温度的降低，开始为暴发性高幅慢波，进一步降温时，波幅和频率出进一步降低，然后进入相对静止期。
（四）影响脑电图监测的麻醉因素
1、术前药 绝大多数术前使用的镇静药在一定量时对脑电图的影响是相似的。低剂量时对脑电活动抑制较小，脑电波以快波为主；镇静剂量时，脑电图与嗜睡状态下相似；中度睡虑时可见到典型的睡眠纺锤波；患者深睡状态时，脑电图以深在慢波为主。
2、吸入麻醉药 吸入性麻药可使脑电图呈全脑慢波状态，在各类麻醉气体中，N2O对波形影响最大，应避免使用。术中监测脑电图通常采用异氟烷或七氟烷。
3、静脉麻醉药 除了氯胺酮外，多数静脉麻醉药对脑电图都呈剂量依赖性抑制，并可引起暴发性抑制。
（五）麻醉考虑
正己烷接触者神经电生理检测研究 篇5
1 资料与方法
1. 1 一般资料
正己烷接触者26 例, 男1 例, 女25 例, 年龄19 ~49 岁, 平均37. 6 岁, 均在鞋厂从事刷胶作业; 模拟现场空气检测正己烷浓度为215. 6 ~436. 5 mg·m- 3; 正己烷接触时间为1 ~4 年; 主要自述症状为头晕、头痛、乏力、恶心, 血常规、生化、肝肾功能等常规检查均未见明显异常, 尚未确诊为正己烷中毒, 就诊行神经电生理检测以协助诊断。正常对照组26 例, 均为女性, 年龄18 ~ 45, 平均36. 3 岁。
1. 2 检测方法
神经传导及针电极肌电图 ( EMG) 均使用丹麦Keypoint肌电图/ 诱发电位仪, 受检者皮温保持在30 ~35 ℃ , 每位受检者均常规检测四肢周围神经, 包括感觉神经传导 ( SNAP) 和运动神经传导 ( CMAP) 。双上肢SNAP使用环指电极逆向记录法, 正中神经置于第2 指, 尺神经于第5 指记录; 双下肢SNAP使用表面电极逆向记录法, 四肢CMAP使用表面电极记录。EMG检测包括拇短展肌、第一骨间肌、肱二头肌、胫前肌、股内侧肌。
1. 3 统计学处理
采用SPSS 11. 0 统计软件对样本进行t检验。
2 结果
2. 1 CMAP
所有受检者均检测双侧正中神经、尺神经、腓总神经、胫神经, 测量数据包括远端潜伏期、波幅、传导速度。其中远端潜伏期、传导速度与正常对照组相比差异无统计学意义 ( P > 0. 05) ; 左尺神经波幅较正常组降低, 差异有统计学意义 ( P <0. 05) 。见表1。
2. 2 SNAP
所有受检者均检测双侧正中神经、尺神经、腓浅神经、腓肠神经, 测量数据包括波幅、传导速度。传导速度: 正己烷接触者右正中神经、双侧尺神经、双侧腓肠神经与正常对照组相比均减慢, 其差异有统计学意义 ( P <0. 05 或P < 0. 01) ; 波幅: 正己烷接触者左尺神经较正常对照组下降, 差异有统计学意义 ( P <0.05) 。见表2。
2. 3 电流刺激
记录刺激右侧正中神经CMAP及SNAP时能引起最高稳定波幅电位再增加20% 的电流值, 即超强刺激电流。正己烷接触者CMAP平均电流量为24. 59 ±6. 50, 较正常对照组 ( 34. 8 ± 7. 21) 低 ( P < 0. 01) ; SNAP平均电流量为16. 92 ±3. 96, 亦较正常对照组 ( 21. 2 ±4. 13) 低 ( P < 0. 01) 。
2. 4 EMG检测
正己烷接触者肢体远端肌均可见高波幅运动单位, 近端肌运动单位形态基本正常。
3 讨论
正己烷长期职业性接触低浓度可致慢性中毒, 引起多发性周围神经病[1]。目前尚无明确的正己烷中毒诊断标准, 怀疑慢性正己烷中毒者, 须根据长期正己烷的职业接触史, 以及以多发性周围神经损害为主的临床症状、体征、以及神经肌-电图改变, 结合现场卫生学调查及空气中正己烷浓度测定等资料, 排除其他病因引起的周围神经病方可诊断。有报道, 工人在正己烷340 ~2 200 mg·m- 3空气浓度下最短2 个月、最长6 个月即可发生周围神经病, 我们检测26 例正己烷接触者均为鞋厂刷胶作业者, 未配戴手套及防毒面罩, 因此易通过呼吸道及皮肤吸收入体。正己烷引起的中毒性周围神经病主要侵犯周围神经的轴索, 肝微粒体中氧化为2, 5-己二酮等代谢产物, 此为原发性亲神经毒剂, 能与神经纤维内线粒体的供能糖酵解酶结合, 使其失去活性, 影响轴突内轴微运输失能性障碍乃至停滞, 引起局限性轴突肿胀、纤维变性及神经元性肌萎缩等病理变化; 另外还能直接与神经细胞内的微丝相结合而影响神经纤维的正常传导功能[2]。本组共26 例正己烷接触者, 神经电生理检测结果显示右正中神经、双侧尺神经、腓肠神经SNAP传导速度均较正常对照组减慢, 左尺神经CMAP、SNAP波幅均较正常对照组降低; 据此提示正己烷接触者神经损害主要存在以下几个方面: ( 1) 主要累及周围神经感觉纤维, 以脱髓鞘为主。 ( 2) 周围神经运动纤维轴索受累为主, 虽然正己烷接触者在运动神经传导检测里仅发现左尺神经波幅下降, 但EMG可见肢体远端所检肌高波幅运动单位, 提示周围神经运动纤维轴索均有轻度受累。CMAP检测的波幅主要反映神经干功能, 而EMG可以反映支配至肌肉的神经分支, 后者可以在更细微平面衡量运动神经功能是否有损害, 这与有关报道称暴露正己烷可引起以轴索变性为主的多发性神经病[3]相符。 ( 3) 本研究所检正己烷接触者EMG异常主要表现为轻收缩见高波幅运动单位, 嘱放松时所有病例均未见自发电位, 与有关文献[4]不同。 ( 4) 主要累及肢体远端神经。另外检测中发现以右侧正中神经为例, CMAP及SNAP所需电流量与正常组相比明显减少; 电刺激在神经传导的检测中是必不可少的, 常规使用皮肤电极电刺激作用于神经干上, 引起一个去极化和超极化, 逐渐加大电流可获得一个超强刺激下全部神经纤维兴奋起来的动作电位, 一般来说, 如有神经病变, 超强刺激需要更高的电流量; 而我们研究发现正己烷接触者超强刺激电流量较正常人小, 这可能与正己烷接触者神经应激阈值降低有关, 有待进一步研究。目前神经电生理检测所需表面电极受材料及信噪比等所限, 主要反映神经干功能, 期待有更多的技术如纳米铂黑修饰微电极阵列[5]等应用于硬件更新, 使神经电生理检测更敏感、更准确。
摘要：目的:探讨神经电生理检查对早期发现正己烷接触亚临床患者神经系统损害的作用。方法:对26例正己烷接触者及26例正常对照者进行神经传导及针电极肌电图检测, 每位受检者均常规检测四肢周围神经, 包括运动神经传导 (CMAP) 、感觉神经传导 (SNAP) 、针电极肌电图 (EMG) 。结果:神经传导检测中正己烷接触者左尺神经CMAP、SNAP波幅均较正常对照组降低;右正中神经、双侧尺神经、腓肠神经SNAP速度均减慢, 差异均有统计学意义;EMG中正己烷接触者组肢体远端肌均可见高波幅运动单位, 近端所检肌运动单位形态基本正常。结论:神经电生理检查可以早期发现正己烷对神经系统的损害, 对临床及时应用药物干预及治疗以提高患者生活质量有重要指导作用及意义。
关键词：正己烷,神经,电生理
参考文献
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电生理实验论文 篇6
目前, 电生理检查网络已在国内多家医院、社区等医疗单位实施, 并已取得了可喜的社会、经济效益, 有效提升了医院医护人员的工作效率和医疗质量, 但建设电生理检查网络是一个复杂的系统工程, 不仅涉及网络选择、数据库制定、图像格式统一等诸多问题, 而且根据医院的工作流程不同, 建立模式也随之进行相应的变化, 特别是作为军队医院, 安全是首要考虑的核心问题, 如何对数据在采集、传输、存储等过程中进行安全安全防护是建设电生理检查网络的关键, 因此, 建设好医院电生理检查网络我们应把握好以下几个方面。
1 网络的选择
电生理设备采用有线与无线连接解决方案, 使其具有远程会诊功能, 实现诊断中心与采集客户端、下级医院、救护车等的连接。有线方式包括网线、光纤、有线电话等, 但电生理检查设备一般采用移动模式, 因此无线方式是电生理检查网络的最佳方案。
无线网络技术发展迅速, 出现了一系列无线接入技术标准, 从无线个域网 ( WPAN) , 如蓝牙, 到无线局域网 ( WLAN) , 再到无线 城域网 ( WMAN) 和无线广 域网 ( WWAN) , 如第三代 ( 3G) 移动通信网络, 特别是现在已经向4G方向发展。相对于GSM移动通信方式, WCDMA在技术上有着多方面的先进性, 尤其在数据速率、传输功率等方面, 而且WCDMA终端具有更低的电磁辐射, 对人体的影响更小, 待机时间更长。利用WCDMA网络传送电、生理信号, 无论是在信号的可靠性方面还是在功能的扩展上, 都有着广阔的前景[2]。
医院无线网络的总体框架可以分为三大部分: 终端层、IP网络层和服务器集群。无线网络的覆盖设计采用的收发器, 利用10 /100 m以太网端口, 通过双绞线和骨干网络连接来实现的, 其要求是保证医院无线网络覆盖区域访问流畅。为了确保无线网络传输的可靠性与稳定性, 医院各楼层、各病区均应安装收发器。收发器通常安装在通道的吊顶处, 每个收发器的覆盖范围以15 ~ 25 m最佳, 在实现无线信号的全面覆盖的同时, 也要尽量减少重叠覆盖的区域。
2 电生理图机的选择
目前, 我国的电生理检查网络产品不多, 国外的电生理网络系统也还没有正式进入中国市场。现阶段成熟的电生理检查网络系统以麦迪克斯公司、嘉和美康信息技术有限公司等产品为主。最方便省时的一种方案是淘汰掉现有电、生理图机等电生理设备, 统一采用新的移动式电、生理图机、电生理设备和配套软硬件, 如软件平台。但此种方案会造成很大的浪费, 一般采用的方法是, 充分利用现有设备, 对现有设备进行改造, 使其具备数字接口, 成为系统的数字终端; 对于那些没有数字接口的过于老旧设备, 则可统一替换为手持式移动终端, 手持式心电图机硬件是PDA掌上计算机或专用平板计算机, 安装心电数字变压器、心电采集软件。临床医生或护士采集心电图, 采集结束后直接以无线的方式传输发送到心电图诊断中心; 而对于脑电图、运动平板等电生理设备, 则通过二次开发方式进行改造, 使其联入网络。
3 电生理检查网络模式的选择
根据医院规模和人员配备及资金预算等情况, 一般有两种选择模式。方案一为 “电生理中心诊断模式”, 设立电生理中心诊断室, 负责集中处理所有电生理病历的报告, 电生理中心诊断室一般设在电生理图室, 根据医院情况也可以设置在心血管内科, 主要包括诊断工作站、显示系统等; 采集终端负责采集数据, 然后通过网络把数据上传至数据中心, 主要包括电生理图机 ( 通常为移动式电生理图机) 和传输网络 ( 包括有线、无线网络) , 此种方案根据科室的地理位置划分, 一般为一个病区放置一台电生理图机; 浏览端一般采用B/S模式浏览图像。这种方案为通用模式, 但缺点是造价较高, 需购置移动式电、生理图机或对电生理图机进行改造, 铺设有线或无线网络, 此模式为未来发展方向。
第二种方案是建立 “电生理采集中心模式”。组建一支符合医院实际情况的电生理采集队伍, 负责在全院各个科室进行电生理的采集, 然后把数据传输至电生理诊断中心, 电生理图仪的数量视工作情况定。这种方案适用规模较小, 科室地理位置相对集中的医院, 优点是花费较少, 易于实现。
4 数据存储格式和传输协议的选择
由于心电图信息较为繁杂、心电图厂家众多、产品规格不一, 而且出于知识产权的自我保护意识, 每个厂家生产的电生理图机对采集的电生理信号都是经过压缩编码并加密的。另外还存在动态心电图、心向量、晚电位、心率变异等更深层次的心电图分析技术, 因此很难通过一种有效的标准和网络技术将其所有的心电产品以及心电检测内容包容在其内。因此直到目前为止, 国际上尚无权威的心电信息标准。
要实现多电生理网络的融合, 各厂家必须对各自的电生理信号进行解码, 获得原始数据, 并且考虑到存在空间和浏览等因素, 可以一种较为通用的格式进行统—存储。电生理图可以通过两种方式进行展现。一种是PDF或是图像格式, 显然这种格式只能用于浏览, 不能用于测量和诊断, 只能配置于一般的浏览工作站。另一种是直接的数据格式。目前系统的数据传输也具有多个不同的标准。现有的电、生理图传输标准有HL7a ECG数据传输标准, 医疗影像协会的DICOM3. 0标准, 美国FDA所指定的XML格式为构架的电、生理图传输标准等。从与HIS系统兼容性的角度考虑, 一般应用相对广泛的XML传输格式[3]。
5 信息安全体系的构建
服务器的安全从两方面考虑, 针对本地硬盘的硬件损坏, 服务器采用RAID技术; 针对其它硬件损坏可能带来问题, 设计采用双机热备或集群技术; 也可采用异地备份存储方式, 进行实时自动备份与定时自动备份, 将数据库构架以及内容全部备份。
为保证数据的安全, 一是使用具有硬件容错技术的NAS、SAN、以及磁盘阵列在线存储; 二是使用磁带或光盘进行备份存储, 离线保存所有数据; 三是对数据的访问设定严格的权限, 针对数据的修改、删除、访问等操作都要具有相应权限, 系统同时自动记录操作人、操作时间等信息, 明确对数据的任何一次操作的详细情况。
数据传输的方式主要为无线, 因此无线网络安全是本方案的核心, 首先是天线的合理选用和布局、合理配置AP发射功率, 再者是引入加密和认证机制, 其中常见加密方式有WEP加密、WPA加密。认证包括IEEE802. 1X验证、IEEE802111标准、WPAI等[4]。在我院实施过程中, 数据的传输基于自主开发的NFS技术, 不设置任何的开放式传输机制, 只能基于NFS的内部认证方可传输, 避免了数据在网络上被非法调用与修改[5]。
6 结束语
电生理检查网络系统涉及领域广泛、技术含量较高, 实施好项目需重点把握的要点较多, 除以上几点外, 还应关注电生理检查网络系统与医院HIS系统、PACS等系统的接口方式, 以及多种网络融合等问题。建设电生理检查网络是未来医疗技术发展的一个方向, 随着电生理、网络、数据存储等技术的不断更新换代, 我们需研究、把握的重点还会进一步深入和扩展。
参考文献
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[4]赵建超, 尹新富.校园无线网络安全综合防御[J].制造业自动化, 2011, 33 (2) :35-36.
电生理实验论文 篇7
该联盟自2010年8月6日在上海正式启动以来, 已签订了二个合作项目。一项是由复旦大学附属华山医院、上海理工大学、上海诺诚电气有限公司合作研发的“基于光学运动捕捉的步态分析与康复评价系统”;另一项是由复旦大学附属华山医院、上海市儿童医院、上海交通大学、上海理工大学、上海诺诚电气有限公司合作研究的“脑电生理数据存储标准-CDF的制定与相关产品”。
为加快研究进度, 联盟成员利用这一新的交流平台, 围绕上述合作项目积极开展活动。
2010年8月13日、9月1日在复旦大学附属华山医院花园大厅会议室举行了“基于语音/肌电混合控制的上肢功能康复训练系统”项目讨论会。8月26日在上海理工大学医疗器械与食品学院三楼会议室举行了“基于光学运动捕捉的步态分析与表面肌电”的项目讨论会;9月13日在复旦大学附属华山医院综合楼会议室举行了上海市2010年生物医药领域重点科技攻关项目“集成多信号检测分析和反馈电刺激的交互式康复评定和治疗系统”项目讨论会。与会期间, 各与专家紧紧把握项目的临床应用可行性、技术实现可行性和产业化可行性, 从各自专业领域进行深入讨论, 并确定项目下一步的分工安排和项目时间节点, 明确下一次讨论的时间和议题。
电生理实验论文 篇8
1 资料与方法
1.1 试剂和溶液的配制
试剂:胶原酶II,蛋白酶XIV,HEPES,Glucose,EGTA,牛磺酸和L-谷氨酸均为Sigma公司,其他试剂均为市售购买。无钙台式液(mmol/L):Na Cl 137,KCl 5.4,MgCl2.6H2O 1,Na H2PO40.33葡萄糖10,HEPES10,用Na OH调p H至7.40。KB液(mmol/L):KCl 40,KH2PO420,MgCl2.6H2O 3,L-谷氨酸50,牛磺酸20,HEPES 10,KOH 80,葡萄糖10,EGTA0.5,用KOH调p H至7.40。有钙台式液(mmol/L):无钙台式液中加1 mmol/L Ca Cl2.电极内液(mmol/L):KCl 130,MgCl2.6H2O 1,Na2ATP 3,EGTA10,HEPES 10,用KOH调p H至p H 7.20。细胞外液(mmol/L)Na Cl 140,KCl 5.4,Ca Cl2.2H2O 1,MgCl2.6H2O 1,Glucose 10,HEPES 10,用Na OH调p H至7.40,溶液均用纯氧饱和。
1.2 方法
1.2.1 单个小鼠心房肌细胞的分离
小鼠,昆明种,雌雄均可,体重20～45 g,由南京青龙山动物中心提供。按照图1所示的操作模式进行分离。小鼠后行颈椎脱臼断离脊髓处死,迅速开胸暴露心脏,取左、右心耳置于氧饱和的4℃无钙台式液中,轻压左、右心耳,清洗残留的血液;然后用眼科剪将心房组织剪成1 mm3小块,置于含有胶原酶II(1.5U/ml)和蛋白酶XIV(0.15U/ml)的无钙台式液中,于37℃水浴中30次/min摇床摇动;10～15 min后更换含有胶原酶II(1.5U/ml)的无钙台式液中继续消化,20 min后取出,组织块呈絮状,200 g/min离心5 min,弃去酶液,加KB液,将组织块轻轻吹打,使细胞松散脱离组织块;细胞悬液用200目滤网过滤,分离出单个小鼠心房肌细胞,KB液保存备用。
1.2.2 显微镜观察及复钙
分离出的单个心房肌细胞,在KB液中保存1 h后,200 g/min离心5 min,弃上清,采用梯度复钙使细胞钙离子终浓度为1 mmol/L,于倒置显微镜下观察。
1.2.3 小鼠心房肌细胞质量测定
台盼蓝排斥试验:吸取50 L的0.4%台盼蓝溶液,加入到50 L的心房肌细胞悬液中,充分混匀,室温放置5 min,吸取20 L细胞悬液置于血细胞计数板,在显微镜下观察心房肌细胞存活状况;如细胞未被染色,提示心房肌细胞存活,如细胞被蓝染,提示心肌细胞死亡。
1.2.4 膜片钳技术记录小鼠心房肌细胞钾电流
取细胞悬液加入细胞池中,静止10 min使细胞自然沉降、贴壁。采用美国AXON公司生产的Axopatch 200B放大器,全细胞膜片钳技术在电压钳模式下记录细胞膜钾电流。玻璃微电极(Sutter公司)经水平微电极拉制仪(P-97,Sutter公司)拉制,充灌电极内液后电阻值为2～4 MΩ,封接电阻达GΩ以上,破膜,形成全细胞模式,补偿快电容和慢电容,以-80 m V钳制电压钳制细胞,10 m V为阶跃,记录小鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)。以-40 m V钳制电压,10 m V为阶跃,记录小鼠心房肌细胞超速激活的延迟整流钾电流(Ikur)和快速激活的延迟整流钾电流(Ik1)。
2 结果
2.1 小鼠心房肌细胞的分离
参考Bustamante等人分离单个人心房肌细胞的方法,通过改良,调整消化酶的配方比例、选择适当的消化时间和消化温度,成功的分离出适合做电生理的单个小鼠心房肌细胞。光镜下观察,细胞呈梭状、细胞膜表面光滑、横纹清晰、两端边缘锐利、遮光性强、细胞无明显搏动(图2a),细胞成活率70%左右。经KB液保存1h,细胞外钙离子浓度恢复至1 mmol/L后,细胞仍能伸直舒展,呈现清晰横纹(图2b);后续膜片钳实验表明,该方法分离的单个小鼠心房肌细胞完全能够满足电生理实验的需求。
2.2 台盼蓝排斥试验结果
在有钙台式液保存4 h,细胞膜仍保持完整,经台盼蓝染色,死细胞蓝染,活细胞拒染(图3)。正常情况下70%以上的长梭状心房肌细胞拒染,提示细胞成活率达70%。
2.3 小鼠心房肌细胞钾电流记录
参考国外文献以及有关心肌细胞离子通道的记录方法[4],在全细胞模式下记录小鼠心房肌细胞钾电流。
2.3.1 小鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)
膜电位钳制在-80 m V,从-120 m V开始,每隔10 m V连续去极化至+100m V,持续时间500 ms,记录小鼠心房肌细胞瞬时外向钾电流(图4a)。
2.3.2 小鼠心房肌细胞超速激活的延迟整流钾电流(Ikur)
膜电位钳制在-40 m V,以10 m V增加,从-40 m V连续去极化至+100 m V,持续时间500 ms,记录小鼠心房肌细胞超速激活的延迟整流钾电流(图4b)。
2.3.3 小鼠心房肌细胞快速激活的延迟整流钾电流(Ik1)
膜电位钳制在-40 m V,以10 m V的阶跃刺激,使细胞膜电位从-120 m V连续去极化至+30 m V,持续时间500 ms,记录小鼠心房肌细胞快速激活的延迟整流钾电流(图4c)。
3 讨论
成年豚鼠、大鼠的心房肌细胞的分离普遍采用langendorff灌流方法。此方法分离的心肌细胞以心室肌细胞为主。因心房肌所占整个心脏的比例小,对消化终点的判断不准确,其分离的产量和质量很不稳定。小鼠心脏小,灌流不均匀,个体差异较大,消化程度更是难以掌握,较难获得满足电生理需要的高质量的心房肌细胞,而且小鼠单个心房肌细胞分离方法也较少报道。Bustamante等(1982年)首次报道了分离人单个心房肌细胞的方法,我们依据该方法进行改良,调整消化酶的配方比例、选择适当的消化时间和消化温度,经过多次实验,将胶原酶II和蛋白酶XIV的浓度分别调整到1.5U/ml和0.15U/ml,采用两步酶消化法,并且把两步总消化时间调整到30～35 min,成功的分离出30只小鼠的心房肌细胞。在实验过程中,以下三个因素会影响细胞的产量和质量:
(1)酶的浓度胶原酶II浓度过高分离的心房肌细胞多数是死细胞,过低则细胞数量少。当胶原酶的浓度调整到1.5U/ml时,能够得到大量的心房肌细胞。
只用胶原酶II分离的心房肌细胞膜表面不干净,有颗粒状物质,膜片钳实验中,不易封接,破膜较难,无法满足电生理的需要。加入适量的蛋白酶XIV,可以得到膜表面光滑、横纹清晰、生理活性良好的单个小鼠心房肌细胞。蛋白酶XIV的浓度以0.15U/ml为最好,当达到0.2U/ml以上时,所得心房肌细胞表面呈密集小泡,折光性差,在膜片钳实验中无法完成封接。
(2)温度在35℃温度时,酶消化时间将延长至1 h,虽能获得较高产量的心房细胞,但细胞表明不干净,细胞不易形成满意的封接阻抗。
(3)消化时间由于胶原酶II和蛋白酶XIV的类型不同,其酶活力也不同,根据酶的特点选择合适的消化时间。由于蛋白酶XIV作用较强,要严格控制消化时间,一般10～15min即可。然后再用胶原酶II,消化20 min。如果酶消化40min以上,细胞死亡较多,虽然细胞表面光滑,但细胞较脆,细胞还没形成GΩ以上封接,细胞膜就破裂。
采用本方法所分离的小鼠心房肌细胞易封接,易破膜,能够满足膜片钳实验的需要,并能记录到心房肌细胞膜上多种钾电流(Ito,Ikur,Ik1),所记录的钾电流具有典型的钾电流特征,证实了细胞的电生理活性[5,6]。
本实验以细胞形态、细胞活力和电生理功能相结合为指标,鉴定心房肌细胞质量。我们应用两步酶消化法,简单易行,节约时间和成本,重复性好。与Langendoff灌流法相比,本实验方法仅需要心房肌,其心室肌仍可用于做其他方面的研究。本方法的建立,为直接研究小鼠心房肌细胞在生理及病理情况下的电生理特性的改变提供了技术基础。
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电生理实验论文 篇9
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取本院自2012年4月至2013年12月间收治的自闭症儿童60例进行材料回顾性分析研究, 所选取的60例儿童患者, 男性占36例, 年龄为1~10岁, 平均年龄为 (5.1±2.3) 岁;女性占24例, 年龄在2~9岁, 平均年龄为 (4.6±1.9) 岁, 患儿出生时有惊厥史21例, 有窒息史患者有22例, 其中原因不明者有17例。患儿入选标准:符合DSMIII诊断标准, 且所有患儿均由儿童精神科医师进行自闭症行为评分检查, 按照自闭症测定量表 (CARS) 评分, 其评分的平均得分为 (42.40±3.90) 分和 (76.30±18.90) 分;排除标准:选取患者排除其他因素造成自闭症行为的精神失常, 在临床区分上容易混淆的临界状态患儿不纳入本次试验。
1.2 检测方法
1.2.1 BAEP检测
BAEP检测又被称为脑干听觉诱发电位检测, 检测过程中在环境安全屏蔽室中使用MEB-9000款诱发电位仪, 患儿口服药物为10%水合氯醛0.3~0.5 m L/kg, 让患儿熟睡之后再行检测, 将患儿头部中央Cz处位置记录为电极, 而参考电极则是置于同侧耳后乳突。通过双耳罩给予极性疏波刺激, 其刺激的频率为10 Hz, 强度大约为70 d B, 其中叠加次数为1500次, 而分析时间为10 ms。测试中先将BAEP听阀进行测试, 然后根据刺激从低到高, 将V波在最低强度时则定位听阀的阀值, 然后听反应阀值正常的则继续完成BAEP检查, 且每耳进行测试两轮, 对于无反应者可以加大刺激的强度, 另外最高的强度达到100 db, 然后将最佳的BAEP波形记录下来, 比较两侧耳间的各项指标差异。
1.2.2 EEG检测
对于EEG标记, 主要是采用8道智能的脑电图仪, 并且要按照国际要求放置电极, 通常按照FP2-F8, FP1-F7;F8-C4, F7-C3;C4-P4, C3-P3;P4-O2, P3-O1。高波的频率为50 Hz, 时间常数为0.3, 采用双导联和参考导联进行常规描记。
1.3 统计学方法
本次研究的所有数据均采用SPSS18.0统计软件进行处理, 计量资料采用均数±标准差 (±s) 表示, 计量资料比较采用t检验, 计数资料比较采用χ2检验, 以P<0.05为差异性有统计学意义的标准。
2 结果
经过本院的检查诊断 (表1) , BAEP检查之后表现正常例数为23例, 异常例数为37例, 则正常率为38.33%, 异常率为61.67%;EEG检查结果为正常例数为52例, 异常例数为8例, 则正常率为86.67%, 异常率为13.33%, 两种方法检测的异常率之间存在着显著性差异 (P<0.05) , 具有统计学意义。
3 讨论
针对当前国内的自闭症儿童的发病原因以及发病机制目前尚无明确的定论现状下, 在对其进行诊断时存在着困难, 对其进行治疗更是缺乏了标准指标, 而且更多的是依靠着主观的经验, 从而导致了治疗效果非常差。据相关数据统计, 自闭症儿童的发病概率在0.3%~0.6%之间, 而且随着国内外的相关研究, 发现自闭症患者其发病率还出现了明显上升趋势, 并且国内外的学者对于该病逐渐达成共识。由于目前对于该病的发病机制、发病的病理不清楚, 所以在诊断和治疗时往往会存在着问题, 对于患者治疗预后存在着严重的影响。人们对于自闭症的关注度越来越高, 从内外对于自闭症神经电生理方面的研究来看, 自闭症症状患者可能是由于脑干部位的感觉传入和信息传出障碍等因素造成。当前对于自闭症的描述主要是存在着社会交流质障碍, 其在言语沟通上存在着困难, 而且对于行为和兴趣的表达存在着僵硬、刻板、重复的问题[2]。随着学者对于自闭症的研究不断深入, 有一种环境因素造成自闭症患者论断出现。
自闭症儿童从生命周期的开始就与正常的环境不一致, 而且也不能像正常儿童那样与周围环境建立起关系。20世纪40年代的里敖·堪纳据此病的表现将其命名为孤独性综合征, 后来的美国人则又将其称为堪纳综合征, 他们认为自闭症发病于儿童早期, 儿童分裂症一般发病于儿童晚期或青少年早期阶段[3]。一般情况下, 被诊断为精神分裂症的儿童在出现幻想或幻觉症状之前若干年会显示出正常或接近正常的发展症状。然而, 被诊断为自闭症的孩子则不是这样, 而是从社会的交往、日常的行为沟通模式上进行评判, 所以对于自闭症的描述和研究种类很多, 不仅仅是一种描述。
从上个世纪六十年代开始, 有人认为了自闭症的症状是由于脑干部位的感觉传入和信息传出的障碍所致, BAEPI波是由于听神经动作电位, 而II波则是由于耳蜗神经核, III波是来自桥脑上橄榄复合体和斜方体, BAEPIV和BAEPV分别代表了外侧丘系和中脑下丘核。经BAEP检测发现, 自闭症可能导致原因是由于脑干的功能障碍[4]。在检查的过程中使用EEG安全可行、无创、简单, 可以从脑电图了解患儿脑户的生理和病理功能变化, 此方法得到了临床的广泛应用, 主要在癫痫、脑血管病、颅内感染、颅内肿瘤、肝性脑病、脑外伤、脑复苏、脑死亡以及睡眠障碍上都有了明确诊断。加上近年来对于脑电图的动态EEG视频、数字化的不断应用, 使得对自闭症儿童的EEG检测提供了有利的条件[5]。
经过本院的检查诊断, BAEP检查之后表现正常例数为23例, 异常例数为37例, 则正常率为38.33%, 异常率为61.67%;EEG检查结果为正常例数为52例, 异常例数为8例, 则正常率为86.67%, 异常率为13.33%, 两种方法检测的异常率之间存在着显著性差异 (P<0.05) , 具有统计学意义。针对自闭症儿童采用临床神经电生理变化研究, 使用的BAEP和EEG两种方法之间对于儿童患者的检查异常率之间存在着差异, 自闭症患儿BAEP异常可能与其自身的特性有关。
摘要：目的 研究自闭症儿童临床神经电生理变化特点以及方法。方法 选取本院自2012年4月至2013年12月间收治的自闭症儿童60例进行材料回顾性分析研究。对此60例患儿采用BAEP和EEG进行检查资料分析, 然后对比检查结果, 比较二者检查的异常率。结果经过本院的检查现正常诊断, BAEP检查之后表例数为23例, 异常例数为37例, 则正常率为38.33%, 异常率为61.67%;EEG检查结果为正常例数为52例, 异常例数为8例, 则正常率为86.67%, 异常率为13.33%, 两种方法检测的异常率之间存在着显著性差异 (P<0.05) , 具有统计学意义。结论 针对自闭症儿童采用临床神经电生理变化研究, 使用的BAEP和EEG两种方法之间对于儿童患者的检查异常率之间存在着差异, 自闭症患儿BAEP异常可能与其自身的特性有关。
关键词：自闭症,神经电,生理变化
参考文献
[1]林云强.自闭症谱系障碍儿童威胁知觉的实验研究[D].上海:华东师范大学, 2012.
[2]郭文斌.自闭症谱系障碍儿童面部表情识别的实验研究[D].上海:华东师范大学, 2013.
[3]邵阳.多模式神经电生理监测在颈前路手术中的应用[D].南京:南京中医药大学, 2013.
[4]Silva LM, Schalock M, Ayres R.A Model and Treatment for Autism at the Convergence of Chinese Medicine and Western Science:First 130 Cases[J].Chin J Integr Med, 2011, (6) :421-429.