条件优化

条件优化（精选12篇）

条件优化 篇1

本文介绍利用Davy Process Technology公司设计的中海油建滔化工公司日产2 500 t甲醇装置合成系统,进行实验、数据分析以及理论分析,研究工艺参数对甲醇合成反应转化率、产率以及甲醇选择性的影响,为甲醇生产企业提供操作参考,进而实现节能降耗、降低生产成本、提高企业经济效益的目的。

甲醇合成采用的催化剂为KATALCO51-9。目前KATALCO51-9型催化剂在国内甲醇生产中应用较为广泛,市场占有率超过50%。因此,本研究不仅具有一定的理论意义,更具有较好的实际应用价值。

1系统简介

1.1合成系统组成

合成系统按功能主要划分为气源、反应装置、冷凝分离、分析检测等4个单元。各单元的组成如下。

(1)气源单元

CO、H2、CO2、N2、CH4等来自于前系统转化单元和变压吸附单元。

(2)反应装置

甲醇合成塔(D121、D122)。

(3)冷凝分离单元

进出口换热器(E121、E123A/B)、冷凝器(E122、E124)、气液分离器(D321、D322)、过滤器(H321A/B、H322A/B)、流量调节阀、压力调节阀、温度控制阀。

(4)分析检测单元

气体组分在线分析仪、在线热电偶、压力表、流量计等。

1.2总工艺流程

原料气CO、H2、CO2、N2、CH4等以一定的比例并配以不同量的循环弛放气经过不同的进出塔换热器后进入两合成塔,在一定温度、压力和催化剂作用下部分转化为甲醇。反应后的气体经冷凝、分离为气液两相物流。为了排掉合成反应过程中不能反应的惰性组分,合成系统必须放掉一部分弛放气。由流量计、在线分析仪测量元件,得到弛放气排放量、各组分浓度等实验数据,液相产品通过流量计分析检测单元得到所需实验数据。实验流程如图1所示。

D121—第一合成塔; D122—第二合成塔;D123—第一合成汽包; D124—第二合成汽包;E121—第一合成塔进出口换热器;E123A/B—第二合成塔进出口换热器;E122—第一合成塔冷凝器;E124—第二合成塔冷凝器;D321—第一合成塔气液分离器;D322—第二合成塔气液分离器;H321A/B—D321出口过滤器;H322A/B—D322出口过滤器;FV3503—粗甲醇流量调节阀;FV3301—合成回路压力调节阀;TV3401—第一合成塔入口温度控制阀;TV3402—第二合成塔入口温度控制阀;AI3701/3702/2201—气体组分在线分析仪;TC—合成塔入口温度控制显示表;PIC3302—合成回路压力控制显示表;FIC3503—粗甲醇流量控制显示表;J111/2—合成气压缩机;J121—合成回路循环压缩机

2测试前装置状况

试验是在装置开车轻负荷运行之后进行的,催化剂的状况及开车情况如下。

2.1催化剂的装填与还原情况

D121合成塔、D122合成塔底部分别装了ϕ6 mm瓷球和ϕ13 mm耐火球,每个塔装KATALCO51-9催化剂396桶,约重83.16 t。装填完成后,合成回路氮气充压到0.65 MPa,启动循环机,控制氮气循环量在38 500～43 000 m3/h,进行配氢、升温还原,直到合成催化剂升温还原全部结束,整个还原共计153 h。期间D121累计出水54.5桶(11 445 kg),D122累计出水56桶(约11 760 kg)。在催化剂还原期间,出口CO2间歇排放,控制出口CO2含量小于20%。还原结束后转入轻负荷运转。

2.2轻负荷运行

轻负荷运行是进入满负荷运行前的一个必须程序。催化剂活化后,初活性较高,一般高于耐热后活性30%,为防止催化剂床层超温,延长催化剂使用寿命,一般都需要经历轻负荷运行过程。另外,为保证实验结果前后的一致性,不因催化剂活性降低而影响到测试数据的可靠性,数据测试工作在催化剂耐热后,即轻负荷运行之后进行。催化剂还原结束后,系统用N2逐步升压至3.0 MPa,N2含量达到100%,催化剂床层温度达200 ℃,在较低温度情况下切入原料气,系统正式进入轻负荷运行阶段,时间约为1 d。

3试验结果与讨论

轻负荷运行之后,分别就温度、压力、进合成系统新鲜气量、氢碳比等工艺条件对甲醇合成CO、CO2、总碳转化率,粗甲醇产量,甲醇选择性以及精甲醇产量的影响进行了实验,并找出其中的规律,给出合理的解释。为了便于取点计算,以上所有转化率计算值都为总转化率,同时,安排了正交实验,就各条件对甲醇合成综合性指标(精甲醇产量)的敏感性进行分析,得出了影响程度的次序。

通常对每个工艺条件实验要求测定三到四个点,每个点的测定时间间隔至少2 h以上,这是充分考虑了某一个工艺参数调整后,系统恢复稳定需要一定的时间确定的,因此必须在系统重新稳定之后才可以测定实验数据。

3.1反应温度的影响

在(H2-CO2)/(CO+CO2)=2.25,进合成系统新鲜气量为321 850 m3/h,且两合成塔D121与D122的新鲜气比例为1∶2,合成系统压力P 7.55 MPa的条件下,考察了合成塔入口温度对KATALCO51-9催化剂甲醇合成反应性能的影响,考察结果如表1。

根据实验数据,温度对CO、CO2、总碳转化率的影响如图2所示,对粗甲醇产量的影响如图3,对选择性的影响如图4,对精甲醇产量的影响如图5。

由图2可以看出,合成塔入口温度在216～222 ℃之间,CO、总碳转化率呈增长趋势。CO2转化率呈先增加后下降趋势,在220 ℃出现最高点。

图3、4、5显示,在低温时粗甲醇产量低、选择性较差、精甲醇产量也低,以220 ℃开始,粗甲醇产量、选择性、精甲醇产量迅速增加,222 ℃达最高值。合成塔入口设计温度为230 ℃,由此可见,入口温度低于设计温度对甲醇合成有不利的影响。

合成甲醇主要化学反应为CO和H2的反应:

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CO2与H2发生以下反应:

undefined (2)

undefined

同时,反应过程除生成甲醇外,还伴随发生一些副反应,生成少量的烃、醇、醛、醚、酸和酯等化合物[3]。

甲醇合成主反应为强放热反应,温度升高,从热力学角度来看,降低了反应的平衡常数,使甲醇合成反应向着生成甲醇的逆方向进行,导致总碳转化率和甲醇产量下降。但从动力学角度来看,提升温度可以较大幅度提高甲醇合成过程中各反应的速率常数,因此各反应的反应速率升高,从而使相同时间内总碳转化率和甲醇产量还是升高。

另外,虽然温度升高对甲醇合成过程中正副反应速率有着等同的影响,但从图4可以看出,随着温度逐渐接近设计温度,甲醇的选择性明显提高,这对实际生产中减小甲醇精馏工段负荷、降低能耗,提高经济性非常有利。

由图5得知,该合成反应在入口温度为222 ℃时,精甲醇的产量最高。由于催化剂活性随着使用时间的增长会逐渐降低,所以目前在催化剂使用初期,催化剂活性最高,应控制在低于设计温度,如220 ℃。如若控制过高,虽然甲醇产量会增加,但由于此时催化剂活性高,会导致反应剧烈放热,引起催化剂床层过热,进而降低催化剂的使用寿命。随着催化剂使用时间的推移,活性慢慢降低,应逐渐提高合成塔入口温度,靠近设计温度,或略高于设计温度,以提高反应速率,保证甲醇的产率。如果催化剂初期就控制较高温度,等到催化剂后期则没有更多的提温空间,而不能保证甲醇的产率。

因此,实际工业生产过程反应器的操作温度要兼顾到催化剂使用的初期、中期和后期,根据反应状况,制定出合理的温度操作范围,实时调整操作温度。

3.2反应压力的影响

在(H2-CO2)/(CO+CO2)=2.25,进合成系统新鲜气量为321 850 m3/h且两合成塔D121与D122的新鲜气比例为1∶2,合成塔入口温度为222 ℃的条件下,考察了合成系统压力对KATALCO51-9催化剂甲醇合成反应性能的影响,考察结果如表2。

压力对CO、CO2、总碳转化率的影响如图6所示,对粗甲醇产量影响如图7,对选择性影响如图8,对精甲醇产量的影响如图9。

由式(1)和式(2)可知,合成甲醇反应是体积缩小的反应,压力提高,有利于反应向生成甲醇的方向进行;从动力学角度考虑,反应速率与反应物浓度的幂次方成正比[见式(4),(5)][4],压力提高,气体浓度增大,反应速率加快,这也有利于甲醇的生成。

undefined

式中,undefined

从图6、7、9可以看出,随着压力的提高,CO转化率、CO2转化率、总碳转化率、粗甲醇以及精甲醇产量均呈上升趋势。从图8看出,甲醇选择性在合成压力7.55 MPa时最高,随后则呈下降趋势,主要原因是生成大分子副产物,如乙醇、甲醚等反应速率的增长速度更快,相对而言甲醇选择性降低。

现代甲醇合成多在7.0 MPa以上进行,压力升高,在其他工艺条件相同的情况下,必然要求合成气压缩机的输出功更大,能耗也就更高;当然,各设备的材料强度要求也会更高,初期投资相对更多。

3.3进合成系统新鲜气量的影响

在(H2-CO2)/(CO+CO2)=2.25,合成系统压力P 7.55 MPa和合成塔入口温度为222 ℃的条件下,考察了进合成系统不同的新鲜气量(两合成塔D121与D122的新鲜气比例不变,仍为1∶2)对甲醇合成反应的影响,考察结果如表3。

根据实验结果,进气量对CO、CO2、总碳转化率的影响如图10,对粗甲醇产量的影响如图11,对选择性的影响如图12,对精甲醇产量的影响如图13。

由图10可知,CO以及总碳转化率随着原料气进气量的升高而降低,这是因为随着合成系统原料气进气量的增加,气体流速增大,意味着单位反应气体与催化剂相对接触时间变短,所以CO以及总碳转化率随之降低。由于CO2在催化剂表面相对H2、CO吸附速率更快,原料气进气量的增加使更多的CO2占据了催化剂的表面,所以CO以及总碳转化率随进气量的增加呈下降趋势,而CO2的转化率呈增长趋势。

随着原料气流量的增加,精甲醇产量增加,见图13。进气量由312 000 m3/h增加到316 540 m3/h,即合成系统进气量增加1.6%,精甲醇产量增加1.9%。这是因为随着原料气进气量的增加,与单位催化剂接触的原料气增多,所以产量升高。因此,适当增加进气量有利于提高甲醇产量,但进气量的提高也会带来催化剂床层压降变大、合成气压缩机动力消耗增加等弊端。

在312 000～316 540 m3/h之间,随着进气量的增加,甲醇选择性上升,见图12。这可能是由于副反应的反应速率相对降得更快,致使甲醇选择性升高。之后随着原料气流量增加,甲醇的选择性呈下降趋势。

3.4氢碳比(H2-CO2)/(CO+CO2)的影响

在合成塔入口温度为222 ℃,进合成系统新鲜气量为321 850 m3/h,且两合成塔D121与D122的新鲜气比例为1∶2,合成系统压力P 7.55 MPa的条件下考察了氢碳比(H2-CO2)/(CO+CO2)对甲醇合成反应的影响,考察结果如表4。

氢碳比对CO、CO2、总碳转化率的影响如图14所示,对粗甲醇产量的影响如图15,对甲醇选择性的影响如图16,对精甲醇产量的影响如图17。

由图14可知,总碳转化率随氢碳比的增加而不断上升。氢碳比升高,意味着原料气中H2浓度的升高,而CO的浓度减少。从反应动力学考虑,这有利于总碳转化率的提高。

当(H2-CO2)/(CO+CO2)=2.14或2.5时,精甲醇产量都较大。氢碳比为2.14时,符合甲醇合成反应[式(1)与式(2)]要求的化学计量配比,但此时氢碳比低而不利于碳的转化反应。从图14、15、16可以看出,由于符合甲醇合成反应要求的化学计量配比,甲醇选择性较高,由于氢碳比低而不利于碳的转化,因此粗甲醇产量很小,但通过图17看出,此时的精甲醇产量很高,由此得出氢碳比为2.14时甲醇选择性提高占据主导地位,而CO、总碳转化率降低则次之,故最后表现为虽然碳转化率较低,但精甲醇产量还是很高。

当氢碳比为2.34时,精甲醇产量最小,虽然此时氢碳比的提高会导致碳转化率以及粗甲醇产量的提高,但由于此时偏离甲醇合成反应要求的化学计量配比,甲醇选择性很低,导致精甲醇产量降低,此氢碳比下甲醇选择性依然占据主导地位。

当氢碳比为2.50时,精甲醇产量又迅速增加,虽然此时氢碳比已远远偏离甲醇合成反应要求的化学计量配比而导致甲醇选择性降低,但此时氢碳比的提高会使碳转化率、粗甲醇产量迅速提高,导致精甲醇产量增加,此时氢碳比的提高使碳转化率、粗甲醇产量升高并占据主导地位。

通过图17看出,当(H2-CO2)/(CO+CO2)=2.50时,精甲醇产量最大。氢碳比控制在2.50较为合适。

氢碳比过低、过高对甲醇生产都是不利的。氢碳比过低不仅影响到甲醇产量,还会促使结炭反应的发生,影响催化剂的使用寿命;氢碳比过高,虽然甲醇产量升高,但带来的是由于甲醇选择性差导致精馏负荷增加、氢气回收负荷加大以及循环机能耗增加等不利结果。

3.5工艺条件对合成过程的敏感性分析

由上述分析可见,各工艺条件对甲醇合成均有不同程度的影响,为了找出主要影响因素,设计了三水平四因素的正交实验,实验配比如表5。

选择温度、压力、新鲜气量以及氢碳比等四因素对综合指标——精甲醇产量的影响进行了极差分析。“极差”是同一因素不同水平间的最大值与最小值的差。“极差”是衡量主要影响因素和次要影响因素的一个重要标准,“极差”越大,说明该因素对甲醇合成的影响越大;“极差”小,则说明该因素为次要因素。而且精甲醇产量指标是最大特性指标,则选使K最大的水平作为该因素的好水平。

正交实验结果和以精甲醇产量为指标对甲醇合成条件的极差分析结果见表6、7。

如表7,第一列温度因素K3>K2>K1,说明提高精甲醇产量,合成塔入口温度220 ℃水平要比218 ℃水平好,222 ℃水平还要比220 ℃水平好。同样,第二列压力因素的好水平是7.8 MPa,第三列氢碳比因素的好水平是2.5,第四列进合成系统原料气量因素的好水平是321 850 m3/h。

综合上述,最佳的组合为,温度为222 ℃,压力为7.8 MPa,氢碳比为2.5,进合成系统的原料气流量为321 850 m3/h 。由极差R确定各因素对指标的影响程度顺序。依照极差大小,各因素对精甲醇产量指标影响的大小顺序为:温度>进合成系统的原料气量>氢碳比>压力。

一般来说,当因素之间不存在交互作用时,通过计算分析得到的好条件要优于直接分析得到的好条件。如果存在交互作用,情况就比较复杂,需要配合其他方法再仔细分析,本文不考虑各因素之间的交互作用。

4结论

本研究工作得到下列主要结论。

(1)甲醇合成存在最佳的温度操作范围,温度过高或者过低不但会大幅度降低甲醇合成的转化率和产率,也会降低产物中甲醇的选择性,KATALCO51-9催化剂最佳操作温度为222 ℃。

(2)提高反应压力,有利于甲醇合成转化率和产率的提高,但甲醇选择性会有所降低。

(3)原料气流量适当增加会提高甲醇的选择性,增加精甲醇产量,但过多的提高进合成系统的原料气流量会使甲醇的选择性降低,同时也带来催化剂床层压降变大、合成气压缩机动力消耗增加等弊端。

(4)甲醇合成原料气(H2-CO2)/(CO+CO2)最佳比例为2.5。

(5)在选定的各工艺参数变化范围内,对精甲醇产量的影响因素从大到小依次为温度、进合成系统的原料气量、氢碳比、压力,最佳的工艺条件组合是温度为222 ℃,压力为7.8 MPa,氢碳比为2.5,进合成系统的原料气流量为321 850 m3/h。

参考文献

[1]张明辉.大型甲醇技术发展现状评述[J].化学工业,2007,25(10):8～12.

[2]Ipatieff V.N.,Monroe G.S..Synthesis of Methanol from Carbon Dioxide and Hydrogen over Copper-Alumina Cata-lysts.Mechanism of Reaction[J].J.Am.Chem.Soc.,1945,67(12),pp2168～2171.

[3]魏文德主编.有机化工原料大全(第二版)[M].北京:化学工业出版社,1999,804～822.

[4]应卫勇,曹发海,房鼎业.碳一化工主要产品生产技术[M].北京:化学工业出版社,2004,164～167.

条件优化 篇2

(1.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550003;2.贵州大学生命科学学院，贵州责阳550025)

摘要：对麸曲酱香白酒生产所需糖化酶菌种：白曲霉的一级种培养工艺条件进行单因素试验，应用Minitabl5软件设计了Plack-c叶-t-Burnlan筛选试验，通过筛选得出蔗糖浓度、硫酸铵浓度、培养摹pH值以及微量元素配比为菌种生长的4个显著性影响因素，并对此进行正交试验得出白曲霉一级种斜面培养的最优条件为蔗糖浓度259/L，硫酸铵浓度3.59/L，MgSO，?7H99K2PO，1.09/L，琼J].159/L，pH值5.5，培养温度28。C，菌体糖化酶活力724。8U/g。关键词：白曲霉：斜面培养;工艺优化中图分类号：093--335

文献标识码：A

文章编号：0254―5071(2010)09-0093―04

1.09/L，KCI!.09/L，

OptimizationofslantculturemediumofwhiteAsperSe/ms

GAOLinfen91，Tang

Qinglil，WUTianxi蛆92.

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering，Guiz凼ouUniversily，Guiyan9550003，China;

2.Schoolofh'fescJclJCC￥，Guizhou

Abstract：Aspergillusplays

an

Universi(y，Guiyang

550025，国ina)

importantmleofsaccharificafionintheproductionofChineseliquor.Thefermentationconditionoftheslantculture

test

mediunwasoptimizedbysingle-factors

inthisstudy.ThePlaekett-Burman

as

experimcmWaSdesignedbysoftwareofMira'tab15.Theoptimalfor-

mentationconditionswcreobtainedbyorthogonaldesignfollowed：theconcentrationofglucose

25班，the

concentrationofammoniumsulfate

ac-

3.5叽，MgSO，-7H：，‘91.0班，KCl1.0叽K，PO(1.0班，mediumpHvalue5.5

tivityofglucoamylasewas724.8U/g.

Keywords：whiteAspergi.us，slantculture，optimization

andfermentationtemperature28℃.Undertheseconditions，the

酱香型白酒的传统生产工艺是以高温大曲为糖化发酵剂，以高粱为原料生产的。贵州茅台酒是其典型代表。但由于该工艺生产周期长、粮耗高、产量低资金周转慢、成本高。从而导致酱香型白酒市场价格相对偏高，不能满足不同层次消费的需求【”。应用纯种微生物制成麸曲，生产酱香型白酒，成为酱香型白酒生产的另一种途径，经研究其粮耗大幅下降、生产周期明显缩短，酒质基本达到大曲酱香的要求【习。麸曲白酒质量的优劣，取决于麸曲和酒母的质量这与选育菌种关系重大，要求麸曲应最大限度地将淀粉分解成可发酵性糖，应具有较高的淀粉酶及糖化酶的活力网。在酿酒工业中，生产麸曲白酒等酒类时白曲霉可作为糖化剂，这是因为白曲霉中的糖化酶可以将淀粉水解为葡萄糖，进而被微生物发酵产生酒精14】，白曲霉斜面试管培养基的好坏可直接影响到酒质的优劣。因此本试验通过对白曲霉斜面试管培养基进行优化，以麸曲糖化

收稿日期：20LO-05.11

酶的活力作为检测指标，探索白曲霉糖化酶活力最高时的培养条件。1材料与方法1.1菌种

白曲霉：购于四川微生物菌种保藏中心。1.2培养基

斜面培养基：葡萄糖309，NaN0339，MgS04?7H20

KCl

0.59，

0。59，K2P04lg，琼脂159，蒸馏水1000mL，pH值自然。固体培养基：250mL三角瓶装A259含水率为65%的

麸皮，恰好可以覆盖瓶底，0.1MPa灭菌30min。1.3培养方法

斜面培养：从活化好的母种试管中挑取黄豆大的菌丝块，接入斜面，在28℃培养4d。

固体培养：从斜面试管中挑取3块黄豆大小的菌丝块接入固体培养基，拌匀。培养温度为28℃，刚开始为堆积培

基金项目：贵州省贵阳市科技局工业攻关项目([2009]筑科2合同字第1-057号)

作者简介：高林峰(1985-)，男，山东济南人，硕士研究生，研究方向为发酵工程;吴天祥?，教授，通讯作者.

条件，均质为60℃、30MPa条件下均质2次，121℃杀菌5min。经单因素试验及正交试验确定其最佳稳定剂配方为单甘酯0.2%，黄原胶0.05%，羧甲基纤维素钠0.12%，蔗糖酯0.1%。制得的产品流体均一，色泽乳白，可稳定保存。经过上述工艺加工的巴旦木蛋白饮料符合国家饮料生产标准，保质期可达12个月。

参考文献：

【1】朱京琳.新疆巴旦杏rM】.乌鲁木齐：新疆人民出版社，1984.

【2]刘金荣，但建明，江发寿，等.巴旦杏仁的营养成分与理化常数测定，

营养学报阴.2002，24(2)：202.203.

【3】郑力.巴旦杏仁乳饮料的品质改良研究啊.粮油食品科技，2006，4：

38-39.

?

【4】高愿军.软饮料加工技术【M】.北京：化学工业出版社，2007.

万方数据

2010NO.9

?94?

SerialNo.222

ChinaBrewing

养，20h后将培养基混匀平摊在瓶底，24h后培养结束。1.4检测方法

1.4.1糖化酶的测定方法嗍

(1)麸曲液的制备：称取59麸曲，加入100mL蒸馏水浸泡lh。

(2)取A、B2个三角瓶，A瓶加入20mL蒸馏水，B瓶加入20mL2%淀粉溶液(准确称取绝干的可溶性淀粉29，用

少量的水调匀，倒入70mL的沸水中，并用20mL水反复洗涤小烧杯，洗液合并其中，用微火煮沸到透明，冷却后用水定容至100mL，当天配制使用)。

(3)向A、B2个三角瓶中各力gXSmL、pH4.67，酸一乙酸钠缓冲液(2mol/L乙酸溶液：取118mL冰乙酸用水稀释至1L，与2moVL乙酸钠溶液：称取2729乙酸钠溶于水并稀释至lL，等体积混合即可)，然后分别加入5mL浸泡好的麸曲液。

(4)置于30℃水浴锅反应60min后加入3mLlmol/LNaOH终止反应。

(5)取2个新的三角瓶C、D盼别加入斐林甲一乙液各5mL，

从反应后的A、B2瓶中各取5mL力n入，在电炉上加热。在沸腾条件下用lg/L葡萄糖溶液进行滴定，直至蓝色消失记录所用葡萄糖液的体积V。、V：。

(6)糖化酶活力(U，妒=(V。.Wx96

1.4.2培养条件优化

对碳源、氮源的选定以及对选定后的碳源、氮源的质量浓度、微量元素配比、培养时间和培养基Ph值进行单因素试验。利用Minitabl5软件设计了5因素2水平的Plack-ett-Burman筛选试验，从中找出对菌体生长的显著性因素并进行正交试验对其优化。2结果与讨论2.1单因素试验2.1.1碳源、氮源的选择

(1)碳源的选择：分别用309/Ll｝勺蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉来代替基础培养基中的葡萄糖，其他条件均不变进行试验，结果见图1。

600

蚕500

o400

杂300

蜒

避200

_

糖100

O

f-淀粉蔗糖葡萄糖麦芽糖玉米粉

圈一圈-L.-圈.-1-一_.1-.I.J

碳源

图1

不同碳源对菌体糖化酶活力的影响

Figure1.Effectofdifferentcarbon

sourceon

theactivityofsaccharifying

enzyme

万方数据

碳源是白曲霉乃至任何微生物生长能量代谢的来源，不同的碳源对菌体生长均有不同的影响，由图l可以明显看出，蔗糖对菌种产糖化酶的影响最大，而且蔗糖的价格适宜，故选蔗糖作为斜面培养的碳源。

(2)氮源的选择：用3班的尿素、碳酸氢铵、酵母膏、硫

酸铵和蛋白胨来代替基础培养基中的硝酸钠，其他条件不变进行试验，结果见图2。

5

44

332

●●

硝酸钠尿素碳酸氡铵酵母臂蛋白胨硫酸铵

氮源的种类

图2不同氮源对菌体糖化酶活力的影响

Figure2.Effectofdifferentnitrogen

sourceontheactivnyof

sacchariiyingenzyme

氮源是构成菌体成分的主要物质，不同的氮源对菌体的生长及糖化酶的`活力的影响也不一样。由图2可以明显看出，白曲霉对酵母膏和硫酸铵的利用率较高，并且考虑到经济因素以及试验操作的因素，故选择硫酸铵作为菌种斜面培养的最佳氮源。取10鲫卜S09/L不同浓度的蔗糖加入到斜面培养基当中，其他的条件保持不变，观察对菌体生长的影响，试验结果(图3)可以明显看出，白曲霉产糖化酶活力随糖浓度的增加而增加，当蔗糖浓度为309/L时达到最佳。

700

玉600

o

500

、400

R

蜒300

塞200

囊100

蔗糖浓度“g?L‘‘)

图3蔗糖浓度对菌体生长的影响

Figure

3.Effectofsucroseorl

theactivnyofsaccharifyingenzyme

取lg/I一59/L不同浓度的硫酸铵tJnA，斜面培养基当中，其他条件保持不变，观察对菌体生长的影响，试验结果(图4)可以明显看出，白曲霉产糖化酶的活力随硫酸铵的浓度增加而增加，当硫酸铵的浓度为39/L时达到最佳。

2.1.2碳源浓度对菌体生长的影响

2.1.3氮源浓度对茵体生长的影响

中国酿造

2010年第9期研究报告

f

bo

●

√

)长蛭避g耀

硫酸铵浓度/(g?L。)

图4硫酸铵浓度对菌体生长的影响

Figure4.Effectofammoniumsulfateconcentration

oll

the

act脯y

of

sacchadfyingenzyme

微生物的生长都需要在适宜的酸碱环境下，调节培养基的pH值为4、5、6、7、8，其他条件保持不变，观察对菌体生长的影响，结果(图5)可以明显看出，在pH值为6时菌体糖化酶的活力最高，故选择培养基的pH值为6。

o

k

●

o

、-，

R蜒潼基瓣

pH值

图5

pH值对菌体生长的影响

Figure5.EffectofpHvalueoN

theactivnyofsaccharifyingenzyme

2.1.5培养时间对菌体生长的影响

o

h

●

o

―R蜒滋S舞

培养时间/d

图6培养时间对菌体生长的影响

Figure6.Effectofculturetime

oll

theactivityofsaccharifying

enzyme

分别选择2d√od作为培养时间，通过检测糖化酶活力的大小来确定培养时间，结果(图6)可以看出，随时间的高，但随后随着菌体的老化糖化酶的活力逐渐降低，故选

万方数据

总第222期

?95-

择4.5d为培养时间。

2.1.6微量元素配比对菌体糖化酶活力的影响

Mg、K、P元素作为培养基中的微量元素，虽然需要的量很少但是对微生物来讲却也是必不可少的。试验将MgS04、KH2PO，按照l：l、1：2、l：3的比例进行组合，试验结果(图7)可以看出，当MgSO。：K.H：P03为1：l且均为1.09/L时糖化酶的活力最高。

500

0.5+0.50.5+1.0O.5+1.51.o十1.01.o+2，01.o+3.0

MgS04+KH2POd(g?E。)

图7微量元素配比对菌体生长的影响

7.Effectof

trace

elementratios011

theactivityofsaccharifying

enzyme

表1各因素所选水平

Table1.SelectedIeveIs‘

ofvariousfactors

水平擀参搿群L篱-州值搋

”。

度/(g?L.1)

问/d

度/(g?1)

P11咀索配比

高水平(1)

354

4.5

6.5

1.25：1.25

低水平(.I)

25

表2Plackett-Burman设计矩阵及试验结果

Table2.DesignmatrixofPlackett-Burmanandexperimentalresults

试验号

蒙藿

培养时间pH

微差鼋素‘焉繁v/(u.g.1)

..

1

I

-

5

●2.

.

9345

-

;1

-

5

.

i

_

3-

ll

8611.

16

7_

ll

.

l8.l

-

l--

1-

9

-l

l

-

i｝658m

--●

n抡

-

;

-

-

i

.

;lll

i

l1

l

试验根据碳源浓度、氦源浓度、培养基pH值、培养时间和微量元素配比的单因素试验结果，设计了n=12的2.1.4培养基pH值对菌体生长的影响

Figure2.2显著性因素的筛选

Plackett-Burman筛选试验，每个因子取高“1)低(.1)2个水平(例如培养基pH值为6时最高，取高水平为6.5，低水平为5.5)。以糖化酶的活力大小为响应面的Y值，试验因素水平见表l，结果见表2，各因素的效应评价及系数估计见表

增加糖化酶的活力逐渐的升高，当4.5d时糖化酶的活力最

2010No.9

?96?

SerialNo.222

ChinaBrewing

Research3。若p

裹3各因素效应与系数估计

Table3.Factoreffectandcoefficientestimation

2.3正交试验分析

根据显著性试验筛选出的4种显著性因子进行正交试验分析，试验采用的是k(30正交试验，各因素选取水平见表4，试验结果及分析见表5，方差分析见表6。

表4优化菌体生长条件正交试验因素水平

Table4.LovoIsofvariousfactorsoforthogonaltest

水平”。

A孳蔓?粤c(g?L1)

B硫甓孽饕度/(2?L’‘)

。p18pH值D微量元素配比。”5“8““l253.55.50.75：0.75230461.00：1.oo3

35

4.5

6.5

1.25：1.25

表5优化菌体生长条件正交试验数据及结果分析

Table

5.Resultsandanalysisoftheorthogonalexperiment试验号

AB

CD糖化酶活力/(U?g-1)

ll1

ll53421.2225183l’33350942l234805223l470623’1247973l32461832l34379

332l443

均值l520.333491.667483.333482.333均值2476.333475.000480.333486.000均值3447.333477.000480.333475.333极差

73.000

16.667

3.333

10.667

由正交试验结果可以看出，对菌体生长的最大因素为蔗糖的浓度，其次为微量元素配比培养基pH值及硫酸铵浓度。4个因素的最佳组合应该是A。B.C。D：，即蔗糖浓度为259/L，硫酸铵浓度为3.59/L，MgS04?7H201.o#-，KCI1.09/L，K2P041.09/L琼脂lSg/L，pH值为5.5。按照所得出的

万方数据

Report

培养基最佳组合进行试验，并取2个水平，计算其平均值，最后得到菌体糖化酶的活力为724.8U/g。

褒6正交试验方差分析

Table6.Variance

analysIsofheorthogonalexperiment

3结果分析

传统的大曲酱香型白酒生产，工艺复杂，生产周期长，

耗粮高，对自然气候条件要求奇刻。近年来，发展较快的麸曲酱香型酒生产工艺，具有简化工艺、降低消耗，缩短周期的特点使得纯种麸曲发酵为酱香型白酒发展的新途径嘲。白曲霉为麸曲发酵的糖化剂，可以将原料中的淀粉分解成菌体生长所需要的糖，其糖化酶的活力大小对麸曲白酒的产酒率以及白酒的质量有着重要的影响，因此本实验以糖化酶的活力大小作为验证菌体生长好坏的考察指标。

通过单因素试验对自曲霉斜面培养基成分及培养条件进行优化，确定蔗糖为培养基碳源，硫酸铵为培养基氮源。通过Plackett-Burman筛选试验对蔗糖浓度、硫酸铵浓度、培养时间、培养基pH值、微量元素配比进行筛选确定蔗糖浓度、硫酸铵浓度、培养基pH值、微量元素配比为菌种生长的显著性因素。

对4组显著性因素进行L9(34)进行正交试验，得到菌体生长培养条件的最佳配比为蔗糖浓度为309/L，硫酸铵浓度为3.Sg/L，MgS04?7H20

1.09/L，KCI1.09/L，K2P04

1.09/L，琼)指159/L，pH值为5.5。在此培养条件下进行培养可以明显的提高茵体糖化酶的活力，活力值可以达到724.8U/g。完全符合白曲霉作为发酵糖化剂的作用，对以后麸曲白酒的发酵产酒具有指导意义。参考文献：

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【2】时卫平.新型酱香型白酒的生产叨.酿酒科技，2005(8)：54-55.【3】熊子书.麸曲白酒优良菌种的选育【J】.酿酒科技，1998(1)：15.16.【4】张娇英，孙学嘉。彭仁清。等.白曲霉一级种培养基的筛选【J】.佳木斯大

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【5】栗永清，赵玉培，徐加顺.大曲、麸曲相结合生产酱香型白酒佣.酿酒，

苇蘑液体培养条件的优化 篇3

摘 要：通过苇蘑菌丝体液体培养的单因素试验，初步确定苇蘑的较适生长条件：pH值为5～7；温度 25 ℃；转速 100～200 r·min-1；装液量50～90 mL。再经正交试验对培养条件进行优化，得出苇蘑的最适制种工艺为：初始pH值为6；温度恒定为25 ℃；转速保持150 r·min-1；装液量为90 mL/250 mL。在该培养条件下，苇蘑的菌丝干质量可达到19.4 g·L-1。在通气量为4.5 L·min-1条件下进行苇蘑液体菌种的5 L发酵罐培养，在44 h即达峰值19.9 g·L-1。

关键词：苇蘑；液体培养；菌丝干质量

中图分类号：Q93-335 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.033

Abstract： The optimum growth condition of liquid culture for Weimo was studied by the way of single factor test， including pH， temperature， rotating speed and liquid volume. The results showed that the range of growth conditions of Weimo are as follows： pH 5～7， temperature 25 ℃， rotating speed 100～200 r·min-1 and liquid volume 50～90 mL. Then the optimal spawn-making for Weimo was concluded by three factors three levels orthogonal experiment， and they are pH 6， temperature 25 ℃， rotating speed 150 r·min-1 and liquid volume 90 mL. Under the optimal growth condition， the dry weight of Weimo could reach 19.4 g·L -1. And Weimo spawns grew to a peak value 19.9 g·L -1 after cultured by 5 L fermenter， 4.5 L·min-1 ventilation， 44 h.

Key words： Weimo；liquid culture；mycelium dry weight

苇蘑为蜡伞科（Hygrophoropsidaceae）、拟蜡伞属（Hygrophoropsis）蘑菇[1]，产于天津市宁河县七里海地区芦苇地。芦林苇海中多年败叶腐草厚积成为独特的苇蘑生长基质，在闷热的夏季形成特定湿度、温度和光照环境，苇蘑才破土而出。苇蘑味道极其鲜美，香味浓郁，远胜于其他蘑菇，当地人们采集后鲜食或晒干食用。近些年来，由于自然生态环境的变化，芦苇长势大不如前，苇地里形不成阴暗潮湿的环境，苇蘑等也就很少见到[2]。

目前国内外关于苇蘑的研究报道较少，班立桐等[3]初步研究了苇蘑不同溶剂粗提物组分的抗氧化活性，发现总提取物的抗氧化力最好，除总提取物外，苇蘑的乙酸乙酯可溶性组分总抗氧化力最高，苇蘑的脂溶性组分对超氧阴离子（O2-）清除能力低于水溶性组分，而对羟自由基（·OH）的清除能力相差不多。为了更好地保护这一珍贵的蘑菇品种，本课题组在获得苇蘑快速生长的液体培养基后，进一步研究苇蘑液体培养的最适生长条件，为更好地开发利用苇蘑提供依据。

1 材料和方法

1.1 菌 种

苇蘑（Weimo）由天津农学院农学与资源环境学院生物技术系保藏。

1.2 培养基

（1）斜面培养基的制备[4-5]。取600 g草炭土，在一定量的清水中煮沸20～30 min，用4层纱布过滤，得滤液。向滤液中加入硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、葡萄糖、琼脂，待药品溶化后，补足水分，分装试管。

（2）液体培养基（g·L-1）：葡萄糖 15 g，乳糖 15 g，酵母膏 6 g，115 ℃灭菌20 min。

1.3 方 法

1.3.1 苇蘑培养条件的单因素试验 （1）设置pH梯度为4、5、6、7、8、9，按照最适培养基的配方，每组配制6个摇瓶，每瓶装液量为70 mL的培养基。接种完成后分别放入温度为20，25，30 ℃的恒温摇床中震荡培养，并观察记录。（2）将接种完成的三角瓶分别放入不同转速（100，150，200 r·min-1）的恒温摇床中培养7 d。锥形瓶中长出很多淡黄色的小菌球为最佳[3]。

1.3.2 苇蘑液体培养的正交试验 以苇蘑单因素试验结果为基础设计了3因素3水平正交试验，以确定苇蘑的最适生长条件。正交试验因素水平见表1[4]。

1.3.3 分析方法 待各试验组生长出大量淡黄色小菌球时，取5 mL菌液稀释检测各组菌球数，并取等体积（50 mL）菌液测干质量和多糖[6]。干质量为离心后用蒸馏水冲洗菌丝3次置50 ℃烘箱中烘至恒质量测得，多糖测定采用苯酚硫酸法。

2 结果与分析

2.1 培养温度对苇蘑生长的影响

通过在20，25，30 ℃ 3种不同温度、150 r·min-1条件下培养苇蘑，7 d后各培养基中均长出淡黄色的苇蘑菌球，检测各组菌球数和干质量，结果见图1。

在不同温度条件下的pH为6的试验组中菌丝干质量分别为5，7.8，5.6 g·L-1，可以看出25 ℃下，菌丝干质量最多。对比3个温度环境下的各组试验，可知25 ℃有利于苇蘑生长。

2.2 摇床转速对苇蘑生长的影响

苇蘑接种到在摇床转速100，150，200 r·min-1条件下分别进行培养7 d后，测得的菌丝干质量见图2。

对比不同转速下的培养，可以推测出苇蘑的生长需要一定的溶氧，转速太低不利于苇蘑的生长，150 r·min-1菌丝干质量最高，而200 r·min-1比150 r·min-1条件下的菌丝干质量略低，可见转速太快不一定有利于苇蘑生长。

2.3 初始pH对苇蘑生长的影响

通过图3可以看出，在同一温度条件下pH值为6的试验组中菌球数、干质量、多糖含量明显高于其他试验组，并且各指标变化趋势基本相同。从图3可以看出，pH趋于碱性时，苇蘑的干质量逐渐减小，多糖含量及菌丝球数变化趋势相同，可见苇蘑为一种酸性食用菌，但过酸和过碱均不利于菌体的生长[7]。结果表明其最适生长pH值在6左右，与羊肚菌液体发酵所需最适pH值相同[8]，而与适于桦褐孔菌液体发酵所需碱性pH值刚好相反[9]。

2.4 正交试验结果

2.4.1 极差分析 苇蘑经过7 d的液体菌丝培养后进行离心测菌体干质量并进行统计分析，结果见表2。经单因素试验发现，菌丝球数及多糖含量与菌体干质量正相关，故此处只列出各试验组的菌丝干质量。

由表2中的极差R可以看出， 初始pH对苇蘑生长的影响最大，其次为装液量及转速。从表中得出最优组合为A2B3C2，即pH 6，装液量 90 mL，转速 150 r·min-1。这与试验组中的最大值6号组合A2B3C1不一致，有必要进行一次验证试验，以确定苇蘑的最适生长条件。

2.4.2 验证试验 将正交试验极差分析的最优组合A2B3C2和试验组合A2B3C1进行重复试验，每组接种4瓶，经7 d培养后对菌丝干质量进行记录、分析，结果见表3。

由表3可知，试验组合A2B3C2条件下的苇蘑菌丝干质量均值高于试验组合A2B3C1，即A2B3C2条件更适合苇蘑生长，苇蘑的最适液体培养条件是：pH 值为6、温度 25 ℃、装液量 90 mL、转速150 r·min-1。

2.4 通气量对苇蘑液体培养的影响

以10%的接种量进行苇蘑液体菌种的5 L发酵罐通气培养，设定通气量为3，4.5，6 L·min-1进行比较试验，过程曲线见图4。

由图4可见，苇蘑的发酵罐培养后的干质量在44～48 h即达到峰值，时间远远短于摇瓶培养，可见发酵罐培养条件优于摇瓶。不同的通气量条件下，苇蘑的生长情况差异比较大，通气量由3 L·min-1增大至4.5 L·min-1后，菌体的干质量得到了大幅度提升，而进一步增大至6 L·min-1后，菌体干质量反而出现下降趋势。通气量可控制发酵罐中的溶氧处于合适的范围，进而促进菌体的快速增长及生长得率的增加[10]，苇蘑的液体菌种培养在适量的通气量条件下生长，于44 h可达峰值19.91 g·L -1，达峰值的时间远低于常见的珍稀食药用菌如杏鲍菇、桑黄、荷叶离褶伞等的6～8 d[11-13]。

3 结论与讨论

苇蘑为具有天津“肺叶”之称的七里海湿地的特色资源，其产出不仅需要特定的地理环境，还需要独特的气候条件。野生苇蘑生长于茂密的芦苇根部，采集非常困难，采集者有时在密集的芦苇丛中寻觅几小时而不得一子实体，而且苇蘑不一定每年均有产出，气候条件的变化导致几年都采集不到是常有的事。苇蘑的稀少及独特的味道促使这一野生资源2015年售价达4 000元·kg-1，而且往往价高而货缺。

七里海是华北大地渤海之滨的一颗璀璨明珠，七里海因南北宽 7 华里而得名，又名七里淀，古属神州九十九淀之一。古称七里海为“七里烟波”，属宁河八景之一。它在 20 世纪 60 年代以前曾有过几千年辉煌的历史，是津京唐三角地带极其难得的一片绿洲，是天津滨海地区既大又美的后花园，是我国第一个也是唯一的古海岸与湿地同处一地的国家级自然保护区，还是世界著名三大古海岸之一[14]。从20 世纪70 年代开始，由于湿地生态系统的脆弱性，加上人们在对湿地资源的开发中存在着许多不合理，极大地影响了湿地生态环境，破坏了生态平衡。七里海湿地的面积不断缩小，水源逐渐枯竭，植物群落严重衰颓。尤其是芦苇，在充足的热量和水分条件组合下，长势良好，植株高大，茎杆粗壮，生长茂密，曾覆盖了70%～80%的沼泽面积，形成绿色的芦林苇海[15]。由于沼泽面积缩小、土质退化和干旱无水，芦苇的长势也严重衰退，栖身芦苇地的苇蘑也逐年减少。此外，人为采集的增加，导致幼龄菇未完成生理成熟期即夭折，长此以往，芦苇地由于缺乏苇蘑孢子的存集，苇蘑将面临灭绝的危险。

为延续苇蘑的资源再生，多年来很多学者一直在研究人工栽培苇蘑技术，目前未有成功。笔者所在研究室长期研究苇蘑，以期通过液体发酵模式开发苇蘑产品，并对七里海地区的物种保护作一份贡献。在不同pH值、温度、转速、装液量下对苇蘑进行摇瓶振荡恒温培养，通过正交试验对培养条件进行优化，确定出苇蘑的最适合液体制种工艺。在该工艺条件下，苇蘑的菌丝干质量达到最大值：19.4 g·L -1，是未优化前的3.9倍。通气量为4.5 L·min-1条件下进行苇蘑液体菌种的5 L发酵罐培养，在44 h即达峰值，制种时间可大幅度缩短。

参考文献：

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[2]梁枝荣.苇蘑的分离与驯化栽培[J].新技术，2009，70（9）：62-67.

[3]班立桐，杨红澎，吴疆，等.野生苇蘑不同活性组分的体外抗氧化作用研究[J].食用菌，2010，32（3）：72-73.

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[14]张丹.湿地生态旅游开发机制与路径研究——以天津七里海湿地为例[D].天津：天津商业大学，2010.

蜜环菌培养条件优化 篇4

蜜环菌具有药用价值,对治疗腰腿疼痛、佝偻病、癫痫病均有功效。经常食用蜜环菌,可预防视力减退、夜盲、皮肤干燥,并可增强人体对某些呼吸道及消化道传染病的抵抗力。

蜜环菌营腐生为主,兼营寄生生活[6]。子实体一般7cm以上,丛生成伞状,具黄色或黄褐色的菌盖,直径5~15cm[7]。蜜环菌的菌丝体是蜜环菌的基本结构,一般以菌丝和菌索两种形式存在,并相互转换着侵染寄主[8]。

国外最早报道蜜环菌可以引起多种针叶树及阔叶树根瘤病,其寄主植物多达300属,但并非完全致病,相反有些被蜜环菌侵染的植物生长旺盛,有的必须有该菌侵染,植物才能正常生长发育[9]。由于中药天麻及猪苓必须依靠蜜环菌侵染提供营养才能生长繁殖,因此,引起国内外学者对该菌研究的极大兴趣[10]。近几十年来,国内外对蜜环菌进行了大量研究,结果证明蜜环菌发酵产物与天麻有类似的药物作用,具有镇静、抗惊厥、增强耐缺氧能力及增强肌体免疫功能等作用[11]。本试验通过对蜜环菌培养条件的优化,研究蜜环菌的生物学特性,为进一步利用蜜环菌资源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种为蜜环菌Armillariellasp.保存于实验室。马铃薯琼脂培养基(PDA培养基):马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫胺素10mg、琼脂20g、水100 mL;基础培养基(改良察氏培养基):葡萄糖20g、蛋白胨5g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、琼脂20g,加水1 000mL,pH自然。

1.2 方法

试验于2015年9-12月在黑龙江八一农垦大学实验室进行。

1.2.1不同碳源对菌丝生长的影响

以不加碳源的改良察氏培养基为基础培养基,供试碳源为:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维素、淀粉、甘露醇。培养基配制灭菌后倒入平皿,按常规无菌操作将大小一致的接种块接入平皿中心,每个处理5次重复,25℃恒温培养,观察其菌落形态变化,测其菌丝生长直径。

1.2.2不同氮源对菌丝生长的影响

以不加氮源的改良察氏培养基为基础培养基,供试氮源为:蛋白胨、酵母粉、尿素、豆饼粉、(NH4)2SO4、KNO3。每个处理5次重复,25℃恒温培养,观察其菌落形态变化,测其菌丝生长直径。

1.2.3温度对菌丝生长的影响

培养基采用PDA培养基,温度分别为10、20、25、30、37℃,共5个处理,每个处理重复5次,观察其菌落形态变化,测其菌丝生长直径。

1.2.4 pH对菌丝生长的影响

采用PDA培养基,用1mol·L-1NaOH和1mol·L-1HCl将培养基的初始pH分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,共6个处理,每个处理5次重复,25℃恒温培养,观察其菌落形态变化,测其菌丝生长直径。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对蜜环菌生长的影响

通过不同碳源的添加测定菌丝生长速率发现:供试的7种碳源中,葡萄糖为最佳碳源,最适合蜜环菌的生长(见表1),菌丝生长速率为17.5mm·d-1;该蜜环菌在利用蔗糖、麦芽糖这两种碳源时菌丝生长速率也较快,且二者生长能力差异不显著,但对淀粉的利用能力最差;尽管能够利用纤维素和乳糖,但菌丝的长势比较微弱(见表1)。

++++:菌丝生长旺盛;+++:菌丝生长中等;++:菌丝生长中等偏弱;+:菌丝生长稀少。下同。++++:exuberant grown;+++:medium grown;++:medium weak grown;+:scarce grown.The same below.

2.2 不同氮源对蜜环菌生长的影响

由表2可知,蜜环菌在所试不同氮源条件下都能生长,不同氮源条件下蜜环菌的生长状态差异显著。蛋白胨作为氮源,蜜环菌菌丝生长速率最大,为19.5mm·d-1,尿素作为氮源时蜜环菌菌丝生长速率最慢,为13.5 mm·d-1,无机氮硝酸钾、硫酸铵作为氮源情况下,蜜环菌菌丝生长速率分别为17.0、16.5mm·d-1。

2.3 温度对蜜环菌生长的影响

由图1可知,蜜环菌在不同温度下生长状况差异较大,在37℃ 下蜜环菌菌体无法生长,在10~30℃范围内蜜环菌菌丝均可生长,其中25和30℃下蜜环菌生长最好,二者差异较小,10~20℃次之。当温度低于20℃时菌丝生长速度缓慢,在20~30℃时菌丝生长较快,当温度高于30℃时生长速度下幅很大。

2.4 pH对蜜环菌的影响

从图2看出,蜜环菌在pH 3.0~9.0均可生长,其中pH 6.0时生长状况最好,在6.0处随着pH的升高或降低其菌丝生长速率减小。

3 结论

采用平板培养法,对蜜环菌在不同碳源、氮源、温度、pH条件下的生长状态做试验研究。通过试验可以看出,蜜环菌的生长对碳源的选择性高于对氮源的选择性,虽然多种不同碳源均能利用,但生长状况差别很大,表明蜜环菌对不同碳源的利用能力差别很大,其中葡萄糖作为碳源时蜜环菌生长最好,为最佳碳源。在对氮源的利用上,不管是无机氮还是有机氮,生长状况差别小于不同碳源间的差别,其中蛋白胨作为氮源时生长最好,为最佳氮源。在供试温度范围内,25~30℃为最适生长温度,37℃ 停止生长,在10℃低温条件下仍可生长。供试的pH范围内,pH6.0最适合蜜环菌生长,随着pH的升高或降低其菌落直径减小。

参考文献

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[10]贺新生,吴钰娟.野生假蜜环菌生物学特性[J].食用菌,2008(2):19-21.

条件优化 篇5

洋葱细胞骨架制备条件优化及影响因素研究

以洋葱为材料,研究1%Triton X-100抽提非骨架蛋白时间、细胞环境温度和紫外线照射活细胞对洋葱细胞骨架形态观察效果的影响.结果表明:1%Triton X-100抽提非骨架蛋白25 min观察效果较好,细胞处在20℃和4℃环境下骨架清晰完整,呈网络状分布;-18℃、50℃及紫外线照射60 min处理均会造成细胞骨架不同程度的`解聚,影响细胞骨架的观察.

作 者：马云 王启钊 王伍 柴翠翠 MA Yun WANG Qi-zhao WANG Wu CHAI Cui-cui  作者单位：信阳师范学院,生命科学学院,河南,信阳,464000 刊 名：新乡学院学报（自然科学报） 英文刊名：JOURNAL OF XINXIANG UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2009 26(1) 分类号：Q245 关键词：细胞骨架   细胞环境温度   紫外线   洋葱鳞茎   显微观察  

亚硝化细菌培养条件的优化 篇6

关键词：亚硝化细菌；培养条件；优化

中图分类号： X172 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0314-03

收稿日期：2013-08-19

基金项目：江苏省自然科学基金（编号：BK2011201）；徐州工程学院科技计划（编号：XKY2012216）。

作者简介：董玉玮（1980—），男，江苏徐州人，博士，讲师，主要从事环境微生物学研究。E-mail：dongyuwei66@163.com。

通信作者：张雁秋，教授。E-mail：yanqiuzhang66@163.com。亚硝化细菌在自然界分布十分普遍，土壤、淡水及海洋中都有亚硝化细菌的存在，能将氨氧化成亚硝酸，属于硝化细菌科两个生理亚群之一[1]，在硝化作用第一步即由铵盐氧化为亚硝酸盐的过程中起作用，同时也是其第一个限速反应[2-3]。亚硝化细菌与人类的关系十分密切，被广泛应用于食品、生物、医药工业废水凈化，城市污水处理，鱼类养殖，农作物土壤改良等方面[4-5]。亚硝化细菌的生长代谢过程极其缓慢，在适宜的条件下一般需要24 h才能完成1次分裂周期。在进行固体培养过程中甚至需数月才能长出菌落。亚硝化细菌是严格的专性化异养菌，以铵盐的氧化满足其能量的需要。在纯培养的情况下，培养基中若加入有机物质将会抑制亚硝化细菌的生长，但是自然环境中有机物质对亚硝化细菌的影响不如在纯培养中的大。亚硝化细菌对培养基组成、pH值和温度等的改变都敏感[6]。本试验研究碳源、氮源、温度、刺激因子、pH对亚硝化细菌生长及亚硝酸盐富集能力的影响，对亚硝化细菌培养条件进行优化。

1材料和方法

1.1材料

亚硝化细菌从中国矿业大学环境与测绘学院实验室活性污泥中富集分离获得，经鉴定为Nitrosomonas sp.[7]，经不断选育后该菌种亚硝酸盐富集能力较强。

1.2方法

1.2.1培养基亚硝化细菌富集培养基[8]：0.4%（NH4）2SO4 、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4、0.2% NaCl、004% FeSO4，0.5% CaCO3 混匀溶解。调节pH值至8.0～8.2。亚硝化细菌液体培养基：亚硝化细菌富集培养基稀释5倍，即为亚硝化细菌液体培养基，其中NH+4-N浓度为 206 mg/L。

1.2.2亚硝化细菌培养条件优化

1.2.2.1温度选取一定量的长势较好的亚硝化细菌，加入500 mL亚硝化细菌液体培养基，于500 mL摇瓶中，调pH值为8，在15、25、30、35、40 ℃下，110 r/min摇床培养。

1.2.2.2Na2CO3浓度选取一定量的长势较好的亚硝化细菌，加入500 mL亚硝化细菌液体培养基，于500 mL摇瓶中，调pH值为8，分别加入0.1%、0.2%、0.4%，1%Na2CO3，110 r/min，最适温度下摇床培养。

1.2.2.3NH4HCO3浓度选取一定量的长势较好的亚硝化细菌，加入500 mL亚硝化细菌液体培养基，于500 mL摇瓶中，调pH值为8，分别加入0.02%、0.1%、0.2%、0.3% NH4HCO3，110 r/min，最适温度，最适Na2CO3浓度下摇床培养。

1.2.2.4刺激因子（氯化镧）浓度选取一定量的长势较好的亚硝化细菌，加入500 mL亚硝化细菌液体培养基，分别加入0.001%、0.002%、0.004%、0.008%、0.01%、0.02% LaCl3，110 r/min、最适温度、最适Na2CO3浓度、最适NH4HCO3浓度下摇床培养。

1.2.2.5pH值选取一定量的长势较好的亚硝化细菌，加入500 mL亚硝化细菌液体培养基，于500 mL摇瓶中，分别于pH 6、7、8、9、10条件下，110 r/min，最适温度，最适Na2CO3浓度，最适NH4HCO3浓度，最适LaCl3浓度下摇床培养。

1.2.3亚硝化细菌培养方式的改进

1.2.3.1亚硝化细菌的半连续式培养采用最佳培养基，接种亚硝化细菌300 mL菌液分别于1 L三角瓶和1 L量筒中，不断曝气。30 ℃恒温培养38～40 d，每7 d更换新的培养基，每2 d测定其亚硝酸态氮的含量。

1.2.3.2亚硝化细菌的连续式培养取300 mL亚硝化细菌菌体，接种于1 L三角瓶中，加满亚硝化细菌最佳培养基，30 ℃ 连续式培养，每2 d测定其亚硝酸态氮的含量。

1.2.4检测方法[9]亚硝态氮含量的测定采用α-萘胺分光光度法；铵态氮含量的测定采用纳氏试剂分光光度法；硝态氮含量的测定采用酚二磺酸分光光度法。

2结果与分析

2.1温度对亚硝化细菌培养的影响

分别于15、25、30、35、40 ℃下，120 r/min培养亚硝化细菌18 d。从图1可知，随着培养时间的增加，不同温度下亚硝态氮含量都是先增加后趋于平缓。温度过低时，亚硝化细菌的生长代谢缓慢，随着温度升高，亚硝化细菌细胞内的生化反应加快，促进了亚硝态氮的生成。当温度为30 ℃时，亚硝态氮浓度最高，为160.71 mg/L，即此时亚硝化细菌的脱氮能力最强，因此亚硝化细菌培养最佳温度为30 ℃，这与 Hyungseok 的研究结果[10]一致。

nlc202309011518

2.2pH值对亚硝化细菌培养的影响

从图2可知，随着培养时间的增加，不同pH值下亚硝态氮含量都是先增加后趋于平缓。亚硝化细菌适宜在偏碱性条件下生长，pH偏低时，其活性受到影响，随着pH值的升高，亚硝化细菌变得活跃。当pH值为8.0时，亚硝态氮浓度最高，为172.16 mg/L，即此时亚硝化细菌的脱氮能力最强，因此亚硝化细菌培养最佳pH值为8.0，这与廖雪义[11]等的研究结果一致。

2.3Na2CO3浓度对亚硝化细菌培养的影响

亚硝化细菌以无机碳源为唯一碳源，因此培养体系中无机碳源的含量会对亚硝化细菌的生长产生影响。自然界中无机碳主要以CO2、HCO-3、CO2-33种形式存在，不同形式的无机碳源对亚硝化细菌的生长影响有一定影响，原来液体培养基以CaCO3为唯一碳源，由于CaCO3较难溶解，碳源释放不足，因此补加易溶解的Na2CO3以提供更多的碳源供亚硝化细菌生长所需。

从图3可知，随着培养时间的增加，不同浓度Na2CO3下亚硝酸盐氮含量都是先增加后趋于平缓。当Na2CO3浓度为0.2%时，亚硝态氮浓度最高，为171.44 mg/L，即此时亚硝化细菌的脱氮能力最强，因此亚硝化细菌液体培养基中最佳Na2CO3浓度为0.2%。

2.4NH4HCO3浓度对亚硝化细菌培养的影响

以NH+4为氮源最适合亚硝化细菌的生长，即硝化作用效率最高。NH4HCO3不但能提供NH+4形式氮源，且能提供HCO-3形式碳源，有利于亚硝化细菌获得更多形式的碳源。

从图4可知，随着培养时间的增加，不同浓度的NH4HCO3下亚硝酸盐氮含量都是先增加后趋于平缓。当氮源较少时，无法满足亚硝化细菌的生长需要，过多则会对亚硝化细菌有一定的刺激，硝化作用反而受到抑制。当NH4HCO3浓度为0.2%时，亚硝态氮浓度最高，为179.16 mg/L，即此时亚硝化细菌的脱氮能力最强，因此亚硝化细菌最佳NH4HCO3浓度为0.2%，这与杨代金等[12]的研究结果相近。

2.5刺激因子LaCl3对亚硝化细菌培养的影响

LaCl3对亚硝化细菌酶的作用与其浓度有关，当浓度较低时对酶具有变构激活作用，而浓度高时对酶具有抑制作用。在一定的LaCl3含量范围内，亚硝化速率随LaCl3含量的增加而增大。当LaCl3浓度为0.004%时，亚硝态氮浓度最高，为183.12 mg/L，当LaCl3浓度超过0.004%时，反而对亚硝态氮的积累有抑制作用（图5）。

在加入0.2%Na2CO3、0.2% NH4HCO3、0.004% LaCl3的液体培养基中培养亚硝化细菌，pH值8.0，30 ℃，110 r/min培养10 d，每1 d测定亚硝态氮、铵态氮、硝态氮的含量，结果见图6。

从图6可以看出，在最佳培养条件下，随着培养时间的增加，亚硝态氮含量逐渐增加，最高达185.36 mg/L，铵态氮去除率达到92.52%，硝态氮含量始终保持在较低水平，说明经过优化培养后，该亚硝化细菌的脱氮性能较好。

2.6培养方式对亚硝化细菌生长的影响

从图7可以看出，在半连续培养中，随着培养时间的增加，在三角瓶和量筒中进行半连续培养的亚硝化细菌，其脱氮性能总体呈增加趋势。在每次更换培养基之前，亚硝态氮含量逐渐增加。第一次更换培养基前的亚硝态氮最高含量分别为86.04 mg/L和80.11 mg/L，最后一次更换培养基后，亚硝态氮的含量最高，分别达到174.17 mg/L和156.33 mg/L，分别增加了50.60%和48.75%。同时采用三角瓶培养的亚硝化细菌脱氮性能优于量筒培养的。原因可能是：（1）三角瓶底部空间较大，有利于亚硝化细菌生长和营养物质的传递，量筒底部狭小，不利于亚硝化细菌大量繁殖，也不利于营养物质顺利输送；（2）由于亚硝化细菌对氧气需求较低，三角瓶自下而上空间逐渐缩小，阻碍了过多的氧气进入，从而更有利于亚硝化细菌生长。

从图8可知，经过连续式培养，亚硝化细菌的亚硝态氮含量总体呈增加的趋势，最大值达到202.56 mg/L，40 d时亚硝态氮含量为178.08 mg/L，略高于半连续培养的亚硝态氮含量（174.17 mg/L），但连续式培养较半连续式培养操作更方便，同时能够较好地有利于亚硝化细菌菌群数量的增长和繁殖，可为今后亚硝化细菌实验室的扩大化培养提供参考。

3结论

本试验优化后的亚硝化细菌液体培养条件为0.2%NH4HCO3，0.2%Na2CO3，pH值8.0，溫度30 ℃，刺激因子LaCl3最佳浓度为0.004%。在最佳培养条件下，亚硝化细菌富集亚硝态氮能力最高，可达185.36 mg/L，脱氮率最高为92.52%。连续式培养较半连续式培养能更有利于亚硝化细菌菌群数量的增长和繁殖，且更方便。

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[12]杨代金，张穗，王玉军，等. 一株氨氮降解菌的筛选及其降解特性的初步研究[J]. 山东农业科学，2009，3（3）：87-90.

犬精液冷冻保存条件的优化 篇7

1 材料

1.1 试验动物

5只成熟、有生育能力、健康的公犬, 年龄2～6岁。饲喂商品犬粮 (冠能) , 自由饮水, 圈养, 每天自由活动2次。试验开始前, 练习手握法采精。

1.2 药品

三羟甲基氨基甲烷 (Tris) , Promega Corporation U.S.A.公司生产;柠檬酸、葡萄糖、甘油, 北京化学试剂公司生产;新鲜鸡蛋卵黄, 北京农业职业学院畜牧场提供;青霉素钠和硫酸链霉素, 华北制药股份有限公司生产。

2 方法

2.1 精液采集

利用手握法采集犬的精液, 收集第1、第2部分。将采集的精液汇集到一起, 保存在37 ℃水浴中。分成 4 等份, 其中1份作为对照, 3 份分别以1 000 r/min (1组) , 2 000 r/min (2组) , 3 000 r/min (3组) 3种离心条件离心5 min。精液冷冻-解冻 (冷冻温度为-120 ℃, 解冻温度为37 ℃) 后保存在 37 ℃水浴中, 0～6 h 测定精子活力、精子活率、精子畸形率、精子顶体完整率, 对精液质量进行评估。

2.2 精液冷冻保存

2.2.1 精液冷冻稀释液

A液:Tris 2.4 g, 柠檬酸 1.4 g, 葡萄糖 0.8 g, 青霉素钠0.06 g, 硫酸链霉素 0.1 g, 20枚卵黄, 加纯化水至 100 mL。B液:Tris 2.4 g, 柠檬酸 1.4 g, 葡萄糖 0.8 g, 青霉素钠0.06 g, 硫酸链霉素 0.1 g, 甘油12 mL, 20枚卵黄, 加纯化水至100 mL。

2.2.2 精液处理

离心:将汇集的精液分成 3 等份, 分别在 1 000 r/min、2 000 r/min、3 000 r/min 3种离心条件下离心5 min。

稀释平衡:弃掉上层液体 (留下 0.1 mL左右的精清) , 用A液稀释沉淀的精液, 稀释后精液密度为2亿/mL。稀释液与精液的温度相同, 均为37 ℃左右, 应防止温度的突然变化对精子造成损伤。37 ℃水浴5 min后, 加入等体积的B液稀释, 等温稀释后的精液用4层纱布包裹, 置于4 ℃冰箱中降温40 min。

2.2.3 精液冷冻与解冻

在4 ℃环境中将平衡后的精液吸到 0.5 mL 的冷冻管中, 封口, 在液氮罐口降温熏蒸后投入液氮罐中冷冻保存。解冻时将冷冻管从液氮中取出, 室温平衡30 s, 37 ℃水浴解冻。解冻后将精液倒入有盖的小离心管中, 在 37 ℃水浴中保存。第0小时、2小时、4小时和6小时对精液进行质量评估。

2.3 数据统计

试验设4个重复, 采用SPSS统计软件对数据进行统计分析, 并进行多重比较。

3 结果与分析

3.1 离心条件对犬精液冷冻保存后精子活率及精子活力的影响 (结果见表1)

注:同列数据肩标字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 无肩标表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表1可知:0小时时, 1组、2 组、3组的精子活率分别为 (59.5±4.0) %、 (57.8±6.1) %、 (61.3±4.9) %, 差异不显著 (P>0.05) 。精子活率随保存时间的延长明显下降, 保存2 h时, 1组的精子活率显著高于2组、3组 (P<0.05) , 保存6 h时, 3组的精子活率较高 (P<0.05) 。 冷冻-解冻后 (0小时时) 1组、2组、3组的精子活力分别为 (52.9±3.5) %、 (49.5±2.5) %、 (50.8±3.1) %, 差异不显著 (P>0.05) 。随保存时间的延长精子活力明显降低, 保存2 h时, 1组的精子活力显著高于2组、3组 (P<0.05) 。精子活力与活率的变化趋势相似。

3.2 离心条件对犬精液冷冻保存后精子畸形率及精子顶体完整率的影响 (结果见表2)

注:同列数据肩标字母不同表示差异显著 (P<0.05) , 无肩标表示差异不显著 (P>0.05) 。

由表2可知:解冻后 (0小时时) 1组、2组、3组的精子畸形率分别为 (34.4±5.8) %、 (33.4±4.6) %、 (36.9±7.1) %;保存2 h时, 采用2组的离心方式精子畸形率最高;保存6 h时, 采用3组的离心方式精子畸形率最高。精子畸形率随保存时间的延长而升高。解冻后 (0小时时) 1组、2组、3组的精子顶体完整率分别为 (32.5±5.2) %、 (31.3±4.6) %、 (33.5±4.6) %, 差异不显著 (P>0.05) 。3组精子顶体完整率均随保存时间的延长而升高。

4 讨论

试验采用3种离心条件对犬的同一份精液进行处理, 其他条件均相同, 精液解冻后放入37 ℃水浴中保存6 h, 每2 h进行1次精液质量检查。

4.1 离心条件对精子活率和精子活力的影响

精子活率和精子活力均随水浴保存时间的延长而快速下降, 0～2 h最明显。

4.2 离心条件对精子畸形率的影响

冷冻精液和新鲜精液相比, 解冻后精子畸形率明显升高, 新鲜精液精子畸形率<10%, 而解冻后精子畸形率>30%。畸形精子主要是尾部畸形精子和头尾分离的精子增多。

4.3 离心条件对精子顶体完整率的影响

解冻后的精子顶体完整率明显增加, 新鲜精液精子顶体完整率<10%, 而解冻后的3组精子顶体完整率均达到30%左右。随着保存时间的延长精子畸形率也明显增加。精液冷冻和解冻过程中对精子造成了不可逆的损伤, 顶体内含有受精所必需的酶类, 即使有些精子活力未发生变化, 但顶体的破坏最终会导致精子丧失受精能力。

5 小结

冷冻温度为-120 ℃, 解冻温度为37 ℃时, 随保存时间的延长, 精子活力和活率大幅度下降, 精子畸形率和精子顶体完整率显著增加。冷冻温度为-120 ℃, 解冻温度为37 ℃时, 保存0 h, 宜采用1 000 r/min离心5 min的方式;保存2～4 h, 宜采用2 000 r/min离心5 min的方式;保存6 h时, 宜采用3 000 r/min离心5 min的方式。

参考文献

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[2]马毅, 曹斌云, 姬云涛.山羊除精浆冷冻精液的研究进展[J].国外畜牧科技, 2001 (4) :33-35.

传统客家黄酒的发酵条件优化 篇8

黄酒是我国独有的酒类,是世界上最古老的酒类,与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒[1]。客家人自古以来便习惯饮用黄酒,传统客家黄酒是在没有经过灭菌的状态下开放式发酵制取的,在发酵过程中,外界的许多微生物都有可能接入其中。在正常的发酵情况下,黄酒发酵浓醪和多种酵母菌、细菌等微生物互生、共生,互相促进、平衡发酵。然而,有害的微生物如乳酸杆菌、醋酸杆菌及野生酵母等杂菌大量存在时,酿造过程中就会产生过量的乳酸和其他有机酸,致使发酵醪的酸度上升,抑制正常酵母发酵产酒精,当总酸度超过7.5g/L以上,发酵醪的香味和口味就变坏,称为酸败[2]。

引起传统黄酒发酵酸败的原因较多,主要由原料(糯米或者玉米)种类、酒曲使用量、发酵温度、投入配比和操作过程的严密与否有关[3]。本文就对传统的客家黄酒酿造工艺中的主要操作参数p H值、发酵温度、水投加量和发酵时间为研究对象,通过单因数分析研究黄酒发酵醪中的总酸、氨基酸态氮、总糖和酒精度这几个感官目标,为客家传统的黄酒酿造方法提供更加有利的条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原材料:糯米、酒曲、白醋、小苏打。

仪器设备:高压灭菌锅、生化培养箱、无菌工作台。

1.2 实验方法

1.2.1 检测方法

总酸、总糖、p H值、氨基酸态氮、酒精度的测定:参照GB/T 13662-2008黄酒国家标准方法。

1.2.2 发酵工艺流程[4]

糯米→浸泡→蒸饭至大量冒气(用蒸饭柜蒸煮30min)→加水--摊冷→拌曲→发酵→压榨→灭菌(煎酒)→成品(甜酒型)

1.2.3 操作要点

1)糯米的处理粉碎挑选均匀一致的糯米,反复清洗后浸泡,最后沥水,这一步的目的是使原料中的淀粉颗粒充分吸水,后续蒸米的步骤时能使淀粉充分糊化。

2)蒸米用蒸饭柜进行蒸饭,时间为30min。要求蒸出来的米饭松软并且不黏连。

3)冷却、摊冷将蒸熟的米饭摊开,在常温下冷却至55-60℃。

4)拌曲、发酵将自制的酒曲按照一定比例加入到米饭液中并搅拌均匀。然后分别装入坛中进行发酵。

5)压榨经过长期发酵后的酒醪液,虽然已经有黄酒的成和色泽,但酒和酒糟混在一起,不能作为成品。我们采用传统压榨方式进行压榨和澄清,进行固液分离。

6)灭菌灭菌也成为煎酒,是酿造黄酒的最后一道工序,如果掌握不好会使得黄酒变质而功亏一篑,因此需要格外小心。我们利用加热的方法杀灭新制黄酒中的微生物、并使得其中的酶钝化,使黄酒中的成分固定下来,防止黄酒的变质和酸败。

1.3 黄酒的感官评价

本实验根据GB/T13662-2008《传统型黄酒感官要求》的感官评分标准,请7位色觉、味觉、嗅觉等灵敏的评审成员对我们的样品进行评价,得到一致通过的样品结果方可采用。

1.4 实验设计

采取序批实验的方式,利用单因素分析的实验方法,分别改变酿造过程的p H值、发酵温度、水投加量和发酵时间,检测黄酒发酵醪中的总酸、氨基酸态氮、总糖和酒精度,借此来评价在不同条件下黄酒成品的感官、营养指标。

1.4.1 p H值的影响

水的添加量为80%,发酵温度为25℃,发酵时间15天,在起始p H值分别为4、5、6、7、8的条件下,在无菌工作台进行拌曲,后分别装入500ml三角瓶中用6-8层纱布包住瓶口,再分别于恒温箱内保湿发酵,探讨p H值对黄酒发酵的影响。每个实验做三个重复。

1.4.2 发酵温度的影响

发酵时间15天,起始p H值为7,水的添加量为80%,在无菌工作台进行拌曲,后分别装入500ml三角瓶中用6-8层纱布包住瓶口,再分别于20、25、30、35、40℃温度下保湿发酵,探讨发酵温度对黄酒发酵的影响。每个实验做三个重复。

1.4.3 水添加量的影响

发酵温度25℃,发酵时间15天,起始p H值为7,分别加入原料体积分数为40%、60%、80%、100%、120%的水,在无菌工作台进行拌曲,后分别装入500ml三角瓶中用6-8层纱布包住瓶口,再分别于恒温箱内保湿发酵,探讨水的添加量对黄酒发酵的影响。每个实验做三个重复。

1.4.4 发酵时间的影响

起始p H值为7,水的添加量为80%,发酵温度为25℃,在无菌工作台进行拌曲,后分别装入500ml三角瓶中用6-8层纱布包住瓶口,再分别于恒温箱内保湿发酵10、15、20、25、30d,探讨发酵时间对黄酒发酵的影响。每个实验做三个重复。

2 结果与讨论

2.1 p H值的影响

不同的初始p H值条件对酿造的黄酒的影响见图1。如图所示,不同的p H对总酸较小,在p H为4-8的范围内所酿造的黄酒的总酸呈先下降再上升并保持稳定的趋势。p H值小于5时,因受到发酵条件酸度较大的影响,发酵产生的酒体酸度也较大,随后酒体随p H增大而酸度增大,直到p H=7时,黄酒的总酸最大,随后有轻微下降;黄酒中的氨基酸态氮则是随p H值变大而增大,直到p H7时至最大,随后下降。这表明,p H=7的时候是最适产氨基酸态氮的;黄酒中的总糖随着p H值的增大而减少,直到p H等于6时保持稳定,这说明为了保持甜度应当适当降低酿造过程中的p H值;黄酒的酒精度在p H4-8时呈上升趋势,说明p H越大,所酿黄酒的酒精度越高。

2.2 发酵温度的影响

发酵温度对酿酒至关总要,微生物都有适宜的生长温度,温度过高或者过低都会影响微生物的生长和酶的活性,不同的发酵温度对酿造的黄酒的影响见图2。如图所示,总酸是随着发酵温度温度的升高而增加的,这应该是因为温度高了,酒精会进一步氧化变成乙酸;而氨基酸态氮则是在酿造温度从20℃升高到25℃时有小程度的下降,但是温度从25℃增高到40℃是氨基酸态氮都呈上升趋势,因此总体而言黄酒产生的氨基酸态氮是随着酿造温度的增加而增加的,这可能是因为蛋白酶最适宜的温度是38-45℃[5],温度低不利于蛋白酶的作用,所以产生的氨基酸态氮含量较低,随着温度升高,蛋白酶开始发挥作用,产生的氨基酸态氮开始增加;总糖的产生在不同酿造温度下呈现波动趋势,在酿造温度为30℃的时候产生的总糖浓度最高,30-35℃酿造的黄酒糖分较高;如图2所示,酒精度在温度为20°到25°时上升,温度从25到40°时开始下降,总体来说,酿造温度为25-30℃时是产生酒精的合适发酵温度。

2.3 水添加量的影响

成品黄酒中含水量一般都超过80%,是黄酒中很重要的组成部分。水可以作为酶和营养物质的溶剂,所有的生化反应都必须在水中进行,水中含有的微量元素和金属离子也是微生物生长的必要组分。水的存在还可以调节黄酒的p H值并保持黄酒液的胶体稳定[6]。不同的水添加量对酿造的黄酒的影响见图3。如图所示,水的添加量从40%到60%时,黄酒的总酸浓度有所升高,水的添加量从60%到80%时总酸大弧度下降,水的添加量从80%到120%时总酸浓度又有所回升,从总体看总酸随水的添加量的增加而减少;氨基酸态氮的变化趋势与总酸类似,在水的添加量为40%到60%时增加,水的添加量从60%到120%时氨基酸态氮减少,结果表明,产生氨基酸态氮的最适宜的水添加量为60%左右;水添加量对黄酒酿造中总糖的产生量影响也呈现先增加后降低的趋势,水量为40%到80%时增加,水的添加量从80%到120%时又减少,从图可以说明水的添加量过少和过多对总糖都有影响,最佳的水的添加量为80%左右;水添加量直接影响着成品黄酒的酒精度,酒精度与水添加量呈准确的反比关系。这都表明了加水量在黄酒酿造中起着非常重要的作用,系统中含水比例合适的时候,微生物和各种元素都有了适宜的溶剂,可以快速反应作用;当水量过少时,微生物过于聚集无法完全发挥作用,水量过多时,溶液被稀释导致各种微生物与原料的接触机会和接触面都大大降低,直接导致了反应程度的降低,并且也直接导致乙醇的体积分数下降。

2.4 发酵时间的影响

不同的发酵时间对酿造的黄酒的影响见图4。如图所示,总酸的浓度随着发酵时间从10天增加到25天的波动不大,然而发酵时间增加到30天时,总酸的产生量突然大幅度增加,这有可能是因为发酵前期产酸菌还没有大量繁殖,时间长了之后产酸菌开始大量产生酸味物质导致总酸剧烈增加;氨基酸态氮浓度在发酵的10天到15天时减少,15天到30天时开始产生大弧度增加,可以看出氨基酸态氮的总体趋势是随着时间的增加而增加的;总糖的产生量反而随着时间的增加而减少,发酵的钱20天总糖下降较快,然后趋于稳定;酒精度在发酵时间为10天到25天的时候呈线性增加趋势,25天后有所下降。

由于黄酒的酿造是一个复杂的体系在发挥作用,一般分为前酵阶段和后酵阶段[7]。前酵阶段主要是在各种酶的作用下发生淀粉糖化作用并且积累酒精,这个阶段会消耗较多的氨基酸和糖类,因此发酵时间较短的时候氨基酸态氮和总糖都在下降,酒精度增加;后酵阶段主要进行黄酒风味物质的积累,这就包括氨基酸态氮和芳香类的物质的合成,因此此时氨基酸态氮开始大幅度增加。

2.5 传统客家黄酒的适宜发酵条件

根据前面的单因素实验分析,我们得出传统科加黄酒的适宜发酵条件见表1。如表1所见,我们可以得出结论,最佳操作条件应该是在p H=7左右、水添加量为80%左右,发酵温度30-35℃、发酵20天,这个条件下所酿造的传统客家黄酒的风味应该是最好的。

3 结语

本文通过单因素实验,研究了传统客家黄酒的适宜发酵条件。本研究结果明,最佳操作条件应该是在p H=7左右、水添加量为80%左右,发酵温度30-35℃、发酵20天,此时制得的黄酒从各种指标来看风味应该较好,而且该工艺发酵时间较短,在实际生(产中可进一步推广应用。

参考文献

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[4]陈细丹,屠小夫,毛青钟,周立平.传统福建粳米红曲黄酒的工艺技术和质量控制[J].酿酒,2004(2):67-71.

[5]赵梅,冷云伟,李鹏.黄酒发酵过程分析及关键点的控制[J].江苏调味副食品,2009,26(5):30-34.

[6]顾国贤.酿造酒工艺学[M].2版.北京:中国轻工业出版社,2013:472-494.

优化工艺条件, 提高苯乙烯收率 篇9

锦州石化公司苯乙烯装置受阻聚剂阻聚能力、操作条件、设备运行状态等因素的制约, 苯乙烯产品收率在同行业处于较低水平, 与国内先进水平相比有较大差距。经过攻关小组的认真研究和讨论, 认为若要采取一些技术措施或改造, 提高苯乙烯收率是可行的。

1 查找出的问题

技术攻关小组通过通过反复试验、技术分析, 认为装置存在以下问题。

1.1 阻聚剂阻聚效果较差

阻聚剂的阻聚效果决定了焦油闪蒸系统的闪蒸温度, 温度的高低又影响着焦油中苯乙烯的含量, 苯乙烯装置原阻聚剂EC-3351A由于阻聚效果不理想, 为防止或降低苯乙烯的聚合, 就要加大焦油外甩量, 使焦油产率居高不下;焦油中苯乙烯含量不能控制太低, 否则焦油的流动性太差, 易堵塞管线;焦油闪蒸系统不能在较高温度下运行, 达不到设计值, 焦油中苯乙烯含量较高, 又会加大苯乙烯损失, 造成苯乙烯产品收率较低。

1.2 原阻聚剂冬季易结晶, 影响装置稳定运行

寒冷的冬季给苯乙烯生产带来一定难度, 尤其是原阻聚剂EC-3351A低温下容易发生结晶。一旦结晶, 就会影响装置的稳定运行。装置自2007年11月开工以来, 阻聚剂EC-3351A多次发生结晶现象, 造成阻聚剂进料管线结晶堵死, 进料管线被迫更换, 不但给装置正常生产带来安全隐患, 也造成苯乙烯产品收率大幅下降。

1.3 脱氢反应正压操作, 转化率低, 副产焦油量高

由于脱氢尾气压缩机故障率高, 始终无法正常运行, 导致脱氢反应系统始终正压状态生产, 装置负荷较低, 乙苯转化率低, 苯乙烯产率达不到国内先进水平。由于系统正压生产, 为了防止苯乙烯在反应器内发生聚合, 污染催化剂, 通常会选择较低的反应温度, 造成反应转化率下降;而由于正压状态下不能加入急冷水, 使反应产物 (脱氢液) 不能由高温状态快速进入安全温度, 使脱氢液和脱氢尾气中聚合物含量增加, 导致副产物焦油产量增加, 影响苯乙烯产品收率。

2 技术措施和改造方案

2.1 选择新型高效阻聚剂

通过对各种阻聚剂阻聚方案和阻聚效果的比选, 认为具有自主知识产权的国产阻聚剂BL-628D具有高效阻聚性能, 而且具有分散效果, 能够把结垢物分散到液相中, 能够提高换热器的运行效果, 保证苯乙烯精馏塔釜更好的运行。BL-628D为油基性介质, 不结晶, 冬季生产时可避免因阻聚剂结晶带来的隐患。经过锦州石化公司研究院对新型阻聚剂BL-628D和EC-3351A的小试评价, 认为阻聚剂BL-628D阻聚效果较好, 完全可以满足大装置实际生产的需要。

2.2 改变阻聚剂的加入量和加入方式

为了充分发挥阻聚剂的阻聚效果, 采用阻聚剂生产厂家的专利应用技术, 在焦油闪蒸罐增加1处阻聚剂注入点, 同时改变阻聚剂的加入量和加入配比, 使阻聚剂达到最佳的阻聚效果。利用4月份装置停产期间, 在焦油闪蒸循环线上新增加一条DN15 PN2.5的阻聚剂注入管线。生产工艺及阻聚剂注入流程见图1。攻关前后阻聚剂配比及加入量的比较见表1。

2.3 提高焦油闪蒸温度, 优化苯乙烯精馏系统操作条件

阻聚剂BL-628D的良好阻聚效果, 为优化苯乙烯精馏系统操作条件打下基础。降低粗苯乙烯塔温度可以减少焦油产量, 提高精苯乙烯塔和焦油闪蒸罐温度可以降低焦油中苯乙烯含量。在实际生产中锦州石化对焦油闪蒸温度进行平稳率考核, 要求平稳操作, 充分发挥BL-628D的阻聚效果。应速度;更换振幅测量探头和前置器, 消除振幅误报连锁故障, 使尾气压缩机实现长周期运行。脱氢反应系统实现负压生产, 不仅使乙苯的转化率提高了, 还降低了苯乙烯的高温高压聚合速度。

3 攻关结论

3.1 焦油中苯乙烯含量显著下降

自系统注入BL-628D后, 闪蒸系统开始提温, 从图2看出提温后, 焦油中苯乙烯含量逐渐下降, 下降幅度较大, 现系统稳定在120℃, 焦油中苯乙烯含量控制在10%左右, 完全达到了降低焦油产量, 提高苯乙烯产品收率的目的。

3.2 焦油产率显著降低

从表3中可以看出, 技术攻关前后, 焦油中苯乙烯含量由使用前的26%下降到10%以下, 焦油产率由攻关前的40.3kg/t SM下降至9.3kg/t SM, 从而苯乙烯的产品收率也得到了提高。

3.3 苯乙烯收率显著提高

通过现场实地调研、技术交流和工艺改造, 应用新型高效阻聚剂, 调整加料位置和阻聚剂配比;提高焦油闪蒸温度, 优化苯乙烯精馏系统操作条件;消除设备故障, 反应系统负压生产, 提高反应温度及降低水烃比等措施, 达到了降低焦油产率, 提高苯乙烯产品收率的目的。焦油产率由攻关前的40.3kg/t EM下降至9.3kg/t EM, 苯乙烯收率由攻关前的93.09%提高至95.95%, 使锦州石化公司苯乙烯装置苯乙烯产品收率位列国内同行业先进水平。

摘要：由于苯乙烯装置工艺路线、装置负荷以及所加阻聚剂的种类不同, 苯乙烯的收率也不尽相同。锦州石化公司苯乙烯装置的苯乙烯收率处于相对较低水平。通过技术攻关, 选择新型高效阻聚剂、改变阻聚剂的加入量和加入方式、优化苯乙烯精馏系统操作条件, 使阻聚剂效果好, 苯乙烯产率高, 焦油产率低, 焦油含量乙烯产品收率完全达到要求。

关键词：苯乙烯,阻聚剂,焦油

参考文献

[1]上海石化研究院开发异丙苯新型催化剂[J].精细石油化工进展, 2002 (07) .

[2]王玉瑛.异丙苯法制苯酚的催化技术[J].精细石油化工进展, 2004 (06) .

条件优化 篇10

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试细胞为Marc-145细胞 (来自中国动物疫病预防控制中心) 。供试培养基为DMEM培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 Marc-145细胞传代培养。

取生长良好的转瓶或方瓶细胞, 倒掉培养液, 加入少量PBS洗液, 沿瓶壁转动, 清洗带出细胞代谢废物[3], 倒掉PBS洗液, 倒入适量预热好的消化液, 沿瓶壁转动, 使其充分接触长有细胞的瓶壁, 静置, 待瓶壁变的模糊, 像起雾状即可 (若是转瓶细胞需待瓶壁上出现透亮细线状方可) 。加入事先准备好的已经加好血清、双抗、泰勒、调好p H值的DMEM适量, 摇瓶, 然后将瓶内的液体分装到各子瓶中, 上架, 培养48 h后挑选生长状态良好的细胞继续传代[4]。

1.2.2 影响Marc-145细胞传代培养的各单因素试验。

影响细胞传代培养的因素主要包括复苏温度、血清浓度、生长液p H值、培养温度、消化液浓度、传代比例等。针对这几个因素, 分别在保持其他因素相同的条件下进行单因素试验, 考察各因素对Marc-145细胞的生长状态的影响, 选择最佳的细胞传代条件。

(1) 复苏温度对Marc-145细胞传代培养的影响。取5支冻存种细胞的冻存管, 立即放入25、30、35、37、40℃的水浴中至彻底融化后接入5个小方瓶中, 编号为1~5, 分别加入p H值为7.2、血清含量为10%的DMEM生长液20 m L, 置于37℃的CO2培养箱中培养4~6 h后换掉1次生长液, 培养48 h后取出放置倒置显微镜下观察。

(2) 血清含量对Marc-145细胞传代培养的影响。取一细胞生长状态良好的大方瓶细胞, 经消化, 加入p H值为7.2的DMEM液100 m L, 摇匀, 平均分装到5个小方瓶里, 编号1~5, 向其中各加入2%~10%的新生牛血清后, 置于37℃的CO2培养箱中, 培养48 h后观察细胞生长情况。

(3) 生长液p H值对Marc-145细胞传代培养的影响。取1个细胞生长状态良好的大方瓶, 经消化, 加入血清含量为10%的DMEM生长液50 m L摇匀, 分装到5个小方瓶中, 调节p H值分别为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6, 置于37℃的CO2培养箱中培养48 h后观察, 。

(4) 培养温度对Marc-145细胞传代培养的影响。选取培养48 h, 细胞生长状态良好的母瓶细胞, 经消化, 加入p H值为7.2、血清含量为10%的DMEM生长液20 m L摇匀, 分装到5个小方瓶中, 放置温度分别为25、30、35、37、40℃的CO2培养箱中, 培养48 h后观察。

(5) 消化液浓度对Marc-145细胞传代培养的影响。选取培养48 h, 细胞生长状态良好的中瓶细胞5瓶, 经37℃预热浓度分别为0.10%、0.20%、0.25%、0.40%、0.50%的消化液消化时间2 min后, 加入p H值为7.2、血清含量为10%的DMEM生长液20 m L, 摇匀, 分别倒入10 m L至5个小方瓶, 放入37℃的CO2培养箱中, 培养48 h后观察。

(6) 传代比例对Marc-145细胞传代培养的影响。选择细胞致密单层的细胞大方瓶6瓶分别标注瓶号1~6号进行传代, 经消化液浓度为0.25%消化后加入p H值为7.2、血清含量为10%的DMEM生长液20、30、40、50、60、70 m L, 培养环境为37℃的CO2培养箱。将1~6号母瓶按1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7的传代比例将传代生长液分到1-1、1-2, 2-1、2-2、2-3, 3-1、3-2、3-3、3-4, 4-1、4-2、4-3、4-4、4-5, 5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6, 6-1、6-2、6-3、6-4、6-5、6-6、6-7的子瓶中, 培养48 h后, 观察各子瓶, 综合同一母瓶传出的子瓶细胞生长情况。

2 结果与分析

2.1 复苏温度对Marc-145细胞传代培养的影响

从表1可以看出, Marc-145细胞复苏温度从25℃增至37℃的过程中, 细胞的致密度不断提高, 死细胞数量也越来越少。然而, 当温度进一步上升到40℃时, 死细胞数量开始增加, 细胞形态逐渐变差。分析其原因, 可能是复苏温度影响了细胞代谢速度, 复苏温度过低会导致细胞代谢速度减慢, 分裂速度下降, 从而影响某些细胞摄取生长液的能力。而复苏温度偏高, 虽然会促使细胞代谢速度加快, 但也容易引起细胞死亡。通过该单因素实验结果可初步判断, 设置复苏温度为37℃, 可以使Marc-145细胞进行最佳传代培养。

注:+表示显微镜下细胞铺满视野的比例。

2.2 血清含量对Marc-145细胞传代培养的影响

从表2可以看出, 随着血清含量的升高, 细胞数量越来越多, 而且贴壁生长状态也越来越好。当血清含量为8%时, 细胞在小方瓶中的生长状态已经达到最高水平。这表明血清中可能含有维持细胞生长、促进细胞分裂的因子存在, 这些因子含量越高, 越有利于细胞生长。但是, 考虑到实际生产中生产成本的制约, 以及实际生产中细胞逐渐老化的因素, 所以采取血清含量10%作为Marc-145细胞传代培养的最适条件。

注:-表示视野中看不到细胞, +表示视野中细胞致密度。下同。

2.3 生长液p H值对Marc-145细胞传代培养的影响

从表3可以看出, 当p H值为6.8, 即细胞在偏酸性环境中生长时, 死细胞较多, 而且细胞形态不好, 由此可见该p H值影响了细胞的正常分裂。随着p H值逐渐升高, 死细胞数量减少, 而且细胞形态也变好。细胞在分裂初期, 经过延迟期进入对数期, 在对数期会不断排出CO2, 而导致生长液p H值下降, 所以在进行细胞培养时, 最初生长液p H值不宜偏低。研究表明, 多数细胞适于在p H值7.2~7.4条件下生长, 且一般的原代细胞对碱性的耐受性比酸性差[5], 所以过高的p H值环境不利于正常的细胞分裂。故在进行细胞传代培养时, 可选择p H值7.2的生长环境, 作为Marc-145细胞传代培养的最适酸碱度。

2.4 培养温度对Marc-145细胞传代培养的影响

从表4可以看出, 细胞传代培养温度为25℃时, 细胞基本不生长, 少量贴壁后维持原样, 还有大量死细胞漂浮于液体中, 细胞形态不佳。30℃时, 细胞贴壁比较好, 但生长分裂缓慢, 液体存在少量死细胞, 细胞形态不佳。35℃时, 细胞贴壁较好, 生长较快但形态不佳。37℃时, 48 h时细胞已形成致密单层, 形态较好。40℃时, 48 h细胞形成致密单层, 形态正常但存在少量死细胞。由此得出, 37℃为Marc-145细胞传代培养的最佳温度。

2.5 消化液浓度对Marc-145细胞传代培养的影响

从表5可以看出, 在细胞传代培养过程中, 若消化液浓度过低, 消化2 min后母瓶细胞脱落少, 导致传代效果差, 需要延长消化时间使消化彻底, 但消化耗时多影响生产进度, 实际生产中不可取。若消化液浓度过高, 消化时间太短则来不及操作, 并且消化液成分主要为胰酶, 消化时间过长会对细胞产生破坏性的作用, 所以过高的消化液浓度, 虽然消化快, 但也很容易造成细胞损伤。因此, 选取最佳消化液浓度为0.25%作为Marc-145细胞传代培养的最适条件。

2.6 传代比例对Marc-145细胞传代培养的影响

从表6可以看出, 在细胞生长致密的情况下, 传代比例过低, 会导致子瓶细胞数量过多, 而生长液供应不足, 导致细胞因营养缺乏而出现死亡。而传代比例太高, 会导致子瓶细胞密度降低, 以致在培养48 h后, 子瓶细胞致密度依然不适合作为母瓶接着传代。综合试验结果, 以及考虑到生产中母瓶细胞没有试验用方瓶母细胞生长状态好, 所以生产中在转瓶细胞生长较好的情况采取1∶3的传代比例作为Marc-145细胞传代培养的最适条件。

3 结论与讨论

本文研究了影响Marc-145细胞传代培养的几个主要因素, 最终试验结果表明:复苏温度为37℃、血清浓度10%、生长液p H值7.2、培养温度37℃、消化液浓度0.25%、传代比例1∶3, 在这样的传代培养条件下, 获得的Marc-145细胞状态最佳。然而, 在生产中还有很多不可预见的因素, 比如细胞在传代中的老化现象[6], 生产中的污染问题等。因此, 以上试验条件并不一定适用于所有类似细胞传代培养, 其所得到的结论是在一定的原辅材料下试验得出的[7], 如若改变生产原料来源、生产厂家不同, 均可能需要重新设计试验, 以寻找最优的细胞培养条件。

参考文献

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[6]胡野, 凌志强, 单小云, 等.细胞凋亡的分子医学[M].北京:军事医学科学出版社, 2002.

响应面法优化香菇液体发酵条件 篇11

关键词：响应面法；液态发酵；条件优化；生物量

中图分类号： TQ920.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0200-04

香菇（Lentinula edodes）别称香蕈、香菌等，分类上属担子菌门层菌纲伞菌目侧耳科香菇属[1]，是世界著名食用菌之一。它不仅肉质肥厚脆嫩，香气独特，而且具有很高的药用和保健价值[2-4]。我国是世界上香菇人工栽培最早的国家，也是最大的生产国。我国对香菇液态发酵工艺的研究虽有报道，但对其发酵条件的研究大多停留在单因素试验方面[5-7]，很少研究香菇液态发酵过程中各因素之间的交互作用。响应面法已被广泛应用于生物过程的优化[8-9]，但在香菇液态发酵条件研究方面报道较少。前期研究利用意杨下脚料作为主要碳源培养获得高产香菇菌种（香菇933），并研究出该香菇菌种液态发酵培养基的适宜配方，在此基础上为进一步提高香菇产量和质量，本试验利用响应面法对其液态发酵条件进行优化，找出适合香菇菌丝生长的最佳培养条件，为香菇液体菌种培养和规模液态发酵生产研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 香菇933菌种，由江苏食品药品职业技术学院省级食品微生物工程实验室筛选提供。

1.1.2 主要仪器 ZQZY-HB型全温振荡培养箱，上海知楚仪器公司生产；LDZ5-2型高速离心机，北京京立离心机有限公司生产，JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎仪，厦门精密仪器有限公司生产。

1.1.3 培养基 （1）母种和活化培养基：马铃薯200 g/L（煮汁）、琼脂20 g/L、葡萄糖15 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1 g/L、KCl 0.5 g/L、pH值自然。（2）液体种子和发酵培养基：蔗糖20 g/L、酵母膏10 g/L、MgSO4 1 g/L、KH2PO4 3 g/L、KCl 0.5 g/L、初始pH值5～6。

1.2 方法

1.2.1 种子液的培养 取500 mL的三角瓶，加入100 mL液体种子培养基，经121 ℃高压蒸汽灭菌25 min，冷却后接入蚕豆大活化后的斜面香菇菌种块，在转速为160 r/min的条件下24 ℃恒温振荡培养5 d，得到带有细密菌丝球的种子液。

1.2.2 菌丝体生物量的测定 将待测香菇菌丝发酵液放于离心机中，设定转速为4 000 r/min，离心15 min，上清液用于多糖提取。用去离子水洗涤沉淀4次，置于60 ℃干燥至恒重，即得菌丝体生物量。

1.2.3 发酵液及香菇菌丝体总粗多糖的测定[10-11] 取上述发酵上清液加4倍体积95%乙醇，于4 ℃下静置24 h，在 5 000 r/min 下离心15 min，沉淀用无水乙醇洗涤、低温干燥，得到发酵液粗多糖。将上述“1.2.2”称重后的香菇菌丝体超声波粉碎，加入约20倍体积的蒸馏水，98 ℃抽提3 h，过滤并将滤液浓缩，用4倍体积95%乙醇静置24 h，在5 000 r/min下离心15 min，去上清液，沉淀用无水乙醇洗2次，低温干燥，即为香菇菌丝粗多糖。发酵液粗多糖和香菇菌丝粗多糖混合后称重即得总粗多糖。

1.2.4 香菇液体发酵单因素试验设计 （1）接种量处理：将装有100 mL液体发酵培养基的 500 mL 三角瓶，经121 ℃高压蒸汽灭菌25 min，按不同接种量（体积比）将培养好的液体菌种接种到发酵培养基中，在转速为160 r/min的条件下 24 ℃ 振荡培养3 d，每处理做3次平行试验，计算发酵液生物量和总粗多糖的平均值，下同。（2）pH值处理：用NaOH或HCl调节初始发酵液的pH值，设置不同的pH值，取100 mL装入500 mL的三角瓶中，灭菌方法同（1），按12%（体积比）的接种量将培养好的液体菌种接到发酵培养基中，在转速为 160 r/min 的条件下24 ℃振荡培养3 d。（3）温度处理：按（1）的方法量取液体发酵培养基并灭菌，将液体菌种按12%（体积比）的接种量接种，设置不同温度，在转速160 r/min条件下恒温培养3 d。（4）转速的处理：按（1）的方法量取液体发酵培养基并灭菌，将液体菌种按12%（体积比）的接种量接种，设置不同转速（r/min）进行培养，24 ℃恒温培养3 d。

1.2.5 香菇液态发酵工艺的优化设计 选择接种量、接种温度、转速3个因素对生物量和总多糖有显著影响的因素进行响应面试验设计，通过Design Expert软件对试验数据进行回归分析，预测香菇液态发酵最优工艺参数。

2 结果与分析

2.1 接种量对香菇液态发酵的影响

接种量的大小与该菌在发酵液中生长繁殖的速度有关。接种量大，种子进入发酵液后适应快，可以缩短发酵繁殖至高峰所需时间，种子液中含有大量的水解酶，使产物合成速度加快。大接种量往往使菌种生长过快，造成营养基质缺乏或溶解氧不足而不利于发酵；接种量不足，则会引起发酵前期菌丝量少、菌体生长缓慢，使发酵周期延长，还可能产生菌丝团，导致发酵异常等。不同的接种量（3%～24%）对香菇液态发酵培养的生物量及粗多糖产量的综合影响结果见图1。结果表明，在接种量3%～12%范围内，香菇生物量与总粗多糖产量均随着接种量的增加而增加，增长趋势显著，而在接种量大于12%以后，生物量及粗多糖产量增幅不大，在产物不增加情况下增加接种量意味着增加发酵成本，因此初步确定香菇液态发酵适宜接种量为12%。

nlc202309022338

2.2 初始pH 值对香菇液态发酵的影响

pH值的高低直接影响菌丝体的新陈代谢，导致微生物细胞膜的电荷变化，影响代谢过程中酶的活性，从而影响生物量和多糖代谢产物。本试验设计初始发酵液不同的pH值3～7.5对香菇生物量及粗多糖产量的影响（图2），结果表明，当发酵初始pH值为5.0时，香菇菌丝体生物量与粗多糖产量均达到最大值，分别为17.58、1.76 g/L。当pH值高于5.0时生物量与粗多糖产量下降明显，表明香菇菌丝适宜生长在偏酸性环境，pH值5.0是香菇液态发酵较适pH值。

2.3 发酵温度对香菇液态发酵的影响

试验以不同发酵温度9～36 ℃进行发酵培养，测定对香菇生物量及粗多糖产量的影响（图3），结果表明，当发酵温度从 9 ℃ 升至24 ℃时，香菇生物量与粗多糖产量均随着温度升高而增加，在24 ℃时粗多糖产量最高，为1.77 g/L。当发酵温度超过24 ℃时，粗多糖产量有下降趋势；当发酵温度为27 ℃时，生物量最高，为17.57 g/L。温度高于27 ℃，生物量开始下降，因温度过高会导致微生物代谢加快，自身物质消耗过快，生物量、粗多糖产量呈下降趋势；高温发酵生物热增速较快，可促进菌种老化，从而影响生物量增加和粗多糖的生物合成。初步选定香菇菌液体培养适宜发酵温度为24 ℃。

2.4 摇床转速对香菇液态发酵的影响

不同转速（120～200 r/min）条件下，液态发酵试验结果（图4）表明，当转速从120 r/min升至160 r/min时，香菇生物量及香菇粗多糖产量呈上升趋势；当转速达到160 r/min时菌丝体生物量和粗多糖产量均达最高，分别为17.45、1.73 g/L。转速超过160 r/min时，菌丝生物量及粗多糖产量略有下降趋势，因增加转速虽然有利于增加溶氧和通气效果，但增加了菌丝球相互间的摩擦和剪切作用，加大对菌丝球的机械刺激，从而影响生物量的增加。初步确定适合香菇菌丝生长的摇床转速为160 r/min。

2.5 香菇液体发酵条件响应面法分析

从单因素试验结果看出，香菇粗多糖产量与菌丝生物量变化趋势较为一致，因此优化液态发酵条件时选择菌丝生物量作为量化指标，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验，选取对生物量影响较大的接种量、pH值和培养温度3个因素作为响应面法的试验因素，分别以A、B、C表示，每个因素的低、中、高试验水平分别以-1、0、1进行编码，试验因素水平编码如表1所示，Box-Behnken 设计方案及试验结果见表2。为研究影响因素间的曲面效应，利用Design Expert软件对表2数据进行多元二次回归拟合，所得到的二次回归方程的等高线及响应曲面见图5至图7。结果表明，在所选因素水平范围内，均有最大响应值出现。

图5结果表明，接种量和pH值对生物量的影响，响应面图可以看出接种量曲面和pH值曲面变化幅度均较明显，说明接种量和pH值对生物量的影响较为显著，与二次回归拟合方差分析结果一致，响应面的最高点同时也是等高线中的最小图形的中心点。从等高线图可以看出，图形接近圆形，说明pH值和接种量交互作用不显著。

图6结果表明，培养温度和pH 值对生物量的影响，可以看出培养温度曲面变化幅度不大，pH 值曲面变化幅度较大，说明pH 值对生物量的影响较为显著，当pH 值和培养温度较低或较高时，都会降低香菇菌丝的生物量。从等高线图可以看出，培养温度和pH 值交互作用相对显著。响应面的最高点同时也是等高线中的最小椭圆的中心点。

接种量和培养温度对菌丝生物量的影响见图7。从图7可见，培养温度曲面变化幅度不大，接种量曲面变化幅度较大，说明接种量对生物量的影响较为显著，对同一等高线椭圆曲线分析，接种量变化很小区域需要培养温度较大区域的变化，培养温度和接种量对菌丝生物量的交互影响相对显著。

2.6 最佳培养条件的预测和试验验证

根据Design Expert建立的数学模型进行参数的最优化分析，得出香菇液态发酵的优化条件为接种量12.42%、pH 值4.96、发酵温度24.11 ℃。在此条件下，香菇生物量理论上可达17.58 g/L。为验证该法的可行性，采用上述优化发酵条件进行香菇液态发酵试验，为方便试验操作，将上述优化发酵温度调整为24 ℃，在单因素试验测得的最适转速 160 r/min 条件下，按照优化条件做3组平行试验，测得香菇菌丝生物量实际平均值为17.76 g/L，试验结果与模型预测相差1.02%。

3 讨论与结论

以菌丝生物量和粗多糖产量为量化指标，对香菇液态发酵的接种量、培养温度、pH值、转速进行单因素试验，在此基础上通过响应面优化发酵试验，建立了接种量、pH值、培养温度3个因素和响应值菌体生物量之间的数学模型，研究用响应面法确定香菇液态发酵条件的可行性。结果表明，建立的模型的回归效果显著，能很好地预测菌丝体的生物量。确定优化发酵条件接种量为12.42%、pH 值为4.96、发酵温度为 24.11 ℃，按照此优化条件实测菌丝体生物量为17.76 g/L，与理论值相差1.02%。表明采用响应面法对试验数据进行回归分析和条件优化能很好地预测香菇液态发酵条件，具有一定的可行性和实用价值。

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贝壳强化除磷条件的优化 篇12

1 贝壳和硅藻土的简介及应用

贝壳主要有碳酸钙组成, 大约占贝壳的95%左右, 其他为少量的有机贝壳素以及微量元素钾、钠、镁等[3]。贝壳不但含有大量钙盐, 还拥有天然多孔表面, 是微生物附着的理想载体[4]。硅藻土是一种硅质生物沉积岩, 或者说是一种硅藻遗体沉积物, 其矿物成分主要是蛋白石Si O·H2O及其变种[5]。

2 材料与方法

2.1 贝壳的获取及前期处理

实验采用的贝壳原料是在当地海产品加工厂获得的, 将贝壳用清水清洗后, 在阳光下自然干燥。将干燥的贝壳处理成1cm2的小块, 用不锈钢研磨机将准备好的贝壳研成粉末状待用。原水样取自大连开发区大开污水厂。

2.2 贝壳粉溶液的配制

取浓度为36%-38%的浓盐酸溶液1.72ml, 加入70ml的蒸馏水中, 缓慢加入贝壳粉, 直至饱和。

2.3 硅藻土溶液的配制

取2.5g硅藻土用容量瓶配成100ml的硅藻土溶液。

3 实验结果

向12支试管 (编号A-L) 中分别加入100ml污水。实验分为1、2、3三个大组, A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L十二小组。第一组中每个分试管均加0.1ml贝壳粉溶液, 第二组中每个分试管均加1ml贝壳粉溶液, 第三组中每个分试管均加2ml贝壳粉溶液。A、E、I试管中均不加硅藻土溶液, B、F、J试管中均加入0.1ml硅藻土溶液, C、G、K试管中均加入1ml硅藻土溶液, D、H、L试管中均加入2ml硅藻土溶液。吸取Na OH溶液调节p H为11-12, 然后分别测定HRT为1h、3h、5h、7h、9h的出水TP浓度, 并计算去除率, 结果如图所示。

图1显示没有加入硅藻土的A组去除率明显低于加硅藻土的其他组分, 表明硅藻土对磷的去除有促进作用, 加入2ml硅藻土的D组去除率最高, 很明显的看出时间越长去除率越高, 但是3小时之后去除率的升高趋势并不明显, 已经趋于平稳, 所以三小时为最佳时间。

图2显示没有加硅藻土的E组去除率明显低于其他加硅藻土的组分, 表明加入硅藻土有助于实验中磷的去除, 加入2ml硅藻土溶液的H组磷的去除率最高, 并且时间越长去除率越高, 但3小时后去除率升高缓慢趋于平稳, 所以3小时为最佳时间。

图3显示没有加入硅藻土的I组去除率明显低于其他加入硅藻土的组分, 这表明加入硅藻土对磷的去除有促进作用, 加入2ml硅藻土溶液的L组磷的去除率最高, 也可以看出时间越长去除率越高, 但3小时后变化并不明显, 所以3小时为最佳时间。

综合三个图来看, 加入2ml贝壳粉溶液的第二组去除率均高于第一组和第三组, 每组的图均表示加入2ml硅藻土溶液去除率最高, 3小时为最佳时间。

4 结论

贝壳可以用作污水除磷, 并且与硅藻土同时加入会使磷的去除率升高, 也就是硅藻土的加入可以优化贝壳除磷, 3小时时为最佳时间, 贝壳粉溶液为2ml为最佳投入量, 2ml硅藻土溶液为最佳投入量, 也就是每100ml污水中贝壳粉溶液和硅藻土溶液投入分别为2ml静置3小时最优。

摘要：近年来污水中磷的去除一直是人们关注的问题, 来自生活污水和工业废水的磷, 如果不加以去除直接排入水体, 将会造成水体富营养化;若进行灌溉的水中含磷太多则会造成庄稼贪青倒伏。多年来, 研究人员已经研究出了很多办法来去除废水中的磷。目前, 有采用贝壳作为填料和贝壳粉作为除磷剂的除磷方法。本文就贝壳强化除磷做了进一步研究, 在加贝壳粉的同时加入少量硅藻土, 进一步优化除磷条件。实验分为1、2、3三个大组, A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L十二小组, 1组中每个分试管均加0.1ml贝壳粉溶液, 2组中每个分试管均加1ml贝壳粉溶液, 3组中每个分试管均加2ml贝壳粉溶液.A、E、I试管中均不加硅藻土溶液, B、F、J试管中均加入0.1ml硅藻土溶液, C、G、K试管中均加入1ml硅藻土溶液, D、H、L试管中均加入2ml硅藻土溶液。分别测每组在1、3、5、7、9小时磷的去除率。实验数据表明实验时间越长去除率越高, 但三小时后升高趋势缓慢没有明显变化, 所以3小时为最佳时间。

关键词：贝壳,含磷废水,硅藻土

参考文献

[1]姚梦迪, 宋浩, 岳强.贝壳粉强化污水除磷效果研究.

[2]Mohammad A.AL-Ghoutia, Yahya S.AL-Degsb.New adsorbents based on microemulsion modified diatomite and activated carbon for removing organic and inorganic pollutants from waste lubricants[J].Chemical Engineering Journal, 2011 (137) :115-128.

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[4]崔玉波, 杨少华, 黄继国.贝壳填料酸化反应器预处理生活污水试[J].吉林大学学报:地球科学版2010, 40 (6) :1425-1428.