鸡α干扰素

鸡α干扰素（精选9篇）

鸡α干扰素 篇1

1957年, ISSACA等发现了干扰素 (interferon, IFN) 的存在, 现已证明不论高等动物还是低等动物都有干扰素类似物质的产生。干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子 (Levy D E等, 2002) , 在抗病毒、恶性肿瘤、增强免疫调节能力等方面有明显效果, 它分为Ⅰ型和Ⅱ型两类, Ⅰ型主要包括IFN-α和IFN-β, Ⅱ型又称免疫干扰素IFN-γ, 主要由T淋巴细胞产生 (Constanze H等, 2005;Mege D等, 1991) 可增强巨噬细胞的吞噬活性及淋巴细胞对靶细胞的特殊细胞毒性 (亓立峰等, 2003) , 从而发挥其抗病毒活性。干扰素虽最早发现于禽类, 但禽类干扰素分子生物学水平的研究一直比较滞后, Sekellick M J等 (1994) 于1994年首次成功克隆和表达了鸡IFN-α基因, 并进行了结构分析。1995年成功克隆了鸡IFN-γ基因 (Digby M R和Lowenthal J W, 1995) , 近年禽类干扰素在基因和蛋白水平的研究也越来越多, 国内也相继研究了IFN-γ的克隆以及重组干扰素-γ在球虫感染中的作用 (刘胜旺等, 2000;吕英姿等, 2002;史耀旭等, 2006) ;陈红英等 (2009) 用原核表达系统表达了鸡α干扰素, 并证明表达产物在细胞上有抗病毒活性。文献报道已成功克隆了惠阳胡须鸡 (汪明等, 2000) 和丝羽乌骨鸡IFN-α基因 (夏春等, 2000) 。李秋霞等 (2011) 用原核表达系统表达了三黄鸡α干扰素, 通过鸡胚抗新城疫病毒实验证明重组干扰素具有良好的延迟和减少病毒复制的作用。此基础上, 我们对发表于Genebank中的三黄鸡IFN-α干扰素基因进行密码子优化, 人工合成, 构建原核表达载体和真核表达载体, 为干扰素的表达和其抗病毒活性的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 质粒与菌株。

大肠杆菌BL21、Rossta和毕赤酵母KM71均购自北京全式金生物技术有限公司;p MD-18T克隆载体为Promega公司产品;表达载体p ET-28a和PGAPZαA由山东农业大学畜牧兽医学院馈赠。

1.1.2 酶和试剂。

T4 DNA连接酶为Ta Ka Ra公司产品;限制性内切酶Eco R I、Not I和AVRⅡ为宝生物公司产品;普通DNA聚合酶、蛋白质Marker 2000和BCA蛋白定量测定试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒和U-NIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品;PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 干扰素基因的获得及密码子优化。参照NCBI中已发表的鸡α干扰素基因序列 (AB021154) , 根据大肠杆菌密码子偏好性对去除信号肽基因序列的干扰素基因的进行密码优化。

1.2.2引物设计。根据密码子优化后的干扰素基因, 利用Primer 5.0软件设计1对引物。IFN-α-F1:5-AATGAATTCTGTAACCACCTGC-3 (Eco RⅠ) ;IFN-α-R1:5-ATTGCGGC-CGCTTAAG TACGA-3 (NotⅠ) ;真核通用型引物:p GAP-F:GTCCCTATTT-CAATCAATT-GAA;AO-X1:GCAAATGG-CATTCTGACATCC引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 克隆质粒p MD-18T-IFN-α的构建。鸡α干扰素全基因的PCR扩增、克隆与序列测定参照《分子克隆试验指南》, 以人工合成的干扰素基因为模板, 采用引物IFN-α-F1和IFN-α-R1进行PCR扩增。反应程序为94℃预变性3 min;94℃30s, 55℃45 s, 72℃1 min进行35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳, 参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收489 bp处DNA带, 回收的PCR产物与PMT-18T载体连接, 转化E.coil DH5α感受态细胞。挑选多个菌落接种含Kan的LB液体培养基, 37℃过夜培养, 提取质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。

1.2.4 原核表达载体PET-28a-IFN-α的构建。将鉴定为阳性的干扰素基因克隆质粒和PET-28a分别进行Eco RⅠ和NotⅠ双酶切, 回收酶切产物后连接, 转化至Rossta菌感受态细胞中, 挑选数个单个菌种进行PCR、双酶切和测序鉴定。

1.2.5 真核表达载体p GAPZαA-IFN-α的构建。将鉴定为阳性的干扰素基因克隆质粒和p GAPZαA分别进行Eco RⅠ和NotⅠ双酶切, 回收酶切产物后连接, 经AVRⅡ线性化后, 与p GAPZαA连接转化至毕赤酵母KM71感受态细胞中, 在含博莱霉素平板中挑选数个单菌落进行PCR、双酶切和测序鉴定。

2 结果

2.1 干扰素基因密码子优化

根据原核表达受体菌大肠杆菌Rossta和毕赤酵母对密码子的偏好性, 对Genebank中收录的鸡干扰素基因序列进行密码子优化, 结果如图1所示, 对原基因序列91个碱基位点进行了改变, 干扰素蛋白序列保持不变, 大肠杆菌和毕赤酵母对其偏好性增强。

2.2 干扰素基因克隆质粒p MD-18T-IFN-α的构建

将合成的干扰素基因片段与克隆质粒p MD-18T进行连接、转化, 对提取的质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定, 显示转入大肠杆菌DH5α中的质粒为阳性质粒, 成功构建了干扰素基因的克隆质粒p MD-18T-IFN-α。

2.3 干扰素基因原核表达载体p ET-28a-IFN-α的构建

将鉴定为阳性的重组克隆质粒和原核表达载体p ET-28a分别进行双酶切、回收、连接转化大肠杆菌Rossta中, PCR和双酶切鉴定 (见图2和图3) 及测序结果显示成功构建了干扰素基因的克隆质粒p ET-28a-IFN-α。

2.4 干扰素基因真核表达载体p GAPZαA-IFN-α的构建

将鉴定为阳性的重组克隆质粒和真核表达载体p GAPZαA分别进行双酶切、回收、目的片段与表达载体连接后, 用AVRⅡ进行线性化, 进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 结果如图4所示, 线性化后的重组质粒大小要高于为空质粒大小, 未线性化质粒出现两种存在形式, 在此基础上完成了重组质粒的转染。转染后对筛选的阳性克隆子进行特异性引物扩增, 成功获得鸡IFN-α基因的目的片段;通用型引物成功扩增出目的片段, 大小在1000bp处, 如图5所示;而双酶切结果同样获得了预期结果, 如图6所示。

注:M1:DNA Marker 2000; (1) 重组质粒p GAPZαA-IFN-αAVRⅡ线性化结果; (2) IFN-α基因回收结果; (3) 质粒p GAPZαA回收结果; (4) 重组质粒p GAPZαA-IFN-α未线性化结果;M2:DNA Marker 15000

注:1:阴性对照;2-3:特异性引物PCR扩增结果;4:通用型引物PCR扩增结果;M:DL2000。

注:M1:DL15000;1-3:阳性转染子双酶切结果;4阴性对照;M2:DL2000

3 讨论

目前, 随着我国养鸡规模的逐渐加大和集约化程度的不断提高, 疾病的发生、发展、流行、预防一直是行业内关注的问题, 重大流行性疾病, 尤其是原发性的病毒病, 如新城疫、禽流感, 鸡传染性支气管炎等所带来的危害越来越严重, 给养鸡业造成了重大经济损失, 所以对病毒病的防治不容忽视, 寻求一种好的治疗型制剂显得尤为必要。近年来, 干扰素因其作用机理的独特性而具有广谱的抗病毒活性和免疫增强作用 (Richard E R和Stephen G, 2008;Jennifer Z等, 2009) , 一直是病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点。研究表明, 重组干扰素与天然干扰素具有同样的抗病毒和免疫调节活性, 因此重组干扰素的研究和应用将成为家禽养殖中增强鸡的免疫, 减少发病, 降低鸡的死亡率的重要方向 (周海龙等, 2007) 。但重组干扰素与天然干扰素相比又有着诸多不同, 天然干扰素活性很好, 但获得手段相对单一, 且产量不高, 一定程度上影响了干扰素制品的开发与应用;重组干扰素则是利用基因工程手段, 选择不同的表达系统, 可以获得较高产量的干扰素。

本研究根据Genebank中发表的及α干扰素基因序列和大肠杆菌密码子偏好性, 对干扰素基因进行了密码子优化后人工合成编码干扰素成熟蛋白的基因序列, 在此基础上完成了干扰素重组质粒原核和真核表达载体的构建。在整个实验设计过程中, 考虑到要在原核生物中表达真核基因, 信号肽由于缺少相应的受体而无法发挥作用, 所以我们在人工合成基因片段的过程中, 人为的去掉了干扰素信号肽序列。此外, 考虑到工业化生产的需要, 采用了不用诱导即可表达的真核表达载体p GAPZαA, 以期获得较好的表达效果, 为干扰素便捷化工业生产提供技术支持。

干扰素因其独特的优势而被广泛研究, 但目前动物领域干扰素制品较少, 开发和应用较为成熟的是重组人干扰素, 取得了很好的治疗效果和经济效益。相比之下, 动物干扰素制品在生产工艺方面存在着诸多难点, 尤其是原核表达干扰素工艺存在着环节多、操作复杂、蛋白不稳定等缺点;酵母表达系统获得的蛋白活性一般较好, 但是需要进行人工诱导, 且生产时间较长, 也存在改变表达蛋白生物学活性的可能, 以上均造成了动物干扰素开发不理想的重要因素, 也是需要研究人员不断去改进和突破的环节。

哪些因素影响α－干扰素的疗效 篇2

乙型肝炎病毒主要通过输血、使用血制品、使用被污染的有关器械，如注射器、针灸针、文身针，以及母婴垂直传播等方式传染。目前，我国新生儿普遍接种乙肝疫苗，加上乙肝免疫球蛋白，都对阻断母婴传播起到了重要作用。新生儿在接种了乙型肝炎疫苗后，90%以上能够免受乙肝病毒感染，这种保护作用可持续8～9年。随着乙肝疫苗的全面普及应用，我国新增的慢性乙肝患者将会越来越少。不过，当今社会上慢性乙型肝炎患者仍有数百万人，治疗仍是一个没有完全解决的问题。

慢性乙型肝炎治疗的关键是消灭乙肝病毒，即抗病毒治疗。目前最常用的抗病毒药物为干扰素和拉米夫定等核苷类药物。α-2b干扰素是美国食品药品管理局最早批准用于慢性乙型肝炎治疗的抗病毒药物，现在仍被认为是治疗慢性乙肝的首选药物，除 a-2b干扰素外，还有a-1b干扰素和a-2a干扰素两种。慢性肝炎患者使用干扰素治疗的最佳时机是:血清丙氨酸转移酶（ALT）高于正常（尤其是高于正常的2～10倍）、HBeAg和HBV-DNA阳性。

那么，哪些因素决定着a-干扰素的疗效呢？医学研究与临床观察表明，患者感染乙肝病毒的数量、患者自身因素以及干扰素的剂量、疗程对疗效都有较大影响。感染乙肝病毒的数量越多，治疗效果必然较差，我们可通过HBV-DNA定量来了解乙肝病毒的数量。所谓患者本身的因素，最重要的是肝组织损伤的程度，这需要通过肝组织活检，即通过针刺取得少量肝组织，在显微镜下观察组织的病理变化，了解肝脏内慢性炎症和纤维化程度。肝纤维化程度越严重，干扰素疗效越差；反之，疗效越好，越容易治愈。乙肝病程越长，肝损伤越重，故早期治疗甚为重要，尤其是青少年更应争取及早治疗。免疫功能正常、乙肝病毒未发生变异者疗效较好。干扰素大劑量、长疗程治疗效果较好。国内使用干扰素成人一般每次用量至少为300万国际单位，最好为500万～600万单位，但并非多多益善。单次剂量超过1000万国际单位，副作用过大，患者不易耐受。每周至少注射3次，可隔日1次，皮下或肌内注射，一个疗程不少于6个月，最好10～12个月。

鸡α干扰素 篇3

1 资料与方法

1.1 病例选择

按2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》[1]选择慢性丙肝40例, 按随机方式分为两组:PEG IFN-α-2b组20例, 其中, 男性12例, 女性8例, 年龄为17~60岁, 平均年龄为38.5岁;普通干扰素组20例, 其中男性11例, 女性9例, 年龄为18~57岁, 平均年龄为37.5岁。两组年龄差异无显著性 (P>0.05) 。所有病例符合以下条件: (1) 年龄性别比相近; (2) 血清抗-HCV阳性超过或等于6个月; (3) H CV-R N A阳性; (4) 血清丙氨酸转氨酶A LT高于正常值1.5~10倍, TBil小于正常值2倍以下; (5) 近6个月内未接受抗病毒免疫调节剂治疗; (6) 无合并其他肝炎病毒感染; (7) 非妊娠期及哺乳期; (8) 除外自身免疫性肝病、药物性肝病、酒精性肝病和失代偿期肝硬化; (9) 无其他合并症如心脑血管疾病、用药前查心电图、血常规、肾功均正常。

1.2 治疗方法

PEG-IFN-α-2b组:PEG-IFN-α-2b 1.5μg/kg体重, 每周注射一次, 疗程6个月。

干扰素α-2b组:普通干扰素α-2b 500万单位, 隔日1次肌肉注射, 疗程6个月。

治疗前后观察血清ALT、TBil及血清抗-HCV、HCV-RNA的变化。检测肝功能、血常规、尿常规、尿素氮、肌酐、心电图, 每个月1次, 肝胆B超、甲状腺功能测定3个月1次。同时口服利巴韦林依体重的不同给予800~1000mg/d口服。

1.3 疗效判定[1]

完全应答: (1) 血清ALT、AST恢复正常; (2) 抗-HCV或HCV-RNA阴转。部分应答:符合上述条件的一项。无应答:不符合上述两项中的任意一项。

2 结果

长效干扰素 (PEG-IFN-α-2b) 组治疗前乏力、纳差、腹胀和肝区疼痛分别为19例、17例、16例和10例;治疗后分别为10例、5例、3例和1例。普通干扰素α-2b组上述症状治疗前分别为18例、16例、14例和9例, 治疗后分别为12例、10例、6例和3例。长效干扰素α-2b治疗组治疗前肝、脾肿大者6例, 治疗后为2例。普通干扰素α-2b组, 肝、脾肿大者治疗前为5例, 治疗后为3例。长效干扰素 (PEG-IFN-α-2b) 组有13例ALT恢复正常, 3例接近正常;治疗前后有明显下降 (P<0.05) 。普通干扰素α-2b组ALT有8例恢复正常, 1例接近正常, 其余患者ALT治疗后仍高。长效干扰素 (PEG-IFN-α-2b) 组治疗前HCV-RNA定量均异常, 治疗后有12例正常, 2例接近正常, 其余的HCV-RNA均较治疗前有所下降。普通干扰素α-2b组治疗前HCV-RNA均异常, 治疗后有9例正常, 1例接近正常, 8例较治疗前下降, 2例HCV-RNA定量与治疗前相同。长效干扰素组完全应答者9例, 部分应答者5例, 无应答者6例, 总应答率为70%。普通干扰素 (α-2b) 组完全应答者6例, 部分应答者3例, 无应答者11例, 总应答率为45%。

两组患者治疗后均出现流感样症状, 如发热、头痛、肌肉酸痛等, 随着治疗的延续, 上述症状均有所减轻或消失。部分患者出现骨髓抑制现象, 白细胞及中性粒细胞下降, 给予口服升白药物或集落细胞刺激因子后, 白细胞、中性粒细胞均恢复正常达到治疗要求水平。长效干扰素 (PEG-IFN-α-2b) 组有3例出现脱发现象, 普通干扰素有5例出现脱发现象, 停药后好转。普通干扰素组有1例出现精神行为反常, 停药后症状消失。

3 讨论

目前临床上治疗丙肝最有效的药物仍为干扰素[2], 同时配以口服利巴韦林。其余的药物仍处于研究阶段。有人统计:单用干扰素治疗有效率达20%~30%。如配以口服利巴韦林, 依体重不同, 每日800~1000mg, 总有效率可达50%~70%。干扰素通过与细胞膜上干扰素受体结合, 诱导生产多种抗病毒蛋白, 可阻止病毒核酸及蛋白合成, 从而抑制病毒复制[3]。

干扰素有四大作用:抗病毒、抗纤维化, 提高机体免疫能力和抗肿瘤, 而丙肝是丙肝病毒直接与肝细胞作用, 从而损害肝脏, 因此丙肝进展快。早期干扰素治疗尤为重要。但干扰素治疗需维持较稳定的有效血药浓度才能发挥最大抑制病毒复制作用。普通干扰素的半衰期短, 用药后24h和给药间歇日血药浓度降至很低, 使病毒重新开始复制, 这就是普通干扰素的“峰一谷效应”, 是影响疗效的主要因素, 而长效干扰素克服了这一缺点, 把普通干扰素聚乙二醇化后延缓了干扰素体内代谢, 延长了其体内作用时间。药代动力研究表结果表明, 长效干扰素用药后3~8h可达到有效血药浓度, 并且维持80h以上。与普通干扰素相比, 其在血液中的清除速度减慢, 每周给药1次在整个治疗期间能维持有效血药浓度。临床研究表明, 长效干扰素 (PEG-IFN-α-2b) 治疗慢性丙肝的疗效显著高于普通干扰素α-2b, 本文中再次验证了这一结果。

参考文献

[1]中华医学会传染病毒寄生虫病分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].肝脏, 2000, 5:257～263.

[2]张厚勤.丙型肝炎病毒基因型的研究进展[J].中国现代医生, 2007, 45 (15) :144～145, 148.

鸡α干扰素 篇4

关键词:IFN-α2b;IFN-γ;MCF-7乳腺癌细胞;作用机制;细胞凋亡;流式细胞技术;Fas/FasL

中图分类号:R71文献标识码:A 文章编号:1671-4954(2010)03-0162-05

doi:10.3969/j.issn.1671-4954.2010.03.001

【Abstract】:Purpose:To investigate apoptosis of the MCF-7 breast cancer cells treated by interferon-γ combinated with interferon-α2b and its mechanism.Methods:Detected the apoptosis and Fas/FasL protein of the MCF-7 breast cancer cells after treated by interferon-γ combinated with interferon-α2b through flow cytometry (FCM). Results:The percentage of apoptotic cells increased after treated,and as the extened of time,the percentage of apoptotic cells increased,the difference was considered significant(p<0.05);the expression of FasL in MCF-7 cells increased after treated,and as the time of treatment extened,the expression of FasL in MCF-7 cells increased;The expression of Fas did not changed significantly after treated(p>0.05).Conclusion:Interferon can induced apoptosis in MCF-7 breast cancer cells.Mechanism of the apoptosis may be related by upregulated the expression of FasL protein and increased the sensitives of the Fas/FasL in the MCF-7 breast cancer cells.

Keywords:IFN-α2b;IFN-γ;MCF-7;mechanism;apoptosis;flow cytometry; Fas/FasL

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,国内外乳腺癌发病率呈上升趋势,全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌[1],占女性肿瘤发病率的第一位,乳腺癌的发生发展是一个多基因多阶段的变化过程,是由基因和环境因素联合作用而引起的疾病。近年来,国内外文献报道,肿瘤的发生不仅与细胞的异常增生和分化有关,且凋亡机制参与多种肿瘤的病理过程,细胞凋亡与肿瘤发生发展及消退密切相关。现代肿瘤学认为肿瘤细胞凋亡机制的失活是恶性肿瘤发生发展的普遍特性。诱导细胞凋亡成为治疗肿瘤的新途径。干扰素(Interferon,IFN)是一类重要的抗肿瘤、抗病毒和免疫调节作用的细胞因子,可通过阻滞细胞周期、诱导抑癌基因的表达,增强肿瘤细胞对凋亡信号敏感性而发挥抗肿瘤活性。有关干扰素诱导肿瘤细胞凋亡的研究屡见报道,但有关Ⅰ型和Ⅱ型干扰素联合作用诱导乳腺癌细胞凋亡的研究甚少。

本实验选用干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、干扰素-α2b(Interferon-α2b,IFN-α2b)二者联合应用诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,并探讨其诱导凋亡作用的机制,为其进一步临床应用提供理论依据。

1.材料与方法

1.1药品与试剂

基因重组人IFN–γ:上海克隆生物高科技术有限公司,基因重组人IFN-α2b:北京远策药业有限责任公司,RPMI Medium 1640 培养基:GIBCOBRL 公司,胎牛血清:北京元亨圣马生物技术研究所, Fas/FasL单克隆鼠抗人:美国Santa cruz公司,Fas/FasL单克隆鼠抗人二抗:南京凯基生物科技发展有限公司,Annexin V-EGFP:南京凯基生物科技发展有限公司,碘化丙啶(PI):Sigma公司,MCF-7乳腺癌细胞:南京凯基生物科技发展有限公司

1.2.肿瘤细胞培养

MCF-7乳腺癌细胞以适量浓度接种于培养瓶中,加入RPMI-1640 培养液(含10%胎牛血清)置于37℃,5%CO2浓度及饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长,每3～4天传代一次,传代时用0.25%胰蛋白酶消化2～3min,以培养液吹打制成细胞悬液,按所需浓度接种。

1.3分组与方法

1.3.1实验分对照组和实验组,对照组即正常培养的MCF-7乳腺癌细胞,实验组为500u/ml IFN-α和500u/ml IFN-γ联合作用组。作用时间分别为24h、48h、72h。流式细胞仪检测Annexin V-EGFP染色的细胞凋亡情况、通过亚倍体峰检测PI染色细胞凋亡情况及检测处理后Fas/FasL蛋白表达情况。

1.4统计分析

所有数据资料以均数±标准差(±S)表示。采用SPSS11.5统计学软件进行统计处理,进行析因设计方差分析,两两比较用Tukey或Dunnett t检验,P<0.05表示统计学差异明显。

2.结果

2.1流式细胞仪检测Annexin V-EGFP染色的细胞凋亡情况

随着作用时间的延长,凋亡细胞百分率有增加趋势,作用72h时,实验组与对照组比较,差异显著,有统计学意义(P<0.05);实验组中,作用72h与作用24h、48h比较,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。(见表1,图1-图2)

2.2流式细胞仪通过亚倍体峰检测PI染色细胞凋亡情况

随着作用时间的延长,凋亡细胞百分率有增加趋势,作用48h、72h时,实验组与对照组比较,差异显著,有统计学意义(P<0.05);实验组中,作用24h、48h、72h、之间相互比较,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。(见表2,图3-图4)

2.3流式细胞仪检测Fas/FasL蛋白表达情况

随着作用时间的延长,FasL蛋白表达有增加的趋势,作用72h时,实验组与对照组比较,差异显著,有统计学意义(P<0.05);实验组中,作用72h与作用24h、48h比较,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。Fas蛋白表达实验组与对照组相比,差异不明显,无统计学意义(P>0.05)。(见表3、4,图5-图6)

3讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,国内外乳腺癌发病率呈上升趋势,占女性肿瘤发病率的第一位,由于手术、化疗、放疗、内分泌治疗及免疫治疗等综合治疗措施的实施,乳腺癌病人的死亡率开始下降,但由于耐药、转移、复发等原因使得乳腺癌治疗的总体疗效仍然不能令人满意,因此研究探索更为有效的治疗方法显得尤为重要。

恶性肿瘤发生、发展的过程,是细胞过度增殖和细胞凋亡受到抑制的过程[1]。细胞基因调控异常,使细胞过度增殖或凋亡减弱是肿瘤的重要发生机制[2]。现代肿瘤学认为肿瘤细胞凋亡机制的失活是恶性肿瘤发生发展的普遍特性。肿瘤的发生与正常的细胞凋亡过程被抑制,破坏了细胞增殖与凋亡之间的平衡有一定关系。目前,诱导细胞凋亡被视为抗癌药物研究和开发的新靶点[3]。干扰素是一类重要的抗肿瘤、抗病毒和免疫调节作用的细胞因子。研究发现,干扰素除了增强肿瘤细胞对凋亡信号的敏感性诱导肿瘤细胞凋亡之外,还可以通过阻滞细胞周期、诱导抑癌基因的表达等作用来发挥其抗肿瘤活性。近来研究发现,干扰素还可放大由caspase诱导的线粒体功能紊乱效应,诱导细胞经线粒体途径凋亡。这些表明了干扰素的多种抗肿瘤生物学活性。

凋亡是有基因编码调控的细胞主动参与的自杀过程,以清除多余的和衰老的或损伤的细胞。凋亡主要被一个天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(aspartate specific cysteineproteases)家族,即半胱天冬蛋白酶caspases来执行。目前公认的三条凋亡途径:(1)死亡受体途径。(2)线粒体途径。(3)内质网途径。研究发现在哺乳动物细胞中主要存在两种细胞凋亡途径即死亡受体途径[4]和线粒体途径[5,6],他们通过一系列分子和生物化学途径导致两条途径的共同的“中央处理器”分子即caspases的活化。其中死亡受体途径:死亡受体与特异性配体结合而发生自聚化,即而通过转接器蛋白募集、激活肤氨酸门冬氨酸蛋白酶(Caspase)-8,继而激活下游procaspase,引起caspase级联效应,破坏DNA完整性,干扰细胞周期正常运行,破坏细胞结构而最终导致典型的细胞凋亡形态改变[7]。线粒体途径:即内源性凋亡途径,是细胞外界的信号以及DNA损伤通过Bcl-2家族提高线粒体膜的通透性,使线粒体释放出促进凋亡的细胞色素C(cytC),cytC通过与接头蛋白Apaf-1(apoptosis activating factor-1)发生寡聚化而与半胱天冬氨酸蛋白酶原(procaspase)procaspase-9形成凋亡小体,激活caspase-9,进而激活“效应”caspases(如caspase-3),随之活化多种核酸内切酶(Dnase)裂解细胞内的关键蛋白,从而使细胞产生凋亡形态学改变,导致细胞凋亡[8]。通过调控细胞信号转导系统诱导细胞凋亡以治疗肿瘤正成为目前肿瘤学领域的研究热点之一,在调控细胞凋亡的众多信号转导系统中,Fas/FasL介导的通路是引起细胞凋亡的重要途径之一,Fas和FasL均主要以膜形式存在,两者结合可引起多种细胞凋亡,大多数肿瘤细胞都同时表达Fas和FasL, 在机体抗肿瘤的免疫反应中Fas和FasL途径尤为重要。然而由于肿瘤患者这一途径发生了变化,存在比较普遍的Fas和FasL系统的异常,如Fas表达下降和FasL异常表达。IFN-γ可以通过干扰素受体上调肿瘤细胞的Fas蛋白和淋巴细胞的FasL从而加强这一肿瘤免疫途径[9]。临床应用的许多治疗方法的作用机制之一是通过影响Fas和FasL引发肿瘤细胞凋亡。Fas配体(Fas ligand,FasL)和死亡受体(Fas)结合是介导细胞凋亡的最主要途径之一,Fas又称Apo-1或CD95,属于TNFR(tumor necrosis factor receptor)家族,FasL分子胞外区与TNF高度同源,FasL蛋白为Fas的体内天然配体[10,11],FasL与Fas结合介导细胞凋亡,故FasL又称死亡因子,FasL与Fas结合后,Fas相关死亡区蛋白(FADD)激活Caspase,组成死亡诱导信号复合(DISC),pro-caspase-8(-10)可自身催化成活性异四聚体形式[12],继而激活下游procaspase,再激活一系列caspase1、3、7等级联反应促使Fas蛋白所在的细胞的凋亡发生[13-15]。

研究发现,Ⅰ型和Ⅱ型干扰素都具有调节和增强多数肿瘤细胞对Fas介导的凋亡敏感性的作用[16]。IFN-α可通过直接活化Caspase-3而激活caspase-8,或通过使线粒体释放细胞色素C而间接活化caspase-3诱导细胞凋亡信号的转导,调节肿瘤细胞对Fas介导细胞凋亡的敏感性[17]。Liedtke等[18],报道IFN-α能上调肝癌细胞的caspase-8和Fas的表达来介导其凋亡。IFN-γ与其相应受体结合后首先活化非受体型酪氨酸激酶,继而导致转录激活因子1(signal transductors and activator of transcription 1,STAT1)磷酸化和二聚化,STAT1与位于干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)启动子区域的IFN-γ活化位点紧密结合,激活IRF-1基因的表达。由于caspase-3和caspase-7基因是IRF-1作用的重要靶基因,特别是caspase-7是诱导肿瘤细胞凋亡的关键分子,在抑制肿瘤细胞bcl-2的抗凋亡效应和诱导凋亡过程中发挥关键作用[19]。Inaba等[20]报道INF-γ有增强由Fas/FasL介导的骨肉瘤细胞凋亡作用。本实验结果可见,两种干扰素联合应用可诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,随着作用时间的延长,凋亡细胞百分率有增加趋势;也可提高细胞FasL蛋白的表达,随着处理时间的延长,FasL蛋白表达百分率有增加的趋势,差异有统计学意义(P<0.05),干扰素对MCF-7乳腺癌细胞Fas蛋白的表达无明显影响。可见两种干扰素联合应用可能通过增加MCF-7乳腺癌细胞FasL蛋白的表达,进而增加Fas/FasL的交联,增加Fas/FasL通路的敏感性来诱导MCF-7乳腺癌细胞的凋亡。研究干扰素诱导肿瘤细胞凋亡的多种机制和途径,将对干扰素的临床应用有很大的指导意义。

结论

干扰素-γ、干扰素-α2b二者联合应用可诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,作用机制可能与通过上调FasL蛋白的表达,加强Fas/FasL之间的交联及使Fas/FasL通路敏感性增加有关。

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猪α干扰素研究进展 篇5

1 猪干扰素研究概况

干扰素主要是由动物细胞在病毒等诱生剂的作用下诱导产生的。许多动物, 包括人、哺乳动物、鸟类、鱼类等都能产生干扰素。根据干扰素的抗原特性和分子结构分成不同的类型。干扰素 (IFN) 分为I型和II型, I型干扰素基因缺少内含子, 包括α、β、δ、ω、τ5种类型, II型仅有γ型1种, 含有内含子。它们具有相关的结构并共用同一受体 (第一受体) , 第一受体分布相当广泛, 包括单核/巨噬细胞、多形核白细胞、B细胞、T细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞与肿瘤细胞等[2]。Ⅰ型干扰素的表达常因细胞类型和诱导物的不同而异。IFN-α主要由单核吞噬细胞产生, B细胞和成纤维细胞也能合成IFN-α。IFN-β则主要由成纤维细胞产生。而造血细胞则产生IFN-ω。在牛、绵羊胚胎着床的早期, 其子宫内膜上皮细胞中能产生大量IFN-τ, 它与维持正常妊娠有关。IFN-α、β、δ主要是对病毒感染的应答产生的, 能诱导机体抗病毒蛋白的产生。Ⅱ型干扰素又称免疫干扰素, 即IFN-γ, 主要由活化的T淋巴细胞 (包括TH0、TH1细胞和几乎所有的CD8+T细胞) 和NK细胞产生[2]。

目前所发现的猪干扰素包括IFN-α、β、ω、τ和IFN-γ, 并且IFN-τ未在其它物种中发现[3]。猪IFN-α、ω, 分别是由12个和5个以上的相关功能基因编码的蛋白质家族组成, 这些干扰素的各亚型之间同源性很高, 天然IFN-α常常是IFN-α、ω功能基因表达产物的混合体, 而INF-β、ω和IFN-γ仅由单一基因编码。现在已完成基因克隆、测序和定位的猪干扰素基因主要包括IFN-α、β、ω和IFN-γ。

2 猪α干扰素作用机制

病毒感染细胞导致IFN的产生, 并随被感染细胞死亡、崩解而释出。IFN分子向附近扩散, 随血液循环至全身。IFN是由宿主细胞编码的蛋白质, 因其是通过作用于靶细胞、激活靶细胞内的基因而发挥作用的, 故其具有广谱抗病毒作用。当IFN进入细胞后, 干扰素与细胞表面的干扰素受体结合后, 可诱导细胞产生具有酶活性的抗病毒蛋白 (Antivirual Protein, AVP) 。已经知道的AVP至少有3种:蛋白激酶、磷酸二脂酶和2’-5’寡腺苷酸合成酶。蛋白激酶和磷酸二脂酶能破坏细胞核糖体转译病毒蛋白质, 2’-5’寡腺苷酸合成酶能降解m RNA。这些抗病毒蛋白或抑制转录酶, 阻止m RNA的形成, 或抑制病毒DNA和RNA的合成。因此, 可以说干扰素是通过AVP间接地抑制病毒的增殖而达到抗病毒作用。干扰素的产生受细胞基因组控制。细胞DNA中干扰素基因抑制物 (IFN supressor) 与干扰素基因结合, 抑制复制酶系统, 一般情况下, 干扰素基因处于被抑制状态。当机体受到诱生剂的作用时, Toll样受体通过对病原相关分子模式 (PathogerrAssociated Molecular Patterns-PAMPS即天然免疫系统在长期的进化过程中形成识别病原入侵的一种能力) 的识别和信号放大, 从而激活NFOκB、MPKS、ERK、JNK等炎症信号来放大反应。进而依次激活骨髓分化因子88、丝/苏氨酸激酶、TNF受体相关分子6 (TRAF6) 、TGFβ活化激酶 (TAKO1) 和IKK复合物, 导致NFOκB活化及核转位, 进一步诱导IFN等表达;干扰素的表达还可以通过介导MYD88非依赖性的信号转导, 诱导α干扰素的表达。

3 猪α干扰素生物学活性

3.1 免疫调节作用

干扰素是重要的免疫调节因子。干扰素可增强免疫球蛋白Ig G的受体表达, 从而有利于巨噬细胞对抗原的吞噬和K、N K细胞对靶细胞的杀伤以及T、B淋巴细胞的激活, 增强机体的免疫应答能力。IFN-α是天然免疫和获得性免疫的桥梁, 可以激活NK细胞的细胞毒性并促进其增殖, 调节机体免疫。IFN-α主要是通过对淋巴细胞和巨嗜细胞的调节或诱导MHC I型分子的表达起免疫调节作用的[4]。IFN-α能诱导淋巴细胞释放肿瘤坏死因子 (TNF) , 启动细胞毒性T细胞 (CLT) 和NK细胞的分化;IFN-α能诱导巨嗜细胞提高Fc受体的表达, 增强巨嗜细胞吞噬抗原的能力;IFN-α能诱导病毒感染细胞和肿瘤细胞提高MHC I型分子的表达水平, 增强免疫系统对其的清除作用。近年来研究发现, IFN-α在先天性免疫与获得性免疫的转变过程中起主要的作用。IFN-α这一主要功能以树突状细胞的产生和激活为纽带[5]。

3.2 抗病毒作用

干扰素具有广谱的抗病毒作用, 能使病毒增殖量减少、受感染细胞损伤程度降低等, 其抗病毒作用并非本身直接灭活病毒, 而是抑制病毒的增殖。IFN-α可抑制感染细胞中病毒m RNA翻译, 并促使病毒m RNA降解;能提高细胞表面MHC I类分子的表达水平, 有助于向T细胞呈递抗原, 引起靶细胞的溶解, 并可增强NK细胞对病毒的杀伤能力。干扰素作为一种抑制和干扰病毒繁殖的可溶性细胞因子, 可刺激机体淋巴细胞分泌产生多种广谱抗病毒蛋白质, 阻断病毒的繁殖。它的作用机理主要是通过T和B淋巴细胞或K细胞在Ig G的作用下使病毒感染细胞溶解而失去致病性。猪干扰素对许多病毒性疾病具有有效的防御功能, 虽然病毒性疾病能诱导机体产生少量干扰素, 在体内抑制病毒的增殖, 但因表达量低, 所以难以保护机体抵抗疾病的侵袭。干扰素还可以通过诱导N K细胞、T细胞等免疫调节细胞来发挥抗病毒的功能。对于NK细胞, 主要是通过促进其增殖来实现的, NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分, 其杀伤活性无MHC限制, 不依赖抗体, 其杀伤的靶细胞主要包括部分肿瘤细胞、病毒感染细胞、部分自身组织细胞、寄生虫等。当NK细胞增多后, 可以将病毒感染的细胞清除掉, 从而达到清除体内病毒的目的。

3.3 抑制细胞分裂活性

干扰素在试管内和在机体内对细胞生长有抑制作用, 产生这一作用的干扰素量要比抑制VSV繁殖量大30倍, 对细胞生长快的远比对生长慢的抑制作用要强[6] (Derbyshire and De Laat, 1991) 。干扰素可以选择性地抑制迅速分裂的肿瘤细胞, 故可用来防治肿瘤性疾病。干扰素抗肿瘤作用的机制并不是单一的, 除直接抑制肿瘤细胞的生长外, 还可以抑制肿瘤病毒的繁殖, 调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞。干扰素可以改变肿瘤细胞的细胞膜以增加肿瘤特异性组织相容性抗原的表达, 以利于杀伤清除肿瘤细胞。另外, 干扰素可以增进NK细胞的活力, 这可能是干扰素抗肿瘤作用的最为重要的原因[7] (Filippo et al., 2002) 。

4 猪基因工程α干扰素的研究近况

Lefevre和La Bonnar等在大肠杆菌中表达了Po IFN-α1基因, 得到了一个含189个氨基酸的前体蛋白, 去除其N端的含23个氨基酸的信号肽后, 得到了具有完全天然猪IFN-α1生物学活性的产物, 并且其在猪源性细胞上的抗病毒活性至少是病毒刺激猪白细胞产生的干扰素的6倍[8]。Horisberger MA[9]对重组猪IFN-α (r Po IFN-α) 在猪的细胞中抗病毒活性测定发现r Po IFN-α可大大降低猪水泡性口炎病毒 (VSV) 在猪PK-15上引起的病变, 并能削弱猪水泡性口炎病毒 (VSV) 和流感病毒在猪肾细胞中的复制。Jordan LT等发现r Po IFN-α对传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 有很好的预防作用[10]。Buddaert W[11]对r Po IFN-α在体内、外对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV) 的抗病毒活性进行了研究, 发现PRRSV在体内、外对r Po IFN-α都很敏感, r Po IFN-α可明显抑制PRRSV的产量和感染细胞的数量。Chinsangaram J等[12]用大肠杆菌表达r Po IFN-α进行了抗口蹄疫病毒 (FMDV) 实验, 发现r Po IFN-α抑制FMDV复制是在蛋白质翻译水平上的, 主要是激活双链RNA依赖性蛋白激酶 (PKR) 作用的结果:在细胞中加入PKR抑制剂2-氨基嘌呤后, 病毒的产量就会上升;而RNase L和PKR基因缺失的细胞在干扰素的作用下仍能感染FMDV, 充分说明了PKR在抑制病毒复制中起作用。

我国学者也对猪干扰素进行了多项研究。曹瑞兵等[13]克隆了一种新的猪IFN-α基因并在大肠杆菌中进行了其成熟蛋白的单纯表达, 表达产物具有较高的抗病毒活性。杜以军等[14]利用猪IFN-α的成熟蛋白基因构建了重组腺病毒质粒p Ad-po IFN-α转染HEK-293A细胞, 滴度为107 TCID50/m L。RT-PCR证明目的基因在m RNA水平上可有效表达;在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性, 从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。谢海燕等[15]克隆了猪IFN-α基因, 构建了原核表达载体, 初步对其进行了原核表达研究;我国学者夏春等 (2005年) 报道了用p QE30表达载体在大肠杆菌原核表达的r Po IFN-α在猪源细胞和非猪源细胞系上可显著抑制CSFV、PRRSV和VSV的增殖, 证明了原核表达Po IFN-α的可行性及将基因工程原核表达的Po IFN-α真正用于生产实践中作为抗病毒制剂可行性。曹瑞兵等对猪IFN-α1基因进行了改造, 在保留编码蛋白序列的同时, 使用了大肠埃希菌的偏爱密码子, 将合成的猪IFN-α1成熟蛋白编码基因插入原核单纯表达载体p RLC中, 实现了猪IFN-α1在大肠埃希菌中的高效表达, 且重组猪IFN-α1具有较高的抗病毒活性, 约为6.4×106 U/mg。此外, 葛丽等克隆了猪IFNα基因, 构建了真核表达载体, 初步对其作了真核表达研究。刘占通等对丹系长白和法系长白、英系大白和法系大白猪IFN-α基因进行克隆, 得到了上述4个品系的猪IFN-α基因, 证明核苷酸同源性均在97.2%以上, 氨基酸同源性均在92.8%以上。陈瑞爱等克隆了新兴猪IFN-α基因片段, 与Gen Bank上登录的2个猪IFN-α基因序列 (登录号为M28623和X57191) 比较核苷酸的同源性分别为99.4%和99.2%。焦茂兴等成功克隆获得猪IFN-α基因, 编码166个氨基酸, 与Gen Bank上序列号为M28623及X57191的序列相似性分别为96.6%和96.4%, 氨基酸的相似性为91.6%。

5 猪α干扰素的应用前景

干扰素以其抗病毒作用广泛、残留小、廉价、无污染、无耐药性、无药物残留等优点, 有较广阔的应用前景。目前人重组干扰素和细胞因子产品已广泛用于人类医学临床, 但动物干扰素和细胞因子的应用在我国兽医临床中才刚刚起步。由于干扰素及细胞因子具有相对的种属特异性, 故同一种属干扰素和细胞因子只有对本种属动物疾病才有疗效。正常情况下, 动物体内干扰素和细胞因子基因处于封闭状态, 只有在病毒感染或诱导下才表达干扰素基因, 但是表达量很小, 因此单靠病毒感染自身诱导的干扰素对病毒性疾病和细胞内寄生菌和寄生虫病的治疗作用是微乎其微的;而且由于其表达量低, 也非常难以提取纯化。所以, 在考虑使用干扰素防治动物病毒性疾病时, 最好采用基因工程技术生产;采用基因工程技术原核表达技术生产干扰素和细胞因子具有活性效价高、产量大、成本低廉、生产速度快、易于规模化生产等优点, 因此可以在生产实践中应用。近年来分子生物学的迅速发展, 干扰素的研究也日益深入, 特别是PCR技术的广泛应用, 极大地推动了动物干扰素基因的研究, 动物干扰素基因的克隆与表达成为研究热点, 采用基因工程的方法研制重组α干扰素已成为干扰素制剂研究的重点。

猪α干扰素的研究进展 篇6

1猪α干扰素的作用机制

α 干扰素主要由淋巴细胞和单核 - 巨噬细胞等, 在细菌、病毒、人工合成的双链RNA、原虫感染及某些细胞因子等干扰素诱生剂诱导下产生的,α 干扰素不同亚型的诱导可能与诱生剂的种类不同有关。干扰素伴随感染病毒细胞的崩解、死亡而被释放,被释放出来的干扰素分子向附近扩散,由血液运送至全身各处。干扰素与细胞表面的干扰素受体结合后,可诱导细胞合成抗病毒蛋白( antivirual protein,AVP) 。已知的AVP主要包括磷酸二脂酶、蛋白激酶和2’~ 5’ 寡腺苷酸合成酶 。磷酸二脂酶和蛋白激酶能够抑制病毒多肽链的合成,终止病毒的复制; 而2’~ 5’寡腺苷酸合成酶能够降解病毒的mRNA。因此,干扰素发挥作用的过程可以简单概括为: 首先干扰素作用于细胞的干扰素受体,之后经过信号转导等一系列生化过程激活细胞基因表达AVP,从而实现对病毒增殖的抑制作用。猪 α 干扰素的作用特点: 1) 间接性,通过诱导细胞产生AVP抑制病毒; 2) 种属特异性,在同种细胞中活性高,对异种细胞无活性; 3) 广谱性,AVP是一类作用无特异性的酶类,对多数病毒均有一定抑制作用; 4) 起效快,干扰素既能中断病毒感染又能限制病毒扩散。在感染初期,体液免疫和细胞免疫发挥作用以前,干扰素发挥着重要作用。

2猪α干扰素的分子结构

猪 α 干扰素由166 ~ 172个氨基酸残基组成,分子质量约为19 ku,有四个保守的半胱氨酸,两对二硫键( Cys1 - Cys99和Cys29 - Cys139) 使 α 干扰素分子形成球状折叠构象,这种构象对于 α 干扰素的生物学活性非常重要。猪 α 干扰素与猪 β 干扰素之间的同源性在氨基酸水平上仅为30% ,在核苷酸水平上约为45% ,但它们识别并结合相同的受体,发挥相似的生物学效应。天然猪 α 干扰素常常是猪 α 干扰素、ω 干扰素功能基因表达产物的混合体。编码猪 α 干扰素的片段无内含子,现已证实,大多数猪 α 干扰素基因中存在TATTTAAA序列[4]。

3猪α干扰素的生物学功能

合成的猪 α 干扰素与特异性细胞受体结合,通过细胞因子的信号传递使细胞相应基因激活,产生的作用主要表现在以下三个方面。

3.1增殖抑制

α 干扰素能够抑制前癌基因的表达,阻止细胞株从G0期进入G1期,并能诱导肿瘤细胞株分化[5]。 干扰素可以抑制分裂迅速的肿瘤细胞,因此可用来防治肿瘤性疾病。干扰素可以增强NK细胞的活力, 这可能是干扰素抗肿瘤作用最为重要的原因[6]。干扰素可以改变肿瘤细胞的细胞膜以增加肿瘤特异性组织相容性抗原的表达,杀伤、清除肿瘤细胞。郭人花等[7]通过试验得出,不同浓度的 α 干扰素对淋巴瘤细胞的杀 伤能力是 不同的,α 干扰素浓 度在2 000 U / m L以下时,对细胞的杀伤作用不明显,随着 α 干扰素浓度的升高、作用时间的延长,对细胞的杀伤作用逐渐增强。当 α 干扰素浓度达到5 000 U/m L时,对淋巴瘤细胞能够产生明显的抑制作用。

3.2抗病毒作用

猪 α 干扰素具有很广的抗病毒谱,由诱导剂诱导细胞产生的干扰素,对同种或异种病毒均有效果, 即可抑制多种RNA病毒的复制,又可抑制多种DNA病毒的复制; 并且对动物无毒性或毒性很小,抗原性也很弱,因此可以反复应用。猪 α 干扰素并不直接作用于病毒,而是通过其他途径达到抗病毒的效果。 猪 α 干扰素抑制感染细胞中病毒mRNA的翻译,并促进病毒mRNA的降解; 提高细胞表面MHC Ⅰ类分子的表达水平,从而有助于向T淋巴细胞呈递抗原, 引起靶细胞的溶解,并可增强NK细胞对病毒的杀伤能力; 在未感染细胞表面与特殊受体结合,产生细胞蛋白,其中抗病毒蛋白分别对病毒复制的任何阶段都具有靶向作用。

3.3免疫调节作用

干扰素也可作用于免疫系统,增强免疫功能,起到调节免疫反应的作用。

3. 3. 1干扰素对免疫监视功能的调节作用 α 干扰素能诱导淋巴细胞释放肿瘤坏死因子并促进淋巴细胞的细胞毒作用,之后进一步的研究表明,干扰素促进细胞毒作用主要是增强NK细胞的杀伤活性。这种增强作用体现在以下两个方面: 1) 干扰素能激活现有的NK细胞。2) 干扰素能诱导NK前体细胞向效应细胞分化。在一定条件下,干扰素增强NK细胞的杀伤活 性与所使 用的干扰 素剂量呈 正比,即当≥2 × 104单位剂量时,杀伤活性呈直线上升。α 干扰素还能诱导感染病毒的细胞和肿瘤细胞提高MHC Ⅰ型分子的表达水平,增强免疫系统对其的清除作用。

3. 3. 2干扰素对免疫防卫功能的调节作用1 ) 对体液免疫的调节。干扰素能够抑制依赖胸腺和非依赖胸腺抗原的抗体形成,增强机体的免疫应答能力。 α 干扰素主要影响B淋巴细胞的早期分化,随着加入 α 干扰素时间的延迟,其抑制B淋巴细胞分化的效应也相应降低。

2) 对细胞免疫的调节。高浓度的干扰素能够在一定条件下抑制有丝分裂原( Con A等) 诱导的淋巴细胞增殖。增强组织相容抗原和某些受体的表达。

3) 对吞噬功能的调节。干扰素能够增强巨噬细胞的细胞毒活性。α 干扰素能诱导巨噬细胞提高Fc受体的表达,增强巨噬细胞吞噬抗原的能力。

3. 3. 3干扰素对免疫自稳功能的调节作用干扰素能够增强免疫器官巨噬细胞的吞噬作用和销毁能力, 从而达到调节免疫自稳功能,降低应激反应等目的。

4猪α干扰素的特性

与人类干扰素不同,由于动物种类繁多,从不同动物得到的干扰素在基因序列上存在较大差异,因而对动物干扰素的研究工作需要具体到种属上。种属特异性是干扰素的一大基本特性。即某种属动物产生的干扰素只能对同种属或亲缘相近的动物有效。 闫若潜等[8]研究发现,在猪的各种干扰素中,猪 α 干扰素的种属特异性较弱,可在人、牛、猪及鼠等动物的细胞上起效,而猪 β 干扰素、γ 干扰素的种属特异性则较强。但因为猪 α 干扰素的活性具有种属特异性,所以抗病毒活性在不同细胞上存在差异。

5猪α干扰素的研究现状

S. M. Kim等[9]通过串联使用口蹄疫病毒( FMDV) 2A序列间接影响重组腺病毒表达 α 干扰素和 γ 干扰素过程中两种干扰素蛋白的分裂,得到的产物被称为Ad - porcine IFN - αγ。Ad - porcine IFN - αγ 能够刺激猪肾细胞( IBRS - 2) 诱导产生与 α 干扰素和 γ 干扰素相关的干扰素刺激基因( ISG) 。此外,与腺病毒仅表达单一 α 干扰素或者 γ 干扰素相比,Ad porcine IFN - αγ 对FMDV的抗病毒效应更强。S. L. Brockmeier等[10]研究发现,感染病毒时,α 干扰素的出现能够改变机体对猪繁殖与呼吸综合征病毒 ( PRRSV) 的先天和适应性免疫反应应答。O. García Nicolása等[11]研究发现,Ⅱ型PRRSV更容易逃避由 Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的机体抗病毒效应。我国学者也对猪干扰素进行了多项研究。钟鲁龙等[12]优化并合成猪 α 干扰素基因,利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中表达猪 α 干扰素,在家蚕幼虫体内成功表达了有活性的猪 α 干扰素。刘淑敏等[13]对猪 α 干扰素 - 白细胞介素 - 2重组复合蛋白( r Po IFN - α linker - Po IL - 2) 在猪体内抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒( HPPRRSV) 的效果进行对比试验,得出r Po IFN - α - linker - Po IL - 2蛋白对HPPRRSV的抑制作用优于单一r Po IFN - α 蛋白,稍优于r Po IFN α - r Po IL - 2蛋白等量混合物,显著优于单一r Po IL 2蛋白。周顺等[14]利用兔 β - Globin Intron Ⅱ基因调控序列改造真核表达载体p VAX1,构建基因调控型质粒,对猪 α 干扰素( p IFN - α) 和 γ 干扰素( p IFN γ) 进行串联表达。体外抗病毒活性表明,p IFN - α /γ 的量为100 U( 稀释度1∶106) 以上时,对HPPRRSV具有明显的抑制效果。

6猪α干扰素的前景展望

鸡α干扰素 篇7

1 干扰素的分类与来源

目前通用的分类方法将干扰素分为3型:Ⅰ型:有IFN-α和IFN-β, 其中IFN-α有20余个亚型, IFN-β仅有1个亚型。Ⅰ型干扰素具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等作用。Ⅱ型:只有IFN-γ, 且只有1种亚型, 除具有抗病毒、抗增殖活性外, 其主要生物学活性为免疫调节作用。Ⅲ型:即IFN-λ1 (IL-29) 、IFN-λ2 (IL-28a) 和IFN-λ (IL-28b) 。IFN-ω属于IFN-α家族, 其结构和大小与其他IFN-α稍有差异, 但抗原性有较大的不同。

干扰素来源又可分天然和非天然2类: (1) 天然IFN:根据国际干扰素命名委员会的建议, 天然IFN一般首先按动物来源分类, 例如人干扰素 (Hu IFN) , 牛干扰素 (Bov IFN) 等, 然后再按IFN的抗原特异性和分子结构分成不同的型别, 加以命名。天然干扰素种类繁多, 分子量也不同, 亦有不同的抗原性。目前了解由人的不同细胞产生的干扰素至少有3种不同的抗原成分:白细胞干扰素抗原 (Le) , 人成纤维细胞干扰素抗原 (F) 和T淋巴细胞干扰素抗原 (T) 。事实上, 人白细胞产生的干扰素有99%为Le, 1%为F, 人成纤维细胞产生的干扰素占80%~99.9%;而由Namalva细胞系 (为一种由Burkitt淋巴瘤患者所获得的类淋巴细胞系) 产生的干扰素中有85%为Le, 15%为F。唯有T淋巴细胞产生的干扰素则因应用不同诱生剂而不同, 如以短小棒状杆菌诱导, 主要为Le (>95%) ;如果用PHA或诱导, 则主要产生T (>80%) .根据世界卫生组织规定, 统一命名, 将人细胞所产生的几种干扰素, 按其抗原性不同分为α、β和γ3类, Le干扰素即为α-干扰素 (IFN-α) , F干扰素为β干扰素 (IFN-β) 。T-干扰素即γ干扰素 (IFN-γ) 。通过核酸内切酶切割分析, 从而搞清了其全部核苷酸的顺序, 由此又推导出全部核苷酸顺序, 在α、β与γ3型干扰素中又因各型中又有氨基酸的顺序不同, 又可分为若干亚型, α-干扰素至少有20个以上的亚型。而β-干扰素则有4个亚型, 至于γ-干扰素只有一个亚型。α-干扰素的亚型为IFN-α1, IFN-α2, IFN-α3等或IFN-αA, IFN-αB, IFN-αC等。 (2) 非天然IFN主要指基因工程IFN, 即以DNA重组技术生产的IFN。基因工程IFN具有与天然IFN完全相同的生物学活性。从c DNA途径建立IFN-2α无性繁殖系的基本步骤包括, 人IFN-αmRNA的诱生, mRNA的提取与纯化、基因克隆与重组、转化大肠杆菌和基因表达[1]。

2 干扰素α2a与干扰素α2b都是α-干扰素的的亚型

根据干扰素的分类与分型可知, 干扰素α2a与干扰素α2b其实都是干扰素 (IFN-α型) , 所不同之处就是氨基酸序列与个数不一样。α2a是肿瘤被诱导以后产生的, 其与α2b仅在第23位氨基酸有所不同, 但这个变化虽对生物活性影响不是很大, 却可令干扰素构象产生较大的改变使之易于产生抗体, 抗体与α2a结合后抑制了后者的生物活性, 这可能是其疗效低于干扰素α2b的原因[2]。

3 干扰素α2a栓与α2b栓的临床应用作用特点比较

干扰素Ⅰ型:有IFN-α和IFN-β, 其中IFN-α有20余个亚型, IFN-β仅有1个亚型。Ⅰ型干扰素具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性、参与免疫调节、抗肿瘤等作用。干扰素α2a与干扰素α2b都是α-干扰素的的亚型。

根据药品说明书适应证知, r IFNα2a栓用于治疗阴道病毒性感染引起的慢性宫颈炎、宫颈糜烂、阴道炎、预防宫颈癌。r IFNα2b栓治疗病毒感染引起 (或同时存在) 的宫颈糜烂患者。两者药理作用都是由白细胞及淋巴细胞所产生的多功能和高活性的诱生蛋白r IFNα, 它对宫颈糜烂的治疗主要是依靠其广谱抗病毒作用和对机体的免疫调节功能。在干扰素作用下, 使病变部位及其临近的正常组织细胞产生抗病毒蛋白, 从而阻断了病原病毒的复制过程, 再加上干扰素抑制感染细胞的增殖, 于是糜烂面柱状上皮细胞开始脱落, 逐渐为新生的鳞状上皮所替代。同时, 干扰素还可促进NK细胞对病毒的杀伤作用, 并增强机体对抗体依赖细胞介导的细胞毒作用的活力。此外, 干扰素的激素样作用还可降低患者体内的血清雌二醇和孕酮的水平, 使宫颈分泌物减少, 从而加速子宫糜烂面的愈合过程。可以看出都是以治疗宫颈糜烂为主, r IFNα2a的适应症多些, 但从不同亚行干扰素生物活性分析, 可看出r IFNα2b抗病毒活性大于r IFNα2a。

临床上r IFNα2a栓用于妇科疾病用于治疗慢性宫颈炎, 宫颈糜烂, 病毒性阴道炎, 改善阴道内环境, 预防宫颈糜烂, 预防宫颈癌[3]。但在实际临床妇科用药过程中, 笔者发现干扰素α2a栓与α2b栓应用并未有明显的区别。美国FDA对干扰素的合理使用规定了严格的适应症, 目前批准的是IFNα临床适应症主要有毛细胞白血病、尖锐湿疣、与人类免疫缺陷相关的卡波济肉瘤、丙型肝炎和慢性肉芽肿病等[4]。因此, 在以后合理使用药品过程中, 可以建议临床上在治疗单纯病毒性宫颈糜烂时用r IFNα2b栓, 而具有合并症的宫颈糜烂时用r IFNα2a栓, 这符合不同干扰素类型合理使用原则。

关键词：干扰素,作用分析,糖蛋白

参考文献

[1] 侯云德.干扰素的不同亚型与临床应用[J].中国生物制品学杂志, 1993, 6 (4) :145-148.

[2] 盛伟华, 杨吉成, 张云.基因工程人干扰素α2a与α2b亚型抗病毒效应的实验研究[J].生物学杂志, 19 9 8, 15 (3) :19-21.

[3] 李德泽, 耿桂兰.干扰素α2a栓在妇科疾病中的应用[J].实用医技杂志, 2004, 11 (10) :2210-2211.

鸡α干扰素 篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机抽取我院2014年2月—2015年2月收治的68例丙肝患者作为本次研究对象, 所有患者均符合丙肝诊断标准[1]。其中男36例, 女32例;年龄25岁~67岁, 平均年龄 (46.3±2.5) 岁;8例患者合并其他类型肝炎;25岁~34岁者18例, 35岁~44岁者21例, 45岁~54岁者11例, 55岁以上者18例。病理分期:急性期患者25例, 其中重症患者11例, 轻型或者中型患者14例;慢性期患者43例, 其中肝纤维化或者重症患者20例, 轻度或者中度慢性活动性肝炎患者23例。

1.2 方法

诊断丙肝时, 主要采用的是抗体检测与病毒检测两种方法。在进行抗体检测时, 采用的第一代为HIV-ELISA, 第二代为重组免疫转印试验-I、HCV-I-LISA以及重组免疫转印试验RIBA-1, 病毒检测采用HCV-RVNA方法。

所有丙肝患者予以α-干扰素治疗, 规格为每支500 000 U, 持续治疗时间为12个月;于治疗开始前的2个月先予以肌肉注射, 每周3次, 每次500 000 U;持续治疗到第3个月~4个月时, 行肌肉注射, 每周2次, 每次500 000 U;自第5个月开始, 行肌肉注射, 每周1次, 每次500 000 U。

1.3 疗效评价标准[2]

依据丙氨酸转氨酶 (ALT) 水平对治疗效果进行评价:治疗后在6个月内患者ALT水平恢复至正常水平, 持续时间6个月为显效;治疗后患者ALT水平下降到低于正常水平的2倍且持续时间为6个月为有效;治疗后患者ALT水平较之于治疗前并无变化甚至增加为无效。

2 结果

2.1 年龄对α-干扰素治疗丙肝效果的影响

年龄段处于25岁~34岁的患者治疗总有效率最为显著, 55岁以上患者治疗总有效率最低, 随着患者年龄的增长, 其治疗总有效率也就越低。见表1。

2.2 病理期对α-干扰素治疗丙肝效果的影响

α-干扰素治疗后, 患者治疗总有效率为42.65%;其中8例合并其他类型肝炎的患者经治疗1例有效, 7例无效。病理期对α-干扰素治疗丙肝效果也具有一定影响, 急性期患者治疗总有效率优于慢性期患者。见表2。

3 讨论

丙肝也被称之为丙型病毒性肝炎, 是由于丙肝病毒导致, 该病症的传播途径主要包括肾移植、性传播、血液透析、输血、母婴传播以及毒品静脉注射等[3]。丙肝具有分布较为广泛的特点, 可进一步转变为肝硬化或者是肝癌, 而丙肝当前也已经成为肝硬化、肝癌最为关键的诱因。加之丙肝存在的医源性较强的特点, 并不存在再次感染保护的能力。

在防止丙肝病症继续发展的过程中, 最为重要也是关键的环节便是对献血员进行严格筛选, 如果在进行血液检测时, 发现抗-HCV或者HCV-RNA均呈阳性状态, 那么必须要禁止献血。就我国现阶段的丙肝防控来说, 由于还未能对高危人群的精准确定, 由此丙肝防控并不容乐观[4]。

丙肝与其他类型的肝炎对比, 有其自身独特的特点:丙肝的发病具有较强的隐敝性, 通常表现出来的是亚临床状态, 于成人群体中较为常见且具有极高的传播率, 母婴传播率较低。该病症一般都会发生无黄疸现象, 病情发展程度为高慢性化, 且极易发展成为肝硬化或者是肝癌症状, 且有很大的可能性会诱发重症肝炎。患者若还伴随有其他类型的感染, 在临床上不会表现出其典型性, 仅呈多样化, 丙肝症状持续时间较长。

现阶段在临床上干扰素属于普遍应用的药物, 其效果较好, 该药物一方面可以抗病毒, 另一方面还能起到促进机体自身免疫力提高的作用。干扰素中效果最为明显的是α-干扰素、β-干扰素, 而γ-干扰素疗效较差。干扰素治疗丙肝可有效抑制病毒的复制, 直接产生对抗病毒的性能, 另外还会促进人体细胞活性的增加, 提高病毒吞噬能力, 对促进机体恢复有重要意义。

本次研究表明, α-干扰素在治疗丙肝的过程中其临床疗效与患者年龄存在一定的相关性, 表1表明, 年龄的差异性使患者的治疗总有效情况也存在显著差异。同时单纯伴有丙肝症状的患者于治疗过程中其治疗疗效显著优于合并伴有其他肝炎症状的患者;急性期中等或轻型丙肝、慢性期中等或轻型慢活肝的治疗疗效显著优于急慢性重症丙肝、肝纤维化的患者。

患者经α-干扰素治疗后并未发现对其肝、脾带来严重影响, 但在实际治疗过程中患者可出现一些不良反应, 例如发热、关节酸痛等;针对于此在治疗过中需注意告知患者合理作息, 积极配合治疗, 规范饮食、戒烟戒酒。

总之, α-干扰素治疗丙肝会由于患者年龄的不同对治疗效果产生影响, 且α-干扰素治疗急性期丙肝患者的临床疗效更佳。

参考文献

[1]戴晨琳, 戴晨阳.慢性丙肝和干扰素治疗与甲状腺疾病的关系[J].中华内分泌代谢杂志, 2013, 29 (7) :631-633.

[2]谢蓉, 林丹.生血宁治疗干扰素联合利巴韦林致丙肝患者血细胞减少的疗效观察[J].海南医学, 2012, 23 (2) :34-35.

[3]郝锐, 郑雪松.标准剂量干扰素联合利巴韦林治疗脾栓塞术后丙肝肝硬化的疗效及安全性[J].实用医学杂志, 2014, 43 (20) :3365-3366.

鸡α干扰素 篇9

1 资料与方法

1.1 一般资料

我院2010年8月—2012年1月确诊晚期肺癌患者60例, 随机平分为观察组和对照组:观察组30例患者, 男17例, 女13例;年龄最小41岁, 最大72岁, 平均年龄 (52.8±1.2) 岁;肿块直径大于8 cm的患者有12例, 直径6 cm~8 cm 10例, 2 cm~5 cm的患者8例;腺癌7例, 鳞癌10例, 未分化小细胞癌13例;初次进行化疗患者14例, 再次进行化疗患者16例;Ⅱ期肺癌患者6例, Ⅲ期肺癌患者11例, Ⅳ期肺癌患者13例。对照组30例患者, 男14例, 女16例;年龄最小42岁, 最大78岁, 平均年龄 (53.1±1.4) 岁;肿块直径大于8 cm 13例, 直径6 cm~8 cm 8例, 2 cm~5 cm 9例;腺癌5例, 鳞癌11例, 未分化小细胞癌14例;初次进行化疗患者13例, 再次进行化疗患者17例;Ⅱ期肺癌患者5例, Ⅲ期肺癌患者13例, Ⅳ期肺癌患者12例。2组患者性别、年龄、病理类型等方面均无统计学差异 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 治疗方法

对照组30例给予化疗治疗, 对于病理为鳞癌的患者, 采用400 mg的环磷酰胺注射液+40 m L的生理盐水进行静脉缓慢注射, 2次/周;1 mg长春新碱+20 m L的生理盐水进行静脉缓慢注射, 2次/周;20 mg的甲氨蝶呤+20 m L的生理盐水进行静脉缓慢注射, 2次/周, 以上药物均连续使用6周。对于病理为腺癌及未分化癌患者, 给予500 mg5-Fu+500 m L的生理盐水进行静脉滴注;400 mg的环磷酰胺注射液+40 m L的生理盐水进行静脉缓慢注射, 2次/周;1 mg长春新碱+20 m L的生理盐水进行静脉缓慢注射, 2次/周, 连续使用6周。观察组在对照组化疗的基础上加用α-干扰素3万U/d进行肌肉注射, 1次/d, 连续使用1个月[1]。

1.3 疗效评定标准

完全缓解:在治疗的期间, 肿瘤完全消失;部分缓解:肿瘤有缩小;无变化:临床症状、肿瘤与治疗前相比, 没有任何变化;恶化:临床症状加重, 肿瘤有扩大的迹象。总有效率= (完全缓解+部分缓解) /本组的总人数×100%[2]。

1.4 统计学方法

计数资料采用χ2检验, P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

观察组30例患者, 完全缓解4例, 占13.3%, 部分缓解19例, 占63.3%, 无变化5例, 占16.7%, 恶化2例, 占6.7%, 总有效率为76.6%;对照组30例患者, 完全缓解1例, 占3.3%, 部分缓解10例, 占33.3%, 无变化9例, 占30%, 恶化10例, 占33.3%, 总有效率为36.3%。观察组患者的总有效率明显高于对照组, 其差异具有统计学意义 (P<0.01) , 见表1。

3 讨论

干扰素除了具有抗病毒的功效之外, 还可以有效地促进细胞分化, 有效抑制癌细胞的生长, 并有助于增强机体的免疫力。由于人体所含有的干扰素较少, 并且还没有适当的、合理的制造方法, 进而阻碍了其本应该具备的临床应用价值。随着生物技术的不断发展, 利用最新的纯化技术及基因工程, 干扰素开始逐渐应用于临床治疗。目前, 临床上对于晚期肺癌患者所常用的干扰素是α-干扰素, 但是在使用干扰素的时候, 也难免会出现一些不良反应, 比如:轻度骨髓抑制、消化道反应以及高热等。因此, 治疗期间要密切关注患者的生命体征变化, 及时发现用药的不良反应, 以有效避免患者出现严重的不良后果[3]。

本研究结果显示, 观察组患者的总有效率为76.6%, 明显高于对照组的36.3%, 并且观察组患者的完全缓解率也明显高于对照组, 其差异具有统计学意义 (P<0.05) 。综上所述, 对晚期肺癌患者实施α-干扰素联合化疗的治疗方法, 可以有效改善患者的临床症状, 提高治疗有效率, 提高患者的生活质量, 值得临床推广应用。

参考文献

[1]李海燕.干扰素治疗肿瘤机制研究的进展[J].实用肿瘤学杂志, 2007, 20 (3) :245-246.

[2]廖美琳.肺癌多学科治疗中化疗的应用[J].中国肺癌杂志, 2008, 4 (4) :274.