酶的作用

酶的作用（精选11篇）

酶的作用 篇1

非淀粉多糖酶主要包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果胶酶和纤维素酶等, 能降解饲粮中NSP (非淀粉多糖) 的多聚体、消除NSP抗营养性。谷物饲料尤其是麦类及其副产物为主的饲料中含有较多的非淀粉多糖, 特别是可溶性非淀粉多糖 (SNSP) (主要为可溶性阿拉伯木聚糖和β一葡聚糖) , 具有较强的抗营养作用, 能够提高消化道食糜黏度、降低饲粮养分的消化利用率。在动物饲粮中添加非淀粉多糖酶, 可特异性降解饲粮SNSP, 降低SNSP的黏性, 同时提高饲粮养分的消化利用率、改善动物生长性能及动物健康状况。因此非淀粉多糖酶被广泛的应用于畜禽日粮中。本文就非淀粉多糖的应用效果及作用机制作一综述。

1 非淀粉多糖酶在畜禽饲料中的应用效果

1.1 提高养分消化率

许多研究发现, 在动物饲粮中添加非淀粉多糖酶, 可降解饲粮NSP, 提高能量、蛋白质和氨基酸等养分的消化利用率、改善饲料的营养价值。Rattay (1998) 在含17.1%NSP的生长猪饲粮中添加木聚糖酶 (4 000 IU/kg饲粮) 使总NSP、干物质、粗蛋白质、粗脂肪和粗纤维的消化率分别提高了4%、2.4%、4.7%、7.2%和10.3%。

Li等 (1996) 报道在28日龄仔猪小麦/大麦-豆粕型为基础的日粮中添加0.2%的β-葡聚糖 (1 000 U/g) , 改善了饲粮养分的粪和回肠消化率, 总能分别提高了3.07% (P<0.01) 和9.55% (P<0.05) , 干物质分别提高了2.13% (P<0.05) 和10.98% (P<0.05) , 有机物分别提高了2.18% (P<0.05) 和10.48% (P<0.05) , 粗蛋白分别提高4.71% (P<0.01) 和12.73% (P<0.01) 同时也提高了多种必需氨基酸的消化率。F O Omogbenigun (2004) 等也报道了在断奶仔猪日粮中添加以木聚糖酶为主的复合酶 (木聚糖酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、果胶酶) , DM、CP、GE和淀粉回肠及表观消化率都有显著提高。

1.2 改善生产性能

有关非淀粉多糖酶应用于畜禽日粮中改善生长性能的报道很多。尤其是在家禽日粮中添加NSP酶, 一致表现为提高生长性能。另外, 许多研究也发现在猪的日粮中加入以木聚糖酶和β-葡聚糖酶为主的酶制剂后, 猪的日增重显著提高、料重比显著降低。冯定远等 (1998) 在仔猪的玉米-豆粕型日粮中加入以木聚糖酶和β-葡聚糖酶为主的酶制剂后, 猪的日增重提高5.91% (P<0.05) 料重比比对照组降低3.41%, F OOmogbenigun等 (2004) 也报道在以小麦为基础的断奶仔猪日粮中添加以木聚糖酶为主的复合酶 (木聚糖酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、果胶酶) , 也能显著提高仔猪生长性能。俞沛初等 (2005) 报道在降低292 KJ/kg消化能的玉米-豆粕型的仔猪日粮中添加以木聚糖酶和β-葡聚糖酶为主的酶制剂后, 仔猪日增重和饲料转化率分别提高6.53%和7.25%。但, B G Kim等 (2004) 报道在玉米-豆粕型仔猪日粮中添加复合NSP酶对生长性能没有影响。这可能跟日粮原料组成、酶的活性及猪的消化道生理状态有关。

2 非淀粉多糖酶的作用机理

2.1 破坏植物细胞壁, 消除抗营养因子

畜禽饲料以植物性饲料为主, 植物细胞壁的结构复杂, 许多饲料即使经加工处理后, 仍不能破坏其细胞壁的完整性, 包埋在细胞壁内的许多可消化营养物质 (如蛋白质、淀粉等) , 由于不能与消化酶充分接触而不能被畜禽消化利用。非淀粉多糖酶可以通过降解存在于细胞壁的非淀粉多糖进而打破细胞壁的致密结构, 使包裹在里面的养分释放出来, 从而提高这部分养分的消化率。Dierick and Decuypere (1994) 研究发现, 添加木聚糖酶能引起细胞壁多糖降解, 减轻或消除NSP对养分的包被作用, 从而提高能量和粗蛋白在小肠近端的消化率。在含玉米和高梁的饲粮中, 应用木聚糖酶可成功地消化掉这些谷物纤维素壁, 从而将其中原来很难为动物所利用的养分释放出来。谭支良等 (l997) 研究表明, 米糠中添加戊聚糖酶后可使戊聚糖降解率达50%左右, 肉鸡代谢试验表明, 米糠中DM、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸性洗涤木质素的利用率分别提高了1.16%、3.17%、2.14%及7.29%。

2.2水解SNSP, 降低消化道内容物的黏度

在动物饲粮中添加非淀粉多糖酶, 可特异性降解饲粮SNSP, 降低SNSP的粘性。在小麦基础饲粮中添加主要含有木聚糖酶的酶制剂, 可使21日龄肉仔鸡肠道黏度由11.99 m Pa.s降至3.41m Pa.s。韩正康 (1996) 也报道, 在大麦饲粮添加0.1%粗酶制剂, 显著降低了空肠、回肠段食糜的黏度, 同时改善了养分的消化率, 干物质、有机物和蛋白质的消化率分别提高了4.75% (P<0.01) 、4.26% (P<0.01) 和6.21% (P<0.05) 。Fengler (1988) 进行体外研究发现, 纤维素酶降低了黑麦中水溶性木聚糖的黏性, 消除了水溶性木聚糖对养分吸收的阻碍作用。在降低食糜黏度的同时, 添加非淀粉多糖酶还能提高动物的生产性能。Camphell等 (1989) 发现, β-葡聚糖酶提高了饲喂低黏性或高黏性大麦饲粮肉仔鸡的生产性能, 而且大麦饲粮的黏性越高, 酶的添加效果越好。Bedford (1992) 认为即使在粘度只有5c Ps的饲粮中添加酶制剂 (木聚糖酶) 同样能改善营养物质的消化率。在低黏度的玉米和高梁饲粮中添加木聚糖酶仍然可观察到降低了肉鸡食糜的黏度。这为木聚糖酶应用于玉米-豆粕型饲粮中提供了理论基础。因此, 降低SNSP的黏性是饲粮中添加非淀粉多糖酶提高养分的消化与吸收、提高畜禽生产性能的重要作用机制之一。

2.3 影响消化道微生物区系

存在于消化道的黏性多糖导致小肠有害微生物的活动增强, 致使家禽生长缓慢。另外由于微生物的作用, 使胆汁酸与脂类微粒的结合减少, 从而影响了脂类的消化也是导致动物生长缓慢的原因之一。而肠道的固有菌群:乳酸杆菌、肠球菌、双歧杆菌、链球菌及梭状芽孢杆菌等也能降低胆汁酸与脂类微粒的结合。在这些细菌当中链球菌及梭状芽孢杆菌被证明对胆汁酸的结合影响最大, 所以这两种细菌被认为是对鸡的生长性能影响最大。R.M.Engberg等 (2004) 的研究表明:在小麦日粮中添加木聚糖酶, 回肠、空肠的乳酸杆菌增加而梭状芽孢杆菌数量明显减少。Yu等 (2002) 报道大麦日粮中添加非淀粉多糖酶能显著提高肉鸡盲肠总VFA含量。Choct等 (1996) 在饲喂小麦可溶性NSP提取物后, 肉鸡十二指肠和空肠存在大量的乙酸、丙酸和丁酸, 添加酶后只有少量的乙酸, 表明酶的添加能降低微生物在上部消化道的发酵。另外非淀粉多糖酶可以降低肠道疾病的发生率, 可能原因是非淀粉多糖酶降低了消化道食糜的黏性, 从而加快了食糜的排空速度、降低了消化道微生物的发酵、抑制有害微生物的生长。因此, 改变消化道微生物菌群也是NSP酶发挥作用的重要机制之一。

2.4 改善肠道的结构形态

小肠是营养物质消化吸收的主要部位, 小肠绒毛的发育与仔猪的生长性能有着密切的关系。大量的研究结果显示, 仔猪肠绒毛受损, 如:高度降低、隐窝深度增加、绒毛萎缩等, 就会引起消化道消化吸收功能下降、最后造成生长受阻。Southon等 (1987) 认为不易消化的非淀粉多糖可能会通过微生物间接的影响小肠壁的结构形态。Yasar等 (2000) 研究发现小肠壁形态结构的改善很可能跟添加NSP酶降低食糜黏度有关。N.Mathlouthi等 (2002) 研究证明, 采食大麦为基础日粮的肉鸡回肠绒毛高度、宽度及面积均显著低于采食以玉米为基础日粮组, 在大麦日粮中添加以β-葡聚糖酶和木聚糖酶为主的NSP酶提高了回肠绒毛与隐窝的比值。R.M.Engberg等 (2004) 在小麦日粮中添加木聚糖酶, 结果证明:减轻了肉鸡的回肠、空肠的相对重量。Yu等 (2002) 用去皮大麦替代玉米研究非淀粉多糖酶对肉鸡消化器官的影响也得到了相似的结果。可见日粮中添加NSP酶减少了黏性非淀粉多糖对消化道的损伤, 维持了肠道的正常功能。

摘要：本文阐述了非淀粉多糖酶在畜禽饲料中的应用效果, 即提高养分消化率和改善生长性能, 同时阐述了它的作用机理, 其中包括破坏植物细胞壁、降低消化道内容物的粘度、影响消化道微生物区系及改变消化道的结构形态。

关键词：非淀粉多糖酶,应用,作用机制

酶的作用 篇2

以下是查字典大学网小编精心为大家分享的?高三生物教学设计之酶的作用，让我们一起学习，一起进步吧!。降低化学反应活化能的酶——酶的作用

一、版本：人教版 高中生物必修1

二、设计内容：第5章 细胞的能量供应和利用 第1节降低化学反应活化能的酶(第1课时——酶的作用)

三、设计理念

在实施新课程中，需要构建与新课程理念相适应的教学策略。根据新课程理念，高中生物重在培养学生的科学思维、科学方法、科学精神等生物科学素养。使学生由以前的“学会”到“想学”再到“会学”，“引导──探究” 发现式教学法就是在这种理念下应运而生的，该教学法以问题解决为中心的学习方式。本节课以“引导──探究”科学发现的过程来学习科学研究的方法为设计理念。符合《基础教育课程改革纲要(试行)》的要求：“改变课程实施过于强调接受学习、死记硬背、机械训练的现状，倡导学生主动参与、合作学习、乐于探究、勤于动手，培养学生搜集和处理信息的能力、获取新知识的能力、分析和解决问题的能力以及交流与合作的能力”。该理念的运用有利于学生科学素养、协作精神的培养，有利于培养学生的创新精神和实践能力，有利于学生主动建构知识、发展能力、形成正确的情感态度与价值观。它不仅重视知识的获取，而且更加重视学生获取知识的过程及方法，更加突出地培养学生的学习能力。在问题的推动下、在教师的引导下，学生学得主动，学得积极，真正体现了“教为主导，学为主体”的思想。

四、教材分析 1.地位和作用

“降低化学反应活化能的酶” 第1课时——酶的作用，主要探讨酶在细胞代谢中的作用。该内容以第4章第3节物质的跨膜运输方式中的主动运输需要消耗能量以及初中生物学“消化”为基础。学习本节利于“细胞代谢的学习”，利于选修模块中有关酶的应用、微生物发酵、蛋白质提取和分离等知识的学习。2.教学目标

(1)知识目标：说明酶在代谢中的作用(ⅰ)。

(2)技能目标：进行有关的实验和探索，按所设计的实验方案和步骤，正确完成相关的实验操作。学会控制自变量，观察和检测因变量的变化，以及设置对照组和重复实验(ⅱ)。(3)情感目标：①评价自己的实验结果，②参与交流，听取别人的正确意见，维护或修改自己的方案和意见。3.过程与方法

通过“比较过氧化氢在不同条件下的分解”实验，感悟酶作为催化剂特点，及控制变量的方法。利用教材上形象、直观的图解和文字说明，让学生明确催化剂可降低化学反应的活化能。

4.确定教学重、难点及解决方法 教学重点：酶的作用。

[解决方法]利用学生对无机催化剂的知识基础切入，引入酶的学习。通过实验、资料分析得出酶的作用。自然界中的生命现象都与酶的活动有关，活细胞内全部的生物化学反应都是在酶的催化下完成的。在人体内，大约每分钟要发生几百万次的化学反应，这么多的化学反应之所以能在常温、常压下进行，完全是因为酶的作用，酶是一种什么样的物质?在化学反应中是怎样起作用的?显然应是本节课内容的重点。教学难点：①酶降低化学反应活化能的原理。②控制变量的科学方法。

[解决方法] ①利用教材上形象，直观的图解和文字说明，让学生明确催化剂可降低化学反应的活化能。②通过比较过氧化氢在不同条件下的分解实验，感悟酶作为催化剂特点，及控制变量的方法。活化能这个名词在高中生物教材体系中是第一次出现，无论是学生还是教师对这个名词都很陌生。化学反应之所以能进行，就是达到反应所需的活化能。在酶的作用下，原来不能进行反应的物质发生了反应，是增加了反应物的自由能，还是降低了反应所需的活化能?通过实验和类比，必需要让学生理解。在过去几年的高考中，虽然出现了实验设计，但在教材中没有关于控制变量的内容，在本节教材介绍了控制变量的系列名词，但对刚刚接触高中生物实验的学生而言，不能说不是一个难点。

五、设计思路

从物质跨膜运输方式──主动运输需要能量入手，引出第5章细胞的能量供应和利用。再从教材提供的问题探讨──斯帕兰札尼研究鹰的消化作用进入学习情境，是有趣的，并能和学生已有经验──对消化酶的了解结合起来。利用学生对无机催化剂的知识基础切入，引导学生进入新课学习。既然学生们知道无机催化剂的作用，就让学生通过比较实验来认识酶的催化作用以及与无机催化剂的差别。教师在安排学生做实验时要注意学生对实验的理解，落实好本节课的目标。本节课的实验需要设置实验组和对照组，建议教师利用直观的手段(绘图或电子幻灯等)将实验的装置特别是实验组和对照组的装置分别向学生展示，以增加学生实验操作和讨论的效率，或者采取分组实验进行实验讨论(此法效果很好)。在学生获得感性知识的基础上要求学生体会什么是自变量、因变量、无关变量以及什么是对照实验，再通过对实验中自变量改变训练学生在实验设计中如何控制变量。显然，这种编排有助于引导学生学会确认和控制变量，有助于培养学生的科学探究能力。

学生通过亲身感知酶的作用，顺理成章引入酶在化学反应中能够降低化学反应的活化能知识点。教材利用卡通式插图、图解和文字叙述，指出酶能够显著降低化学反应所需的活化能。通过形象、直观的图解和文字说明以及绘制“没有催化剂、无机催化剂、酶的催化效率曲线”的比较，进一步让学生明确催化剂可降低化学反应的活化能(酶催化作用更加显著)，利于学生理性认识。

六、教学用具：ppt幻灯片、实验材料、器材

七、课前准备：分组实验(“比较过氧化氢在不同条件下的分解”)材料用具的准备;ppt课件制作。

八、教学过程： 教学步骤 教师活动 学生活动 设计意图(一)引入

复习：物质跨膜运输中的主动运输需要的条件?(细胞的主动运输需要能量。细胞内有机物的合成需要能量。肌细胞的收缩需要能量……细胞作为一个基本的生命系统，只有不断输入能量，才能维持生命活动的有序性)。(太阳能是几乎所有生命系统中能量的最终源头。外界能量输入细胞，并为细胞所利用，都要经过复杂的化学反应)。“几乎”一词留有余地，不绝对，应引起学生的注意。问题1：鸟类的消化系统的组成?消化分为几类及其主要场所在哪里? 问题探讨—ppt展示意大利科学家斯帕兰札尼的实验。提出问题：

问题2：这个实验要解决什么问题? 问题3：是什么物质使肉块消失了? 问题4：与外界的化学反应相比，生物体内的化学反应有什么特点?(条件温和、效率高);问题5:在学习化学知识中，我们为了让一些化学反应更容易地进行，会使用催化剂，那无机物催化剂和生物体内的催化剂在反应条件上，效率上有什么区别呢? 在化学课上，我们知道，有些化学反应容易进行，有些化学反应需要添加某种物质之后并且可能需要在特定的环境中才能进行。这种能够促进化学反应进行的物质，叫催化剂。细胞中的化学反应比起同学们在化学课上所学的反应要复杂得多，而且有些反应在细胞外，单纯用无机化学的手段是无法进行的，而在细胞内却可以快速地顺利地进行。这是为什么呢?(教师注意引导分析，答对的要肯定、鼓励、赞扬;答错的也要保护学生的积极性。)对于生物体来说要进行的生理活动非常之多，构成生物体的每一个细胞物质需要不断的合成和分解，不断地处于自我更新的状态，这种自我更新完全依赖于细胞内的发生的生物化学反应，每一个化学反应都伴随能量变化。阅读、识图

思考讨论。理解细胞是一个生命系统，内部有分工合作的各种结构，这些结构是有序的，而这些结构的成分需要不断地更新，这就需要不断地从外界输入能量，否则，细胞内部分工合作的有序结构将被破坏，最终导致细胞死亡。回忆初中知识，阅读问题，探讨内容，进行相关的讨论 思考教师提出的问题。学生回答，学生评价。讨论、归纳、总结

引导学生阅读、识图。注意把握对加点词的理解和解释。“生命活动的有序性”是一个深奥的道理，在这里不必做详尽的解释，否则将限入泥潭。只需简要说明即可。目的是利用学生已有的知识去解答“问题探讨”。以此激发学生强烈的求知欲。

思维热身。引导学生分析说明。

通过学生已有的经验(化学知识)引导学生构建新的知识。让学生通过实例进行“细胞代谢”概念建构(二)细胞代谢

细胞内的环境是一个常温常压下的状态，在这种环境下化学反应却能高效有序地发生，即细胞代谢。而细胞代谢应该有适合的生物催化剂——酶。引导学生产生疑问：酶在细胞代谢中起了什么作用?究竟是怎样起作用的呢?(三)酶在细胞代谢中的作用─“比较过氧化氢在不同条件下的分解”

通过细胞代谢中产生的有害物质过氧化氢在不同条件下的分解实验来解决这些问题。

方案：指导学生阅读，设计实验观察表格，分组完成实验。讨论问题：

问题1：2号管发生了什么现象，说明了什么? 问题2： 3、4号管中，fecl3和过氧化氢酶起了什么作用。(说明催化剂并没有并没有提高分子的能量，而是把发生反应所需要的活化能降低了)问题3： 3、4号管中，哪个反应速度快?说明什么问题?(说明酶具有高效性)问题4：这个实验的结论? 通过实验你还能提出什么问题? 学生可能提出以下的问题： ①该实验的原理是什么? ②这个实验为什么要选用新鲜的肝脏? ③为什么要将肝脏制成研磨液? ④滴入肝脏研磨液和氯化铁溶液时，可否共用一个吸管?为什么? ⑤实验的关键是什么?判断依据是什么? 阅读相关的课文内容，设计表格;学生进行分组实验。

师生共同分析总结：表格的设计;记录实验结果。

展开讨论，并回答问题。完成探究活动，并进行交流和表达.讨论

采取同伴互助：一学生提出问题，由其他学生解答。培养学生阅读、理解能力及对知识转化能力。培养小组协作精神、交流与合作能力。培养学生发现问题、解决问题的能力。控制变量 自变量 因变量 无关 变量 对照组 实验组

2号：90℃水浴加热 3号：加入3.5% fecl32滴 4号：加入20%肝脏研磨液2滴

h2o2分解速度用产生气泡的数目多少表示

加入试剂的量;实验室的温度;fecl3和肝脏研磨液的新鲜程度。1号试管 2、3、4号试管

控制变量：讲解教材p79相关内容，让学生了解实验设计的原则。

讨论：指出“比较过氧化氢在不同条件下的分解”实验中自变量、因变量、无关变量、对照组、实验组。

问题1: 自变量中fecl3如果改成滴加8滴则实验结果如何?是否违背对照实验设计原则? 问题2: 自变量,无关变量能否发生转变? 小组合作讨论 小组合作讨论

知识难点采取小组合作学习方式,利于难点突破.对学生进行求异思维训练.活化能 归纳小结

引导：试管2产生气泡较多是因为加热所致，加热使h2o2分子得到了能量，从常态转变为容易分解的活跃状态。我们把这种转变所需要的能量称为活化能。ppt展示:h2o2分子由常态形成活跃状态.思考分析：

问题1.汽油在常温下会不会自发地起火?为什么?(在高温下,少数汽油分子获得了一定的能量而被活化,才能发生氧化反应.)问题2.为什么铁和过氧化氢酶能提高过氧化氢的分解反应的速率呢? ppt展示教科书图5-1.问题1:在20℃测得的过氧化氢分解的活化能,从图中你能得出什么结论? 条? 件

没在催化剂催化 用胶状铂催化 用过氧化氢酶催化 活化能/kj·mol-1 75 54 29 问题2:请将教科书图5-2在坐标中绘制出来.问题3:请在同一个坐标中绘制”无催化剂、无机催化剂、有酶催化三种条件下分解等质量h2o2曲线图”。阅读教材，结合实验，加深对活化能这一概念的理解。讨论 学生归纳

难点通过动画形象的多媒体演示让学生在愉快中理解概念.注重与现实生活的联系。培养学生图形转换能力.培养学生比较、归纳能力.构建系统知识 练习反馈

(教师按照ppt上试题难度排成第一关、第二关、第三关、第四关、第五关，让学生自由闯关)。培养学生应用知识解决问题能力。

酶的作用 篇3

关键词：甘薯；黑斑病；几丁质酶；核黃素；脱乙酰几丁质

中图分类号：S435.313+.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0106-03

甘薯（Ipomoea batatas）是仅次于水稻、小麦和玉米的重要粮食作物，甘薯叶被世界卫生组织确定为最佳蔬菜^[1]。甘薯产乙醇能效高、无污染，是生物能源的理想材料之一。甘薯黑斑病（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）是危害甘薯的主要病害，在甘薯的种植和储藏过程中均有发生^[2]。目前对于甘薯抗黑斑病的研究多集中在筛选抗病品种和杂交育种方面^[3]，对于甘薯抗黑斑病机制方面的报道很少^[4-5]，研究也不深入。植物病程相关蛋白（pathogenesis-related protein，PRs）是植物体内被病原菌等刺激物刺激产生的一类蛋白质，正常情况下含量并不高，一旦被诱导，含量迅速增加，从而提高植物对病虫害等逆境的防御能力^[6]。植物几丁质酶被认为是一类与植物抗病有着密切关系的病程相关蛋白。它参与了植物体内防御机制^[7-8]，在外界刺激物的刺激下可使植物体内本身含量较少的酶迅速积累。诱导物分为两大类，一类为生物性的刺激物，包括细菌、真菌、病毒类或者真菌细胞壁降解物^[9-10]，另一类为非生物性的刺激物，包括机械损伤、虫伤、脱乙酰几丁质、乙烯、水杨酸、紫外光、重金属盐等。通过诱导物来诱导甘薯几丁质酶含量上升和活性提高的研究未见报道。本试验研究了核黄素和脱乙酰几丁质对甘薯块根几丁质酶诱导作用，旨在为生产上防治甘薯黑斑病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试甘薯品种为南京-92（高抗黑斑病）和烟台-252（高感黑斑病），甘薯黑斑病病原物，均由中国农科院甘薯研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 黑斑病菌孢子悬液的制备 黑斑病菌孢子悬液的制备按照王景景等的方法^[4]进行。

1.2.2 薯块接种 选取两个品种正常无病斑的薯块，用自来水冲洗干净，再放入0.1%的次氯酸钠溶液中，表面消毒 10 min，用蒸馏水冲洗3次。将块根切成约1.0 cm厚的圆片，将0.1 mL黑斑病菌内分生孢子悬液涂在块根圆片的表面，放置于28 ℃恒温箱中培养，以蒸馏水涂抹块根圆片的作为对照组。

1.2.3 几丁质酶的提取和活性测定 分别取两个品种染菌后的甘薯块根各0.5 g，加4 mL 0.02 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.5），冰浴研磨，定容至5 mL，4 ℃ 8 000 r/mi，离心15 min，上清液为待测酶液。几丁质酶活力测定参照Boller等方法^[11]进行。酶活定义：以每小时分解胶体几丁质产生 1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为1个酶活力单位（U/mL）。

1.2.4 甘薯几丁质酶体外抑菌试验

采用琼脂扩散法来检测甘薯几丁质酶体外抑菌的效果^[12]。PDA培养基冷却后，用灭菌后直径 7 mm的打孔器在平板上均匀打出6个孔洞。用无菌牙签挑出琼脂柱。在每个孔中加入少量未凝固的PDA封住孔底部，约2 mm厚度。然后将20 μL无菌酶液以及稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 的酶液分别加入孔中，最后用新的灭菌后的打孔器在活化好的待试菌种培养基上打一个菌饼，将其倒贴于加过菌液的培养基正中央，28 ℃培养箱中倒置培养4 d。通过比较病斑大小来判定几丁质酶的抑菌效果。检测对象为甘薯黑斑病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌。

1.2.5 核黄素和脱乙酰几丁质处理

脱乙酰几丁质原液的制备按王荣娟^[13]的方法进行。

将3 mL核黄素（1 mmol/L）和脱乙酰几丁质（1 mg/mL）均匀涂抹在薯块的表面，然后将薯块放入培养皿中，30±1 ℃暗箱中保温。试验各处理均设3次重复。数据采用SPSS Statistics软件进行统计分析。P<0.05（用*表示）为显著性差异，P<0.01（用**表示）为极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 黑斑病侵染对不同抗性甘薯块根几丁质酶活性的影响

黑斑病对2种不同抗性甘薯块根内几丁质酶活性的影响见图1。从图1可以看出，未接种黑斑病菌时，南京-92和烟台-252块根中几丁质酶活性差异不显著。接菌后2个品种几丁质酶活性上升，于接菌后6 d达到最大值，而高抗品种南京-92块根几丁质酶活性增加速度高于高感品种烟台-252。差异分析表明，染菌4 d和8 d时南京-92块根几丁质酶活性显著高于烟台-252，2 d和6 d时两甘薯品种几丁质酶活性差异极显著。

2.2 甘薯几丁质酶对3种真菌的抑制作用

检测了甘薯几丁质酶对甘薯黑斑病菌、小麦赤霉病菌和水稻纹枯病菌的抑制作用（图2）。通过比较抑菌圈的大小可以看出：甘薯几丁质酶液（100）和稀释成10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5 的酶液对甘薯黑斑病菌（图2-A）有较明显的抑制作用，对小麦赤霉病菌（图2-B）和水稻纹枯病菌（图2-C）的抑制作用较小。

2.3 核黄素对不同抗性甘薯几丁质酶活性的影响

经核黄素处理后，2种不同抗性甘薯块中几丁质酶活性均呈现升高的趋势（图3）。高抗品种南京-92几丁质酶活性的上升幅度比高感品种烟台-252大，且在整个处理期间南京-92几丁质酶活性高于烟台-252。处理4 d和6 d时，南京-92几丁质酶活性是烟台-252的213.9%和175%。显著性分析表明，处理2 d和8 d时2个甘薯品种几丁质酶活性差异显著；处理4 d和6 d时2个甘薯品种几丁质酶活性差异极显著。

2.4 脱乙酰几丁质对不同抗性甘薯几丁质酶活性的影响

脱乙酰几丁质能提高甘薯几丁质酶的活性（图4）。比较2个抗性不同甘薯品种几丁质酶活性的变化可以看出，南京-92几丁质酶活性的上升速度快且活性高于高感品种烟台台-252的221.9%和158.9%。显著性分析表明，处理2 d时2个甘薯品种几丁质酶活性差异显著；处理4 d、6 d和8 d时2个甘薯品种几丁质酶活性差异极显著。

3 讨论

几丁质是真菌细胞壁的主要成分，几丁质酶的底物为几丁质，因此植物几丁质酶能够直接降解真菌细胞壁，抑制真菌孢子萌发和菌丝生长，从而达到抑制真菌病害的作用^[14]。本试验结果验证了甘薯几丁质酶是一种诱导酶^[15-16]。未感染黑斑病时，高抗和高感薯块内几丁质酶活性都很低，并且差异不显著；受黑斑病菌感染后，两个品种薯块能够迅速积累几丁质酶来水解黑斑病菌的细胞壁，抑制菌丝的生长，高抗品种甘薯块内的几丁质酶比高感品种积累的量多，几丁质酶活性在处理 2 d 和6 d时达到极显著差异，说明几丁质酶对于甘薯抵抗黑斑病的侵染具有重要作用。抑菌试验进一步证明了甘薯几丁质酶对甘薯黑斑病有较强的抑制作用。

几丁质酶是重要的病程相关蛋白，能够分解β-1，4键形成的线性几丁质，几丁质酶活性能够在抗性诱导过程中显著增强^[17]。研究表明，核黄素作为非专化激发子可以诱导植物产生系统获得抗病性^[18]。脱乙酰几丁质主要存在于海洋生物、昆虫的甲壳中，研究表明，脱乙酰几丁质能诱导植物提高抗病性[13，19]。本研究结果表明，核黄素和脱乙酰几丁质处理能提高甘薯块根几丁质酶活性，高抗品种酶活性高于高感品种，几丁质酶活性的上升有助于提高甘薯对黑斑病的抵抗能力。这与以玉米、番茄、苹果为试验材料的结果一致^[20-21]。本研究结果为生产上防治甘薯黑斑病提供了一种可行的方法。

参考文献：

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酶的作用 篇4

关键词：复方毛冬青颗粒,细胞色素P450酶,诱导

本研究观察复方毛冬青颗粒对大鼠细胞色素P450酶的诱导作用, 现报告如下。

1 材料与仪器

1.1 试药

复方毛冬青颗粒 (广州市妇女儿童医疗中心医院制剂, 委托广州市康源药业有限公司生产, 粤Z20070810) ;非那西丁 (PHE) 、对乙酰氨基酚 (PAR) 、甲苯磺丁脲 (TOL) 、4-羟基甲苯磺丁脲 (OHTOL) 、奥美拉唑 (OME) 、5-羟基奥美拉唑 (OHOME) 、右美沙芬 (DEXM) 、氧去甲基右美沙芬品 (DEXP) 、氯唑沙宗 (CHL) 、6-羟基氯唑沙宗 (OHCHL) 、硝苯地平 (NIF) 、氧化硝苯地平 (DNIF) 、氯雷他定 (内标, LOR) 购自美国Sigma公司;NADPH tetrasodium salt购自德国AppliChem公司;甲醇、乙酸乙酯为色谱纯购自美国Tedia公司;水为超纯水。

1.2 仪器

Finnigan TSQ-QUANTUM型液相色谱-质谱系统 (电喷雾离子化源、Surveyor输液泵及自动进样器以及Xcalibur 1.3数据采集软件、Lcquan数据处理软件) (Finnigan, USA) ;Avanti J-E型高速离心机 (Beckman 德国) ;Optima LE-80K型超速离心机 (Beckman 德国) ;Ultra-turrax T8组织匀浆机 (IKA 德国) 。

1.3 动物

SPF级 Sprague-Dawley 大鼠, 雄性, 体质量 220～ 250g, 广东省实验动物中心提供, 质量合格号:0081410。大鼠置于 (20±1) ℃控温和光暗周期为12h的环境下, 给予清洁级普通大鼠饲料饲养。

2 方法与结果

2.1 动物处置与肝微粒体的制备

SD大鼠随机分为4组, 每组6只。复方毛冬青颗粒组:设低、中、高3个浓度, 分别为0.5、2.0、6.0g·kg-1·d-1, 溶于适量0.9%氯化钠溶液中 (1ml/100g) ;空白对照组:等量的0.9%氯化钠溶液。灌胃, 1次/d, 连续7d。大鼠均存活。末次给药后禁食, 自由饮水, 24 h后断头处死, 立即取出肝脏, 按照差速离心法制备大鼠肝微粒体[1]。取适量肝脏称重, 剪碎, 用冰冷的蔗糖溶液洗涤数次至没有血色后按1∶2体积比制成匀浆, 在16000g, 4℃离心20 min;取沉淀用焦磷酸钾溶液洗涤1次, 混悬均匀, 再次100000g, 4℃离心60min。弃上清, 沉淀用2倍的含20%甘油的Tris-HCl缓冲液0.1mol/L Tris, 0.1M Tris重悬, -80℃保存备用。

2.2 CYP450酶活性的测定

大鼠6种CYP亚型的活性通过以下特异性底物 (探针) 的反应, 用代谢物的生成速率来表示。CYP1A2:非那西丁氧去乙基化反应生成扑热息痛;CYP2C6:甲苯磺丁脲4-羟基化反应生成4-羟基甲苯磺丁脲;CYP2C11:奥美拉唑5-羟基化反应生成5-羟基奥美拉唑;CYP2D2:右美沙芬氧去甲基化反应生成氧去甲基右美沙芬;CYP2E1:氯唑沙宗标6-羟基化反应生成6-羟基4-羟基化反应生成4-羟基;CYP3A1:硝苯地平氮去氢反应生成氧化硝苯地平。大鼠的2C6、2C11、2D2、3A1分别对应人的2C9、2C19、2D6、3A4。根据作者建立的“cocktail”孵育模型[2]来测定CYP450酶的活性:孵育体系总体积500μL, 包含肝微粒体蛋白 (0.25 mg/ml) , 磷酸盐缓冲液 (0.1mol/L, pH 7.4) , 10、100、5、2.5、20、5μmol/L PH、TOL、OME、DEXM、CHL、NIF, 37℃水浴预孵育5min, 加入NADPH (1mmol/L) 启动反应, 20min后, 加预冷的乙酸乙酯2ml终止反应, 同时加入内标工作液 (氯雷他定10 mol/L) 10μl, 旋涡振荡2min, 静置10min, 3500rpm离心10min, 转移上层有机相至另一离心管中, 于真空干燥器中挥干, 残渣用甲醇:超纯水 (80:20, v/v) 500μl复溶, 涡旋混合1min, 15000rpm离心5min, 取上清液, 进样10μl。LC-MS/MS定量分析生成的6种代谢物对乙酰氨基酚、4-羟基甲苯磺丁脲、5-羟基奥美拉唑、氧去甲基右美沙芬、6-羟基氯唑沙宗、氧化硝苯地平以及内标氯雷他定。

2.3 色谱与质谱条件

LC-MS/MS方法学已另文发表[1], 简述如下。

2.3.1 色谱条件

色谱柱:C18 XTerra MS 分析柱 (5μm, 100×2.1mm.Waters, USA) ;正离子监测:流动相为甲醇:水 (含0.1%甲酸) (70:30, v/v) ;负离子监测:流动相为甲醇:水 (含0.1%甲酸) (90:10, v/v) 。流速均为300L/min, 柱温为室温。

2.3.2 质谱条件

电喷雾电离源 (ESI) ;电喷雾电压ESI+为3500V, ESI-为3500V;加热毛细管温度为350℃;鞘气 (N2) 压力为15psi, 辅气 (N2) 压力为1 psi, 碰撞气 (Ar) 压力为1.0 mTorr;扫描峰宽为0.7Th;扫描时间为0.1s。扫描方式为选择反应监测 (SRM) , 定量监测的母离子、子离子以及碰撞能量见表1。

2.4 复方毛冬青颗粒对大鼠6种CYP450亚型活性的影响

不同处理组制备的大肝微粒体按照2.2项孵育并分析, 每个样品平行做3管。各组CYP450酶亚型的活性见表2。结果显示复方毛冬青颗粒能明显的诱导大鼠肝脏CYP1A2和CYP2E1的活性, 且呈剂量依赖性:0.5、2.0、6.0 g·kg-1·d-1 3个剂量组使CYP1A2的活性分别增加了55.9%, 93.4%, 176.4%;使CYP2E1的活性分别增加了16.1%, 60.4%, 111.3%。复方毛冬青颗粒对其他亚型没有影响。

注:与空白对照组比较:*P<0.05

3 讨论

复方毛冬青颗粒是我院自制制剂, 应用广泛, 通常会中西药联合应用, 但随着研究的深入, 因为中药-西药相互作用所导致的不良反应越来越引起人们的重视, 例如银杏叶提取物能影响华法令、奥美拉唑等的疗效[3]。药物间相互作用一般分为药动学相互作用和药效学相互作用两大类, 其中最主要的是由肝微粒体细胞色素P450酶所介导的。因此, 本实验研究了该药对大鼠细胞色素P450酶上述6种亚型的影响, 旨在考察与其他药物发生代谢性相互作用的可能性。在中药现代化研究中, 明确哪种成分是其药理活性的物质基础十分重要, 因此, 研究复方毛冬青颗粒主要活性单体及其基础与临床实验是今后的重点方向。

参考文献

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[2]和凡, 赵立子, 毕惠嫦, 等.6种细胞色素P450酶雅兴特异性底物的酶动力学研究[J].中国药房, 2009, 20 (17) :1310.

二酶的特性 教学案 篇5

唐山市迁西县第二中学 裴金利

【教学目标】

1、知识目标

（1）理解酶在细胞代谢中的特性。

（2）理解影响酶活性的条件。

2、能力目标：

4、实验设计

（1）实验预期：根据自己作出的假设，预期会看见怎样的实验结果？并做记录。

通过实验，掌握酶的活性受温度、PH值的影响。

3、情感目标：

通过实验，感受科学的严谨性。【教学重点】

影响酶活性的条件实验、酶的特性。【教学难点】

影响酶活性的条件实验。

【教学用具】PPT课件、多媒体、教学案

【教学方法】结合学案进行教学，主要采用自学指导法、分组讨论法、练习法、演示法讲述法等。【教学时数】2课时

第一课时

一、酶的高效性

大量实验证明，酶的催化效率大约是无机催化剂的__________倍。

二、酶的专一性

每种酶只能催化___________化学反应，如过氧化氢酶只能催化过氧化氢的分解，脲酶只能催化尿素的分解。细胞代谢能够有条不紊地进行，与__________是分不开的。

三、探究影响酶活性的条件

酶活性：酶对化学反应的催化效率称为酶活性。

（一）PH对酶活性的影响探究

1、提出问题：

2、作出假设：

3、材料用具：

（2）本实验的自变量是什么？因变量是什么？用什么方法控制自变量？（3）对照组怎样设置？你将设定哪几个PH？怎样将不同溶液的PH分别调到设定

5、实验方法

6、实验结果： 结论：

（二）温度对酶活性的影响探究、提出问题：、作出假设：、材料用具：

的数值？

4、实验设计

（1）实验预期：根据自己作出的假设，预期会看见怎样的实验结果？并做记录。

（2）本实验的自变量是什么？因变量是什么？用什么方法控制自变量？

（3）对照组怎样设置？你将设定哪几个温度？怎样将不同溶液的温度分别调到设定的数值？

5、实验方法

6、实验结果：

结论：

第二课时

四、酶的作用条件较温和

酶所催化的化学反应一般是在____________的条件下进行的。在______________________下，酶的活性最高，温度和pH____________，酶的活性都会_________。

一般来说，动物体内的酶最适温度在___________之间，植物体内的酶最适温度在__________之间，细菌和真菌体内的酶有的最适温度高达________。

动物体内的酶最适pH大多在_________之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适pH为______，植物体内的酶最适评pH大多在____________之间。____________或温度_____，会使_______________遭到破坏，使酶________。0℃左右时，酶的_______，但酶的______________，在适宜的温度下酶的活性可以_______。因此酶制剂适于在________________下保存。

【课堂练习】

1、关于酶的特性，下列表述中错误的是（）A、酶是活细胞产生的具有催化能力的有机物 B、化学反应前后，酶的化学性质和数量不变

C、酶的催化效率很高，但易受温度和酸碱度影响 D、一旦离开活细胞，酶就失去催化能力

2、用纯唾液和用稀释10倍的唾液做唾液淀粉酶的催化实验，其效果完全相同，这说明酶具有（）

A、专一性 B、多样性 C、高效性 D、多变性

3、能水解脂肪酶的酶是（）A、淀粉酶 B、蛋白酶 C、脂肪酶 D、麦芽糖酶

4、人在发高烧时，常常食欲大减，最根本的原因是（）A.所吃食物不能消化 B.胃没有排空

C.体温超过合适温度，消化酶的活性下降 D.吃药使人没有了胃口

5、胃蛋白酶在进入小肠后就几乎没有了催化作用，主要原因是（）

A.pH不适合 B.胃中已经起了消化作用，不能再起作用了 C.被小肠中的物质包裹起来，所以起不到催化作用 D.小肠中没有蛋白质可被消化 课堂练习

6、下列有关酶的叙述错误的是()

A.组成大多数酶的基本单位是氨基酸 B.少数酶是RNA

C.每种酶都具有高效性，专一性 D.酶都具有消化功能

7、将唾液淀粉酶先放入沸水中2分钟，再放在37℃的恒温水浴中，酶的催化效率前后变化是()A、不断降低 B、先升后降 C、先降后升 D、没有变化

8、加酶洗衣粉中一般含有蛋白酶，请回答下面的问题：（1）这种洗衣粉为什么能够很好地除去衣物上的奶渍和血渍？

（2）使用这种洗衣粉为什么要用温水？

（3）含有蛋白酶的洗衣粉不宜用来洗涤下列哪些衣料？（）A.化纤 B.纯毛 C.纯棉 D.真丝

（4）为了更好地除去衣物上的油渍，在洗衣粉中还可以加入什么酶？

【作业】 1.加酶洗衣粉不能用沸水溶解，这说明了酶的作用（）A．适用低温下催化 B．具有高效性 C．需适宜的温度 D．具有专一性

2.人的血液中碳酸酐酶的1个分子，每分钟可催化1900万个碳酸分子，这说明酶具有（）

A．多样性 B．专一性 C．可控性 D．高效性 3.下列有关酶的叙述正确的是（）

A．都是活细胞产生的，在细胞内起作用

B．酶的产生受遗传物质控制，也可从食物中获取

C．酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质 D．酶在催化过程中不断被消耗 4.下列说法正确的是（）A．酶就是蛋白质

B．由于酶比无机催化剂具有更高的催化速率，所以反应前后本身的数量也减少的多 C．酶的活性与PH、温度等因素有关

D．酶不能脱离生物体起作用

5.能正确说明酶不同于一般催化剂的催化特性之一的是（）A．酶都是蛋白质

B．酶是活细胞产生的，只能在生物体内发挥催化作用 C．酶的活性随着温度升高而不断提高

D．每一种酶只能催化一种或一类物质的化学反应

6.唾液淀粉酶进入胃后就失去其催化作用，主要原因是（）A．酸碱度不适宜 B．胃蛋白酶抑制了唾液淀粉酶的作用 C．胃中没有淀粉 D．唾液淀粉酶被分解

7.研究表明：一分子过氧化氢酶能在1分钟内是5×10个过氧化氢分子分解成氧和水，相当于Fe3+催化速度的109倍，但是对糖的水解却不起作用，这个事实说明酶分别具有（）

A．多样性，稳定性 B．高效性，多样性 C．高效性，专一性 D．高效性，稳定性

8.下图中，横轴均表示酶的反应条件，纵轴为酶促反应速度，能正确反映温度和PH值与酶促反应速度的关系是（）

A．甲和丙 B．甲和乙 C．都是丙 D．都是丁

甲 乙

丙 丁

9.10℃（X）、40℃（Y）、80℃（Z）条件下，人唾液淀粉酶的活性是（）A．X＞Y＞Z B．Z＞Y＞X C．X＞Z＞Y D．Y＞X＞Z 10.分别用0℃和100℃的温度处理淀粉酶后，酶都没有活性，但（）A．经过0℃处理的酶的活性能够恢复 B．经过0℃处理的酶空间结构遭到破坏 C．经过100℃处理的酶的活性能够恢复 D．经过100℃处理的酶被水解成了氨基酸

5【课后反思】

酶的特性实验参考资料

探究影响酶活性的条件

（一）PH对酶活性的影响探究

材料用具：

新鲜的质量分数为20%的肝脏研磨液、质量分数为3%的过氧化氢溶液、质量分数为5%盐酸、质量分数为5%的NaOH溶液、蒸馏水 试管、量筒、滴管、pH试纸 实验方法

（1）取三支试管，编号为1、2、3号，分别加入2mL质量分数为3%的过氧化氢溶液。

（2）取三支试管，编号为1′、2′、3′号，分别加入2mL蒸馏水、质量分数为5%盐酸、质量分数为5%的NaOH溶液，摇匀。

（3）分别把1′号试管液体倒入1号试管、2′号试管液体倒入2号试管、3′号试管液体倒入3号试管，摇匀。

（4）观察这三支试管中产生气泡的情况。

（二）温度对酶活性的影响探究 材料用具

质量分数为2%的新配制的淀粉酶溶液、质量分数为3%的可溶性淀粉溶液、热水、蒸馏水、冰块、碘液

试管、量筒、滴管、烧杯、温度计、试管夹、酒精灯、三角架、石棉网、火柴

实验方法

（1）取三支试管，编号为1、2、3号，分别加入2mL质量分数为3%的可溶性淀粉溶液。

（2）取三支试管，编号为1′、2′、3′号，分别加入质量分数为2%的新配制的淀粉酶溶液。

（3）将装有淀粉溶液和淀粉酶溶液的试管分为三组：1和1′、2和2′、3和3′，分别放入热水（约60℃）、沸水和冰块中，维持各自温度5min。

（4）分别将淀粉酶溶液注入相同温度下的淀粉溶液中，摇匀后，维持各自温度5min。

（5）在三支试管中各滴入1-2滴碘液，摇匀。

（6）观察这三支试管中溶液的颜色变化。

浅析固定化酶的制备和应用 篇6

[关键词]固定化酶；固定化细胞

一、酶固定化方法

酶固定化方法由酶的性质和载体特性所决定，主要包括：吸附法、交联法和包埋法等。

（一）吸附法。吸附法有物理吸附法和离子交换法两种。物理吸附法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，对蛋白质有高度吸附能力的有机硅胶、活性碳和石英砂等。离子交换法是利用蛋白质的两性性质，使其带有电荷的基团与离子交换剂形成离子键，而被交换结合至交换剂上。

（二）交联法。交联法是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法，交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。

（三）包埋法。包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中。如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透明高分子膜中。前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。

二、固定化细胞技术

固定化细胞技术是通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性。方法主要有吸附法和包埋法。

（一）吸附法。吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好的附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大空隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。

（二）包埋法。包埋法是将细胞包埋在多孔的载体的内部而制成固定化细胞的方法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶，明胶等。

三、固定化酶和固定化细胞的联系与区别

联系：应用相同，都有催化某些反应。区别：固定化细胞技术操作容易，成本低容易回收；固定化细胞技术对酶活性影响更小；固定化细胞固定的一系列酶；由于大分子难以通过细胞膜，因此固定化细胞的应用有一定的限制。

《酶的特性》教学设计 篇7

本节内容是普通高中课程标准实验教科书《分子与细胞 (必修1) 》 (人教版) 第五章第一节第二部分。它是在第1课时“酶的作用和本质”的基础上结合探究“影响酶活性的条件”实验, 进一步理解酶的特性, 特别是反应条件的温和性, 为后面学习“人体内环境与稳态”知识打下坚实的基础。

本节的教材编排充分体现了新课标的特性, 如:新教材将“探究影响酶活性的条件”探究性课题编排在教材正文内容之前, 这样更有利于学生主动探究;并且在此探究性课题中也布置了不少讨论题, 有利于培养学生的表达能力和思维能力, 此外, 本章节的教材与日常生活联系得更紧密, 这也有利于培养学生学以致用的能力。

针对本节内容的特点, 笔者利用多媒体辅助教学, 通过图片、视频等手段呈现酶的三个特性, 使学生直观地了解和掌握重点, 突破难点, 取得满意的效果。

二、教学目标

1. 知识目标

(1) 能够说明酶在细胞代谢中的特性及意义。

(2) 进行有关实验和探究, 学会控制自变量, 观察和检测因变量变化以及设置对照组和重复实验。

2. 能力目标

(1) 主动参与科学探究实验活动, 掌握科学探究的程序和方法, 形成创造性思维能力和动手实践的能力。

(2) 通过以小组为单位的学习, 学会与人交流和合作的能力。

3. 情感、态度、价值观目标

(1) 养成勇于质疑、自主探究、合作学习的科学探究精神。

(2) 形成关注社会科技发展和学以致用的意识。

三、教学重点与难点

酶的特性及影响酶活性的条件的探究方法, 酶的特性探究活动及控制变量的科学方法。

四、教学方法

探究式教学法, 讲授法, 演示法, 实验法。

五、教学准备

电脑, 投影仪, POWERPOINT课件, 有关实验药品, 器材。

六、教学过程

1. 新课导入

首先, 播放视频———“奇强”的广告, 接着课件展示生活中的酶相关图片 (如图1) , 并进行简要的介绍。利用广告动画, 联系生活实际来激发学生学习的兴趣。

教师:酶已悄悄融入到我们的日常生活中, 它的应用如此广泛肯定跟其特性有密切联系。那么, 它究竟有什么特性呢?让我们来一起研究吧。

2. 回忆所学, 归纳酶的第一个特性———高效性

多媒体图片再现“比较过氧化氢在不同条件下的分解”的实验 (如图2) 。利用多媒体图片吸引学生的注意力, 有利于学生对实验现象和结论的理解和掌握。

教师:1号试管和2号试管对比, 1号试管和3号试管对比, 2号试管和3号试管对比得出什么结论?

教师:其实酶都普遍比无机催化剂的催化效率高许多, 一般酶的催化效率是无机催化剂的107-1013倍。所以, 酶具有高效性。

3. 演示实验, 探究酶的第二个特性———专一性

教师:无机催化剂催化的化学反应范围很广, 如酸可以催化蛋白质的水解, 也能催化脂肪水解, 还能催化淀粉水解。酶也具有这个本领吗?

教师:要说明这个问题, 需要几个酶, 几个反应物?

教师:你探究的是什么问题?选择什么反应物和酶进行实验?用什么鉴别生成物?

多媒体展示出一些实验材料用具。由于给定图片材料有提示作用, 因此, 避免了盲目性。用视频演示实验探究淀粉酶对淀粉和蔗糖的水解作用 (如图3) , 使学生对实验的操作有直观的认识, 对后面的实验设计有提示作用。

4. 设计实验探究酶的第三个特性———作用条件较温和

多媒体展示出一些实验材料、用具。

教师:从上面材料中的现象你能提出什么问题?你能根据所学的知识作出假设吗?

教师:如何探究温度或PH对酶活性的影响?

投影图片激发情境, 发散学生的思维, 激发学生的求知欲。给定材料能够节省时间, 提高效率。教师引导设计、进行实验并及时进行评价与激励。最后, 归纳总结实验结果和结论。

建构数学模型:结合实验给出温度和PH影响酶活性曲线 (如图4) 。

七、知识梳理

引导学生对本节课的主要知识内容进行小结 (如图5) 。

八、板书设计

九、教学反思

运用多媒体创设教学情境, 有助于激发学生学习的兴趣;可以增加教学容量, 提高教学效率;可以使教学突出重点、淡化难点, 提高教学质量。

这节课是根据新课程标准“培养学生科学素养, 倡导探究性学习”而设计的。笔者在本节课中设计了三个不同方式、不同程度的探究实验, 一个是对实验分析得出酶的高效性, 另一个是通过对实验录像的观察总结出酶的专一性, 第三个是通过实际的实验探究得出酶的作用条件比较温和这一特性。第三个实验是在学生已掌握实验二的方法后, 在进一步的思考与讨论中开展的, 突出学生在学习中的主体地位。

酶所需的作用条件的实验设计比较灵活, 需要和物质鉴定实验相结合, 难度较大, 宜以课题小组的形式进行讨论。另外, 由于受仪器设备的限制, 对于酶的催化作用的原理不宜探究过深。

在实际教学活动过程中, 学生会表现出浓厚的学习兴趣, 积极参与讨论和探究。但教学时间不容易控制, 完成教学计划所需要的时间往往比预计时间要长许多, 实验设计的思想体现得还不够充分, 所以, 并不能很好地照顾到每个小组和每位学生, 对于一些没有关注到的组, 必然效果要大打折扣, 这些只能在以后的课程中注意调试, 尽可能满足所有学生的需要。

摘要：本文根据新课程标准“培养学生科学素养, 倡导探究性学习”而设计《酶的特性》一课, 利用多媒体辅助教学, 通过图片, 视频等手段呈现酶的三个特性, 使学生更好地掌握知识内容。

酶的固定化方法及特点探讨 篇8

一、常用的几种固定化方法

酶的固定化方法主要分为物理和化学两大类, 其中物理方法主要有载体吸附法, 包埋法等, 化学方法主要有共价偶联法、交联法等[1, 2]。采用不同的固定化方法对酶的活力回收及稳定性有较大的差异。

1、吸附法[1, 2]

顾名思义就是使用各种固体吸附剂为载体对酶及产酶的菌体或动植物细胞进行表面吸附, 将水溶性的酶转变成不溶于水的固定化酶的方法。多孔玻璃、硅藻土、多孔陶瓷、氧化铝、硅胶、活性炭、羟基磷灰石等可作为常用固体吸附剂。生产过程必须结合固定化载体的来源和价格以及酶的特点, 固定化操作的难易, 何种条件下使用固定化酶等制备固定化酶。利用此方法所制得的固定化酶的酶活回收较高, 主要原因包括操作条件温和, 技术手段简单成熟等, 故不会引起酶大量失活变性, 同时价格便宜, 并且可以重复使用。但另一方面, 物理吸附作用力较弱, 酶与载体结合不稳定, 应用过程中容易脱落, 一定程度上限制了工业上的大规模应用。

2、包埋法[1, 2]

指的是利用多孔载体包埋酶或含酶菌体使酶得到固定化。使用的多孔载体主要有琼脂糖、琼脂、火棉胶、海藻酸钠、聚丙烯酰胺、角叉菜胶、光交联树脂、明胶、聚酰胺等。根据载体材料和包埋方法的不同, 可分为两大类, 分别为半透膜包埋法, 凝胶包埋法。采用包埋方法, 酶蛋白的氨基酸残基一般不参与反应, 即酶的三维结构很少发生改变, 故酶变性失活较少。但此方法有其弊端, 由于酶被包埋在内部, 只有能扩散进载体内部的底物才能发生酶催化反应, 且产物也要能扩散到载体外部, 故固定化酶动力学行为发生一定程度的改变, 酶活性变弱。一般而言包埋方法不适用那些作用于大分子底物和产物的酶的固定化。

3、共价结合法[1, 2]

此法区别于吸附法和包埋法的最大特点是通过共价键将酶与载体结合。酶分子中能与载体分子的功能基团形成共价键的侧链基团有:氨基、羧基、酚基和羟基, 咪唑基等。为保证共价处理后能尽量多得保留酶的活力, 故参与共价结合的侧链基团一定不能是与酶的催化作用有关的必须基团, 否则酶活损失较大或者失去催化能力。共价结合法与其它物理吸附方法相比, 由于其采用共价键进行与载体的结合, 作用力较大, 一般不会因为高浓度的底物或盐等原因而从载体上脱落。但这种方法有其缺点, 主要是反应条件较剧烈且操作复杂, 酶蛋白的三维立体结构容易受到破坏。而酶的活性是结构的体现, 故采用此种方法所制得的固定化酶活力不高, 一般只能回收30%的酶活力。另外, 酶活性中心的变化可能导致酶对底物的特异性等酶催化特点的改变。

二、固定化对酶性质的影响[1, 2]

1、稳定性

固定化酶的稳定性基本上要高于游离酶, 主要体现在这几个方面: (1) 耐热能力得到明显提高, 可在较高的温度下发挥催化作用; (2) 更有利于保存和运输; (3) 耐蛋白酶水解作用能力得到一定改善, 不易被蛋白酶水解; (4) 耐尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的能力得到一定提高, 酶活力损失较少;等等。

2、最适温度和pH

固定化处理之后, 除少数酶的最适温度有明显变化外, 大部分酶的最适作用温度和催化反应活化能的改变不明显, 与游离酶的差别较少。最适作用温度的变化与采用的固定化方法和载体的特性有关。除温度的改变之外, 酶的最适作用p H也会受到一定程度的影响。故在工业中使用固定化酶时要区别对待, 不能沿用游离酶的操作条件。酶经固定化处理之后的p H改变一般受以下两方面因素的影响, 即载体的带电性质和酶催化反应产物的性质。

3、底物特异性

酶经固定化处理之后, 其特性发生一定程度的改变, 其中包括对催化底物的特异性改变, 这种改变的程度受底物分子质量的影响。一般而言, 倘若以小分子物质为催化底物, 酶的作用专一性一般变化不大。倘若既能以小分子物质为催化反应的作用对象, 又能催化大分子物质, 这样的酶在固定化前后, 其底物专一性往往会发生一定程度的变化。这种专一性的改变受载体结构影响, 即空间位阻。酶经固定化处理, 载体横隔在酶和底物之间, 对于分子量较大的底物, 难以靠近酶的活性中心, 形成酶-底物复合物的速率明显降低, 催化反应的速率相比游离酶要慢得多。

三、影响固定化酶促反应的主要因素[1, 2]

主要包括空间效应、分配效应和扩散效应, 其中空间效应又可分为构象效应、位阻效应、微扰效应。在实际生产应用中, 这几种因素往往是几种一起发挥作用, 而非单独作用, 从而改变固定化酶的相应催化特性, 有可能是正面的, 也可能是负面的影响。

四、结语

酶的固定化是当前工业上应用比较广泛的技术, 其在不同领域发挥积极且重要的作用, 是提高国民经济的关键技术手段。针对不同种类的酶以及同一种酶的不同固定化方法都值得进行深入研究, 其前景十分广阔。

参考文献

[1]郭勇.酶工程.-3版.-北京;科学出版社, 2009, 158-165

漆酶的固定化及其应用前景 篇9

关键词：漆酶,固定化,载体材料,应用前景

漆酶 (EC1.10.3.2) 是含有4个铜离子的多酚氧化酶, 可与之作用的的底物相当广泛, 包括许多芳香族化合物, 如氯代酚、多氯联酚、二氯苯胺、杀虫剂、染料等[1]。但是, 由于漆酶本身具有不可重复使用、容易变性失活等特性, 使漆酶的应用受到限制。酶的固定化技术是实现酶重复连续使用的有效手段。与游离酶相比, 固定化漆酶具有下列优点:易从反应体系中分离出来可以重复使用;通过固定化技术, 可以提高酶的化学稳定性;能够严格控制酶反应过程;易从产物中分离出来, 简化了提纯工艺;酶的使用效率提高, 成本降低。通过固定化技术能实现漆酶的重复使用性和提高漆酶的稳定性, 使漆酶具有更为广阔的工业化应用前景, 受到人们的广泛关注。

1 漆酶的结构特征及催化原理

1.1 漆酶的结构特征

漆酶一般含有4个铜离子, 是一种简单的多铜过氧化酶, 铜原子位于漆酶的活性中心, 决定了漆酶的催化性质。根据实验探索和理论研究, 将四个铜离子分为3类:I型Cu2+, Ⅱ型Cu2+和Ⅲ型Cu24+, 通过紫外吸收光谱测试, I型Cu2+呈蓝色, 在614nm处有特征吸收带;Ⅱ型Cu2+为非蓝色, 没有特征吸收峰;Ⅲ型Cu24+是偶合离子对, 在330nm处有宽的吸收峰, 这是由于电子在OH和两个Cu (Ⅱ) 之间的传递引起的。

1.2 漆酶的催化原理

综合目前已报道的文献, 漆酶的催化原理主要表现在底物自由基的生成和4个铜离子的协同作用。当漆酶与反应底物接触时, I型Cu2+从反应底物中吸收电子, 底物被氧化成自由基得到的电子在铜离子之间传递, 并最终传递给分子氧, 将分子氧还原成水, 铜离子在氧化反应中起到协同传递电子的作用[2]。

2 漆酶的固定化研究

2.1 固定化漆酶的方法

随着固定化技术的探索和发展, 固定化酶的方法越来越多, 归纳起来大致可以分为三种方法:表面担载法、交联法和包埋法。

2.1.1 表面担载法。

是通过物理或化学过程, 将酶担载到非水溶性载体上的方法。根据结合形式不同, 担载法又可分为共价结合法、离子结合法及物理吸附法等三种。Andrea Salis等利用SBA-15分子筛, 通过吸附法将漆酶固载到分子筛上, 固载量高, 酶活回收率高, 但较易脱落。目前文献报道的用于吸附酶的载体很多, 例如介孔分子筛, 多孔的金材料 (NPG) , 姜德生等以磁性壳聚糖微球为载体, 通过共价结合法制备了固定化漆酶, 与游离漆酶相比, 热稳定性明显提高, 并具有良好的操作稳定性[3]。

2.1.2 交联法。

是采用双功能团或多功能团试剂进行酶分子与载体之间的交联, 得到固定化酶, 目前最常用交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2, 2二磺酸等。利用戊二醛的两个功能基团醛基将漆酶和载体进行交联。黄俊等制备了CTu APc—Fe3O4纳米复合粒子, 通过戊二醛交联法成功地将游离漆酶固定在纳米复合粒子上;并将固定化漆酶组装到光纤传感器上, 用于监测溶液中氧的浓度。

2.1.3 包埋法。

是将酶包裹于凝胶形成的网络结构中, 或半透膜聚合物的超滤膜内使其固定化, 由于酶的空间结构很少发生变化, 所以酶活回收率较高。用包埋法固定化酶的相关报道很多, 如高阳等通过溶胶-凝胶过程包埋脂肪酶, 得到的固定化酶的操作稳定性, 热稳定性和选择性均提高, 周师毅等以聚丙烯酰胺作包埋载体固定SOD金属酶, 稳定性提高, 酶活损失小。

2.2 酶固定化载体的选择

在固定化酶的过程中, 载体材料的选择对固定化酶的性能有着很大的影响, 近年来, 文献报道了许多新型的载体, 使固定化酶的性能进一步提高。作为固定酶的载体应具有一定的要求, 如载体表面应具有活性基团, 可以直接或间接的与生物分子偶联, 其次载体应是稳定的, 不与底物或产物反应, 而且应具有良好的生物相容性和机械强度, 价格低廉等特点。目前常用的载体材料主要有天然高分子材料, 复合材料等。

2.2.1 高分子材料

高分子材料分为天然高分子材料和合成高分子材料, 天然高分子如纤维素, 球状蛋白及其碳水化合物等, 都比较适合担当酶载体材料。壳聚糖和海藻酸等是近年来使用最多的载体材料, 近年来合成了许多有机高分子材料, 例如聚醚L-64共聚物, 聚丙烯酰胺-丙烯酸高分子钠米粒子, 聚乙烯等。

2.2.2 复合载体材料

复合载体材料是以有机材料和无机材料复合组成的新载体材料, 在众多复合载体材料中, 纳米磁性材料作为酶固定载体有以下特点:高的比表面积可固定大量的酶;在磁场作用下, 固定化酶可从反应体系中迅速分离;有利于回收和反复使用, 降低成本。纳米磁性材料以其特有的物理性质, 将成为载体中的重要组成部分, 成为目前最热门的材料之一。通过表面改性、共聚等化学方法对磁性载体材料进行修饰, 在载体表面引入多种反应性功能基团, 以便与漆酶稳定健合。郑国等合成磁性聚乙烯微球, 首先制备了用油酸做稳定剂的磁流体Fe3O4, 以磁性微粒做磁核, 通过共聚合作用制备了磁性聚乙烯微球, 尺寸在8-34 nm, 且具有超顺磁性, 以该磁性材料为载体担载酶, 担载量较以前的报道明显提高, 化学稳定性和操作稳定性好[4]。吴月等人制备了磁性Fe3O4-壳聚糖 (cs) 钠米粒子, 粒径在20 nm左右, 饱和磁化强度是35.54 emu/g, 通过戊二醛交联法固定化脂肪酶, 酶活回收率55.6%[5]。

3 固定化漆酶的应用前景

漆酶作为一种高效, 绿色的催化剂, 随着固定化技术的不断发展, 扩大了漆酶的工业应用范围和前景, 固定化酶在废水处理, 生物传感器, 食品行业方面中有着重要的应用价值。

工业废水中含有大量的难降解的酚类物质, 如氯酚等, 国内外许多学者已经对固定化酶降解有毒的酚类物质进行了大量的研究, 张树江等用固定化漆酶去处废水中的2, 4-2二氯酚的去除率可达99.5%以上, 且不产生二次污染, 催化效率高[6]。随着染料工业的发展, 染料结构复杂且不易降解, 固定化漆酶对染料的降解也有独特的作用, 且可以回收重复使用, 降低成本。在生物检测器方面和食品行业, 固定化漆酶也发挥着重要的作用。

参考文献

[1]Kalme S, Jadhav S, Jadhav M, Govindar S.Enzyme and Microbial Technology, 2009, 44:65.

[2]万云洋, 杜予民[J].化学通报, 2007, 9.

[3]姜德生, 龙胜亚, 肖海燕, 周菊英, 黄俊, 应用化学, 2005, 22.

[4]Zheng Guo, Shu Bai, Yan Sun.Enzyme andMicrobial Technology, 2003, 32, 776.

[5]Yue Wu, Yujun Wang, Guangsheng Luo, Youyuan Dai, Bioresource Technology, 2009, 100, 3459.

杂交鳢及其亲本同工酶的比较 篇10

关键词：杂交鳢,杂交优势,同工酶,乳酸脱氢酶,苹果酸脱氢酶

乌鳢(Ophiocephalus argus Cantor),俗名黑鱼,隶属鲈形目、鳢科、鳢属,其肉质细嫩,少刺,味道鲜美,营养丰富,深受广大消费者欢迎。随着乌鳢养殖业的迅速发展,也带来了许多经济和社会问题,如农业污染,种质退化,病害以及食用安全等问题。种质是产业的源头,迫切需要开发出优良的品种以代替退化的品种。

鱼类杂交育种是当前水产生物育种技术行之有效的育种方法之一。2006年杭州市农业科学研究院水产研究所从广东引进原种斑鳢(♀,Ophiocephalus maculatus),与浙江本地乌鳢(♂)进行杂交,获得F1代斑鳢(♀)×乌鳢(♂)杂交子代并进行了养殖试验[1]。与传统乌鳢养殖相比,斑鳢(♀)×乌鳢(♂)杂交子代对人工配合饲料摄食情况好,养殖池水质得到改善,发病率降低,养殖产量和效益得到了提高。在此基础上,为了更深入地了解斑鳢(♀)×乌鳢(♂)杂交子代与浙江乌鳢、广东斑鳢在生化遗传特性上的差异,研究主要探讨了三者在同工酶的酶谱特征上的差异性,以便为科学地开发、利用种质资源提供理论依据。

1 材料方法

1.1 试验材料

乌鳢采自浙江杭州余杭,斑鳢采自广东,斑鳢(♀)×乌鳢(♂)杂交子代,为杭州市农业科学研究院水产研究所以斑鳢(♀)与乌鳢(♂)进行杂交所获杂交F1代。

1.2 试验方法

3个群体各采集样本10～20尾,体重300～400g。活体解剖,取肝脏(L)、肌肉(M)、脑(B)、脾脏(S)、鳃(G)、肾(K)和心脏(H)组织,按重量体积比(W∶V)=1∶10加入生理盐水,置冰上反复匀浆至组织完全磨碎为止,匀浆液冷冻离心,12 000 r/min,20 min,取上清液于-20℃保存备用。

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳,进行乳酸脱氢酶(LDH)同工酶和苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶分析,电泳及染色按国标方法进行[2]。

2 结果

2.1 浙江乌鳢同工酶结果

多数鱼类的LDH同工酶是由A、B、C三个等位基因编码的四聚体酶[3],A、B两个等位基因分别编码LDH-A、LDH-B亚基,A、B两个亚基随机组合形成A4、A3B1、A2B2、A1B3及B4等五种四聚体。浙江乌鳢各组织中酶带也由A4、A3B1、A2B2、A1B3及B4等五种四聚体组成,仅肌肉中只有A4和A3B1两条酶带,而鳃中未检测到B4酶带(图1-1)。

硬骨鱼类的MDH有线粒体(m-MDH)及上清液(S-MDH)两种类型,两者均为由两个位点控制的二聚体酶[3]。浙江乌鳢各组织中均具有MDH-1-AB酶带,但肝脏中还检测到MDH-1-B2和MDH-2-A2酶带(图1-2)。

2.2 广东斑鳢同工酶结果

广东斑鳢LDH由A、B两个等位基因编码,肝脏、脑、脾脏、肾、心等组织均有A4、A3B1、A2B2、A1B3及B4等五条酶带,肌肉中只有A4和A3B1两条酶带;鳃中未检测到A1B3酶带(图2-1)。

斑鳢的MDH是由两个位点控制,A、B两个等位基因编码的二聚体酶,脑、脾脏、鳃、肾、心均只具MDH-1-AB酶带;肌肉中还检测到MDH-1-A2,MDH-1-B2两个酶带,肝脏中未检测到MDH-1-A2酶带,但含有MDH-2-A2酶带(图2-2)。

2.3 浙江乌鳢(♂)×广东斑鳢(♀)杂交种同工酶结果

杂交鳢各组织中酶带特征与浙江乌乌鳢、广东斑鳢类似,介于二者之间,但也存在一定的差别。LDH同工酶检测中,杂交鳢的脑和脾脏组织中未检测到A1B3及B4酶带,MDH同工酶检测中,杂交鳢各组织中酶带与斑鳢类似,与乌鳢相比,在肌肉组织中缺少MDH-1∶A2和MDH-1∶B2(图3-1,3-2)。

3 讨论

通过对斑鳢、乌鳢和杂交鳢各组织中乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的研究发现,同工酶在不同动物品种间及在动物体内不同组织中的表达存在差异,有的甚至很明显,LDH-A1B3酶带只在乌鳢的鳃组织中表达,而在斑鳢和杂交鳢的鳃组织中未表达,LDH-B4酶带则在乌鳢的鳃组织中未表达,在斑鳢和杂交鳢的鳃组织中却表达,此外各组织中的各种酶的位点表达强度几乎都存在差异。同工酶基因的表达与动物品种及个体发育相关,不同品种、不同个体的发育过程是基因差别表达的结果,在不同品种鱼类及个体发育过程中,同工酶基因的表达表现出时间和空间上的变化,这种变化不仅是个体发育过程中生理代谢的需要,也与个体发育过程的细胞分化、形态发生和器官形成有关[4,5]。

杂交子代基因的表达通常有父母本基因的同步表达、非同步表达和单方亲本的基因表达等,当种间同工酶的迁移率相同而活性不同时,杂交子代的同工酶活性常介于两亲本之间[6],斑鳢和乌鳢同工酶的酶谱差异不是太明显,杂交子代的同工酶表型和斑鳢、乌鳢比较各有异同,基本符合上述规律。

殷文莉等[5]研究了乌鳢不同组织的同工酶表达情况。本文与其研究结果基本一致,但也存在差异,这可能与多方面因素有关。如编码的等位基因数,控制酶的位点数,染色体倍性及基因调控等[7],此外不同的电泳方法,由于其电泳支持物的种类、浓度、缓冲系统、电泳条件(电压、电流、时间等)不同,可产生不同的电泳图谱,可能会得到不同的生化遗传分析结果[8]。

参考文献

[1]冯晓宇,王宇希,李行先,等.池塘养殖杂交鳢高效试验[J].科学养鱼,2008,3:31-32

[2]李思发,赵金良,徐忠法,等.GB/T18654.13-2008《养殖鱼类种质检验第13部分:同工酶电泳分析》,2008

[3]胡能书,万国贤.同工酶技术及其应用[M].长沙:湖南科技出版社,1985.37-62

[4]唐章生.巴西鲷乳酸脱氢酶同工酶的初步研究[J].水利渔业,2001,21(4):9-10

[5]殷文莉,戴建华.乌鳢不同组织的同工酶研究[J].湖北师范学院学报(自然科学版),2000,20(3):17-24

[6]朱蓝菲,桂建芳,梁翊昌,等.鲢的远缘杂交子代和人工三倍体的同工酶表达[J].水生生物学报,1993,17(4):293-297

[7]熊全沫.鱼类同工酶谱分析(上)[J].遗传,1992,14(2):41-44

精氨酸酯酶的分离和纯化 篇11

1 材料与仪器

1.1 实验材料

药品和试剂:长白山蝮蛇蛇毒、DEAE-SephadexA-50 SWEDEN PHARMACIA产品、TAME (中科院上海生物化学研究所) 、牛血清白蛋白 (中科院上海生物物理所生化) 。

1.2 仪器

WFZ800-D2型紫外一可见分光光度计、T22型光栅分光光度计、BS-100A自动部分收集器、LG-3型多用泳冻干燥机、DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪

2 实验方法与结果

2.1 酶活力测定[2]

以TAME为底物, 比较不同含量待测酶液条件下, 在500nm处测光密度值并记录。见表1。

2.2 蛋白含量测定

Follin-酚法[4]标准牛血清白蛋白稀释不同浓度后于660nm处测比色值并记录。见表2。

2.3 神经毒测定[5]

稀释至0.5μ, 取0.4mL加入10.0mL蛋白底物 (蛋黄一只, 加1mol/L Nacl溶液20mL, 0.01mol/L Cacl2溶液20mL, 脱氧胆酸钠溶液20mL, 用0.02mol/L Na OH调pH, 用水稀释至200mL, 混匀使pH为8.0, 置37℃保温备用) 中, 置恒温水浴 (37℃±2℃) 并立即准确计时, 于4min内缓缓加入Na OH (0.02mol/L) 0.3mL, 反应至4min时, 迅速测反应pH值 (参考精制抗栓酶质量标准) 。

2.4 出血毒测定[6]

将活力稀释至1μ, 取0.2m L在小白鼠 (18g左右) 背部通过皮下注射方式给药, 24h后, 将小白鼠处死, 去皮, 观察背部皮上出血斑情。

2.5 精氨酸酯酶的粗提

DEAE-SephadexA-50柱层析[7]。

2.5.1 柱层析分离条件

二乙氨基乙基葡聚糖A-50酸碱处理并用0.01mol/L Tris-Hcl缓冲液平衡后, 装柱 (40cm×lcm) 。称取一定量长白山蝮蛇蛇毒溶于0.01mol/L Tris-Hcl缓冲液中, 在0.1%EDTA中透析, 低温下离心 (500转/分) , 15min取上清液上样。洗脱先用Tris-Hcl (0.0lmol/L) 洗至无峰, 再用Nacl直线浓度梯度洗脱 (搅拌瓶:300mL Tris-Hclaq, 贮存瓶:300mL含0.5mol/L Nacl的Tris-Hclaq) 洗脱流速4mL/15分, 洗脱液在紫外仪器280nm处测光密度结果。

2.5.2 活性测定结果

见表3。

*注:出血毒:“++++”极多, “+++”较多, “++”较少, “+”极少, “无”

经过DEAE-Sephgadex A-50柱层析, 可将具有精氨酸酯酶的峰和具有高神经毒出血毒的峰得到初步分离, 但其中精氨酸酯酶保持活力的峰Ⅳ, 可能还含有一定浓度的神经毒和出血毒, 还需要进步进行纯化分离。

通过以上分离方法重复操作, 获得三批测量值相近的样品, 将其中分离得到的峰Ⅳ (精氨酸酯酶活力峰) 冷冻干燥待用。

2.6 精氨酸酯酶的纯化过程

按设计的两条路线分别进行路线—:1.DEAE—Sephadex A—50柱层析[8], (1) 柱层析条件:将以上得到的一部分干品溶于0.01mol/L Tr i s-H C L缓冲液中, 透析除盐准备上样, 酸碱处理过的D E A E-Sepddex A-50平衡后上柱 (30cm×lcm) , 用盐浓度梯度洗脱 (浓度0.1~0.4mol/L) 洗脱体积为200mL, 速度4mL/30min, 洗脱液280nm处比色。 (2) 酶活力测定, 见表4。

以此结果可说明路线一用来纯化精氨酸酯酶可行。

路线二:1.Sephadex G—100柱层析, (1) 柱层析条件:用酸碱处理G-100后用Tris-HCL缓冲液平衡, 装柱 (30cm×lcm) , 精提中精氨酸酯酶活力峰冻干品溶于Tris-HCL缓冲液中, 蒸馏水透析除盐后上柱, 用0.15mol/L NacI (Tris-HCL) 溶液洗脱, 洗脱速度为4mL/30min, 于280nm处测光密度。 (2) 酶活力测定结果, 见表5。

粗提产品经G-100分离后, 发现活性较之前有所集中, 可神经毒和出血毒还有部分未除去, 需要进一步分离、纯化。

2.DEAE-SephadexA-50柱层析, (1) 柱层析分离条件:将1中I峰冻干品于Tris-HCL中, 处理后的DEAE-SephadexA-50装柱 (30cm×lcm) , 样品透析除盐后上柱, 洗脱用0.15mol/L Nacl (Tris-HCL) , 洗脱速度为4mL/30min, 洗脱下来样于280nm处测光密度。 (2) 酶活力测定结果, 见表6。

由1、2两步分离结果证明:路线二工艺较路线一工艺比较能达到把精氨酸酯酶中神经毒、出血毒除去, 最终达到纯化目的。

2.7 酶纯度鉴定

聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳[8][参考精制抗栓酶质量标准 (药厂提供) ]:a.药厂提供精制栓酶产品 (0.5μ) ;b.路线一产品;c.路线二产品。

3 结果与讨论

3.1 应用二乙氨基乙基葡聚糖A-50和盐浓度梯度洗脱的方法, 能有效地长白山白嵋蝮蛇蛇毒有效部分粗分, 得到至少10个实用蛋白峰。

3.2 将粗分中得到的具有高精氨酸酯酶活力、低出血毒、低神经毒部分再按两条路线分离。

路线—:DEAE-Sephadex A-50;路线二:Sephadex-G-100→DEAE-Sephadex A-50。实验结果表明两条路线对于纯化精氨酸酯酶均可行。

3.3 上部分离得到实用产品可通过电泳初步鉴定为四条带, 与目前精制抗栓酶产品图谱相近, 略有不同, 主要不同在各种成分含量上。

3.4 路线一和路线二的产品相比, 二产品的区带较一产品的区带更清晰, 可能因为经过Sephadex-G-100分离后, 峰活力被浓缩, 位置集中, 有利于第二次DEAE-Sephadex-A-50分离, 这样看来, 路线二略优于路线一, 但由于实验条件所限, 收率未准确计算, 路线一有一步损失而路线二有两步损失, 哪一个更可行, 有待于进一步探讨。

摘要：蝮蛇蛇毒中活性的组合是激肽释放酶, 类凝血酶及类活血纤维酶。其中类凝血酶的精氨酸酯酶的活力最高。分析表明含有较多的酸性氨基酸及辅氨酸。蝮蛇中的类凝血酶属胰蛋白酶家族, 通过切除血纤维蛋白原的凝聚, 起凝血作用, 但在体内因它不会激活凝血因子XⅢ, 所以由其水解产生的纤维蛋白凝块的侧链不能交联, 易被纤维蛋白溶酯降解, 导致体内纤维蛋白浓度下降而表现出抗凝效应。

关键词：精氨酸酯酶Arvin, (Ancrod) ,Reptilase,crotalase

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