微生物源性（精选3篇）
微生物源性 篇1
多重PCR是通过对PCR技术的改进而建立起来的一种体外扩增技术, 是在同一扩增体系中通过加入多对引物从而对多条目的DNA片段进行扩增[1]。根据扩增模板的种类可以分为单一模板的多个基因位点扩增和多种DNA模板的不同基因扩增。前者在同一反应体系中通过加入单一DNA模板和多对引物进行扩增, 后者在统一体系中加入多种DNA和引物进行扩增。与传统的PCR相比, 具有扩增效率高, 产物特异性高和经济简便特点, 特别适合食品中病原微生物的快速测定。
1 多重PCR在食品中致病菌的检测
目前多重PCR的方法建立主要在食品中病原菌的检测, 这方面的研究最多, 建立的方法也最多。
1.1 多重PCR检测同一致病菌
食品中的某些致病菌由于具有较多的血清型, 很多DNA片段都是某一些细菌所共有的, 很难通过单一的PCR扩增某一条片段进行确定, 极易造成测定结果的假阳性, 影响样品检测的有效性。采用多重PCR针对目的基因的多个DNA片段设计引物进行扩增, 根据多条扩增结果来判断结果可以减少假阳性, 提高测定结果的特异性。
产毒素大肠杆菌是引起腹泻的重要致病菌, 通常分为3种类型:ETEC (产肠毒素大肠杆菌) 、SLTEC (产志贺样毒素大肠杆菌) 和NTEC (产坏死性大肠杆菌) 。其中SLTEC可产生3种毒素类型 (SLT1、SLT2和SLT2v) , 主要血清型是O157:H7[2]。杨小鹃等[3]采用大肠杆菌O157:H7rfe E和fli C基因的保守序列设计两对引物, 通过对包括猪肉鸡肉牛肉羊肉在内的65份样品进行检测, 同时采用传统分离培养鉴定和测序验证进行方法对比, 结果显示阳性样品与标准鉴定方法的一致性达到98%, 显示出测定结果的特异性好。
副溶血性弧菌是主要存在于近海的海水、鱼类、贝类等海产品中的一种病原菌, 可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病等[4]。我国副溶血性弧菌引起的食物中毒在人数和起病数上都处于第一位。李晓虹等[5]根据副溶血性弧菌的tl、tdh、trh基因设计三对引物, 采用PCR多重扩增, 并对扩增结果特异性和标准菌株进行验证, 结果显示采用多重PCR能够特异性地扩增副溶血性弧菌的450、269、500bp片段, 而对其它种类菌没有特异性扩增。可在增菌8h后快速、简单、准确检测出食品中副溶血性弧菌。
沙门氏菌 (Salmanella) 是最常见食源性病原菌, 所含细菌种类繁多。已发现超过2 500种以上的血清型。邵碧英等[6]采用沙门氏菌属特异基因hut、hil A、inv A、hns和hns五个基因建立多重PCR检测方法, 结果表明二重PCR检测灵敏度与单一PCR一致, 三重PCR检测灵敏度有所下降, 并未建立起同时检测4种基因的多重PCR方法。Soumet等[7]根据沙门氏菌属随机克隆序列、伤寒沙门氏菌的fc基因和肠炎沙门氏菌的sef A基因设计了三对引物, 应用多重PCR对1 078份家禽样品进行检测, 敏感性可达95%, 高于常规细菌学鉴定方法的92.5%, 显示出方法建立的不稳定性和引物设计的重要性。
1.2 多重PCR检测不同致病菌
针对不同病原菌高度保守基因、特异性基因和毒素基因设计相应的引物, 从而在同一反应体系中实现对多种病原菌的检测, 可以大大缩短检测时间和降低成本。相对于检测同一致病菌, 检测多种菌更有实际意义。由于食品中病原菌的数量较少, 一般在检测前进行10~24h的增菌过程, 可以显著提高样品检出率。陈伟等[8]对金黄葡萄球菌 (SA) 的nuc、单增李斯特菌 (LM) 的hly和蜡样芽孢杆菌 (BC) 的hemolysin基因, 设计合成三对引物, 结果显示方法检测结果与单基因PCR检测的灵敏度相同, 结果稳定。整个检测过程在16h完成, 监测灵敏度可达1cfu/m L。李博等[9]以金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌建立多重PCR获得相同的稳定结果, 体现出在监测多重致病菌方面的优越性。杨平等[10]对食品中主要存在的4种致病微生物沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌, 根据其主要特异性基因产物设计引物, 建立起4种致病菌的多重PCR检测体系, 体系中4种病原菌随机混合扩增均可成功, 具有很强特异性, 包括增菌时间10h即可检测完毕, 在食品卫生检验中具有较强使用价值。焦豫良等[11]对6种食品致病菌建立起的多重PCR灵敏度与单独PCR相同, 所需时间更短, 整个过程只需3~4h, 显示出快速监测的优势。
2 多重PCR在食品中病毒的检测
病毒只能在活的宿主细胞内才可以生存, 一般在食品中并不能繁殖和复制, 但很多资料证明, 多种病毒性疾病确实由食品传播的, 如甲肝病毒、脊髓病毒、轮状病毒和诺沃克病毒等。由于能够引起食品中毒的病毒种类较少, 而且血清型亦不是很多, 所以采用多重PCR测定多种病毒意义不大, 但在确定食品中是否存在某种病毒方面具有一定的优势, 即用多重PCR检测某一病毒。2003年SARS期间, 我国出口的食品和动植物产品被迫要求进行SARS病原检测要求, 单一PCR必须进行两次PCR才能确定是否为SARS。陈文炳等[12]采用人工合成的特异的SARS病毒DNA片段作为病毒添加到牛肉等食品中, 然后采用公开发表合成的引物进行二重PCR扩增, 并采用单重PCR对照分析, 得到相同的灵敏度, 获得和单重PCR相同的扩增片段。给食品中病毒的多重PCR检测提供了一个研究方向。
3 多重PCR在食品中真菌污染的监测
真菌在谷物和其它食品中生长繁殖时会产生真菌毒素, 真菌毒素会引起人畜严重的食物中毒, 如何能够快速检测食品中真菌及其毒素对于食品卫生具有重大意义。对于真菌的检测, 目前多采用化学色谱法、现代免疫学和毒理学试验等, 大部分是针对其产生的毒素进行鉴定, 而对于未开始产毒或产毒量小的真菌检测可能出现假阴性。多重PCR通过检测真菌的基因序列判断食品被真菌污染的程度, 具有更高的检出率, 检测食品更加安全。秦文彦等[13]根据黄曲霉毒素生化途径中的关键调控基因afl、Romt-l和ver-l的序列以及真菌共有的5.8Sr DNA的ITS序列分别设计Apa F/Apa R、Omt F/Omt R、Ver F/Ver R及ITS1/ITS4四对引物, 研究建立起产黄曲霉毒素真菌及在食品中的快速灵敏监测体系, 扩增出的对应基因序列与基因库中对应的DNA序列同源性达99%以上, 监测特异性较好, 提示多重PCR可作为真菌及其毒素检测的潜在方法进行研究。
4 存在的问题与展望
多重PCR是一种快速、准确、灵敏的检测方法, 但高灵敏往往伴随着稳定性低重复性差的问题, PCR技术本身对操作者和试剂要求较高, 多重PCR的要求则更加苛刻。微量的外源DNA即可对结果产生巨大的影响, 甚至产生假阳性, 导致测定结果错误。同时多重PCR对引物的浓度、Mg2+离子的浓度、d NTPS浓度和扩增退火温度的要求更加严格, 任何一种条件控制不当, 都很容易造成非特异性扩增, 甚至扩增失败。在建立方法时必须进行优化各个反应条件, 使测定结果更加稳定和清晰。
虽然存在上述问题, 多重PCR作为一种快速检测食品中多重病原物生物的方法, 依然具有无可比拟的优越性, 随着实验条件的逐渐优化, 新的靶基因提取技术出现以及与各种技术的整合和发展, 如将多重PCR和DH-PLC、荧光探针定量技术和PCR-DGGE等技术相结合, 从而形成一套完整的分子生物学检测体系, 使得检测方法具有更高的特异性, 灵敏性和稳定性。多重PCR必将有一个更加广阔的应用前景。
微生物源性 篇2
微生物实时荧光光电检测技术是近年来新兴的细菌、霉菌/酵母菌快速检测技术。它将改进后的传统培养分离技术、染色技术、传感和荧光检测技术以及计算机控制的模块化技术合为一体, 不仅大大简化了传统微生物的检测方法, 也将从取样到获得检测结果的时间从数天缩短为数小时。美国BioLumix公司新近推出的微生物实时荧光光电检测系统是目前具有代表性的产品。
上海美凯纯生物科技公司引进的BioLumix微生物实时荧光光电检测系统将染色、新光源和光传感器结合在一起, 使之能够用同一个检测器同步检测颜色和荧光的变化。该技术的基础是监控目标微生物在液体培养基中生长、代谢引起的化学特性的变化情况。当代谢过程发生时, 液体培养基中的感光试剂的光谱模式会发生改变。光传感器可检测到这些改变, 并以预先设定的时间间隔进行监控。
Biolumix系统的组成
Biolumix微生物实时荧光光电检测系统由三部分组成:检测仪器、一次性检测管和基于Windows系统的分析软件。
检测仪器
Biolumix检测仪器内可以同时放入32个检测管在同一温度下进行样本检测, 并可随机取放检测管;仪器温度可以在18～65℃间进行任意调节。同时模块化的设计使其可以用一台计算机控制32台检测仪器, 因而最多可同时检测1024个样本, 系统可根据用户的需要随时扩大。连锁式和前置式设计使多台仪器能够安全的堆叠在一起, 从而节约宝贵的试验台空间。
一次性检测管
检测管内含一个过滤器, 可将样本和微生物所在的孵育区与检测区分开。使用者仅需打开螺旋盖, 将试样加入孵育区即可。
在试剂液体中, 样本颗粒与培养基和染色剂混合产生一个混浊的溶液。例如, 如果样本含有1毫升牛奶, 溶液就完全变得不透明。而检测区则不受样本的影响, 因为只有小的分子和离子才能通过过滤器。因此, 检测区在整个检测过程中始终保持清澈。在检测区观察到的颜色或荧光与孵育区的相应信号相同。测试的整个过程中, 检测区只是像镜子一样反映孵育区被遮挡的颜色。检测瓶底部的传感器检测因微生物生长代谢所释放出来的CO2。当有CO2扩散到检测管底部的传感器时, 传感器就会改变颜色。加样前, 检测管中的传感器颜色为黑色, 随着微生物的生长, 传感器的颜色会变成黄色。
软件
Biolumix系统的操作软件是系统的核心组成部分。Biolumix系统采用一台装有Windows系统的计算机来控制仪器的运行, 并为用户提供分析和管理信息的工具。软件可自动将仪器中收集到的数据换算成CFU浓度, 并对不合格样本提出预警, 由计算机以不同形式的报告进行自动存档和处理。检测结果可以通过任何计算机网络进行实时传递。
软件适用于GMP、HACCP、21CFR第11部分和ISO 9000的标准, 可提供检查追踪功能、趋势分析和多种的客户专用化的报告模式。
Biolumix系统的优点
操作简单, 省时省力
BioLumix系统能提供实时微生物检测, 制备好的一次性检测管能满足每一个客户的需要。要完成一个检测, 用户只需把样本加入检测管后放进BioLumix仪器中即可在数小时之后得到检测结果。系统操作非常简单, 技术人员甚至非微生物专业人员经简单培训后即可进行操作。
实时报告检测结果
检测过程中, 一旦检测到微生物, 无需操作人员在场, 结果即可实时显示。从加样开始, 包括菌总数在内的大多数细菌检测项目都可在一个工作日内完成。污染程度越高, 结果显示越快, 从而确保用户能够采取迅速纠正行动。
优化的样本前处理过程
液体样本可以直接加入检测管内, 固体样本可按1:10稀释后加入检测管内。从而最大限度地减少了样本处理时间。
全程自动化
用户只需将液体样本或固体样本加入检测管并放入仪器, 后续检测工作将由系统自动完成。系统可自动对超标或污染样本进行报警, 并在计算机屏幕上以不同颜色进行显示。检测结果自动存档, 实现可追溯的数据安全性管理。
Biolumix系统的用途
Bio Lumix这一创新性的食源性微生物检测技术和系统可以进行诸如需氧菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母菌和霉菌、假单胞菌、葡萄球菌、肠杆菌科、革兰氏阴性菌、沙门氏菌、乳酸菌等多种微生物检测, 广泛适用于食品、制药和化工业的卫生监督、保质期预测、微生物限定检测、抗生素残留检测、嗜冷嗜热菌计数。特别是在食品行业, Bio Lumix系统可以对原材料、中间产品、生产过程中的关键控制点和终产品进行快速检测, 以实现终产品、尤其是保质期比较短或易腐食品的快速放货, 大大缩短企业库存时间、提高资金周转率。
同时, BioLumix系统对食品生产、运输和销售过程中的质量监控也具有重要意义。政府监督部门能利用BioLumix系统快速确定产品中是否存在致病菌及微生物是否超标, 从而有效保障食品安全。
微生物源性 篇3
1 概况
目前,从方法学上控制性对策主要建立有3个步骤:筛选、二级筛选、最后鉴定。一个好的筛选方法应检测到所有等于或低于最大残留量(maximum residue limits, MRL)水平,且应具有快速、简单、广泛、费用低等优点,传统微生物抑制检测法前处理简单,操作方便,虽然存在着检出限过高等问题,但仍可作为筛选方法对大批量样品同时进行检测[2]。
筛选步骤通常依据细菌抑制试验来实现多种物质残留的微生物法检测,主要包括2种筛选方法加以区别:试管实验和(多)平板实验系统。试管实验包含一种琼脂培养基,针对某一种敏感的细菌,补充以pH值和氧化还原指示剂,由颜色变化来判定抗生素的有无,主要的菌株为Bacillus stearothermophilus,之所以选择此菌是因为该菌在高温下有快速生长的特性使得结果可在几小时内获得。用芽胞代替干燥细菌可便于保存,并且方便于商业化分配,此类实验最初由检测牛奶发展而来(Delvotest等),但是目前也可用于肉、肾脏、鱼、蛋等样品的检测(Premi Test和KIS Test等)[3];但是单一细菌抑制试验对筛选抗生素残留通常是不适合的[4]。在(多)碟实验中,样品被加入至已接种的琼脂层的顶部或小孔内,来自于一片组织或浸满组织液的纸片中含有动物组织的抑制性物质,此物质可扩散至琼脂层抑制接种于平板的敏感菌株的生长,通过隔夜培养,以样品周围出现抑菌环来判定抗生素的存在,用单一平板或不同平板、不同组合的pH值、培养基和不同的菌种以提高不同药物的检测水平[5]。
二级筛选也可通过微生物法来实现。一般针对多碟实验,目前,可用不同的物质作为假定性鉴定的抑菌剂针对不同类型的抗生素,但目前没有单一的物质可针对所有类型的抗生素残留。
筛选试验的目的是为了选择一些样品,这些样品可经过更高级的方法进一步进行鉴定,包括:酶免法、Charm II受体分析法和色谱法。一旦经常规抑制试验为阳性的样品需进行化学鉴定和定量测定。理化检测方法因前处理较复杂,所需仪器较昂贵,不适用于屠宰厂的现场检测,但因其具有高效、灵敏、准确等优点,又因为化学法的极其专一性,因此,作为鉴定试验已为大家广泛应用[6]。
进一步说,微生物法因需要大量的平板而使得实验变得繁琐,但是这并没有影响此法的广泛性,该法因其价廉、简易、广谱等特点在检测抗生素残留过程中发挥巨大作用,以下针对不同类型的微生物法及其发展过程作为阐述。
2 欧盟各国的检测方法
2.1 单碟法
比利时用于检测屠宰场动物的肾组织抗生素残留的常用方法。用Bacillus subtilis BGA作为工作菌,加入三甲氧苄氨嘧啶能较好地测定磺胺类抗生素,加入β-葡萄糖苷酸酶可较好地测定氯霉素类抗生素残留[7]。此法被认为对检测肉类意义不大,因为大多数抗生素会很快从肌肉组织中释放出来, Koenen-Dierick等[8]另研究发现单碟法在检测磺胺类药物方面在pH值为7.2时与四碟法检出限相似,可替代欧盟四碟法。
2.2 New Dutch Kidney(NKT)法
1988年发展于荷兰,是荷兰用于屠宰场动物新鲜肾的检测方法,实际上是一种单碟实验。由standard II 营养琼脂组成,加上1% NaCl、1%葡萄糖、0.2%KH2PO4和0.28 Na2HPO4·12H2O。将此琼脂倒入平板,厚2.2 mm,pH值调至7.00±0.05。同样Bacillus subtilis BGA作为工作菌。在屠宰场测定抗生素残留时,先将4张纸片放在肾盂中至少30 min,将其中2张被肾盂浸湿的纸片于-20 ℃冷冻保存备用,另2张呈对角置于实验平板上。将25 ml三甲氧苄氨嘧啶溶液(含2mg/ml TMP在10% NaCl溶液)滴加在2张纸片上,将平板置于37℃培养3~8 h[9]。
新的荷兰肾实验(New Netherlands Kidney Test, NNKT)对于磺胺类药物有较高的灵敏度,特别是对于屠宰场猪肉样品中磺胺类、氯霉素、四环素、氨基苷类和青霉素类较欧盟四碟法灵敏度高。Broex等[10]认为NNKT与NKT比较,前者可测出5.3%的样品阳性率,后者仅为2.2%。
2.3 德国三碟法
也是利用B. subtilis作为工作菌,3块板的pH值分别为6.0,8.0和7.2,在最后一块平板中加入三甲氧苄氨嘧啶能较好地测定磺胺类抗生素,30 ℃培养18~24 h。肌肉和肾均可作为样品用冷冻肉和鲜的或冷冻肾样,制成直径为9 mm、2 mm厚的薄片,置于平板上培养[11]。如果在2块组织薄片的边缘开始出现2 mm的抑菌环即可判定为阳性。阳性的肌肉试验不适用于整个动物标本,而阳性的肾实验仅能排除器官。在放置猪和马的肾脏薄片之前,预先放置半通透的膜在琼脂表面,以避免由于组织细胞破裂释放出的溶菌酶而导致的假阳性结果出现。此法对四环素类、β-内酰胺类、喹啉类、氨基苷类、磺胺类药物残留均可检出,但是有些抗生素不符合欧盟规定的耐受水平,如土霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、磺胺类药物等,大环内酯类、多黏菌素等药物检测不够灵敏。该实验较New Dutch Kidney法更加繁琐、费用高。
2.4 欧盟四碟法
此法也是微生物抑制法,其中3块平板利用Bacillus subtilis在不同的pH值(6、7.2、8)制成的培养基,第4块平板利用Micrococcus luteus作为检测用菌。将肌肉样品或肾样品保持在冷冻状态下,切成8片,为直径8 mm、厚2 mm的圆柱,每块平板放置2片,呈对称放置在平板边缘,每块平板可放置6块肉片。前3块平板置30 ℃培养20~24 h,当2块肉片周围的抑菌环大于或等于2 mm时,结果可判定为阳性。
4795份调查结果显示,M.luteus在pH值为8的条件下得出的阳性结果检测macrolides和β-内酰胺类抗生素是不可靠的[12];Bacillus subtilis作为工作菌的平板较M. luteus作为工作菌的平板结果可靠。四碟法对fluoroquinolones和磺胺类抗生素不够灵敏。
原则上说,只有深度冷冻的样品才适用于此法,如果采用透析膜和后期的鉴定技术,那么也可利用肾脏作为样品。该法检测大环内酯类残留较德国三碟法检测值低,该法较前2种方法更加繁琐和昂贵。
总之,New Dutch Kidney法、德国三碟法、欧盟四碟法在欧盟各国用于抗生素残留的筛选。New Dutch Kidney法在检测磺胺类药物中较德国三碟法和欧盟四碟法灵敏。
3 美国及加拿大地区的检测方法
STOP(Swab Test On Premises)法和CAST(Calf Antibiotic and Sulfa Test)法用于加拿大和美国的屠宰场,后来,美国又发展了FAST(Fast Antimicrobiol Screen Test)法,STOP用B. subtilis作为实验菌,接种在抗生素5号培养基上,27~29 ℃培养16~24 h,用沾取肾液的棉拭周围出现抑菌来判定抗生素的存在。CAST法用B. megaterium作为实验菌[13],接种于M-H培养基中,44~45 ℃培养16~24 h,在棉拭周围出现抑制环表明样品中存在抑菌物质。FAST法的实验菌和试验温度与CAST法相同,但是CAST法培养基中加入葡萄糖和溴甲酚紫。FAST法检测细菌有较快的生长率,因而使得培养时间由16减少为6 h。当STOP法的培养基换成Saskatoon抗生素培养基时(pH值由8.0到6.7,并加入相应的中和剂)在标准溶液中用此法进行22种抗生素的测液,其中有15种灵敏度增加。这3种方法对氯霉素和磺胺类药物灵敏度较低。
自1967年开始,美国FSIS对大量的肉类和家禽样品进行常规检验以避免农药残留对人类造成伤害。1979年,美国开始实行第1个快速筛选试验,即STOP(Swab Test On Premises)法,此法由Belsville发展于实验室,用于检测和监控动物源性食品中抗生素残留的检测,并可在24h内检测出残留的抗生素,而在这之前,需要五六天才能得出实验室结果。至20世纪80年代,小牛中残留的磺胺类药物和抗生素残留的增加引起了美国FSIS的注意,为了对这种类型的动物进行筛选,1984年Belsville实验室又研究出了CAST法,1985年将此法引入屠宰场作为检测残留的筛选方法。至1987年,小牛中的磺胺和抗生素残留水平明显减少。1994年,FAST出现,研究表明FAST法与前2种方法比较,样品阳性检出率高[14],而且该法更适用于针对磺胺类残留样品的检测,更加使得此法有优势的是,FAST法使用的培养基是紫色的,在培养基内加入糖,细菌培养后产酸使得培养基颜色变黄,如果棉拭周围有抗生素那么会阻碍细菌的生长而使得颜色保持在紫色,说明有抗生素残留。
4 日本针对抗生素残留的检测
在日本的日常监测中,广泛采用平成6年日本原生省所制订的《实用牲畜、水产品中抗生素物质残留的简易检测法(修订)》作为准则。该法使用柠檬酸和丙酮缓冲液20 ml再加入5 g样品均质后,取上清液作为样液进行检测。崛江正一等对此法作了改进,将5 g样品放入聚丙烯制离心管内,加入5 ml甲醇,搅拌1 min,在10 ℃的条件下,用3000 r/min离心10 min取上清液作为检测样液进行检测,利用此法减少了样品中抗生素的稀释倍率,使检测灵敏度大大提高,并检出各类抗生素125种[15]。
5 我国近年来的发展状况
中华人民共和国出入境检验检疫局行业标准《动物源性食品中抗生素药物残留检测方法微生物抑制法》规定了动物源性食品中β-内酰胺类、大环内酯类、四环素、氨基苷类药物残留检测的试样制备、保存和检测方法,10 g试样加入至20 ml缓冲液内用涡旋振荡器振荡3 min,于70~75 ℃水浴20 min后,2000 r/min离心15 min,取上清液作为样液,将滤纸置于检定平板上,每块平板最多不超过6个,滴加100μl样液在滤纸上, 冷藏30 min后,30 ℃培养18 h后观察结果,根据抑菌圈的大小判定结果。
王志强等[16]采用了微生物抑制法快速检测了15种抗生素残留,与上面不同的是该法在样液制备时采用了磷酸盐-乙腈混合液作为缓冲液。
目前,我国食品卫生标准中GB/T 4789.-2003制定了牛乳中抗生素残留的检测方法。即氯化三苯基四氮唑法(TTC法)[17],嗜热链球菌生长繁殖产生的氢可使无色TTC还原成红色化合物。如果牛奶的颜色不变,证明有抗生素存在导致菌种不繁殖,即为阳性,反之变成红色则为阴性。此法的最低检出量为青霉素0.004 U/mL,链霉素为0.5 U/mL,庆大霉素0.4 U/mL,卡那霉素5 U/mL。
6 国际上近年来发展的方法
6.1 STAR法
随着技术的不断改进,Gaudin等[18]2004年研究出一种五碟法(Screening Test for Antibiotic Residues, STAR法)来筛选乳品中抗生素残留。5块平板分别针对不同类型的抗生素而设定,即B.cerues针对四环素,E.coli针对喹啉类,B. subtilis针对氨基糖苷类,Kocuria varians针对大环内酯类,Bacilus stearothermophilus针对磺胺类和β-内酰胺类。该五碟法对不同类型的抗生素进行联合检测,最多可检测66种抗生素,且较传统的方法有至少2倍的灵敏度,检出限也大大降低,作为欧盟实验室参考标准,已用于牛奶中抗生素测定,实际上此法也可用于肌肉的测定。
6.2 六碟法
由6块平板组成。Myllyniemi[19]等用微生物六碟法对肾脏和肌肉样品进行检测,并用液相色谱对阳性样品进行鉴定,得出此法与化学法有较好的一致性。方法是B.subtilis接种在其中3块平板,pH值分别为6.0、7.2和8.0,B.cerues接种在pH值为5.9的培养基中,M.luteus接种在pH值为8的培养基中,E.coli接种在pH值为7.2的培养基中。Ferini[20]等将证实性溶液(Pase, Paba, MgSO4)作为二次筛选试验的必要条件引入试验,同时将分析薄膜插入样品和琼脂表面之间放置溶菌酶的反应以减少假阳性的结果。具体操作如下:将解冻的样品用小刀切成直径8 mm×2 mm厚的薄片,在所有的平皿(除去第3块板)中置2片样品,其中1片样品滴加20 μl相应的中和溶液,在第3块板置4片样品,在其中的3片样品上分别滴加Pase, Paba, MgSO4,将一片方形纤维分析膜(20 mm×20 mm)插入组织薄片和琼脂表面之间。1~4平板在30 ℃,平板5和6在37 ℃培养,这个实验整个过程仅需18 h。
6.3 Delvotest法(SP法)
原理是利用嗜热芽孢菌64 ℃培养后产酸引起指示剂BCP(即溴甲酚紫)变黄,如果抑制剂不变色,说明抗生素抑制嗜热芽孢菌生长,存在抗生素残留,反之变黄色。Althaus等[21]于2003年用Delvotest光度法对牛乳中的抗生素的限值检测研究表明,β-内酰胺类、磺胺类等抗生素的检出限与MRL水平相当,而针对牛乳中氨基苷类、四环素类、链霉素、氯霉素和三甲氨苄嘧啶残留的检测灵敏度有待提高,建议用不同类型的微生物建立联合残留物检测系统以检出不同类型的抗生素。
6.4 BY法
也称蓝黄检测法,通过颜色的对比判断阳性、阴性,从而检测乳制品中抗生素的残留。Linage等[22]通过这种方法对β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类等25种抗生素进行了检测,其检测限与欧盟规定的检测限很接近。此法操作简单,耗时短,检测种类多;但是误差大,容易漏检。
6.5 Premi Test 此法可用安瓿制成商业化培养基进行培养。
将绞碎的新鲜肉20 g用25 000 r/min离心10 min制成肉浸液,将100 μl上清液加入琼脂表面,在室温下20 min预培养后,加至安瓿中64 ℃培养至阴性对照出现黄色为止,大约需要3 h[23]。近年来的研究表明,Premi Test针对四环素、磺胺类药物、喹啉类、链霉素缺乏灵敏度,用此法可检出较低水平的青霉素,对氯霉素不够敏感[24]。较FAST相比,Premi Test的假阳性率较高,新霉素用FAST检测有较好的灵敏度,且对于肾液样品均不能检测小于5 ng/ml的浓度[25]。
6.6 NAT(Nouws antibiotic test)法
用5块平板进行筛选,将肾盂液接种在纸片上进行检测,同时用肉浸液和肾脏浸液作为阳性对照,5块平板分别为:B. cerues ATCC1178针对四环素,Kocuria rhizophilaATCC9341针对β-内酰胺类和大环内酯类,Yersinia ruckeri NCIM13282特异性针对喹啉类,Bacillus pumilus CN607针对磺胺类和二氨基嘧啶,Bacillus subtilis BGA针对氨基苷类。方法是将肾从肾的背部边际向肾盂切割,然后将纸片插入并快速涂抹切割面,在0.5h的吸收后,置于事先准备好的5块平板上,隔夜培养,大于15 mm判定为阳性。阳性的样品再用肉浸液和肾脏浸液进行阳性筛选。与Premi Test比较[26],STAR和NAT法更适用于实验室,并需要多一些的培养时间和不止一种的指示菌,但是可检测4种MRL,而Premi Test不能够检测四环素MRL。该法使得残留的一致性得以缩小,另外加入阳性筛选使得NAT法的结果更加确定。
6.7 检测喹啉类药物残留的快速检测法
用单一的革兰阴性大肠埃希菌作为敏感菌,为一种快速的抗生素残留检测方法,可检测家禽肉和蛋类的喹啉类药物残留,可制成安瓿进行检测,与Premi Test和Delvotest法具有可比性;Helen Ashwin等[27]对此法进行了改进,在营养琼脂中加入pH酸性指示剂,改进后的假阳性率和假阴性率均小于5%;Pikkmaat等[28]认为此法可用于半定量,同时针对多种抗生素残留的样品可用于其他方法(如Premi Test)的补充,用其针对喹啉类药物残留进行检测。
7 展望
随着科学技术的飞速发展,当今许多成就致力于发展液相色谱和气-质联用等证实性方法。但是,我们应该认识到快速监测屠宰场动物的筛选方法还是依靠微生物法检测抗生素残留来实现,传统的检测方法在食源性食品的抗生素检测的过程中仍然起着很大作用。
综上所述,食品中抗生素残留问题因涉及人们健康的公共卫生问题而越来越引起各国重视,建立健全适合本国的检验检测方法,寻求能够简便、快速、准确地检出微量的残留的方法,尽可能地减少其对人类的危害,是我们检验工作的重中之重。目前,各类方法的发展已日趋成熟,关键是如何在实际工作中充分发挥作用,提高各环节人员的意识水平,给食品一个安全、放心的环境。