荧光免疫分析（精选7篇）
荧光免疫分析 篇1
0 引言
免疫荧光分析技术是新发展起来的精密的免疫标记检测技术, 与传统的酶联免疫法及金标法相比, 免疫荧光分析技术灵敏度高, 特异性强, 操作方便, 不用放射性物质作为标记物, 因此具有无放射性、标记物稳定、便于长期保存、试验重复性好、分析速度快、样品用量少及标准曲线量程宽等优点[1]。荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后, 物质本身所发射的光的强度。荧光的强度与物质数量之间存在正比关系, 可通过测定荧光的光谱和荧光强度, 对物质进行定性或定量的分析。免疫荧光分析技术是目前生物医学检验中常用的快速分析技术, 在微生物、病毒抗原或抗体检测、激素检测、肿瘤标志物检测、毒品海洛因、吗啡、摇头丸、氯胺酮等检测领域具有广阔的应用前景。
1 免疫荧光定量检测原理
将特异的荧光抗体先固体于硝酸纤维素膜的某一区带, 当该干燥的硝酸纤维素一端滴加样品后, 由于毛细管作用, 样品将沿着该膜向前移动, 当移动至固定有抗体的区域时, 样品中相应的抗原即与该荧光体发生特异性结合, 随着进一步的层析作用, 用此抗原的另一个抗体对此复合物进行捕捉, 多余的荧光抗体用其二抗进行捕捉, 两次捕捉的位置分别称为质控线 (C线) 和检测线 (T线) 。当光源照射到检测卡上时, 质控线和检测线分别激发出不同强度的荧光, 光电转换器接收不同强度的荧光产生不同大小的电信号, 电信号的强弱反映出待检测物的浓度, 从而实现特异性的免疫诊断。
2 免疫荧光定量分析仪系统设计
免疫荧光定量分析仪主要由光学部分、硬件电路部分以及系统软件部分组成。光学部分是荧光定量分析仪的核心部分, 用来激发出荧光, 而硬件电路部分和系统软件部分则用来进行荧光信号的检测处理以及控制整个仪器的正常运行。
2.1 光学部分设计
光学部分设计如图1所示, 光学部分由光源发射光路和荧光检测光路两部分组成。
光源发射光路由LED光源、凸透镜1、滤光片1和凸透镜2组成。LED光源的光轴与凸透镜1、滤光片1以及凸透镜2的光轴在一条线上。光源为绿色 (中心波长为580 nm) 高亮度LED光源, LED位于发射光路凸透镜1的焦点, 这样光源发出的光经凸透镜1后变为平行光, 滤光片1采用中心波长580 nm带宽为30 nm的窄带干涉滤光片, 平行光经过滤光片1后, 入射光中565 nm~595 nm范围以外的光被滤除掉, 出射的光为窄带光 (565 nm~595 nm) , 其经过凸透镜2后, 被聚焦到样品上, 激发出荧光, 荧光波长为610 nm。
荧光检测光路由凸透镜3、滤光片2、凸透镜4和光电转换器组成。光电转换器与凸透镜3、滤光片2、凸透镜4的光轴在一条线上。荧光检测光路光轴和发射光路光轴成45°角, 最大程度地减少了激发光对荧光信号检测的影响。荧光检测光路光轴和发射光路光轴的交点在检测试纸上, 且交点为凸透镜2和凸透镜3的焦点。滤光片2采用中心波长610 nm, 带宽为15 nm的窄带干涉滤光片。激发出的荧光被凸透镜3收集后变为平行光, 平行光通过滤光片2后, 原来的少量激发光会被滤光片滤除掉, 仅剩激发出的610 nm左右的荧光信号通过[2,3]。通过滤光片后的光被凸透镜4收集聚焦到荧光检测模块上的光电转换器上, 实现光信号到电信号的转换。
2.2 系统硬件电路部分设计
系统硬件电路的结构框图如图2所示, 仪器的测量原理是:处理器控制步进电机带动待检测样本到达检测器的检测口上方, 通过发光控制模块控制LED的发光强度以符合测量的强度要求, 光电传感器检测荧光信号的强弱, 传感器输出信号经放大和滤波处理后进入ADS1252转化为数字信号交给处理器进行处理[4]。
图2中检测器框中所示的部分包括上文2.1所描述的光学部分以及部分硬件电路, 两部分共同封装在检测器内, 提高了检测信号的稳定性和抗干扰能力。检测器硬件电路部分由发光控制模块和荧光检测模块组成。
为了保证光源的稳定性, 发光控制模块采用了恒流源驱动方式, 这样可以有效保证光源发光强度的恒定。对于有的样品, 照射光源不宜太强, 因此, 恒流源采用的是程控调节的恒流源, 通过输入不同的数字值, 可以控制LED的发光强度。即LED驱动电流的大小可以通过程序进行控制。
光电转换器选用内置运放的光电转换芯片OPT101。荧光检测模块包含了光电转换、信号放大滤波、电压偏置、模/数转换等部分。其中, 信号放大采用程控放大, 模/数转换采用24位的A/D转换芯片ADS1252, 可保证足够的转换精度和大的动态检测范围。检测器传输给控制器的是数字电信号, 数字信号比模拟信号有更强的抗干扰能力和准确性, 这就大大提高了系统的检测精度。
2.3 系统软件部分设计
系统软件使用C语言进行编写, 软件流程图如图3所示。系统初始化主要完成系统各外围模块的配置以及历史设置的读取和配置。待系统初始化完成后, 控制电机带动样品卡卡槽出仓, 并在显示屏上提示用户插入检测样品卡。系统循环检测样品卡是否插入卡槽内, 当检测到样品卡插入后系统打开二维码扫描枪并控制电机带动样品卡移动至扫描枪处进行二维码的读取。二维码包含检测项目、产品批号、标准曲线等信息。系统判断二维码信息有效后打开LED并根据二维码相关信息调整LED亮度同时控制电机带动待检测样本移动至检测器上方进行检测。采集到的数据将以txt文件的形式保存在SD卡内, 经一定的算法计算出T线与C线对应波峰的面积比后代入二维码信息中的标准曲线内, 得出待检测样品的浓度并将最终的荧光强度曲线及样品的浓度检测结果显示到显示屏上并自动存储和打印检测信息[5]。
3 测试结果及分析
本文设计的免疫荧光定量分析仪可以测量血液和尿液中多种物质的浓度, 本文以NT-pro BNP (N末端脑钠肽前体) 的浓度测量为例对仪器的运行效果进行分析。NT-pro BNP是由心脏分泌的一种神经内分泌激素, 已被证明是临床上诊断、治疗及判断心力衰竭患者预后的重要指标[6]。
3.1 荧光信号的采集
将样品卡插到仪器的卡槽内进行检测得到荧光强度曲线如图4所示。图中横坐标代表数据个数, 纵坐标代表光电转换器输出的电压值, 单位为m V。
3.2 标准直线拟合
得到样品荧光强度的曲线后, 利用高斯拟合可以计算出T线和C线对应的曲线波峰的面积, 利用T线和C线对应波峰的面积可以计算出待检测样品的浓度。这就需要一组标准浓度校验品, 根据标准浓度校验品的测量结果, 建立一定的数学模型计算出T线和C线对应波峰的面积与样品浓度之间的数学关系。
根据标准浓度校验品得到样品浓度与T线对应波峰的面积 (用AT表示) 与C线对应波峰的面积 (用AC表示) 之比AT/AC的对应关系如表1所示。
由表1中的对应关系, 利用最小二乘法得到的样品浓度与AT/AC数学量化关系, 如图5所示。
由图5可以得出, 最小二乘法拟合直线的表达式如式1所示:
直线拟合相关系数R=0.999 92, 说明这6种标准浓度校验品的浓度与AT/AC之间存在良好的线性关系。
3.3 系统测量误差分析
选择一组同一批次不同浓度标准浓度样品, 依据式1对样品浓度进行测量, 分析系统的检测误差, 得到的测量结果如表2所示。
由表2的实测结果可以看出, 对于标准浓度样品的测量误差在±8%以内, 满足实际的使用要求。下面选取一组医院的病人血液样品, 以进口的锐普智能荧光干式定量分析仪作为标准仪器进行对比测量。每个病例取75μL病人血液样本加到样品缓冲液中, 将溶液充分混匀后取75μL混匀后的样本滴加到样品卡的加样孔内, 等待15 min后将样品卡插入到仪器的卡槽内得到的测量结果如表3所示。
由表3的对比测量结果可以看出, 本文设计的免疫荧光定量分析仪与现已商品化的免疫荧光检测仪相比, 测量误差在±8%以内, 能满足临床应用要求。
4 结论
本文设计了免疫荧光定量分析仪, 对仪器的光学部分、硬件电路部分以及系统软件部分进行了详细介绍。从多个角度对仪器的运行结果进行了分析, 从测试结果可以看出, 仪器可以拟合出线性度良好的标准直线, 通过对标准校验品的测量试验和与标准仪器的对比试验表明仪器在小型化、快速性的基础上, 测量误差能够控制在±8%以内, 可以满足临床应用的要求。
摘要：设计了免疫荧光定量分析仪, 用以对人体血液和尿液中的各种分析物 (CRP、PCT、NTpro BNP、c Tn I等) 含量进行快速准确的定量分析。光源采用大功率LED灯珠, 采用窄带干涉滤光片对激发光和荧光进行滤光, 采用内置运放的光电转换芯片OPT101进行荧光强度的检测。采用步进电机驱动, 皮带传动方式带动双排滚珠宽体滑块在单根精密直线导轨上滑动, 实现对检测样品的扫描式检测。通过与标准仪器进行对比试验, 结果表明样机在小型化、快速性以及低成本的基础上, 测量结果准确, 测量精度高, 稳定性好, 能满足临床应用要求。
关键词：免疫荧光定量分析仪,干涉滤光片,OPT101
参考文献
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荧光免疫分析 篇2
1 资料与方法
1.1 研究对象
76例患者就诊时均有胸痛、心慌或胸前不适感, 男45例, 女31例, 平均年龄48.7岁。
1.2 诊断标准
WHO推荐有胸痛、心电图改变、心肌酶谱异常三项指标中有两项符合即可诊断为AMI[1]。
法国梅里埃MINI-VIDAS荧光定量分析仪检测结果以c Tn I<0.01ng/ml为阴性, Mb<46ng/ml为阴性。RAMP荧光定量分析仪结果以<0.16ng/ml为阴性, Mb<99.3ng/ml为阴性。
1.3 检测设备与试剂
法国梅里埃MINI-VIDAS荧光定量分析仪及配套试剂, 采用酶联荧光分析 (ELISA) 法;比对分析仪器为加拿大生产RAMP荧光干式定量分析仪及其配套试剂, 采用荧光标记免疫层析法。
1.4 方法
患者于主诉有胸痛6h内分别采集EDTA-K2抗凝全血和含纤维蛋白酶促凝剂的促凝管各3ml, EDTA-K2管立即进行RAMP荧光干式定量分析仪测定心梗二项;促凝管用3000rpm离心10min进行MINI-VIDAS荧光定量分析仪的测定, 并将结果与临床诊断做比对。
1.4 统计学方法
两种方法的数据用χ2检验, P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
76例患者按照诊断标准有54例诊断为AMI。RAMP荧光干式定量分析仪测定结果:c Tn I<0.16ng/ml有16例, c Tn I>0.16ng/ml有60例, Mb<99.3ng/ml有10例, Mb>99.3ng/ml有66例;梅里埃MINI-VIDAS荧光定量分析仪测定结果:c Tn I<0.01ug/l有22例;c Tn I>0.01ng/ml有54例, Mb<46ng/ml有22例, Mb>46ng/ml有54例。结合诊断标准发现酶联荧光分析法与诊断标准相符, 发现荧光标记免疫层析法有6例c Tn I<0.01ng/ml, 12例Mb<99.3ng/ml为假阳性, 由此可见, 酶联荧光分析法优于荧光标记免疫层析法。两种c Tn I的阳性报告率差异显著 (χ2=4.167, P<0.05) ;Mb结果有显著性差异 (χ2=10.083, P<0.05) 。见附表。
3 讨论
心梗二项是目前公认的比较好的心肌损伤特异性标志物, 在急性心肌梗死 (AMI) 、急性冠状动脉综合征 (ACS) 等心肌损伤的诊断中起到了非常重要的作用, 由于临床使用的各种类型的检测仪所用的原理和方法各不相同, 使不同的仪器对相同的标本检测结果也有较大的差异[2], 本文结果与部分文献[3]报道一致。
肌钙蛋白I (c Tn I) 在心肌损伤2~8h释放人血, 在血中可维持14d左右, 并且仅存在于心肌当中, 作为心肌损伤标志物有较高的特异性。所以它是目前较理想的心肌损伤标志物之一, 然而在检测时由于方法学的原因引起的差异不可小觑, 从上述的两种方法学的对比可以看出, 荧光标记免疫层析法出现假阳性的结果几率要大, 这是因为有很多种原因可以使其假阳性, 例如血液中含有较高浓度的类风湿因子 (Rf) 和嗜异性抗体或大量的纤维蛋白 (Fib) 有关[4]。而荧光免疫定量ELISA法应用了单克隆抗体技术, 有较高的敏感性和特异性, 所以从方法学上讲, 荧光免疫定量法优于荧光标记免疫层析法。
肌红蛋白 (Mb) 分布于心肌和骨骼肌, 心肌中含量特别丰富。在急性心梗 (AMI) , Mb释放人血液, 在症状出现2~3h后, 血中的Mb可超出正常上限, 9~12h达到峰值, 24~36h后恢复正常。其作为心肌损伤标志物的特点就是敏感度高, 窗口期短, 对再次梗死有诊断意义, 但其特异性差, 各种原因引起的骨骼肌损伤、休克、慢性肾功能衰竭等都可以使其升高, 其阴性有助于除外心肌梗死[5]。
总之, 心梗二项是诊断心梗较为理想的实验组合, 由于标志物本身的代谢特点及在检测标志物时的方法学原因, 使得这些指标有时在临床应用时并不能相吻合, 所以这就要求临床医师应用这些指标、心电图及临床症状等辅助检查加以判断, 才能有效减少MI的漏诊和误诊。
参考文献
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荧光免疫分析 篇3
关键词：直接免疫荧光法,呼吸道病毒,快速检测
呼吸道感染为常见疾病, 主要病原体为病毒。呼吸道病毒可以侵犯呼吸道导致呼吸道局部发生病变或者通过呼吸道入侵导致呼吸道的组织器官发生病变[1]。目前呼吸道病毒感染不断上升, 而传统病毒分离及鉴定的操作比较复杂, 无法满足临床对其进行快速检测的需要。而直接免疫荧光法可为诊断和治疗提供及时的临床依据, 逐渐应用到临床中[2]。为研究分析直接免疫荧光法用于多种呼吸道病毒抗原的快速检测, 该研究对该院2013年1—5月间共接诊呼吸道感染患者230例的多种呼吸道病毒采取直接免疫荧光法进行快速检测, 报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取该院共接诊呼吸道感染230例患者, 由患者的病史、X线以及辅助检查等结果以及《中华人民共和国传染病防治法》中规定的呼吸道感染诊断标准得到确诊。年龄0～55岁, 平均 (31±2.8) 岁。将其按照年龄分为成人组和儿童组, 成人组105例, 男67例、女38例, 年龄23～55岁, 平均 (41±2.8) 岁;儿童组125例, 男80例、女45例, 年龄0～12岁, 平均 (4.2±0.8) 岁。
1.2 方法
样本的采集及处理:由专业的临床医生或者护士采取鼻咽拭子从患者的鼻咽部取的鼻咽分泌物, 或者选取鼻腔的灌洗液, 将样本置于无菌收集管中 (含有缓冲液) 以便送检。将样本置于离心管中, 震荡均匀, 在400～600 r/min转速下离心5～10 min后弃上清, 在沉淀中加入1～2 mL的1∶20PBS缓冲液, 再次震荡均匀离心, 除去上清液及粘液层, 直到粘液层被全部除去。在沉淀中加入0.5 mL左右的1∶20PBS缓冲液, 用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀, 形成一个略混浊的悬液。
直接样本制备及测试:在8孔板上的每个孔内滴加25μL的细胞悬液, 风干, 室温下用预冷的丙酮固定10 mL。然后将细胞涂片和病原体的对照玻片通过直接免疫荧光进行检测。
1.3 统计方法
采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析, 计数资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 呼吸道病毒检出情况
230例呼吸道感染的病毒检出呈阳性85例, 检出率为37.0%, 其中最高为呼吸道合胞病毒50例 (21.7%) , 其次为流感病毒A (16例, 6.9%) 、流感病毒B (14例、6.0%) , 见表1。
2.2 不同年龄呼吸道病毒检出情况
呼吸道病毒的阳性检出率随着年龄增长而下降, 其中儿童组检出阳性55例, 阳性率为44.0%, 明显高于成人组 (30例, 28.6%) , 差异有统计学意义 (P<0.05) , 且两者的最高检出率均为合胞病毒, 分别为27.2%和15.2%, 见表2。
3 讨论
研究表明大约80%呼吸道感染由病毒感染引发, 并且可通过空气进行传播, 传染较快并且传染性极强, 很容易导致局部流行或者大流行[3]。研究显示导致病毒性呼吸道感染病原, 比较常见的包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等[4]。尤其是儿童, 为呼吸道病毒感染高发人群, 再加上儿童的抵抗力低于成人, 病毒感染对其身体健康及生活质量造成严重的伤害, 因此早期的诊断和治疗是最有效的控制方法[5]。目前对病毒诊断的方法主要包括病毒分离培养检测、组织培养法、分子生物学检测、免疫法等[6]。其中病毒分离检测是传统方法, 主要是采用电镜对病毒颗粒进行直接检测, 但是该法的检出率较低, 而且比较难以普及应用。随着分子生物学的发展, 分子检测逐步取代了10年前病毒检测的“金标准”—组织培养法, 其灵敏度和特异性较高, 但在对病毒种群遗传学及抗原性变化等方面, 组织培养法仍具有重要的作用[7]。目前免疫技术得到快速的发展, 尤其免疫标记技术得到了广泛的应用, 如直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术等, 特别是直接免疫荧光法已成为一种检测病毒抗原的稳定、敏感及高特异性的方法。而标本是否合格关系到阳性符合率, 因此应尽量采取鼻咽部较深处的分泌物, 在制备标本时一定要将黏液去除干净, 否则会造成非特异荧光从而影响实验结果[8]。
该研究显示, 230例呼吸道感染患者通过直接免疫荧光法进行病毒抗原检测, 呈阳性85例, 检出率为37.0%, 其中最高为呼吸道合胞病毒50例 (21.7%) , 其次为流感病毒A (16例, 6.9%) 、流感病毒B (14例, 6.0%) 。并且呼吸道病毒的感染阳性率随着年龄增长而下降, 儿童组阳性检出率明显高于成人组差异有统计学意义 (P<0.05) , 由此说明呼吸道感染与流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、呼吸道合胞病毒、腺病毒等7种病毒密切相关, 直接免疫荧光法可对其进行快速检测, 并且灵敏度及特异性均较高, 易于标准化, 能满足实验室对病毒检测要求, 应在临床中推广应用。
参考文献
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荧光免疫分析 篇4
1 材料与方法
1.1 Mini VIDAS检测原理
VIDAS单核细胞增生李斯特菌Ⅱ分析是一种用自动化VIDAS仪器进行的酶联荧光免疫分析 (ELFA) 。SPR用单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体包被。各种试剂均密封在试剂条内。将增菌肉汤加于试剂条上, 在特定时间内样本在SPR内、外反复循环。样本中的单核细胞增生李斯特菌抗原与SPR内面的单核细胞增生李斯特菌抗体结合, 未结合的样本则被洗去。标记有碱性磷酸酶的抗体也在SPR内外循环, 并与SPR内面捕获的单核细胞增生李斯特菌抗原结合, 最后洗去未结合抗体标记物。在SPR中加入荧光底物, 磷酸4-甲基伞型物。在SPR内面上酶催化底物分解为具有荧光的产物4-甲基伞形酮。通过VIDAS的光扫描仪在世界范围内450 nm测定荧光强度。
1.2 仪器和试剂
法国生物梅里埃 (Biomerieux) Mini VIDAS全自动荧光免疫分析系统;美国SHELLAB电热恒温培养箱;英国Grant OLS200电热恒温水浴箱。
LEB增菌肉肠、FRASER肉汤、VIDAS单核细胞增生李斯特菌Ⅱ (LMO2) 试剂条均由Biomerieux公司生产。均在有效期内使用。单核细胞增生李斯特菌微量生化鉴定管:广州环凯微生物科技公司生产。
1.3 菌株来源
1.3.1 质控菌株来自组织单位, 半固体质控菌种管两管, 将质控菌株编组, 由参加质控各实验室随机抽取。
1.3.2 实验对照菌株单核增生李斯特菌2株, 沙门菌2株均为本试验室流病监测分离所得。
1.4 试验方法
从质控菌种管转种于10 ml LEB肉汤置30℃±1℃恒温箱培养24 h, 吸取1 ml LEB肉汤于10 ml FRASER肉汤置30℃±1℃恒温箱培养24 h。取Farser FRASER肉汤1 ml, 置97℃±1℃水浴箱10 min灭活。取500μl加入VIDAS LMO2试剂条, 同时加阴阳性对照。用MiniVIDAS全自动荧光免疫分析系统进行快速筛查, 70 min获得结果。同步用国标法—GB4789.30-2003规定方法进行检测。
2 结果
2.1 Mini VIDAS检测两份质控菌株, 1号为阳性, 2号为阴性;采用国标法检测两份质控菌株, 确认1号为单核增生李斯特菌。两种方法检测阳性标本为同一标本。
2.2 实验对照菌株经Mini VIDAS检测结果符合, 未发现交叉假阳性。
2.3 生化试验结果, 见表1。
2.4 协同溶血试验
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌, 在它们两者中间垂直接种可疑李斯特菌, 但不要触及它们, 30℃培养48 h, 检查平板中垂直接种点对溶血的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点溶血明显增强。
3 分析与讨论
3.1 质控结果表明, 两份质控菌株, 1号为单核增生李斯特菌, 2号为阴性;Mini VIDAS和国标法两种方法检测阳性标本为同一标本, 结果一致。实验对照菌株经Mini VIDAS检测结果符合, 未发现交叉假阳性。说明Mini VIDAS检验结果准确, 无假阳性、假阴性。
3.2 李斯特菌属现分为6个种, 在环境中广泛分布, 对未加工原料、部分加工食品及发酵食品具有潜在危害。单核增生李斯特菌是唯一对人致病的菌种, 对人危害极大。人类李斯特菌可引起流产、脑膜炎、败血症和脑炎。用传统的分析方法为获得最后结果, 必须经过一些烦琐、费力操作及长时间的培养, 实验室诊断要7 d才能出来。本次质控试验, 用Mini VIDAS 48 h报出结果, 对于检测阴性的菌株样本能很快作出非单核增生李斯特菌的判断, 节省了大量的试剂与器皿。与传统方法相比, 大大缩短了检验时间, 提高了工作效率。
3.3 Mini VIDAS容量大, 有两个试验仓, 一次可检测多份样品, 可同时进行两种以上不同项目的检测。在发生突发性公共卫生事件, 特别是发生食物中毒时, 检验结果能快速准确[2], 为疾病控制尽早作出防控决策, 提供依据。
参考文献
[1]GB/T4789.30-2003.食品卫生微生物学检验.
荧光免疫分析 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料:
选择我院2014年6月至2015年6月收治的肝病患者3580例作为对比实验研究观察组;同期选择健康体检人员3580例作为对比实验研究对照组;观察组 (1790例) :男994例, 女796例;年龄分布范围为35~79岁, 患者的平均年龄为 (63.12±10.12) 岁;患者的疾病分期为:慢性肝炎属于轻度的患者412例, 慢性肝炎属于中度的患者396例, 慢性肝炎属于重度的患者453例, 属于肝硬化的患者523例;对照组 (1790例) :男1200例, 女590例;年龄分布范围为36~82岁, 患者的平均年龄为 (63.23±10.15) 岁;观察两组研究对象的年龄分布, 均衡性显著 (P>0.05) 。
1.2 方法:
对于观察组肝病患者以及对照组健康人员, 临床均选择时间分辨荧光免疫法实施肝纤四项检测。对于所有研究对象, 要求在清晨保持空腹状态, 对静脉血液 (8 m L) 实施采集, 完成后于一次性试管 (2支) 中有效放入, 每支剂量为2.5m L, 于室温条件下进行放置, 时间为30 min, 实施血清分离[2]。选择时间分辨荧光免疫法展开HA (血清透明质酸酶) 水平、PCⅢ (Ⅲ型前胶原) 水平、LN (层粘连蛋白) 水平以及Ⅳ-C (Ⅳ型胶原) 水平检测, 最终对两组研究对象的临床检测结果进行对比。
1.3 统计学方法:
对于观察组肝病患者以及对照组健康体检人员数据的统计学分析, 临床均选择统计学软件SPSS17.0完成, 对于肝纤四项检测结果实施t检验, 以 (±s) 表示, 当P<0.05为存在明显差异以及统计学意义。
2 结果
对于对照组1790例健康人员, 其HA水平为 (93.81±19.69) ng/L, LN水平为 (69.62±21.29) ng/L, 患者的PCⅢ水平为 (6.29±1.92) ng/L, Ⅳ-C水平为 (7.42±2.43) ng/L;对于轻度慢性肝炎患者, 其HA水平为 (123.59±42.27) ng/L, LN水平为 (87.81±27.59) ng/L, 患者的PCⅢ水平为 (9.36±2.32) ng/L, Ⅳ-C水平为 (10.57±3.17) ng/L;对于中度慢性肝炎患者, 其HA水平为 (176.69±57.72) ng/L, LN水平为 (99.53±34.42) ng/L, 患者的PCⅢ水平为 (13.37±3.73) ng/L, Ⅳ-C水平为 (13.39±4.56) ng/L;对于重度慢性肝炎患者, 其HA水平为 (183.35±65.35) ng/L, LN水平为 (156.66±53.39) ng/L, 患者的PCⅢ水平为 (21.22±6.63) ng/L, Ⅳ-C水平为 (21.32±6.19) ng/L;对于肝硬化患者, 其HA水平为 (654.36±112.55) ng/L, LN水平为 (208.77±61.13) ng/L, 患者的PCⅢ水平为 (43.77±9.76) ng/L, Ⅳ-C水平为 (27.31±8.15) ng/L;伴随着患者疾病病程的发展, 患者的HA水平、PCⅢ水平、LN水平以及Ⅳ-C水平表现为一定程度的升高, 同对照组健康人员进行比较, 表现出显著差异 (P<0.05) 。
3 讨论
HA作为大分子非胶原糖蛋白的一种, 针对患者肝内生纤维量以及患者肝细胞受损情况可以做到准确反映, 属于对肝硬化以及纤维化进行判断的一种敏感指标[3,4]。LN作为基底膜中一种非胶原性结构蛋白, 其由患者的内皮细胞以及患者的贮脂细胞有效合成, 同患者肝纤维以及炎性细胞发生的浸润程度表现出正相关[5]。PCⅢ作为一种胶原蛋白, 通过对其血清含量实施检测, 针对患者肝内Ⅲ型胶原合成可以进行准确反映, 伴随着慢性肝炎疾病的发展, 患者的纤维化程度表现出一定程度的增加后, 患者的PCⅢ水平会表现出一定程度的升高[6]。Ⅳ-C作为基底膜的一种重要成分, 针对肝纤维化的早期判断可以发挥显著的价值[7]。
通过对本次实验结果进行分析发现, 伴随着患者疾病病程的发展, 患者的HA水平、PCⅢ水平、LN水平以及Ⅳ-C水平表现为一定程度的升高, 同对照组健康人员进行比较, 表现出显著差异 (P<0.05) 。有效证明采用时间分辨荧光免疫分析法对肝病患者实施肝纤四项检测的临床价值。
综上所述, 对于肝病患者, 临床采用时间分辨荧光免疫分析法实施肝纤四项检测, 对于患者肝纤维化进程可以详细了解, 对于肝病疾病的临床治疗提供准确参考依据。
摘要：目的 探讨选择时间分辨荧光免疫分析法对肝病患者实施肝纤四项检测的临床价值。方法 选择我院2014年6月至2016年6月收治的肝病患者3580例作为对比实验研究观察组;同期选择健康体检人员3580例作为对比实验研究对照组;对于所有研究对象于临床展开HA (血清透明质酸酶) 水平、PCⅢ (Ⅲ型前胶原) 水平、LN (层粘连蛋白) 水平以及Ⅳ-C (Ⅳ型胶原) 水平检测, 通过对比检测结果以突出时间分辨荧光免疫分析法检测肝病患者肝纤四项的临床价值。结果 伴随着患者疾病病程的发展, 患者的HA水平、PCⅢ水平、LN水平以及Ⅳ-C水平表现为一定程度的升高, 同对照组健康人员进行比较, 表现出显著差异 (P<0.05) 。结论 选择时间分辨荧光免疫分析法对肝病患者实施肝纤四项检测, 针对患者肝纤维化的相关情况可以做出准确反映, 针对患者的疾病预后可以进行有效预测, 对于肝病的临床治疗方法研究可发挥显著的价值。
关键词：时间分辨荧光免疫分析法,肝病,肝纤四项
参考文献
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荧光免疫分析 篇6
1资料与方法
1.1一般资料:选择2014年1~12月在本院的同时申请检测ANA和ANAs的门诊和住院患者6121例。其中男1020例,年龄18~75岁,女5101例,年龄14~86岁。
1.2 IIF检测ANA:采用德国欧蒙公司提供的ANA(马赛克)IIF试剂盒,商品号:FA1510-1005-1,每个反应区含2种抗原复合基质:HEP-2细胞和猴肝组织。以抗体滴度≥1∶100为阳性。
1.3 LIA检测ANAs:ANAs检测采用LIA法,检测试剂盒由深圳市亚辉龙生物科技有限公司提供,其试剂条含有17个测定项目:抗ds DNA、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体(抗histones)、抗Sm D1、抗增殖性细胞核抗原抗体(抗PCNA)、抗核糖体P蛋白抗体(抗P0)、抗SSA/Ro52kd、抗SSA/Ro60kd、抗SSB/La、抗着丝点蛋白B抗体(Cenp B)、抗硬皮病70抗体(抗Scl-70)、抗U1-sn RNP、抗线粒体M2型抗体(抗AMA-M2)、抗J0-1、抗多发性肌炎/硬皮病抗体(抗PM-Sc1)、抗Mi-2、抗Ku。将血清1∶100稀释,严格按试剂说明书操作,肉眼判断反应结果。
1.4统计学分析:统计学分析采用SPSS19.0统计软件,率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差别有统计学意义。
2结果
2.1对2014年6121例标本同时用IIF检测ANA和LIA检测17种自身抗体,发现有IIF检测ANA阳性1200例,占19.6%,阴性4921例,占80.4%,LIA检测ANAs阳性1659例,占21.1%,阴性4462例,占70.9%。其中IIF-ANA-/LIA-ANAs+的有1107例,不一致率为22.5%。IIF-ANA+/LIA-ANAs-的有124例,不一致率为10.3%。见表1。
2.2在1107份IIF-ANA-/LIA-ANAs+标本中,中阳性率最高的前五种自身抗体是SSA/Ro60kd、SSA/Ro52kd、抗Sm D1、抗SSB抗体、抗histones,阳性率为分别为29.62%、18.32%、10.20%、9.58%、8.61%,总占76.33%,其余的占23.67%。见表2。
3讨论
抗核抗体是以细胞成分为靶抗原的器官非特异性自身抗体的总称,以Hep-2细胞为抗原基质的间接免疫荧光法(IIF)被认为是ANA检测的“金标准”[2]。而随着靶抗原的纯化技术不断提高,不断涌现自动化程度较高、易于标准化的检测方法,其中LIA是近年来研究较多的一种检测方法。但在实际检测过程中,我们会发现IIF检测ANA与LIA检测ANAs的结果不一致,笔者通过对二者不同结果进行分析,试图阐述该类标本检测自身特异性抗体的临床意义。
在对2014年6121例标本同时用IIF检测ANA和LIA检测17种自身抗体中发现,IF-ANA-/LIA-ANAs+的有1107例,不一致率为22.5%。其中阳性率最高的前五种自身抗体是SSA/Ro60kd、SSA/Ro52kd、抗Sm D1、抗SSB抗体、抗histones,阳性率为分别为29.62%、18.32%、10.20%、9.58%、8.61%,总占76.33%,其余的占23.67%,结果与周仁芳等人的报道的以SSA为主要抗体一致[3]。分析原因可能是HEP-2细胞SSA的表达丰度低以及固定过程中抗核抗原出现弥散丢失。有文献报道,如选择转染Ro60c DNA的HEp-2000细胞基质可提高检测的灵敏度[4],另外其他抗体也有不同程度的漏检,笔者认为可能是:(1)IIF中HEp-2细胞为人源的细胞,部分表达的靶抗原含量低,且不均一,不同固定方法对特定抗原可能会丢失,故容易漏检,而LIA所包被的是来源于牛的胸腺和脾脏纯化抗原,含量高且固定,当标本抗体浓度低时,也可被检测(灵敏度高)。(2)方法学上IIF一般手工操作,且操作繁琐,滴度判断需系列稀释,荧光染色不稳定,荧光类型需肉眼判断,少见的特殊类型还需经验丰富专业技术人员鉴定等;而IIF可自动化,判读方便,重复性较好。
而IIF-ANA+/LIA-ANAs-的有124例,不一致率只为10.3%,表明以Hep-2细胞作为抗原基质的IIF法能检测出绝大多数自身抗体,是目前筛选ANA的理想实验。
综上所述,IIF-ANA与LIA-ANAs的检测有其互补性,二者不相互替代。IIF-ANA具有覆盖ANA抗体面广,同时即是筛查试验又是ANA检测金标准的特点,而LIA-ANAs有较高的检测敏感性和疾病特异性,故两种方法学间存在检测敏感性和特异性的差异。如果单用任何一种方法检测都有可能造成ANA阳性结果的漏检、漏报或AID的漏诊。因此,临床应用时,尤其对AID的早期诊断、鉴别和治疗,需联合进行IIF-ANA筛查和LIA-ANAs检测,减少漏诊或误诊。
参考文献
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荧光免疫分析 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2013年1月-2015年12月在我中心体检的体检者750例作为检测对象, 其中男420例, 女330例;年龄30~52 (38.1±6.23) 岁。
1.2 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测方法
使用仪器:MK3全自动酶标仪, MK3全自动洗板机, 移液器 (上海热电仪器有限公司生产) , 生物安全柜 (苏州净化设备有限公司生产) 。试剂生产厂家:上海科华生物制药有限公司, 所有试剂均批批检合格且有效期内使用。操作方法:首先在酶标孔内加入100μl样品稀释液, 阳性及阴性对照空不加, 分别在相应的酶标空内加入10μl样品, 设置2空阳性对照孔, 3空阴性对照孔, 每空加入100μl阳性或阴性对照, 加样完成后封板37℃温育60min, 用MK3全自动洗板机洗板5次, 然后每空加入酶结合物100μl, 再次封板37℃温育30min, 然后用MK3全自动洗板机洗板5次, 每空加入底物缓冲液50μl及底物液50μl, 混匀后再次封板37℃温育30min, 每空加入终止液50μl, 选择酶标仪450/630波长测量结果, 按照试剂说明书判断结果。
1.3 荧光定量PCR检测方法
使用仪器:PCR仪器:PTC200GAJF, 提取仪器:西安天隆科技有限公司。试剂厂家:艾康生物技术有限公司。操作方法:首先使用天隆全自动提取仪进行核酸提取, 提取后使用荧光定量PCR仪进行定量检测, 检测参数的设置及结果判断严格按照试剂说明书进行。
1.4 质量控制
ELISA检测方法及荧光定量PCR检测方法均加入阳性及阴性对照进行质量控制。
1.5 统计学方法
应用SPSS 16.0统计软件进行数据处理。计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
本组750例体检者中ELISA法检出阳性21例, 阳性率为2.80%, PCR法检出阳性40例, 阳性率为5.33%, 两种检测方法检测结果比较差异有统计学意义 (χ2=6.170, P<0.05) 。
3 讨论
丙型肝炎主要是因机体受到丙型肝炎病毒入侵而引起的一种血液传播性传染病, 目前在世界范围内广泛流行, 普通人群均易感, 感染年龄也无大小之分, 各个年龄阶段均可感染[4]。近年来丙型肝炎在我国的流行趋势也越来越严重, 其中多数会引发严重肝炎, 如果在感染初期不能得到及时有效的治疗, 多数患者会转变为慢性丙型肝炎患者, 丙型肝炎病毒感染的一个重要特点就是慢性转化率很高, 随着病程的延迟, 患者的肝脏组织会出现不同程度的病变, 并且随着时间的推移而进行性加重, 再严重的患者则会出现原发性肝癌, 给患者造成严重的经济及心理负担[5]。丙型肝炎的传播途径多为血液传播, 其次为母婴及性传播, 以前丙型肝炎多在吸毒等特殊人群中传播, 目前已经有向一般人群流行的趋势, 需引起医学界的重视。因此对丙型肝炎进行早发现、早诊断、早治疗是控制病情恶化的主要措施, 丙型肝炎仅依据临床症状很难作出正确的诊断, 因此必须要结合实验室检测结果综合判断[6]。ELISA用于丙型肝炎抗体的检测, 是当前各家实验室较为常用的检测方法, 该方法具有较高的敏感性和特异性, 基本可作出正确的判断。其操作方法主要为患者血清中的抗-HCV, 血清丙型肝炎抗体通过与酶标孔上已经包被好的抗原相结合, 然后与酶标记物相结合, 最后加入底物显色, 加入终止液后使用酶标仪测量吸光度, 通过吸光度值进行结果判断[7]。荧光定量PCR是一种近年来出现的新型检测方法, 其检测原理主要为选用丙型肝炎病毒保守基因片段设计特异引物及特异Tapman探针, 该探针能与引物扩增区域中间的一段c DNA模板特异性结合。在PCR延伸反应过程中, Taq酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来, 从而脱离3’端光淬灭基因的屏蔽, 能接受光而发出可供仪器检测的荧光, 从而在全封闭反应体系中对丙肝病毒核酸的自动化检测。该检测方法具有高度敏感性及特异性[8]。本结果显示, ELISA法检出阳性率低于荧光定量PCR法, 说明使用荧光定量PCR检测丙型肝炎感染情况, 检测结果明显优于传统的ELISA法。在临床检测中, ELISA法检出的结果, 有时需采用确诊实验确定患者的感染情况, 对感染的程度也不能作出明确的判断[9,10]。荧光定量PCR检测技术是表示传染性及复制病毒最可靠指标, 是显示丙肝感染状态及治疗效果的重要指标, 不但可判断患者是否感染丙型肝炎病毒, 同时还可跟踪患者的治疗效果。因此, 荧光定量PCR检测方法用于检测丙型肝炎病毒感染准确可靠, 可在临床检测中推广使用。
摘要：目的 分析酶联免疫吸附试验法和荧光定量PCR检测患者感染丙型肝炎病毒的情况, 以期为丙型肝炎病毒的检测寻找更为合理有效的检测方法。方法 选择2013年1月-2015年12月在该中心体检的体检者750例作为检测对象, 分别采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和荧光定量PCR进行检测, 统计分析检测结果。结果 ELISA法检出阳性21例, 阳性率为2.80%, PCR法检出阳性40例, 阳性率为5.33%, 两种检测方法检测结果比较差异有统计学意义 (χ2=6.170, P<0.05) 。结论 荧光定量PCR检测方法用于检测丙型肝炎病毒感染准确可靠, 可在临床检测中推广使用。
关键词：丙型肝炎,荧光定量PCR,抗-HCV,结果分析
参考文献
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