内源性医学（共7篇）
内源性医学 篇1
循证医学是针对经验医学的不确定性提出的,要求临床医生在对疾病的诊断中要用最可靠的证据证明它是什么或不是什么[1]。头痛病因涉及内科、眼科和耳鼻咽喉科等多学科。患者就诊和临床诊断都有一定误区和盲目性[2]。本文收集笔者所在医院临床确诊的220例鼻源性头痛临床资料,用循证医学方法分析、探讨鼻源性头痛的诊断。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2008年1月～2009年12月笔者所在医院由笔者接诊、检查、诊断、治疗或手术的220例有CT、血常规、C反应蛋白(CRP)检查结果,接受全程治疗,最后确诊为鼻源性头痛的门诊和住院患者。男119例;女101例。病程7 d～6年,其中1～4周33例;4～12周73例;12周～6个月39例;7个月～6年75例。年龄:3～12岁,其中3～5岁29例;6～12岁191例。
1.2 研究方法
按循证医学方法[1]记录患者病程、疼痛部位、规律,鼻部症状、其它伴随症状、鼻腔检查、CT检查、血常规、CRP检查结果、系统评价、诊断。对拟诊为鼻源性头痛患者先给予规范的保守治疗,记录头痛缓解时间和疗效,保守治疗无效或有手术指征者采取手术治疗。记录手术治疗效果和头痛缓解时间。随访:保守治疗随访2个月;手术治疗随访6个月。头痛消失或缓解为有效,确诊为鼻源性头痛。
1.3诊断标准
参考2004年国际头痛协会(IHS)标准[3]将鼻源性头痛分类为鼻窦性头痛和黏膜接触点头痛两种病因。因二者不易区分,并可同时存在,诊断标准又过于繁琐,笔者做如下归纳。(1)鼻窦性头痛:有额面部等特定部位疼痛,鼻、鼻窦有急性炎症证据,炎症消退或有效治疗7 d内头痛缓解。除外鼻外急慢性炎症引起的头痛。(2)黏膜接触点头痛:有颞、眶部等特定部位疼痛,鼻内镜和CT检查有黏膜接触点证据,无鼻、鼻窦急性炎症。麻醉中鼻甲头痛5 min内消失,手术去除接触点头痛7 d内消失并且不复发。
1.4 治疗措施
(1)保守治疗:①鼻腔负压吸引。②鼻腔喷丙酸氟替卡松+口服或静滴抗生素+黏液促排剂。疗程:10 d～4周。(2)手术治疗:对6岁以上顽固性头痛采用。包括纠正鼻腔结构异常,解除黏膜接触点,小范围矫正鼻中隔偏曲,部分切除结构异常中鼻甲形态和位置异常的钩突、过度气化筛泡等。鼻窦炎患者开放鼻窦引流,有腺样体阻塞者同时切除腺样体;鼻窦囊肿患者给予开放鼻窦钳除囊壁等。
2 结果
2.1 220例患儿头痛特点
头痛性质:胀痛、压迫感186例(84.5%)、头昏沉34例(15.5%)。头痛部位:依次为前额及眉心部90例(40.9%);双侧和单侧颞部48例(21.8%);头顶部26例(11.8%);枕部16例(7.3%);眼和内眦部8例(3.6%);面颊部6例(2.7%);无固定位置26例(11.8%)。头痛规律:上午加重90例(40.9%);下午64例(29.1%);无规律或表达不清66例(30%)。
2.2 伴随症状、体征
鼻部症状有鼻塞、流涕、喷嚏、鼻出血等症状之一者160例(72.7%);恶心、呕吐65例(29.5%);发热15例(6.8%)。鼻腔检查:鼻腔黏膜急性充血、有涕者127例(57.7%)。接触点证据见CT检查。
2.3 CT检查
有鼻窦炎和鼻窦囊肿者188例(85.5%);无鼻窦炎32例(14.5%)。根据CT诊断分为鼻窦炎组和无鼻窦炎组。鼻窦炎组有黏膜接触点67例(35.6%);无鼻窦炎组有黏膜接触点者21例(65.6%);有鼻腔解剖变异无接触点7例(21.9%);无异常者4例(12.5%)。
2.4 实验室检查
白细胞总数或CRP任一项增高者65例(29.5%)。其中鼻窦炎组59例(31.4%);无鼻窦炎组6例(18.8%)。
2.5 鼻腔麻醉试验
无鼻窦炎者32例和有鼻窦炎经保守治疗无效者37例接受该项检查,共69例用1%丁卡因+肾上腺素棉片放置嗅裂、中鼻道5 min后取出。无鼻窦炎者32例,头痛全部缓解;鼻窦炎者14例头痛缓解(37.8%)。
2.6 病因诊断
根据诊断标准,诊断为鼻窦性头痛201例(91.4%);接触点头痛19例(8.6%)。
2.7 疗效观察及随访
194例选择保守治疗:头痛7 d内缓解152例(78.4%),2个月内复发128例,再行保守治疗102例缓解。无效或复发37例和有手术指征者26例,共63例接受手术治疗,其中术前诊断鼻窦炎者51例;接触点头痛12例。术后7 d内头痛全部缓解,随访6个月无头痛复发。
3 讨论
3.1 循证医学对鼻源性头痛诊断的指导意义
循证医学强调临床诊断应依赖客观证据而不是个人经验,强调用科学实证的态度寻找临床问题的最佳解决方案[4]。由于鼻源性头痛诊断缺乏金标准,这就尤其需要临床医生用循证医学方法从病史、症状、体征、影像学、鼻内镜检查和实验室检查去寻找鼻-鼻窦急性炎症和黏膜接触压迫的证据,并注意这些证据与头痛的相关性。
3.2 首先要排他性诊断和注意“报警症状”
首先要排除鼻外因素引起的头痛,应特别关注有无生命征改变的“报警症状”。急性头痛要关注体温、脉搏、血压、呼吸、精神、神经症状、伴随症状等。除外颅内感染、颅脑外伤、鼻外其它炎症性疾病、青光眼、偏头痛等。慢性炎症性头痛要想到脑内寄生虫病、颞颌关节炎、牙源性、耳源性、咽源性疾病等。非炎症性头痛要想到青光眼、屈光不正、颅内颅底肿瘤、脑外伤、偏头痛等。
3.3 症状、体征和实验室检查的循证诊断
美国耳鼻咽喉头颈外科协会(AAO-HNS)和HIS都肯定了症状、体征和实验室检查对鼻源性头痛的诊断意义[2,3]。本组病例显示有额、颞、颅面部等特定部位疼痛的患者占88.2%;有上午或午后头痛加重规律者占70%;有鼻部症状者占72.7%;有充血、脓涕等鼻腔炎症者占57.7%;实验室检查有急性炎症者占29.5%。笔者认为额、颞、颅面部规律性疼痛可以作为鼻源性头痛的特点。有鼻部急慢性炎症病史、症状、体征或黏膜接触点证据,实验室检查有急性炎症,基本可以把头痛界定在鼻源性范围内。恶心呕吐是鼻源性头痛的常见症状,但因缺乏特异性未被AAO-HNS和HIS关注。笔者观察鼻源性头痛恶心呕吐不剧烈,因此认为是头痛引起的反射性呕吐或鼻涕刺激咽腔所致。不剧烈的呕吐可以作为与颅脑病变、青光眼和偏头痛等鉴别诊断时的参考。
3.4 CT检查的必要性
CT和鼻内镜检查对鼻窦炎和黏膜接触点头痛的确诊是必要的,尤其对需要鉴别诊断的疑难病例和对治疗无效的病例[1,7]。CT可以发现鼻窦的轻微炎症,影响鼻窦引流的解剖异常和黏膜接触点[6]。Fereidoon等[7]认为鼻窦冠状位CT足以发现接触点病变。但许多专家也发现有慢性鼻窦炎和接触点病变的许多人并无头痛。因此CT诊断并不是鼻源性头痛的金标准,CT检查正常也不能排除鼻源性头痛。必要时应做鼻腔表面麻醉试验和鼻内镜检查明确诊断。
3.5 疗效指标对循证医学诊断的意义
HIS把急性鼻窦性头痛经有效治疗7 d症状缓解,接触点头痛在手术去除接触点后头痛在7 d内消失并且不复发作为鼻源性头痛的诊断标准。由于鼻源性头痛诊断的复杂性和不确定性,经过一定时间的随访确定的治疗效果可以作为诊断的金标准[5]。本组资料显示黏膜接触点和窦口鼻道复合体解剖异常引起的头痛大部分都存在不同程度的炎症,见图1和图4。楼正才等[8]报告接触点头痛经药物治疗1个月痊愈率达37.3%。笔者认为对鼻源性头痛包括无急性炎症证据的接触点头痛的患者,应首选规范的保守治疗,治疗无效或反复复发者才考虑针对病因的手术治疗。
3.6 对鼻源性头痛病因的认识
3.6.1 鼻窦炎和黏膜接触点作为头痛的两种病因可同时存在。笔者认为存在接触点的鼻窦炎患者的头痛病因不应该只是鼻窦炎引起,理论上接触点应先于鼻窦炎发生,继发鼻窦炎后头痛病因应该是双重的。
3.6.2 窦口鼻道复合体解剖异常是鼻源性头痛的关键病因[9],如中鼻甲气房,见图1。中鼻甲曲线异常,见图2。钩突异常,见图3。过度气化筛泡不但影响鼻窦通气和引流,引起鼻窦性头痛,也是造成黏膜接触压迫的常见原因。
3.6.3 HIS认为慢性鼻窦炎除非急性发作不会引起头痛。笔者也观察发现慢性鼻窦炎的头痛发作期实验室检查有急性炎症,但频繁头痛发作和持续头痛病程在12周以上的鼻窦炎应该诊断为慢性鼻窦炎。因此,笔者认为慢性鼻窦炎也应该是头痛的病因之一。
附图
参考文献
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内源性医学 篇2
1 雌激素与生长激素基本情况
生长激素有着促进长发育和调节人体的代谢的作用。此过程可由GH直接发挥作用或通过类胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)发挥作用。肝脏在性发育阶段的身高突增等体现了雌激素和雄性激素对GH的调节。在此代谢过程中起着至关重要的作用。人体循环中的IGF-1主要来源于肝脏,而且肝脏又是一个性激素反应性器官。
雌激素的主要功能是促进女性的第二性征发育、维持女性的第二性征和女性的生殖功能。青春期的生长和发育就是GH和雌激素相互作用的结果。GH和雌激素的快速增高,触发了生长发育,并出现与之相应的巨大生理改变,表现出性别特有的身体构成。雌激素对GH的调节作用可以发生在多个层面,分泌、清除和作用。有许多的研究已经证明,雌激素通过在下丘脑和垂体层面,影响GH的分泌。另有许多的研究证明,雌激素对GH作用的调节重要作用于肝脏,独立于GH分泌。鉴于雌激素和GH之间密切关系,有研究者观察到了雌激素补充治疗和GH补充治疗之间的关系。口服雌激素影响了GH的代谢作用,而经皮给予雌激素却无此效应。在给予GH补充治疗的成人中,口服雌激素补充可以影响GH补充治疗的效果。雌激素通过影响IGF-1轴从而影响GH分泌和功能[2]。
在女性,雌激素调节GH分泌有着显著证据。血清雌二醇和GH水平在青春期女孩显著相关[3]。在青春前期通过雌激素铺垫可以增强GH激发试验的反应性。在月经周期中GH分泌平均高峰与卵泡期末高水平雌激素相一致[4]。女性绝经后24 h平均GH和IGF-1水平降低系继发于雌激素降低所致[5]。
2 内源性雌激素对GH的影响
大量的研究证明,成人的GH分泌受雌激素影响。Frantz和Rabkin首先提出:女性的GH水平较男性高,并且随着月经周期变化。有研究发现,刺激后或者自主的GH分泌,年轻女性较绝经后女性高,也较年轻男性高,这种差异与外周循环中的雌二醇水平密切相关。而在绝经后,女性和男性之间的GH和IGF-1水平的差异消失。有关月经周期中GH分泌的研究结果揭示,围排卵期的GH分泌和IGF-1水平较卵泡早期高。在一个针对围绝经期女性长达6年的前瞻性研究中发现,绝经后的女性较绝经前女性的IGF-1水平明显降低,表明雌激素独立于年龄对GH/IGF-1轴发挥效应。这些观察性研究结果强有力证实,在女性生理性调节GH分泌中,雌激素或者相关的卵巢因子(与雌激素同时分泌)起着重要作用。在妊娠期间,循环雌激素水平明显升高,直到妊娠终末期,雌二醇的生成速度可以达到20 mg/d,大约是非妊娠状态的200倍。在人类,二种相关基因(组织特异表达)形成了GH的同分异构体,GH-N基因位于垂体前叶,GH-V基因位于胎盘。在人类的妊娠早期,垂体GH是唯一可在母体血液中能够检测出的GH;随后,垂体GH分泌逐渐被抑制,取而代之的是胎盘GH分泌;至妊娠末期,仅胎盘GH能在母体的循环中测出。胎盘GH是母体血清中IGF-1水平的主.要调节因子,具有与垂体GH相似的代谢和促生长效应,但没有催乳作用。调节胎盘GH分泌的因子尚未明了。
除了性激素,成人GH分泌受到营养、脂肪和体育运动等的影响。在三十多岁至五十多岁期间,随着年龄的增加,在男性中GH分泌下降较女性更快。腹部脂肪块是24 h GH分泌的独立的预测因子,GH水平低者腹部脂肪沉积明显。GH分泌、身体构成和外周代谢之间的关系是复杂的,又是密切相关的,但不能明确是因果关系。回顾各种研究结果,结果提示在女性和男性中,雌激素在调节GH/IGF-1轴方面起着重要的作用。
3 外源性雌激素对GH的影响
在Turner综合征女孩和绝经后女性中给予口服雌激素,可以增加外周循环中的GH水平[6]。然而,雌激素治疗对IGF-1的影响各不相同,有报告没有影响的,甚至有的报告使IGF-1水平下降[11]。许多有关雌激素替代治疗的研究报告,雌激素能降低IGF-1水平。肝脏是性激素反应性器官,也是GH调节代谢的主要场所,IGF-1的主要来源地。在口服雌激素后,门静脉循环中雌激素水平超过生理浓度,由此从不同的方面影响肝脏功能。因为雌激素在肝脏细胞色素系统中代谢活跃,口服剂量必须超过雌激素每天产生速度的数倍才能达到所需要的全身效应。大剂量给药,导致门静脉系统中表现出药理性浓度,而不是在自然状态下的生理性浓度。这就是所谓的首过效应,刺激血管紧张素原、血液凝集因子、脂蛋白和数个甾体激素结合蛋白的合成。如果以非口服途径给予雌激素,就避免了这些效应。GH在血循环中与高亲和力结合蛋白(GHBP)结合。GHBP主要来自肝脏,从GH受体(GHR)的细胞外部分经蛋白裂解而来。GHBP改变了GH的分布和药代动力学指标,可能调节了GH的作用。
4 雌激素给药途径或者剂型对GH的影响
新近的证据表明,依赖于给药途径,雌激素对GH/IGF-1的生理作用发挥了重要的作用。Weissberger等研究,在绝经期女性中,分别给予口服(乙炔基雌二醇,20μg/d)和经皮(17β-雌二醇,100μg/d)雌激素。二种治疗方案都导致外周循环中LH和FSH水平的下降,并且具有可比性,提示总体雌激素生物等效性。与体质量匹配的绝经期女性比较,口服给予乙炔基雌二醇导致24 h平均GH浓度增加3倍。与此相反,经皮给予17β-雌二醇,对24 h平均GH浓度没有影响。口服雌激素又导致平均IGF-1水平下降,而经皮给予雌激素导致很小但是具有意义的平均IGF-1水平上升。平均GHBP活性在绝经前和绝经后女性相似,但是仅仅在口服雌激素女性中明显增加。由于GHBP浓度的增加,其结合活性增加,但是亲和力不增加。如此,绝经后女性中给予雌激素治疗,对GH/IGF-1轴的影响受给药途径的影响[8]。BelIantoni等[9]报告,口服雌激素,而不是经皮给予雌激素,增强对GHRH反应而增加GH分泌。GH对阶梯剂量GH释放肽的反应,可以被口服雌激素放大,导致循环中IGF-1水平的下降。一些研究者已经证实,口服途径给予雌激素降低外周循环IGF-1。肝脏生成IGF-1被抑制,可能是口服给予乙炔基雌二醇药理学效应的结果。首过效应也可能解释口服和经皮给予雌激素对血清GHBP效应的不同,因为肝脏富含生长激素受体的配体(GHRs),而GHBP就来自于GHRs。由于GHBP在体外研究中表现为是使GH作用钝化,尽管GH浓度增加,GH配体可能是解释IGF-1下降的另外一个机制。GH分泌增加不是雌激素的最初效应,而是IGF-1负反馈抑制作用消失的继发性结果。
在上述研究所使用的雌激素制剂不同。因此,不能完全除外口服和经皮剂型作用相反的可能性,即反映的是内在的化学上的不同,而不是不同的给药途径。有研究表明,与其他雌激素比较,乙炔基雌二醇诱导肝脏蛋白质合成能力较强,这似乎比它对促性腺激素分泌的抑制能力更强。当乙炔基雌二醇通过肠外途径(经阴道)给药时,这些肝脏效应并不完全消除。有学者比较了3种口服雌激素制剂的效应(乙炔基雌二醇20μg,结合马雌激素1.25 mg,戊酸雌二醇2 mg)。所有3种制剂都导致了LH和FSH的明显下降,SHBG和血管紧张素原升高。GHBP的升高与这些肝脏蛋白质平行。3种雌激素制剂,每个都能使IGF-1水平明显下降,增加平均24 h GH和GHBP浓度。在治疗期间,平均24 h GH浓度的上升明显与IGF-1下降的百分比呈负相关[10,11]。这种由3种雌激素诱导的相反方向的效应,进一步支持,刺激GH分泌的原因是IGF-1抑制性负反馈作用的降低。CHBP的增加是对口服而不是经皮雌激素的反应,提示与SGBG和血管紧张素原相似,GHBP为雌激素敏感性肝脏蛋白质。从质的方面看,所有3种制剂表现出相似的反应,提示IGF-1水平的降低是口服给予雌激素对肝脏的内在效应。不管哪种雌激素,全身循环中雌激素水平提高到足够高的水平,应该导致在肝脏功能方面的相似效应。有研究发现在绝经期女性中,当给予17β-雌二醇敷贴,为治疗剂量的7倍,循环中的IGF-1水平下降,同时伴有GH浓度的升高,这些改变与口服给予雌二醇2 mg明显不同。总之,这些结果提示不管是通过门静脉或者全身循环,高浓度的雌激素损伤了肝脏IGF-1的合成。
5 雌激素对IGF结合蛋白(IGFBPs)的影响
IGFBP家族的6个成员(IGFBP-1到6)都已经被发现。IGF-1与IGFBP-3和酸不稳定性亚单位(ALS)结合形成三聚体,IGF-1几乎完全以此形式进行循环,IGFBP-3和酸不稳定性亚单位(ALS)均受GH严重调节。三聚体改变了IGF-1的药代动力学、分布和组织利用度。ALS专由肝脏合成,而许多的外周组织可以产生IGFBP-3。ALS受雌激素影响的方式与IGF-1相似。因此,雌激素对ALS的影响依赖于给药途径和剂量,不受雌激素制剂的影响[12]。因为ALS和IGF-1同存在于肝细胞,雌激素作用的给药途径依赖性提示,对肝脏的首过效应与IGF-1相似。口服雌激素对IGFBP-3的效应不一致。有些研究报告表明,在绝经后女性中具有抑制作用,其他的则不是。出现矛盾性的观察结果的原因还不清楚。有可能的一种推测:对肝脏IGFBP-3的效应被外周组织来源的结合蛋白所稀释了。已经表明IGFBP-3在三聚体中作为转运蛋.白,而未结合的IGFBP-3很快从循环中被清除。在口服雌激素时观察到IGFBP-3水平的下降可能继发于原发的IGF-1和ALS水平的下降。与IGF-1和ALS不同,IGFBP-3在Kupffer细胞中合成,而不是在肝细胞合成,雌激素可以通过不同的方式对其进行调节。在性功能低下的GH缺乏女性中,口服雌激素治疗同样明显降低IGFBP-3和ALS,提示此效应独立于GH。在各个干预研究中,IGF-1的改变与IGFBP-3和ALS的改变平行。因此,雌激素依赖于给药途径和剂量,对三聚体的三个组成部分发挥抑制作用。IGFBP-1也是来自肝脏的蛋白质,受营养和胰岛素的急剧影响,而两者都对其合成具有抑制作用。IGFBP-1与小部分的游离IGF-1结合,减弱生长因子的降低血糖效应。雌激素以给药途径依赖方式对循环中的IGFBP-1水平发生影响;与它对ALS的抑制作用相反,口服给予增加循环中的IGFBP-1,从而进一步减少游离IGF-1,由此降低其活性。如此,当口服给予雌激素时,雌激素对来自肝脏的IGFBPs发挥的巨大的作用,尽管效果各不同。因为IGFBPs改变了IGF-1在组织中的利用度和作用力度,雌激素可能修饰了IGF-1的生物学作用,以给药途径依赖的方式。其他成员IGFBP-2、4、5、6均在肝外组织中产生。IGFBP-5来自骨骼组织,受GH调节,而其他的则不受GH调节。有关雌激素和这些结合蛋白之间调节关系,几乎不知。
鳙内源性转谷氨酰胺酶特性的研究 篇3
在鱼糜的制作过程中, 冷冻鱼糜加盐擂溃后需在0~40℃进行保温, 这一过程即为凝胶化。经过凝胶化的鱼糜具有更好的凝胶强度和弹性, 这是由于鱼糜中含有内源性转谷氨酰胺酶 (transglutaminase, TGase) 的原因。TGase是一种催化酰基转移的酶, 研究表明在鱼糜的低温凝胶化过程中TGase催化肌球蛋白重链的谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基与赖氨酸残基的ε-氨基之间发生交联作用, 生成分子内或分子间ε- (γ-Glu) -Lys非二硫共价键, 这些共价键非常稳定, 能促进蛋白质分子之间发生交联, 从而改善了蛋白质的凝胶性质, 提高了鱼糜的凝胶强度, 提升了鱼糜的品质[1]。
海水鱼糜中的内源性TGase的特性在国内外已有较多的研究[2,3,4,5,6], 从哺乳类动物和植物到海洋生物以及微生物, 研究人员都对TGase进行了相关的分析, 而关于鳙 (Hypophthalmichthys nobilis) 的TGase的研究鲜见报道。文章以中国产量大、精深加工少的鳙为研究对象, 研究鳙TGase的活性以及不同外部因素对其活性的影响, 旨在为淡水鱼糜的品质改良提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鳙购于浙江省杭州市西湖区物美超市;N-苄氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸 (Nα-CBZ-Gln-Gly) 、还原型谷胱甘肽 (GSH) 、L-谷氨酸γ单羟肟酸 (L-glutamic acidγ-monohydroxamate) 均购于Sigma公司;二硫苏糖醇 (DTT) 、乙二胺四乙酸 (EDTA) 、羟胺溶液 (Hydroxylamine solution, NH2OH) 、盐酸 (HCl) 、三氯化铁 (Fe Cl3) 、三氯乙酸 (TCA) 、三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 、氯化钙 (Ca Cl2) 等试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Evolution 60S紫外可见分光光度计 (Thermo Fisher公司出品) ;BSA124S-CW电子分析天平 (Sartorius公司出品) ;PB-10 p H计 (Sartorius公司出品) ;SORVALL RC-6 PLUS冷冻离心机 (Thermo Fisher公司出品) ;TGL-16G台式离心机 (上海安亭科学仪器厂出品) ;IKA T18均质机 (IKA公司出品) ;DK-S24电热恒温水浴锅 (上海森信实验仪器有限公司出品) 。
1.3 试验方法
1.3.1 酶的提取
酶的提取方法参考WOR-RATAO和YONGSAWATDIGUL[4]的方法并稍作改动。鲜鱼购买以后保存在冰中并于20 min内转运至实验室, 后去头、皮及内脏, 取鱼肉。鱼肉混合4倍体积的提取缓冲液均质 (10 mmol·L-1Na Cl, 5mmol·L-1EDTA, 2 mmol·L-1DTT, 10 mmol·L-1Tris-HCl, p H 7.5) , 均质后离心 (16 000 r·min-1, 4℃, 20 min) 。离心后取上清液继续离心 (20 000r·min-1, 4℃, 60 min) , 得到的上清液视为粗酶。
测定在37℃下TGase酶活力, 结果表明, TGase在37℃下1 m L粗酶活力为110.60 U, 比活力为5.59 U·mg-1。
1.3.2 TGase的活性测定
TGase能催化特殊的底物Nα-CBZ-Gln-Gly形成异羟肟酸, 因此可以通过测定异羟肟酸的形成来测定酶的活力[7]。
一份1 m L的基质溶液含有0.4 m L 0.1 mol·L-1醋酸缓冲液 (p H 5.5) 、0.2 m L 0.1 mmol·L-1NH2OH、0.2 m L 0.01 mmol·L-1GSH以及0.2 m L0.15 mmol·L-1Nα-CBZ-Gln-Gly, 加入0.1 m L 3.75mmol·L-1DTT和0.1 m L 6.75 mmmol·L-1Ca Cl2后与0.4 m L 10倍稀释的粗酶液混合, 37℃保温20min, 然后加入0.4 m L混合酸制剂终止反应 (含有1体积12%HCl, 1体积12%TCA和1体积5%Fe Cl3溶液) , 然后离心 (10 000 r·min-1, 4℃, 5min) , 取上清液在525 nm下测定吸光值。使用L-glutamic acidγ-monohydroxamate作为标准物。酶的活力单位数定义为37℃下TGase每分钟催化形成1.0 nmol L-glutamic acidγ-monohydroxamate所使用的酶。
1.3.3 TGase的生化特性研究
测定最佳温度时将反应溶液分别置于0、15℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃和80℃反应20min随后测定酶活。测定最适p H时, p H 4.0~7.5使用0.1 mol·L-1醋酸缓冲液, p H 7.5~9.0使用0.2 mol·L-1Tris-HCl缓冲液, p H 9.0~12.0使用50 mmol·L-1硼酸缓冲液。在测定DTT、氯化钠 (Na Cl) 、EDTA以及各种金属离子的影响时, 钙离子 (Ca2+) 浓度维持在0.4 mmol·L-1。
2 结果与讨论
2.1 温度对TGase活性的影响
鳙的TGase的酶活力随着温度的升高先增加后降低, 最适温度在37~45℃之间。0~15℃时, 随着温度升高酶活力缓慢增加, 超过15℃以后随着温度的继续升高酶活力开始急剧增加并在40℃时到达顶峰, 同时在37~45℃之间基本保持稳定。但当温度超过45℃后继续升高则酶活力急剧降低, 到80℃时已经彻底失去了酶活力 (图1) 。海洋生物如虾夷扇贝 (Patinopecten yessoensis) [8]、长牡蛎 (Crassostrea gigas) [5]、狭鳕 (Theragra chalcogramma) [9]肝脏中的TGase最适温度在35~50℃。淡水鱼种如草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) [11]和尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) [12], 其最适温度分别在37~45℃和35~50℃。该研究中鳙TGase的最适温度与上述结论基本吻合, 这表明来源不同的TGase最适温度虽然各不相同, 但差异不大, 海洋生物和淡水鱼的内源性TGase有着相似的最适温度。
周爱梅等[10]研究表明鳙鱼糜适合在40℃进行凝胶化, 其最大凝胶强度出现在40℃, 保温1 h。同时通过SDS-PAGE发现在40℃时随着时间的推移鳙鱼糜中肌球蛋白重链逐渐减少。这与鳙TGase最适温度相一致。可以认为在制作鱼糜的低温凝胶化过程中内源性TGase起着关键作用, TGase能够催化肌球蛋白重链之间的相互交联进而可以提高鱼糜制品的凝胶强度[11]。
2.2 p H对TGase活性的影响
鳙的TGase的酶活力随着p H的升高先增加后降低, 最适p H为7~7.5。p H在4~5时TGase酶活力为零。但随着p H的上升, 酶活力开始增加并在p H 7~7.5维持着较高的水平。但随着p H的进一步上升, 酶活力开始出现下降 (图2) 。淡水鱼中罗非鱼的TGase最适p H为7~7.5[12], 与鳙的TGase最适p H相一致, 草鱼的TGase最适p H在8~9[11]。海洋生物红金线鱼 (Nemipterus furcosus) 肝脏中的TGase最适p H在8.5~9.0[13], 而来自长尾大眼鲷 (Priacanthus tayenus) [14]、真鲷 (Pagrosomus major) 鱼肝[6]的TGase最适p H分别为8.0、9~9.5。这表明来自不同鱼种的内源性TGase最适p H各不相同。
2.3 Ca Cl2对TGase活性的影响
鳙TGase在Ca2+处于低浓度 (0~0.4 mmol·L-1) 时, 其酶活力随着Ca2+浓度升高而增加。Ca2+浓度进一步升高, 酶活力基本保持稳定, Ca2+浓度为2.2 mmol·L-1时酶活力达到最高值;但当Ca2+浓度超过2.2 mmol·L-1时, 酶活性受到抑制, 酶活力开始降低;当Ca2+浓度达到4 mmol·L-1时酶活性被完全抑制, 酶活力降为零。鳙的内源性TGase所需的最适Ca2+浓度在0.4~2.2mmol·L-1之间 (图3) 。
哺乳动物及鱼的内源性TGase通常需要Ca2+作为激活剂[15], 由试验结果可知鳙的TGase显然也对Ca2+有依赖性。研究表明在淡水鱼中罗非鱼的TGase在Ca2+浓度为1.2 mmol·L-1时活性达到最大[12], 草鱼的TGase在0~1 mmol·L-1时酶活随着Ca2+浓度升高而增加[11]。海洋生物中来自真鲷鱼肝[6]、长牡蛎[5]、扇贝[8]以及狭鳕鱼肝[9]的TGase所需的最适Ca2+浓度分别为0.5 mmol·L-1、25 mmol·L-1、10 mmol·L-1和3 mmol·L-1。这表明不同来源的TGase所需的激活剂Ca2+浓度各不相同。
有研究表明, Ca2+引诱酶的构象发生改变, 从而使活性部位的半胱氨酸暴露出来[16], 进而促进酶反应的发生。因此较低浓度的Ca2+ (0~2.2mmol·L-1) 可以提高内源性TGase的酶活力, 但继续提高Ca2+浓度则会抑制内源性TGase的酶活力, 这与草鱼中的TGase相类似[11]。但鳙的TGase对Ca2+更加敏感, Ca2+浓度超过4 mmol·L-1时便失去了活力。周爱梅等[10]研究表明适量添加Ca2+可明显改善鳙鱼糜的凝胶特性, 这是因为Ca2+作为鳙内源性TGase的激活剂, 适量添加Ca2+可以提高酶活力, 促进肌球蛋白重链之间的交联提高凝胶强度。因此在制作鳙鱼糜时, 适量添加Ca2+可以提高鳙鱼糜的品质。
2.4 Na Cl和K+对TGase活性的影响
鳙内源性TGase的酶活力随着Na Cl浓度升高而降低 (图4) , 同时由表1可以看出0.1 mmol·L-1钾离子 (K+) 也会抑制酶的活性, 因此Na Cl和K+会抑制鳙内源性TGase的活力。有研究表明淡水鱼中的内源性TGase易受到盐类的影响, 草鱼[11]、尼罗罗非鱼[12]的内源性TGase活力都随着Na Cl浓度升高而降低。高浓度的Na Cl可以引起酶分子的构象发生改变, 从而抑制了酶的活性[5,17]。然而对于海洋生物如扇贝、日本长额虾 (Pandalus nipponensis) 和太平洋褶柔鱼 (Todarodes pacificus) , Na Cl可以显著增加其TGase活力[14]。这表明内源性TGase所需的最适条件和来源生物的生活条件有着密切联系。鳙作为一种淡水鱼, 其内源性TGase需要在低盐环境下工作, 高盐的环境会抑制TGase的酶活力, 这与其他淡水鱼中的TGase表现出相同的性质[11,12]。
2.5 DTT对TGase活性的影响
低浓度 (0~0.2 mmol·L-1) 的DTT可以激发酶的活性, DTT浓度继续升高酶活力有所降低 (图5) 。有研究表明0~1 mmol·L-1和0~5 mmol·L-1的DTT可以分别提高草鱼和罗非鱼内源性TGase的酶活力[11,12], 浓度继续升高酶活力稍有降低, 这与鳙的TGase性质相似。
这是因为DTT作为一种强还原剂, 可以抑制酶的活性中心的巯基被氧化失活, 进而提高酶的活力。但尽管巯基保护试剂DTT对酶活力有着激活作用, DTT同时也可以逆转激活作用。因为它同时也是蛋白质变性剂可以破坏二硫键, 变性目的蛋白。因此当DTT浓度超过0.2 mmol·L-1时酶活力反而降低。不过可能由于空间位阻的作用, DTT对鳙、草鱼以及罗非鱼中的TGase的影响没有很明显。
2.6 金属离子和抑制剂对TGase活性的影响
铜离子 (Cu2+) 、锌离子 (Zn2+) 和铅离子 (Pb2+) 在浓度为10 mmol·L-1时会使鳙内源性TGase完全失活 (表1) 。这一现象不仅和淡水鱼中的草鱼、罗非鱼的TGase性质相类似[11,12], 也和很多海洋生物例如乌贼鳃、鲎 (Limulus polyphemus) 血细胞以及微生物中的拉达卡链霉菌 (Streptoverticillium ladakanum) 的TGase性质相似[18,19,20]。这可能是因为Cu2+、Zn2+和Pb2+这些金属离子对巯基有着很强的亲和能力。由Cu2+、Zn2+和Pb2+能抑制TGase的活性, 可知鳙的内源性TGase和其他来源的TGase一样, 在活性部位具有硫醇基团[8,18]。
铁离子 (Fe3+) 、亚铁离子 (Fe2+) 、镁离子 (Mg2+) 和钡离子 (Ba2+) 会抑制酶的活性。有研究表明Mg2+和Ba2+勉强可以激活真鲷、狭鳕鱼肝中TGase的活性[6,9]。但Fe3+、Fe2+和Mg2+作为常见的酶激活剂并未提高鳙内源性TGase的活力, 这可能是因为这些金属浓度太低不能引起TGase构象发生正确的改变[6], 也有可能是因为Ca2+的拮抗作用抑制了这些金属离子发挥作用。
EDTA能完全抑制TGase活力, 这与真鲷、草鱼、尼罗罗非鱼、鲎血细胞以及虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 中的现象相一致[6,11,12,19,21]。1) 由于EDTA作为金属离子螯合剂可以与激活剂Ca2+结合从而抑制了酶的活性;2) EDTA是一种巯基烷基化剂, 能与TGase活性部位的巯基结合使其烷化[11], 这进一步证明了TGase的活性部位含有硫醇基团。
3 结论
内源性医学 篇4
总的来看, 关于数学焦虑国外的研究比较多, 也较为成熟, 而国内的研究与国外相比数量少了许多, 并且在研究方法上也相对较为简单。综合国内外的研究不难发现, 数学焦虑的影响因素可以分为两大部分:外源性因素和内源性因素。外源性因素即来自于社会、学校和家庭等外部环境的因素, 如教师的教学方式、家长的影响、社会文化偏见的影响和数学学科性质等等。内源性因素是来自于学习者本身的因素, 如学生的人格特征、数学学习效能感、数学学习动机、学习归因倾向等等[7]。
本文认为内因是决定事物发展的主要因素, 因此将重点研究学习者自身的特征, 如数学学习自我效能感、数学学习归因倾向、数学学习动机、数学观等内源性影响因素对数学焦虑的影响。
一、研究方法
1. 研究对象
在江苏徐州选取一所中学, 每个年级随机抽取60人作为被试。共获得被试360人, 收回有效问卷340份。
2. 研究工具
研究工具主要是中学生数学观问卷、中学生数学焦虑问卷、数学学习动机问卷、数学学习归因方式问卷。
(1) 中学生数学观问卷
参照有关文献 (参见文献[7][8]) 并结合本研究的目的编制。问卷分为8个维度, 采用五级评分, 分数越高说明该学生的数学观越正确合理。总量表的内部一致性系数分别为0.8316, 具有较好的信、效度。
问卷的8个维度分别是:
·价值性观念, 在此因子上得高分者认为数学有其特定的价值, 数学能使人思维严密, 与日常生活联系密切, 对经济建设发展有巨大的推动作用。低分者则很少看到数学的价值。
·权威性观念, 在此因子上得高分者不迷信老师或标准答案, 得低分者则认为每道数学题都有唯一正确的解法、唯一正确的答案, 只有按照老师教的解题方法和步骤来解题才能顺利解决问题。
·耗时性观念, 在此因子上得高分者愿意在一个问题上花费较多时间来思考, 以彻底理解。
·性别差异性观念, 在此因子上得高分者认为男生在数学上不存在性别优势。
·规律性观念, 在此因子上得高分者能认识到数学知识是相互联系的, 有其内在规律的, 并不是片断性的、孤立的。
·努力性观念, 在此因子上得高分者认为通过努力可以提高数学成绩。
·快捷性观念, 在此因子上得高分者认为数学成绩需要依靠长时间扎实努力的学习才能得到提高, 掌握每个知识点都需要认真努力, 在平常学习中愿意在一个问题上花费较多时间来思考, 以彻底理解。
·理解性观念, 在此因子上得高分者认为学好数学的关键是理解, 不是靠记忆和模仿老师的解题步骤。
(2) 数学焦虑量表
选用袁桂平在其毕业论文中编制的问卷[10]。该问卷共33个题目, 分为7个维度:被观察焦虑、课堂焦虑、解题焦虑、考试结果焦虑、应试焦虑、数学应用焦虑、学习结果焦虑。各维度分量表及总量表的内部一致性系数分别为0.8298、0.8272、0.7935、0.7440、0.6187、0.5946、0.6286、0.9192, 总量表分半信度为0.9227, 有较好的结构效度, 经预测后发现其对高中生也比较适用。
(3) 数学自我效能感量表
采用李晓东[11]等修订的针对数学学习的自我效能感问卷。问卷共有7道项目, 五级评分, 问卷总得分最低为7分, 最高为35分, 得分越高说明数学自我效能感越强。问卷内部一致性系数为0.93。
(4) 数学学习动机量表
在王悦钢编制的数学学习动机量表[12]的基础上进行修订而成, 该量表采用5级评分, 共10个项目, 内部一致性系数为0.7511。问卷有二个维度, 为外部动机 (包括升学动机、附属动机) 和内在动机。
(5) 数学学习归因量表
根据相关问卷整理而成, 共24个项目, 其中积极归因有12个项目, 消极归因有12个项目。问卷采用五级评分方法, 内部一致性系数为0.6825。
3. 研究程序
(1) 施测过程
主试由任课数学教师或班主任担任, 测试时间为20分钟左右。测试结束后当场收回问卷。
(2) 数据的统计分析
剔除无效问卷后, 将有效问卷的数据输入计算机, 用spss11.0 for windows进行数据统计和分析。
二、研究结果
1. 中学生数学焦虑的总体水平及维度特点
2. 数学自我效能感、学习归因、学习动机及数学观对数学焦虑的影响
(1) 各影响因素与数学焦虑的相关
(2) 各因素对数学焦虑的影响分析
(1) 直接效应分析
以数学焦虑为因变量, 以数学自我效能感、积极归因、消极归因、外部动机、内部动机以及数学观等因素为自变量运用逐步筛选法进行多元线性回归分析, 进入回归方程的因素依次是数学自我效能感、消极归因、外部动机、积极归因和内部动机。多元相关系数是0.64, 调整后的决定性系数是0.410。从回归方差分析对回归方差的检验结果看, F值达到极显著水平 (p<0.001) , 这说明回归方程是有意义的。由此我们可以建立以下回归方程:
数学焦虑=2.068-0.253***×数学效能感+0.317***×消极归因+0.106**×外部动机+0.204**×积极归因-0.076*×内部动机。
(2) 间接影响分析
分别以自我效能、积极性、归因、消极归因、升学动机、附属动机、内部动机为因变量, 其他因素为自变量, 进行多重回归分析。根据数据分析, 我们可以作出路径分析图
三、分析与讨论
1. 中学生数学焦虑的总体水平及维度特点比较
全体被试者的焦虑平均分为2.6348, 低于中间值3, 被试总体的平均焦虑程度并不高, 造成平均分不高的原因可能是数学焦虑较重的学生只是总体的一小部分, 不能影响到总体的平均分。
在数学焦虑的各维度中, 考试结果焦虑的指数最高。其次是学习结果焦虑。两者的平均分均超过了3, 说明中学生确实存在数学焦虑, 并且对学习结果和考试结果的担忧可能是中学生数学焦虑的主要来源。
2. 数学自我效能感、学习归因、学习动机、数学观对数学焦虑的影响
(1) 数学自我效能感对数学焦虑的影响
从多元回归分析的结果看, 数学自我效能感对中学生数学焦虑有直接的负面影响。另外, 数学自我效能感通过外部动机、内部动机、消极归因间接对数学焦虑产生负面影响。中学生的数学自我效能感与数学焦虑总分以及绝大多数的维度都呈显著负相关, 说明学生的数学自我效能感越强, 数学焦虑就越轻。学生的数学自我效能感强意味着个体对自己学习数学的能力, 获得好成绩的能力有较强的自信, 处于考试、练习以及等待考试结果等与数学有关的情景中时产生的焦虑相应较小。这似乎表明了数学自我效能感与数学焦虑是同一件事物的两个对立面, 此消彼长。
(2) 学习归因对数学焦虑的影响
从多元回归分析的结果看, 积极归因方式和消极归因方式都对中学生数学焦虑有直接的正向影响, 另外积极归因通过增强外部动机, 消极归因通过降低数学自我效能感间接对数学焦虑产生正向影响。
积极归因是指将成功归因于能力、正确的方法、努力、有兴趣和端正的态度, 将失败归因于错误的方法、努力不够、兴趣的缺乏以及不端正的态度。路径分析得出积极归因对数学焦虑有直接的正向影响, 相关分析发现积极归因与数学焦虑的总分以及多个维度均没有显著相关, 但是和学习结果焦虑以及考试结果焦虑有显著的正相关, 即积极归因得分越高数学学习结果焦虑和考试结果焦虑就越高。出现这种情况的原因可能是由于个体认为只要具有正确的方法、端正的学习态度再加上足够的努力就能提高数学成绩, 因此在这种情况下再失败就只能怀疑自己的学习能力不够了, 这样就会给个体带来较大的心理压力, 担忧努力付出后却没有相应的好成绩, 在学习结果和考试结果两个方面产生较大的焦虑。看来, 虽然积极归因方式是一种较为科学、理性的认识事物的方式, 但也容易给学生带来较大的心理压力, 以致引发数学焦虑。因此这里建议指导学生适当、适时地使用一些心理防御机制, 调节心理活动, 从而减轻学习失败带来的压力和痛苦。
消极归因是指将成功归因于他人、任务简单和运气好, 将失败归因于他人、任务太难、运气不好和能力太差。消极归因对数学焦虑有直接影响, 相关分析发现消极归因与数学焦虑总分及各维度都有显著的正相关, 这说明学生越采取消极归因方式, 数学焦虑就可能越重。消极归因与数学焦虑的各维度中相关程度最低的两项是学习结果焦虑和考试结果焦虑, 这与前面分析的积极归因与数学焦虑相关的情况恰好对应。
(3) 学习动机对数学焦虑的影响
外部动机主要包括升学动机和附属动机, 升学动机是指学生为了升学要求而学习数学, 附属动机是指学生为了满足家长的要求、获得教师或他人的肯定而学习数学。回归分析发现外部动机对数学焦虑有直接和间接的正向影响, 这说明个体的外部动机越强, 其数学焦虑也相应地越强。
内部动机是指学生是出于对数学的兴趣而学习数学的动机。内部动机与数学焦虑及其各维度均有显著的负相关。路径分析显示内部动机会直接负向影响数学焦虑, 还通过增强数学自我效能感对数学焦虑起负向影响, 说明数学学习的内部动机可能有助于数学焦虑的减轻。其中的原因可能是:一、具有内部动机的学生能在数学学习活动中得到满足, 他们积极地参与学习过程, 在课上认真听讲, 课下刻苦钻研, 并且在数学学习上付出的时间和努力也相对较多。因此他们进步快、成绩好, 并进一步增强自己的数学自我效能感, 在数学学习中体会到愉悦、成功的感觉, 自然会减轻数学焦虑。二、具有内部动机的学生对数学的学习热情不是在外界影响下产生的, 因此相对持久。即便个体在数学学习中暂时受到了挫折, 也不会轻易动摇学习数学的热情和决心, 能够积极探寻失败的原因, 期待在以后取得优秀的成绩。这种对数学的喜爱会抵消掉许多对数学的焦虑情绪。
(4) 数学观对数学焦虑的影响
在表5中, 可以看到除个别几处外, 中学生的数学观与数学焦虑普遍呈负相关, 且达到显著水平, 说明中学生的数学观越正确合理, 数学焦虑也相应的越低。另外, 数学观对数学焦虑通过内部动机、外部动机和消极归因对数学焦虑产生负向影响, 并通过积极归因对数学焦虑产生了正向影响。这说明学生的数学观对数学焦虑也有不可忽视的影响。
学生的数学观对学生的数学情感态度有密切影响。假如学生过于强调数学学习的快捷性, 便不愿投入更多的时间和精力, “例如, 如果一个学生认为, 真正学会了数学的人能迅速地做出任何数学作业题, 他努力钻研难题的动机就会减弱”[13]。假如学生看不到数学的价值及数学知识的内在联系和规律, “学生由于对数学持有种种误解, 因而难以体会数学的力量、吸引力和价值, 在学习上进行死记硬背, 从而导致不良的学习效果以及惧怕、焦虑和厌烦心理”[14]。假如学生对数学的认识具有一定的片面性, 认为“数学就是解题”、“学数学就是通过解题求得一个结果”, 那么对数学学习也缺乏兴趣, 在学习中难以形成愉快体验[15]……
学生的数学观作为一种元认知知识, 是学生先前经验中重要的组成部分, 是在学校数学学习过程中发展起来的, 反过来对学生的数学学习活动及其自我调节过程有着十分重要的影响。由图1看, 数学观有助于提高学生对数学的兴趣, 加强内部动机, 降低外部动机, 有助于学生选择积极归因方式, 避免消极归因方式, 数学观除了通过积极归因这一因素的影响路径外, 其余的影响途径均是降低数学焦虑, 可见科学的正确的数学观对数学焦虑有显著的消减作用。本文认为中学生应该了解数学的价值, 认识到数学知识的内在联系与规律, 不迷信权威或标准答案, 在学习数学的过程中乐于投入时间来思考, 以求真正理解, 而不是记忆和模仿老师的解题步骤, 知道数学成绩的提高必须依靠长时间扎实努力的学习才能得到实现, 不妄想在短期内有较大进步, 不存有数学学习的性别偏见。
心理学家普遍认为, 无论认知反馈的动机如何只要情感反馈为负值, 学习者就不愿意进一步学习, 因此我们应该重视数学焦虑对数学学习的影响。本研究对中学数学教学提出以下建议[16]:
·提升学生信心, 增强中学生数学自我效能感。
·提高学生学习数学的兴趣, 加强学生学习的内部动机。
·培养学生积极的归因方式, 同时指导学生适当、适时地使用防御机制, 减缓压力和焦虑。
内源性医学 篇5
一、甘肃中小微企业内源融资现状
在发达国家, 内源融资比重一般都超过融资的一半以上。据美国独立企业联合会对其中小微企业融资方式调查, 中小微企业资金45%来源于个人储蓄。而我国目前关于中小微企业内源融资方面官方数据很少。2006~2008年国家发改委中小微企业司发布的中小微企业发展的相关报告中没有提及中小微企业内源融资问题。中小微企业内源融资比例过低意味着中小微企业内源融资匮乏, 这点在甘肃尤其突出, 融资成本过高, 债务负担过重, 中小微企业自我积累的融资机制难以形成, 降低了中小微企业抗御融资风险能力。
二、甘肃中小微企业内源融资现状存在的主要原因
(一) 自身内部经营管理不强, 盈利能力较弱, 内源融资源头不畅
1. 产品、技术、市场创新能力弱
甘肃省众多中小微企业普遍存在产品结构不合理、产品技术含量低、质量不过关等问题使产品缺乏相应竞争力, 再加上不注重新市场开拓, 市场占有率必然不高。
2. 财务管理能力低
表现在:一是缺乏严密的资金使用计划, 内部资金调度能力弱, 资金营运能力不强, 重视利润而忽视现金管理, 资金利用率低, 二是不重视财务管理, 未建立有效财务管理体系, 把财务管理工作视为可有可无的工作;三是缺乏高素质的财务管理人才。
3. 管理层缺乏科学决策能力
许多中小微企业重大决策由企业主决定, 决策不民主, 没有形成一种良好的决策机制, 缺少科学的可行性分析, 使企业陷入困境。
(二) 自我积累意识差, 对内源融资缺乏认识
1. 对内源融资重视不够
很多企业很少考虑利用自留资金经营补充资金的不足, 经营缺乏长期经营思路, 在内部利润分配中存在“重消费、轻积累”的短期化倾向, 不注重自身积累, 企业发展难以为继, 其生命力不能持久。
2. 缺乏折旧意识、折旧率过低
企业利用折旧进行内源融资的可能性小主要由于折旧率低, 自留折旧资金少, 不少企业甚至无足够资金用于维持简单再生产, 更无法对设备进行更新改造。
(三) 中小微企业财税负担重
1. 宏观税收负担重
近几年, 国有大型企业大多处于亏损状态, 2011年国有企业亏损补贴为470.48亿元, 2012年国有企业亏损补贴为564亿元。而20世纪90年代后半期以来, 我国财政收入增长速度明显高于同期GDP增长速度, 说明国有企业对财政收入的增长贡献能力有限, 财政收入快速增长并非建立在国有大型企业快速发展基础上, 其主要负担落在中小微企业等主体身上。
2. 现有税收政策不利于中小微企业增强内源融资
近年来, 政府出台了一些针对于中小微企业的税收政策, 但存在以下问题:一是税收优惠对象不是直接针对所有中小微企业, 而且多以所有制形式为划分标准, 占绝大多数比重的私有中小微企业被排除在外;二是税收优惠政策比较凌乱、缺乏系统性, 而且由不同的部门负责实施, 对中小微企业的促进作用有限。2003年1月1日实施的《中华人民共和国中小微企业促进法》虽然在税收优惠方面做出了规定, 但也仅是一个法律框架, 缺乏具体的实施方案, 中小微企业很难利用税收增强内源融资的能力。
三、增强中小微企业内源融资的对策与建议
(一) 加强中小微企业内部经营管理能力, 提高资金利用效率
1. 加强产品技术的创新和市场的开拓
运用科学定价和营销策略, 拓展产品的潜在市场。通过建立适当的销售渠道和服务体系, 增强销售能力, 提高产品的市场占有率。
2. 挖掘企业内部资金潜力
一是降低成本以增加潜在利润, 增强企业内部融资能力。二是加强资产管理, 使其占用的资金更加合理化。三是提高资金周转速度, 使其可变资本的利用率不断提高, 节约资金。四是减少企业资产及时变卖, 实现企业资源的再分配, 优化资产组合, 从而达到专业化程度, 提高了企业的竞争能力和盈利水平。五是加速折旧, 降低固定资产使用风险。
3. 提高企业经营管理层的素质、形成科学的决策机制
随着市场竞争的日益激烈, 企业要想在市场竞争中立于不败之地, 必须不断地提高企业管理水平, 企业管理水平的高低决定着企业发展的方向与持续经营的时间。如何提高企业管理水平, 是企业应予以高度重视并亟待解决的首要问题。管理者的正确决策决定着企业各项工作的成功与否, 企业重大经济问题的决策对企业日后发展具有重要作用。
(二) 完善财务制度, 提高财务管理水平
1. 重视财务管理, 引入财务管理新模式
规范财务管理体系, 规范财务管理制度, 这是按新《企业会计制度》的要求, 促进企业的持续循环发展的方式之一。
2. 注重营运资金的管理
加强信用管理, 减少坏账损失, 利用现金预算表和资金调度表做好现金管理;加强存货管理, 减少资金积压;避免借短期资金长期的投资使用。
3. 加强融资管理的财务协调
在营运资金方面, 中小微企业要更处理好资金的结构性短缺问题, 与大企业相比更应稳健理财, “以筹定投”。在收益管理协调上, 既要努力增加收益, 又要在收益分配中为积累财力做准备。
4. 提高财务管理人员素质
如企业具备相应条件, 应当引进优秀的财务管理人才, 如尚不具备条件, 则可以借助独立的会计师事务所对外提供的一些专业服务。
(三) 合理避税, 减少税收支出
一方面要研究相应的法律知识, 特别是与税收相关的税法知识, 寻找合理避税的可能;另一方面要用足税收优惠政策, 尽可能利用合法的税收优惠政策为自己合理避税。这些避税措施必须建立在不违反有关法律法规的基础上, 否则就会得不偿失。
(四) 政府的大力支持
1. 通过财税政策支持以增强其内源融资能力
一是降低税率。如降低中小微企业营业税、增值税等流转税和企业所得税的税率。对于小企业而言, 所有内源性的融资, 实际上是小企业资金来源非常重要的一个方面。大的金融环境很难以在短时间内改变大金融机构主导的金融体制。我们可以试图通过很简单的减税方式, 增强小企业的内源性的融资能力。前段时间政府也出台了一些措施, 降低中小微企业的增值税、营业税税率。这个方面实际上还可以做更多的更有力度的工作来推进这个事情。
二是进行税收减免。为鼓励中小微企业对外出口, 政府对中小微企业在初创期的发展以及产品与服务的出口等方面, 有着一定税额的减免政策。
三是提高税收的起征点。提高营业税、所得税的起征点, 可以减少起征点以下的企业的营业税和所得税税收。
四是提高固定资产折旧率。
2. 政府采购项目倾斜于中小微企业
近年来国家的政府采购支出直线上升:2008年为5990.9亿元, 2009年为7413.2亿元, 2010年为8422亿元, 2011年为1.13万亿元, 2012年为2.28万亿元。甘肃省相关部门应当明确向中小微企业的采购份额。这样可以缓解中小微企业产品销售的困难, 增加中小微企业的获利能力, 为内源融资提供资金来源。
(五) 推进中小微企业积极建立现代企业制度
形成企业自我积累能力, 成为市场真正主体的关键是产权是否明晰, 现代企业制度是以产权清晰、权责明确、政企分开、管理科学为条件的新型企业制度, 推进中小微企业产权改革, 通过适当的方式, 真正建立适应市场经济竞争需要的、产权明晰权责明确的现代企业制度为中小微企业增强自我积累意识提供了源动力。
摘要：中小微企业在我国国民经济发展中发挥着重大作用, 但其在发展过程中也出现了许多亟待解决的问题, 其中最为关键的就是内源融资问题, 它已经严重制约了中小微企业与我国国民经济的健康发展。所以, 改善与完善我省中小微企业的内源融资问题, 对于促进中小微企业的健康成长和确保国民经济的健康稳定发展有着极为重要的意义。
关键词：甘肃省,中小微企业,内源性融资
参考文献
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[2]冯银波.中小微企业内源融资和间接融资现状分析[J].学术理论, 2007 (7) .
[3]吴庆念.中小微企业内源融资的渠道和模式研究[J].企业经济, 2012 (3) .
[4]黄东坡.我国中小微企业内源融资问题探讨[J].财务与金融, 2008 (4) .
内源性医学 篇6
关键词：科技型中小企业,实地调研,内源性障碍,政策建议
在事物发展过程中, 内因是决定性因素, 外因只是内因发挥作用的诱导因素。目前, 理论界对科技型中小企业发展障碍分析与未来发展探讨, 都有意无意忽略了这一基本原理, 把“融资难”这一外部原因带来的负面影响无限上纲, 似乎只要“融资”的问题解决了, 科技型中小企业的问题就解决了。这类文献俯拾即是。须知, 此种观点有失偏颇, 正如生活俗语说得好“没有钱万万不能, 有钱也不是万能”!
在任何发展环境中, 都有成功的科技型中小企业脱颖而出;即使是在金融海啸的冲击下, 生意红火依旧者亦不乏其例。本文由此认为:在科技型中小企业发展过程中, 外部环境变化带来的负面影响在多大程度上起作用、起多大的作用, 归根到底还是取决于企业内部各因素的完善程度。基于这个考虑, 本文通过对荆门一些科技型中小企业实地调研, 在对比成功企业与失败案例基础上, 总结出了科技型中小企业内源性发展的四类障碍, 并由此提出了相应的政策建议。
一、科技型中小企业界定
目前, 国家对科技型中小企业只有概念上的界定, 并没有出台具体的技术界定标准。因此, 尽管理论界对科技型中小企业的研究很多, 但科技型中小企业的界定却因作者的个人理解不同而不同。
对科技型中小企业来说, “科技型”是其本质属性, “中小”则是其规模特征。所谓科技型企业, 就是以高新技术及其产品研发、生产转化和销售经营为主体业务的企业, [1]这个涵义是明确的。至于中小企业, 则一直是一个相对的、比较模糊的概念, 目前理论界还没有一个统一标准。
(一) 界定标准
在实践中, 人们一般遵循差异性和相对性原则, 把规模标准和地位标准结合起来考虑。[2]
规模标准或是以企业的某些客观指标为标准, 主要包括销售额、就业人数、总资产等, 其中使用最多的指标是就业人数;美国的标准是就业人数在500人以下, 欧盟的标准是就业人数在750人以下。规模标准也有以行业中的相对份额指标为标准, 就是不管一个行业中企业实际规模的大小, 只确定一个百分比, 凡在这个百分比以内的企业都是中小企业;美国常用的相对份额指标是, 把累计只占所在行业总销售额75%的那些企业定义为“中小企业”。
地位标准主要是指根据企业在市场中的地位对企业进行分类。由于激烈的市场竞争和科学技术的快速发展, 企业的生产能力和规模经常发生变化, 仅以规模标准来划分中小企业, 已经谈不上很科学;从保护竞争的角度出发, 只有使一个行业中的中小企业占有相当比重, 才能形成有效的市场竞争。美国的中小企业法规定:凡是独立所有和经营, 并在某行业领域不占支配地位的企业, 一概属于中小企业。
(二) 本文界定
本文对荆门中小企业的界定原则是以地位标准为主、辅助以规模标准。地位标准则以该企业所在行业的市场分割状况与行业地位为主要依据, 兼以考虑该企业在荆门及周边同类企业中的话语权。
以湖北日月油脂有限公司为例, 尽管该公司仍处企业发展成长期、在行业中也不居支配性地位, 但公司主导产品“双低菜籽色拉油”的市场空间极大, 公司满负荷运转也无法满足潜在的市场需求;考虑到公司在湖北市场的地位, 在荆门同类企业中的话语权, 及该公司由浙江凯凌集团注资新建、资金相对充裕等原因, 所以本文在界定科技型中小企业时, 并不把该公司列为调研的范畴。因此, 本文所称荆门科技型中小企业, 是指既除荆门石化等中小企业 (一般规模都较大) 、又除与湖北日月油脂有限公司同类型公司之外的其它所有科技型企业。
二、科技型中小企业内源性发展障碍
原因当然是多方面的。通过对荆门几家有代表性的科技型中小企业实地调研, 并和不少荆门企业家接触、交流, 总结出了科技型中小企业做不强、做不大的四大内部原因。
(一) 企业合伙人之间的矛盾
几个合伙人之间在企业中各自的权利、义务与分担的职责在公司成立时划分不明晰, 在合作的过程中, 合伙人中也没有产生一个绝对的权威。
在企业发展初期, 由于面临的主要矛盾是如何生存, 合伙人一般都能齐心协力, 同甘共苦。一旦日子好过一点, 企业的主要矛盾就从如何生存转变为如何发展。合伙人之间或由于对企业发展的理念不同, 或由于选择的决策方向不同, 或由于经济利益分配的看法不同, 很容易产生矛盾。特别是那些由技术持有人和资金持有人合办的科技型中小企业, 当企业发展到年产值几百万这个规模的时候, 投资方已经收到回报, 技术方对资金的需求也不象以前那样迫切。这时候, 双方观察问题、考虑问题的角度都会发生一些变化, 为了各自的利益很容易产生矛盾。
如果双方不能就产生的矛盾, 进行实时有效的沟通;在企业的规章制度中, 也没有事先对各种可能出现的情况做出明确的规定, 一个很好的企业就可能由此错过成长壮大的市场机遇, 而一直改变不了自己“中小企业”的市场身份。甚至于企业也有可能因矛盾激化而解体。
(二) 企业发展定位不准
企业发展定位不准, 主要是指二个方面, 一是企业在市场中的定位, 二是企业主导产品的技术定位。
不少科技型中小企业刚开始成立的时候, 都把企业在市场中的位置确定为以贸易养技术, 属“贸易型”, 精力大部分放在流通领域。随着竞争的加剧, 贸易的利润率开始下降, 以贸易经营为主的企业就很难有大的突破, 一些从业人员也很难在短时间内适应以技术开发为主的经营战略, 最终导致企业发展后劲不足。荆门几家较有名气的电脑公司都属这种类型。
有的企业尽管属“生产型”, 但将产品定位在较低档次, 没有精品意识、单纯追求过低的成本。往往是进入市场容易, 扩大市场难, 当企业形成一定的规模后, 一般会在二个方面发生问题:要么是由于进入低端市场的门槛低, 竞争者不断涌入, 早期发展顺利的企业如果不能及时调整发展战略, 必将被淹没在众多新加入的竞争者中;要么缺乏战略眼光, 习惯于现有产品的市场开拓, 习惯于围着现有的市场转, 不仅技术上没有独到之处, 对产品进一步创新的投入也不足, 当原有产品逐渐进入成熟期后, 由于没有及时推出新产品, 企业慢慢就被市场淘汰。
(三) 惯性管理思维
科技型中小企业刚开张的时候, 一般人员少, 资金也不多。企业决策与运营都是几个合伙人商量着办, 企业管理的典型特点是:决策简单化、人员使用随意化。这种现象在企业刚开始的时候, 确实有节省开支、管理灵活等优点。随着企业规模不断扩大, 简单的内部管理就逐渐暴露出不少弊病。这就需要企业的管理者及时调整管理思维, 建立与企业发展相适应的较为规范的管理体系。但现实中一些企业容易沉溺于以往成功的惯性思维中, 主观努力往往滞后于客观现实, 导致企业管理出现问题、后劲不足。
惯性思维影响企业发展的另一种表现形式是:企业不能适应由小市场向大市场的转变。一些企业凭借其既有“关系网络”或市场知名度, 产品比较顺利地进入市场, 但当企业发展到一个新的阶段, 就需要走出既有关系网络与固有市场, 参与更大范围内的市场竞争, 这就要求企业改变以往的思维方式, 根据市场经济的特点开拓大市场。由于一些企业不能适应市场变化, 市场开拓进展缓慢, 不仅没有能够拓展新的市场, 原有市场也被外地进入的大企业蚕食, 一旦市场发展的黄金时期过去, 企业就会被边缘化。
还有一种情况:伴随着企业规模的扩张, 企业内部工作人员分工越来越明确, 销售人员与技术人员、管理人员与开发人员、财会人员与办公人员逐渐分离开来, 整个企业的管理费用大幅上升, 企业受市场环境的影响程度越来越大。当市场出现波动, 企业管理者又没有适时调整思维方式, 一旦这种波动持续一段时间, 多数情况下实力不强的科技型中小企业就有可能因为承受不住压力而开始走下坡路。
(四) 盲目冒进带来恶果
一些企业在顺利发展一段时间后, 产生了求大、求快的冒进思想, 这个时候有二种情况可能导致企业失败。或者对国家政策可能的动向缺乏必要的了解, 盲目布点, 或者热衷于上新项目、片面追求经营上的多样化, 特别是未经充分调研, 就贸然进入自己并不熟悉的领域, 导致经营不利、投资失败。
据荆门市工商联介绍, 发展势头很好的一家以经营纺织品出口业务的荆门公司, 亏就吃在这上面。该公司为了单纯追求贸易便利, 在长三角地区布点纺织印染类企业, 却由于环保方面的原因, 面临着在投资所在地无法立足的尴尬。
显然, 在激烈的市场竞争中, 中小企业基于科学精神基础之上的自我认知、自我创造、自我规划是企业发展的基本点, 以“科技”为企业主要特征的科技型中小企业就尤其应该如此!
三、政策建议
目前, 推动科技型中小企业发展的建议大多围绕解决资金不足的问题展开。有“以融资服务为核心”[3]的建议, 有“业务外包以解决科技型中小企业资金短缺”[4]的建议, 有“利用资本市场加快企业发展”[5]的建议, 有“知识产权质押贷款”[6]的建议……
囿于立意, 这里着重针对上述内源性障碍展开讨论。本文的基本观点是:科技型中小企业内源性障碍是客观存在的, 是中小企业生命周期中必然要经历的过程;鉴于科技型中小企业的固有特点, 破解内源性障碍这篇“内部文章”要从政府这个“外部推手”做起、且只能从政府做起, 政府的工作重点就是建立科技型中小企业支撑体系。
(一) 加强创业指导, 提供创业服务
中小企业的经营规模限制了其收集信息的能力, 在财务管理、技术水平、人才素质等方面也逊于大企业。因此, 政府应该为科技型中小企业提供针对性明确的创业指导与创业服务。
具体的服务内容应该包括:建立地方政府参与的中小企业贷款担保机构, 积极为企业引进风险投资, 并借助风险资本的介入, 在管理理念、资金管理、市场开拓等多方位对企业加强培训。强化企业孵化器、生产力促进中心的作用, 充分利用共享空间、共享资源的优势, 有针对性地组织企业进行必要的培训, 通过联合培养、专题讲座、培训班、交流会等多种教育培训服务为科技型中小企业培养熟练工人、技术骨干、企业管理人员乃至企业家本身;积极提供宏观经济、行业发展、市场动态等信息服务和计算机信息网络服务, 为企业提供战略咨询、管理咨询、市场咨询等多方面的咨询或中介服务, 聘请专家为企业进行诊断, 为企业家提供一个互相交流借鉴的机会。
(二) 引导企业强化工作环境建设
许多科技型中小企业因为“中小”特征明显, 企业管理者往往只注重经济效益的追求, 而忽略企业文化建设、忽视良好工作环境的营造。
在中国企业管理情境下, [7]工作环境与知识创造存在相关关系, 特别是工作环境中的工作团队支持, 挑战性工作、工作资源这些因素与知识创造活动存在明显的正相关关系。良好工作环境能够激发员工创造性, 这种创造性正是企业获取竞争力的源泉, 是企业获得持久创新能力的动力。
政府要在为科技型中小企业提供良好外部环境、不断推动企业提高创新能力的同时, 还要引导企业强化工作环境建设, 鼓励企业不断为员工提出具有挑战性、多样性的创新工作, 及时为员工提供有利于创新的工作资源。
(三) 引导企业开拓市场, 推动企业间合作
荆门这样层次的中等城市, 科技型中小企业不同程度存在着“进入市场易, 扩大市场难”的问题!曾有人讲, 怎么样算是为荆门作贡献?!怎么样算是爱荆门?!很简单, “喝金龙泉啤酒, 穿周健西服”。金龙泉是荆门品牌企业, 其产品“金龙泉啤酒”是中国名牌产品;周健西服则是以一位荆门籍企业家名字命名的西服企业, 在荆门有一定的知名度。这个观点非常简单、非常朴素, 实践指导意义则十分深刻。政府就是要针对当地科技型中小企业的产品特点, 多做一些引导人们“喝金龙泉啤酒, 穿周健西服”这一类的事。
在金融海啸冲击下, 中国不少家具企业把产品针对性地调整到拉丁美洲、中东甚至非洲市场, 从策略上避开风暴中心;也有不少玩具出口企业及时调整经营策略, 把目光从国外转移到国内, 不只是看着国外的订单来吃饭, 而是看着中国人的腰包来消费。政府就是要瞄准新的市场, 推动科技型中小企业间合作, 通过建立民间地方商会、行业协会、互助协会、创业协会、革新促进会等, 一方面弥补政策性扶植措施的不足, 一方面提高市场谈判能力, 降低谈判成本。但要切记, 企业间的合作绝不应该是政府的“拉郎配”。
(四) 鼓励技术创新
科技型中小企业的成长主要取决于企业自身创新能力的高低。但现实却是, 科技型中小企业的“中小”特征体现得十分充分, “科技型”特征却相对弱化, 政府就是要鼓励技术创新这个科技型中小企业发展的“牛鼻子”, 强化科技型中小企业的“科技型”特点。
由于资金有限、信息渠道不畅等原因, 科技型中小企业的内部创新能力相对不足, 已经是不争的事实;由于科技型中小企业规模相对较小, 完全依赖其自主创新能力还不太现实。因此, 一个完善的区域创新体系就具有决定性作用。
政府要对中小企业产业结构做出明确规划, 并以产业的优先顺序制定不同优惠措施, 努力促进优先发展的产业率先实现技术升级, 促进中小企业与科研院所、高校及大企业研究部门的合作, 共同研究开发适合中小企业的新产品、新技术、新工艺。同时, 政府要千方百计开源节流、努力降低行政成本, 把有限的资金用到“刀刃”上, 用到科技型中小企业支撑体系的建设上、用到公共技术平台的构建上、用到企业核心竞争力的培育上。金融海啸爆发后, 国家一些税收政策的调整十分有利于企业发展。据税务部门测算, 2009年荆门市企业因税收政策调整, 可得到2.35亿元的好处, 政府要引导科技型中小企业把这些资金真正用到技术改造、新产品开发等内涵发展上。
湖北省钟祥市郢中镇的金汉江纤维素有限公司, 正因为十分注重技术创新, 不仅有效抵御了金融海啸的冲击, 反而变“危”为“机”, 与意大利宾霸公司签订了一份价值200万美元的出口合同, 抢占了部分意大利市场。正如金汉江公司董事长周家贵所言:金融危机还没有见底, 但金汉江心里已经有了底, 新的工艺、新的技术、新的产品扩张了新的市场、占领了新的市场。
(五) 切忌过多介入企业微观经济活动
政府在加强指导、提供服务时, 一定不能过多介入企业微观经济活动, 否则, 事与愿违, 不仅没有为企业发展提供“动力”, 反为有可能演变为“阻力”!
作为市场主体的企业看重的是自身经济效益最大化, 政府工作则不同, 属于公共事务, 强调的是社会效益最大化, 政府职能就是着眼社会、经济和文化协调发展, 通过抓好公务员队伍建设, 为社会提供一流的公共服务……。
政府过多介入微观经济活动, 客观上会造成不公平的竞争。同样是科技型中小企业, 外来企业与本土企业享受的市场待遇却大不相同, 其后果就如人们常说的“招了女婿, 慢待了儿子”, 也有人戏称为“外来和尚好念经”, 极大挫伤了本土科技型中小企业的积极性。
一些本土科技型中小企业本来就相对困难, 再加上市场竞争不公平, 问题就来了。本土与外地二类企业间顶多也就是个零和博弈, 外来企业的市场所“得”不过是本土企业的市场所“失”, 就整个地域经济实力而言, 并没有实质性增长。
参考文献
[1]由丽丹, 刘传哲.江苏省科技型中小企业融资与发展实证分析[J].现代管理科学, 2005, (3) :20-21.
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[3]黄志刚, 赵玉林.国外科技型中小企业发展模式比较分析[J].武汉理工大学学报, 2001, (9) :114-118.
[4]王宏达.科技型中小企业的业务外包战略分析[J].技术经济与管理研究, 2004, (5) :77-78.
[5]陈国平.科技型中小企业规模发展的路径探索——武汉东湖新技术开发区运作实践启示[J].中国科技论坛, 2006, (6) :52-55.
[6]龚莉.浅析知识产权质押贷款——科技型中小企业融资新路径[J].江苏科技信息, 2007, (5) :28-30.
内源性医学 篇7
1 材料与方法
1.1 实验动物
新生Wistar大鼠, 由广西医科大学动物实验中心提供。
1.2 主要试剂
一抗为鼠抗巢蛋白 (Nestin) 、神经元核心抗原 (NeuN) 和髓鞘碱性蛋白 (MBP) 单克隆抗体以及胶原纤维酸性蛋白 (GFAP) 多克隆抗体 (Sigma) ;ABC试剂盒、FITC羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 药物制备
壮通饮:扶芳藤30 g, 三七10 g, 黄花倒水莲25 g。药材去除杂质切制后, 按组方剂量配比, 加入生药材10倍量的水, 浸泡60 min后, 用TC-15套式恒温器250V电压加热煎煮。沸腾后将电压调低至150 V, 保持微沸状态煎煮1 h, 滤取煎液。药渣再加入生药材8倍量的水, 同法煎煮1 h, 滤取煎液。合并两次煎液, 于恒温水浴锅 (100 ℃) 蒸发去水分至浓稠状, 转入恒温烘箱 (60 ℃) 干燥, 得干浸膏, 称重, 收膏率为36.80%, 4 ℃保存, 备用。临用前使用蒸馏水溶解浸膏至生药材含量为2.0 g/mL。
1.4 方法
1.4.1 原代培养
取新生当天Wistar大鼠, 乙醇消毒后断头取脑, 取双侧大脑海马区于D-Hanks液中, 剥离出脑膜及血管, 用眼科剪剪碎成糊状, 加DMEM/F12培养液 (Hyclone) , 用细口吸管机械吹打, 200目金属滤网过滤后获得单细胞悬液并计数, 以5×105/mL的细胞浓度接种到培养瓶中, 加入2% B27、终浓度为20 ng/mL的EGF和bFGF (均为Gibco产品) 后置37℃、5% CO2恒温孵箱中培养每3 d～4 d进行半量补液。培养7 d～9 d后, 机械分离神经球进行传代[3]。
1.4.2 传代培养
将原代培养7 d～9 d形成的神经球 (50～200个细胞/球) 悬液移至离心管, 低速离心后吸弃上清液, 机械吹打制成单细胞悬液后, 再以5×105/mL细胞密度接种培养。以后每6 d～8 d传代1次[4]。
1.4.3 神经干细胞分化及壮通饮诱导作用
培养的第2代神经球收集, 以约2×105/mL的细胞密度接种于24孔培养板各孔中。孔底放置预先用100 mg/L多聚赖氨酸处理过的盖玻片, 每块培养板分对照组和20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L壮通饮组, 每组6孔。对照组培养液为原有培养液去除bFGF及EGF, 另加10%胎牛血清 (FBS) 配制。壮通饮组培养液是在对照组培养液基础上加入壮通饮, 浓度分别为20 mg/L、40 mg/L和80 mg/L。将培养板置饱和湿度、37 ℃、5%CO2孵箱中培养。
1.4.4 神经干细胞鉴定
以神经干细胞标志物Nestin鉴定增殖期NSC, 并检测各组分化培养7 d时Nestin以及NeuN、GFAP和MBP (分别为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞标志物) 表达情况。取出24孔培养板各孔中的盖玻片, 以4%多聚甲醛固定后, 0.01 mol/L PBS冲洗。检测Nestin用免疫荧光方法, 加一抗37℃孵育60 min, FITC标记的二抗孵育30 min, 甘油缓冲液封片后荧光显微镜下观察。余采用免疫细胞化学ABC改良法。DAB或BCIP/NBT显色, 着棕黄色或紫蓝色的细胞为阳性。其中小鼠抗NeuN及兔抗GFAP为1∶500、小鼠抗MBP为1∶200。Olympus倒置显微镜及普通光学显微镜下观察并拍照。在200倍数下, 每个盖玻片上随机选5个视野, 计算平均阳性细胞数。
1.5 统计学处理
实验数据以均数±标准差
2 结果
2.1 NSC的体外原代及传代培养
培养1 d细胞呈圆形亮点, 2 d～3 d可见有数个细胞形成的哑铃样结构, 4 d～5 d可以见到几十个细胞形成的神经细胞球 (neurosphere) , 6 d可见神经球明显增大, 直径达100 μm～150 μm, 8 d～10 d大的神经球直径已达到150 μm～200 μm。原代及多次传代培养 (目前在本实验室条件下已传10代) 形成克隆球的细胞圆润饱满, 边界清晰, 活力状态佳, 经鉴定Nestin表达阳性。
2.2 壮通饮对体外培养神经干细胞分化的影响
在去除bFGF及EGF, 加10%胎牛血清配制的培养基培养7 d后, 神经干细胞部分分化为NeuN染色阳性的神经元、GFAP染色阳性的星形胶质细胞和MBP染色阳性的少突胶质细胞。NeuN阳性神经元的胞体呈圆形或锥体形, 有较长轴突。GFAP阳性星形胶质细胞的胞体稍小, 胞突长而直, 分支较少。MBP阳性少突胶质细胞的胞体更小, 呈扁平状, 突起比神经元样细胞和星形胶质样细胞的少。添加壮通饮培养7 d后表达Nestin抗原的阳性细胞数较对照组明显增加 (P<0.05) , 而且表达NeuN (P<0.05) 、GFAP及MBP的阳性细胞数较对照组也明显增多 (P<0.01) 。随壮通饮浓度增加NeuN阳性细胞数逐渐增多 (P<0.01) , 但GFAP及MBP阳性细胞数壮通饮各剂量组无统计学意义。详见表1。
3 讨论
近年来研究发现[5], 在哺乳动物中枢神经系统存在NSC, 主要分布在海马、纹状体、脑室下区、嗅球以及发育过程中的大脑皮质和脊髓。本实验应用无血清培养技术从新生大鼠大脑海马中分离、培养成细胞悬浮球, 经鉴定呈Nestin阳性。 Nestin[6,7,8]即巢蛋白, 又名神经上皮干细胞蛋白, 属于中间丝蛋白, 主要在神经干细胞内一过性表达, 当干细胞向着终末细胞分化完成后, 其表达停止, 成熟细胞有着特异的表达标志物, 所以巢蛋白被广泛用于神经干细胞的标记物质, Nestin阳性表明为神经干细胞分化。
体外培养的神经干细胞与其所处微环境关系密切, 其中主要因素就是培养基质中的各种细胞因子, 这些因子的成分和浓度能决定神经干细胞的增殖及其分化方向[9,10]。因此, 利用某种药物对体外神经干细胞进行定向诱导增殖和分化, 为中枢神经系统损伤修复的治疗带来了新的希望。壮通饮中的扶芳藤对小鼠外周血造血干细胞有明显的动员作用, 并具有作为有效干细胞动员剂的潜力[11];三七总皂甙可以提高脑梗死患者骨髓干细胞动员率[12];三七总皂甙能够促进新生大鼠海马神经干细胞分化, 有促进干细胞增殖的作用[13], 但这些都是拘于对该方中单味药进行研究, 壮通饮是否能够诱导大脑海马区NSC增殖分化, 迄今缺乏明确的实验证据。本实验研究发现, 在NSC分化期, 添加壮通饮后, 表达Nestin抗原的细胞数较对照组明显增加, 同时表达NeuN、GFAP和MBP的阳性细胞数量显著增多。其中NeuN (神经元核心抗原) 在神经元分化成熟后开始表达, 是成熟神经元的特殊标志物[14,15];胶原纤维酸性蛋白是星形胶质细胞的特征性标志物[16];髓鞘碱性蛋白是少突胶质细胞的特征性标志物[17]。壮通饮能够促进新生大鼠大脑海马NSC的分化和增殖。在相同接种密度下对比三种不同剂量壮通饮组分化产生的阳性细胞数, 可以看出在本实验剂量范围内, 壮通饮浓度越大, 分化形成的神经元细胞越多, 而壮通饮对NSC分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞虽有促进作用, 但与其浓度的关系不大。提示壮通饮对NSC尚具有一定的定向诱导分化作用。
本实验证实, 壮通饮能诱导大脑海马区NSC分化, 具有一定的促进神经再生的作用。
摘要：目的 探讨壮通饮对体外培养大鼠大脑海马区内源性神经干细胞 (NSC) 分化作用的影响。方法 利用无血清DMEM/F12 (含20ng/mL bFGF和EGF及2%B27) 体外培养技术从新生Wistar大鼠大脑海马区中培养NSC, 在NSC分化过程中添加不同剂量 (20mg/L、40mg/L和80mg/L) 壮通饮进行干预, 以免疫荧光及细胞化学方法对NSC及其分化后的细胞进行鉴定。结果 从大脑海马区分离培养的NSC能够表达巢蛋白 (Nestin) , 并具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。在同一接种密度条件下, 不同剂量壮通饮干预组Nestin阳性细胞表达数分别为:20mg/L组 (20.2±1.4) ;40mg/L组 (23.6±1.9) ;80mg/L组 (32.8±2.2) , 与对照组 (16.7±1.5) 比较明显增加 (P<0.05) 。壮通饮各剂量组表达神经元核心抗原 (NeuN) 、胶原纤维酸性蛋白 (GFAP) 、髓鞘碱性蛋白 (MBP) 的阳性细胞数较对照组明显增加 (P<0.05) 。结论 壮通饮能诱导大脑海马区NSC分化, 具有一定的促进神经再生的作用。