表达条件优化

表达条件优化（精选10篇）

表达条件优化 篇1

芋螺毒素(conotoxins,CTX)是一类由热带海洋肉食性软体动物芋螺分泌的多肽类毒素,是其主要用来捕食和防御的武器,同时也具有与其它对手竞争或在其生物学上具有一定的用途[1,2]。全世界约有500多种芋螺[3],每种芋螺的毒液含有千余种芋螺毒素[4],且不同种的芋螺所含的活性肽也各不相同,据此估计至少有50多万种活性肽组分存在于芋螺毒液中。迄今,已经分离鉴定了几百种芋螺毒素,但不足其总量的0.1%。它们具有分子量小、结构多样性、作用靶点广泛、功能专一、组织特异性强等特点[5],是目前发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽[6]。

本研究在已成功构建含有K41基因的E.coli 工程菌的基础上,从接种比例、诱导时间、IPTG 浓度、诱导温度、培养基pH值等五个影响因子对含重组芋螺毒素基因的工程菌进行优化表达条件,可生产出大量的重组蛋白CTX-K41,这将为芋螺毒素新药的研发和临床药物的工业化生产奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

含有pCTX-K41的重组菌株BL21(DE3) (pXSL1),由本实验室构建并保存。

1.1.2 试剂

IPTG(isopropylthjo-β-D-galactoside,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、氨苄青霉素购自华美生物工程有限公司;蛋白质Marker购自上海生工生物工程有限公司;SDS-PAGE电泳试剂购自大连宝生物工程有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

LB培养基,其成分为蛋白胨10 g·L-1,酵母膏5 g·L-1,NaCl 10 g·L-1,pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养

将含有pCTX-K41的E.coli接种于LB 固体培养基(100μg· ml-1氨苄青霉素),37℃培养箱中培养过夜。挑取单菌落接种于5 ml LB 液体培养基(100μg· ml-1氨苄青霉素),培养温度为37℃,转速为250r·min-1振荡培养12~16 h。

1.2.2 重组菌株培养条件优化方法

取菌液按1:100 比例接种于含100μg· ml-1氨苄青霉素的LB 液体培养基的三角瓶中,培养温度为37℃,转速为250r·min-1振荡培养,培养至菌体浓度A600为0.6 时,加入诱导剂IPTG进行诱导表达,按照以下各种条件进行诱导表达。

1.2.3 接种比例对重组蛋白表达的影响

分别按照活化菌液与培养基的比例为1:20、1:40、1:100、1:140、1:200接种于含有LB 液体培养基的100 ml 锥形瓶中,诱导表达4 h后,取样。

1.2.4 诱导时间对重组蛋白表达的影响

加入终浓度为1.0mmol·L-1的IPTG,37℃、250 r·min-1振荡培养,分别诱导1h、2h、3h、4h、5h、6h和7 h 后,取样,按常规方法进行Tricine-SDS-PAGE,分析目的蛋白的表达量。

1.2.5 IPTG浓度对重组蛋白表达的影响

分别按0.1、0.2、0.4、0.8和1.0mmol·L-1的终浓度加入IPTG,诱导4 h后,取样。

1.2.6 诱导温度对重组蛋白表达的影响

分别在21℃、30℃、37℃条件下诱导表达4h后,取样。

1.2.7 培养基pH值对重组蛋白表达的影响

分别将LB 培养液的pH 分别调到5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,诱导培养4 h 后取样。

上述条件下获得的样品,按常规方法进行Tricine-SDS-PAGE电泳,分析重组蛋白表达情况。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白表达的鉴定

通过Tricine-SDS-PAGE电泳图可以看出,诱导后的菌体总蛋白比未诱导的菌体总蛋白明显在相对分子质量约6 700Da 处可见特异性蛋白条带,与预期大小相符。经超声破碎后电泳发现重组目的蛋白主要形成包涵体,可初步确定重组目的蛋白获得了表达(图1)。

2.2 接种比例对重组蛋白表达的影响

分别采用1:20、1:40、1:100、1:140、1:200比例进行接种,利用Tricine-SDS-PAGE电泳分析,结果接种量对重组菌的生长浓度和目的蛋白的表达量有明显影响,接种比例小于1:100后,目的蛋白表达量明显增加。但在接种比例大于1:100之后,蛋白表达量的增加很慢,几乎无变化(如图2)。

2.3 诱导时间对重组蛋白表达的影响

通过Tricine-SDS-PAGE电泳图可以看出,固定IPTG终浓度进行诱导时,重组蛋白表达量随培养时间延长而逐步增加,在4 h 时表达量较高,继续延长诱导时间则重组蛋白表达量没有继续增加,反而杂蛋白的量不断增加(见图3)。

2.4 IPTG浓度对重组蛋白表达的影响

通过Tricine-SDS-PAGE电泳图可以看出,重组蛋白表达量随着IPTG 浓度的升高而增加,终浓度为0.4mmol·L-1后,再增加IPTG 浓度并未出现表达量的增加(见图4)。

1: protein marker;2: 0mmol/L;3: 0.1mmol/L;4: 0.2mmol/L;5: 0.4mmol/L;6: 0.8mmol/L;7:1.0mmol/L .

2.5 诱导温度对重组蛋白表达的影响

通过Tricine-SDS-PAGE电泳图可以看出,诱导温度对重组蛋白表达量有较大影响。在30℃条件下震荡培养4 h后,可获得较高的目的蛋白表达量,温度过低或过高都不利于蛋白的表达(见图5)。

2.6 培养基pH值对重组蛋白表达的影响

Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明,在不同培养基的pH值条件下诱导表达,结果在pH值5.0时目的蛋白表达量最高。从图6可以看出,pH值偏碱时产物表达相对较少,pH 值偏酸时有利于产物表达。

3 讨论

利用基因工程法获得大量廉价的肽类物质和稀有蛋白,能够解决天然资源匮乏、分离纯化困难、化学合成昂贵等问题[7]。目前芋螺毒素表达的文献报道较少,主要原因是芋螺毒素分子量小、二硫键密度大等特点决定了其较难在外源表达系统中表达。因此,探索重组芋螺毒素的表达条件则显得更加重要。Canhui Pi等[8]利用大肠杆菌成功表达出重组芋螺毒素It7a。外源基因在异源表达时,受多种因素影响,其中除了宿主菌自身因素和表达质粒的质量外[9],发酵条件的优化也是重组蛋白表达的一个关键环节。张洪斌等[10]通过改变发酵条件等影响因子对重组右旋糖酐蔗糖酶的表达条件进行了优化,能够使重组目的蛋白的活性和产量均有所提高。

本实验在考察诱导剂IPTG浓度对于蛋白表达量有较大影响,在IPTG浓度增加到0.4mmol·L-1时,重组目的蛋白表达量达到最大值。这与Novagen提供的表达手册所表述是一致的。温度可能是影响外源蛋白在大肠杆菌中获得高水平表达的最重要因素之一,通过实验确定最佳温度,是表达外源蛋白的关键[11]。实验结果表明30℃时目的蛋白表达量最高,可初步决定最佳温度在30℃左右。对于大肠杆菌表达系统若想获得大量可溶性的重组蛋白则需要较低的温度条件下进行诱导,如李琳等[12]表达重组蛋白时,为获得可溶性的重组蛋白,采用25℃进行诱导表达。大肠杆菌生长的最适pH值在6.8~7.6之间,较多文献报道[13]表达外源蛋白的最佳pH 值为7.0左右。但本实验在研究pH值对重组芋螺毒素表达的影响却是在较酸性环境中有利于目的蛋白的表达,原因可能是在酸性环境条件下很多中性pH蛋白酶都将失活,有利于目的蛋白的稳定性[14]。

研究表明,通过对重组芋螺毒素工程菌在摇瓶水平上优化了表达条件,可以有效提高重组蛋白的表达量,从而为大罐发酵奠定了良好的基础。

条件句的特殊表达方式 篇2

一、并列结构

1.祈使句+and简单句。祈使句具有条件的意味。这个句型表示肯定条件，and表示自然的结果。例：

Push the door hard,and it will open.(=If you push the door hard,it will open.)

使劲推门，门就会打开。

Finish your work and I’ll give you some ice cream.(=If you finish your work,I’ll give you some ice cream.)

你干完活，我就给你些冰琪淋。

Work hard and (=If you work hard) you will pass your examination.

如果你努力学习，就会考试及格。

Go and I won’t call the police.

走开，否则我就报警了。

2.祈使句+or简单句。此句型中的祈使句表示否定条件，or表示结果。例：

Write it down,or you’ll forget it.(=If you don’t write it down,you’ll forget it.)

写下来，否则你会忘记的。

Work hard,or you won’t be able to pass your examination.

努力学习，否则你无法通过考试。

Go,or I’ll call the police.

走开，否则我就报警了。

Don’t eat so much,or you’ll be sorry.

不要吃那么多，否则你会后悔的。

3.名词词组+and简单句。这种句型不但简洁，而且条件意味十分突出。例：

One more effort and you’ll succeed.(=If you make one more offort,you’ll succeed.)

再努力一把，你就会成功。

Another half hour and all doors would be locked.(=If another half hour should pass,all doors would be locked.)

再过半个钟头，所有的门都要上锁了。

二、动词say,suppose引导从句

这类句型多用于疑问句中，同引导条件状语从句的用法一样。

1.Let’s say that...

Let’s say that your plan fails,then what do we do.

假使你的计划失败，那我们怎么办？

2.say(=If,Let’s say)

Say you have had an accident,who would look after you?

如果你遭受意外，谁会来照料你？

3.suppose（=supposing)

Suppose (that) the news is true,what then?

假定这消息是真的，又该怎么办？

Suppose you had a million pounds,how would you spend it?

假定你有一百万英镑，你会怎么花？

Suppose it rains,what shall we do?

万一下雨，我们该怎么办？

三、非谓语形式表示条件

1.不定式表示条件包括两种：表示真实条件和虚拟条件（含蓄条件）。

It would be a mistake not to help him.(=It would be a mistake if we didn’t help him.)

不帮助他将是一个错误。

To hear him speak English you would take him for an Englishman.

如果听他说英语，你就会把他当成英国人。

To listen to him,you should think that no problem whatever existed.

如果听他说话，你就会认为什么问题也没有。

2.分词短语（或含分词短语的独立主格结构）表示条件。

Working hard,you will succeed.

努力拼搏，你就会成功。

Turning to the left,you will find the path leading to the site.

如果你朝左拐，你会发现这条路通往工地。

I’ll come tomorrow,weather permitting.

如果天气许可的话，我明天就来。

United,we stand;divided,we fall.(=If we are united,we stand ;if we are divided,we fall.)

团结则存，分裂则亡。

Heated,water changes into steam.(=If water is heated,it changes into steam.)

如果加热，水就会变成蒸汽。

All things considered,his paper is of greater value than yours.

如果考虑到各方面，他的论文比你的更有价值。

四、seeing(that),provided/providing(that),saving(that),considering(that),supposing(that),granting/granted that,given(that)等用作连词，引导条件状语从句。

Supposing (that) it rains,can we play the match indoors?

如果下雨，我们能在室内比赛吗？

You can borrow my bike provided/providing you bring it back.

你可以借我的自行车，只要你送回来。

I’ll give you the day off on condition that you work on Saturday morning.

我给你这天假，只要你在星期六上午来上班。

You’re welcome to stay with us as long as you share the rent.

表达条件优化 篇3

为了制备JSRV受体Hyal -2蛋白的抗血清和进一步研究JSRV与其受体的相互作用,本试验对JS- RV受体Hyal - 2原核表达条件进行优化,以期摸索出最佳的表达条件,现将结果报道如下。

1材料

pGEX - 4T - 1空载体质粒、含pGEX - 4T - 1 - Hyal - 2重组质粒的BL21( DE3) 重组菌( 重组质粒带有EcoRⅠ、NotⅠ限制性内切酶酶切位点) ,由内蒙古农业大学绵羊肺腺瘤病研究室保存; EcoRⅠ、NotⅠ限制性内切酶、DL - 10 000 Marker,均购自TaKaRa公司; 质粒少量提取试剂盒,购自TIANGEN试剂公司; SDS - PAGE配胶试剂盒、彩色预染蛋白分子质量标准,购自碧云天生物技术研究所; 鼠抗GST抗体、 HRP标记的羊抗鼠IgG抗体,购自北京博奥森生物技术有限公司。

2方法

2. 1菌液的活化及其鉴定

按照1∶100比例将含pGEX - 4T - 1 - Hyal - 2重组质粒的BL21( DE3) 重组菌添加到20 mL含氨苄西林( Amp) 的LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min振荡培养过夜; 按照质粒少量提取试剂盒操作方法提取pGEX - 4T - 1 - Hyal - 2重组质粒,用EcoRⅠ、NotⅠ 限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定,对菌液测序鉴定。将pGEX -4T - 1空载体质粒转化至BL21 ( DE3) 大肠杆菌中得到含pGEX -4T -1空载体质粒的对照菌。

2. 2重组菌IPTG诱导浓度的优化

将过夜活化的重组菌按照1∶100的比例加到10 mL含Amp的LB液体培养基中,37 ℃ 、200 r / min振荡培养; 待其OD值达到0. 6 ~1. 0时,分别加入终浓度为0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0 mmol/L的IPTG; 37 ℃ 、200 r / min诱导4 h; 将诱导好的菌液以12 000 r / min离心5 min; 弃上清液,向菌体沉淀中加3 mL PBS悬浮沉淀,4 ℃ 、12 000 r / min离心5 min; 如此反复3次; 向漂洗好的菌体中加1 mL PBS置于冰上,超声破碎至清亮; 4 ℃、12 000 r/min离心10 min; 分离上清液和沉淀,分别加入蛋白上样缓冲液并煮沸5 min; 取10 μL制备好的样品用10% SDS - PAGE电泳检测,考马斯亮蓝R250染色液染色2 h; 脱色液脱色至条带清晰,扫描仪扫描,确定最佳的IPTG诱导浓度。

2. 3重组菌作用时间的优化

将过夜活化的重组菌按照1∶100的比例加到10 mL含Amp的LB液体培养基中,37 ℃ 、200 r / min振荡培养; 待其OD值达到0. 6 ~1. 0时,加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG,在37 ℃、200 r/min条件下诱导表达; 于第2,4,6,8小时时分别取样,按照2. 2中的方法制样,最后用10% SDS - PAGE电泳检测以确定最佳的作用时间。

2. 4低温对目的蛋白产量的影响

将过夜活化的对照菌、重组菌按照1∶100的比例分别加到10 mL含Amp的LB液体培养基中,37 ℃、 200 r / min振荡培养; 待其OD值达到0. 6 ~ 1. 0时, 向对照菌、重组菌中分别加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG,在15 ℃、150 r/min条件下诱导过夜; 按2. 2中的方法制样,最后用10% SDS - PAGE电泳检测以确定目的蛋白的表达量及其表达形式。

2. 5 Western - blot检测

将低温条件下诱导表达的产物经10% SDS - PAGE电泳后,应用湿转方法( 恒流350 mA、3 h) 转移至硝酸纤维素膜( NC膜) 上,5% 脱脂乳封闭过夜; 次日弃掉封闭液,以鼠抗GST抗体为一抗( 1∶5 000) 稀释,室温孵育1 h; PBST漂洗4次,每次8 min; 以HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗( 1∶4 000) 稀释, 室温孵育1 h; PBST漂洗4次,每次8 min; 显影液显影,多功能成像仪成像。

3结果与分析

3. 1重组质粒的鉴定结果

重组质粒经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后得到大小分别为4 900,1 431 bp的2条条带,分别与pGEX - 4T - 1空载体质粒和Hyal - 2基因片段大小相符,说明目的片段已正确插到pGEX - 4T - 1空载体质粒中,即为pGEX - 4T - 1 - Hyal - 2重组质粒,结果见图1。

3. 2不同浓度IPTG诱导对目的蛋白产量的影响

经10% SDS - PAGE电泳检测显示,重组菌经不同浓度IPTG诱导后均表达了目的蛋白,目的蛋白主要以包涵体形式在沉淀中表达,上清液表达量较少, 不同终浓度IPTG对表达量的影响较小,其中以0. 4 mmol / L的IPTG诱导时表达量最高,结果见图2。

3. 3不同作用时间对目的蛋白产量的影响

经10% SDS - PAGE电泳检测显示,重组菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白,不同作用时间对重组菌表达目的蛋白有明显影响,其中作用2 h后蛋白表达量最高,结果见图3。

3. 4低温对重组菌表达目的蛋白的影响

在15 ℃、终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG诱导条件下,对照菌表达大小为26 ku的GST标签蛋白,重组菌表达大小为80 ku的带GST标签的目的蛋白,重组菌表达的目的蛋白在此诱导条件下可溶性形式增加,包涵体所占的比例明显减少,结果见图4。

1.EcoRⅠ单酶切;2~3.EcoRⅠ、NotⅠ双酶切;M.DL-10 000 Marker。

1 ～ 2. 0. 2 mmol / L 的 IPTG 诱导结果; 3 ～ 4. 0. 4 mmol / L 的 IPTG 诱 导结果;5 ～6.0.6 mmol/L 的 IPTG 诱导结果;7 ～8.0.8 mmol/L 的 IPTG 诱导结果; 9. 1. 0 mmol / L 的 IPTG 诱导结果; M. 蛋白分子 质量标准。

1~2.2 h取样;3~4.4 h取样;5~6.6 h取样;7~8.8 h取样;M.蛋白分子质量标准。

3. 5 Western - blot检测结果

Western - blot检测结果显示: 硝酸纤维素膜上重组菌经诱导后在80 ku附近出现明显印迹,即带GST标签的GST - Hyal -2融合蛋白条带; 对照菌经诱导后在26 ku左右出现印迹,即GST标签蛋白条带。重组菌表达的GST - Hyal - 2目的蛋白包涵体形式所占比例较高,上清液中也有可溶性形式存在,但所占比例较少。对照菌表达的标签蛋白在低温时主要以可溶性形式在上清液中存在,结果见图5。

M.蛋白分子质量标准;1.对照菌诱导超声破碎后的上清液;2.对照菌诱导超声破碎后的沉淀;3.重组菌诱导超声破碎后的上清液;4.重组菌诱导超声破碎后的沉淀。

M.蛋白质分子量标准;1.对照菌诱导超声破碎后的上清液;2.对照菌诱导超声破碎后的沉淀;3.重组菌诱导超声破碎后的上清液;4.重组菌诱导超声破碎后的沉淀。

4讨论

原核表达受多种因素影响,对诱导条件进行优化是十分必要的,为了使GST - Hyal - 2目的蛋白大量、稳定、高效地表达,本试验分别对重组菌表达GST - Hyal - 2目的蛋白的IPTG诱导浓度、作用时间、温度进行优化,摸索出了重组菌的最佳表达条件。 结果发现,含pGEX -4T -1 - Hyal -2重组质粒的重组菌在37 ℃、终浓度为0. 4 mmol/L的IPTG诱导条件下目的蛋白的表达量最高,最佳的作用时间是2 h, 在37 ℃ 时,目的蛋白主要以包涵体形式存在,在15 ℃ 以下时,目的蛋白可溶性形式明显增加,说明温度对GST - Hyal -2目的蛋白的表达有明显影响。

原核表达系统以大肠杆菌表达系统最为常见,大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学已被人们充分了解而成为表达外源蛋白的首选表达系统,而且大肠杆菌表达系统具有成本低、表达量高、表达产物分离和纯化相对简单和周期短等优点[5]。本试验后期计划用表达出的Hyal - 2蛋白制备多克隆抗体,选用的是pGEX -4T -1空载体质粒,pGEX表达载体系列被广泛用于各种融合蛋白的表达[6],该载体在分子生物学的研究中被广泛应用,并且表达出的目的蛋白可利用谷胱甘肽亲和层析进行亲和、纯化,得到较纯的目的蛋白,还可以利用载体自带的凝血酶酶切位点把GST标签特异地切除,得到单一的目的蛋白。

本试验结果显示,在37 ℃时目的蛋白主要以包涵体形式存在,当温度降到15 ℃时目的蛋白的可溶性形式明显增加,主要原因是原核表达系统不能对表达出的蛋白进行修饰和进一步加工,当外源蛋白在大肠杆菌中过量表达时,常导致表达产物在细胞内大量蓄积,二硫键不能以正确的方式配对形成正确的空间结构,最后形成不溶性包涵体,对大多数蛋白来说在低温、低IPTG诱导浓度的条件下可以抑制包涵体的形成,使可溶性形式增加[7]。由于包涵体的复性操作复杂而且复性效率不高,所以包涵体的形成是蛋白表达的一个难题,后期的蛋白纯化步骤也十分繁琐。 任增亮等[8]研究发现,添加信号肽、分子伴侣及改变培养基营养条件有利于目的蛋白的高效表达。

青天葵组织培养条件优化 篇4

关键词：青天葵；根状茎；球茎；诱导；增殖

中图分类号： Q943.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0066-03

收稿日期：2013-10-17

基金项目：广西自然科学基金（编号：2011GXNSFA018189）。

作者简介：李林轩（1986—），男，广西全州人，助理研究员，从事中药资源保护与开发利用研究。E-mail：starry1125@sina.com。

通信作者：白隆华，研究员，从事中药资源保护与利用研究。E-mail：whitefh2008@126.com。青天葵为兰科植物毛唇芋兰[Nervilia fordii （Hance）Schitr]的叶或带球茎的叶，别名独叶莲、独脚莲、珍珠叶、坠千斤、铁帽子、山米子、青莲。青天葵性平，味苦，甘、凉，有清肺止咳、健脾消积、清热解毒、消结散疬等功效，主治肺痨咯血、肺热咳嗽、小儿肺炎、急性喉炎、 口腔炎、咽喉肿痛、瘰疬、疮疡肿毒、跌打损伤等[1]。青天葵是广西特产药材，也是我国出口创汇主要药材，经济价值较高，主产于广西、广东、四川、云南等地，属于多年生宿根小草本。该物种濒临近危，已被列入中国物种红色名录[2]。栽培试验发现，青天葵组培球茎不仅能正常生长，而且在相同条件下栽培组培球茎优于野生球茎[3]。为了解决青天葵产业发展中种源短缺的问题[4-7]，本研究利用现代生物技术优化青天葵组织培养条件，以期为青天葵组织培养规模化生产育苗提供技术支撑。

1材料与方法

1.1材料

供试材料采自广西药用植物园科研基地内引种栽培、生长健壮、无病虫害的植株，经广西药用植物园鉴定，选取其球茎为外植体。将球茎在洗洁精溶液中浸泡5 min，清洗干净，用自来水冲洗10 min，置于0.1%氯化汞溶液（加1～2点的吐温）浸泡消毒10 min，再用无菌水浸洗5次，然后直接将球茎接种于1/2MS+2.0 mg/L 6-BA培养基上[8]，培养条件为pH 值5.8，平均照度2 000 lx，光照时间12 h/d，温度（25±3） ℃，30 d后将其诱导出芽形成根狀茎，作为试验材料（图1）。

1.2方法

1.2.1根状茎繁殖取无菌根状茎约2 cm长的小段，接入添加不同浓度的6-BA、NAA、IAA（表1）的MS基本培养基中，观察其对青天葵根状茎繁殖的影响。

3结论与讨论

6-BA是最重要的细胞分裂素，能促进细胞分裂、非分化组织分化、侧芽生长等；NAA是植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大、诱导形成不定根等作用；IAA是植物生长素，能促进细胞分裂与细胞生长，诱导形成不定根[9]。多种因素组合能更有效促进植物生长，因此在MS培养基中配合使用6-BA、NAA、IAA对青天葵生长具有较大影响。本研究表明，青天葵根状茎增殖的最适培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA，在该培养基上形成根状茎的数量最多，增殖数为6.5倍，且根状茎粗细适中。

青天葵为兰科植物，和其他兰科植物一样靠球茎繁殖。兰科植物球茎的增殖方式在兰科植物工业化上尤为重要[10]。杜勤等对青天葵组织培养研究发现，在1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA的生根培养基上培养1个月，根茎上长出绿色的芽，并伸展成为叶柄和叶片，并在叶柄下端长出白色的根[8]，这与本研究结果相似，都是使用细胞分裂素和生长激素按1 ∶1比例进行培养，青天葵根状茎可以直接形成植株。但是直接形成植株的诱导率远低于新球茎诱导率，植株移栽成活率也低于球茎，且试管苗没有球茎便于携带和运送，不利于青天葵大规模生产与种植。但可为新品种遗传改良提供材料。本研究表明，球茎诱导的最佳培养基为MS+1.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，在该培养基中青天葵球茎诱导系数为11.5，且球茎质量好，球茎发芽成活率达到90%。这与凌征柱等使用的MS+2.0 mg/L NAA诱导培养基[11]稍有不同，但都是使用高浓度生长激素进行球茎诱导。

参考文献：

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[11]凌征柱，梁学金，潘素芬，等. 青天葵诱导多球茎及丛生苗的研究[J]. 种子，1998（5）：35-36.

表达条件优化 篇5

基因治疗( gene therapy) 是指利用分子生物学方法将目的基因导入靶细胞,使其表达目的基因产物, 以此达到治疗目的。在基因治疗过程中,需要借助一定技术方法或者载体才能将外源性目的基因导入生物细胞内。目前,载体基本可以分为非病毒载体和病毒载体两大类。非病毒载体的特点是安全性相对高, 但效率低。病毒载体是将外源性目的基因先通过基因重组技术,使之组装到病毒上,然后通过重组病毒去感染受体宿主细胞,以达到病毒介导基因导入的目的。作为载体的病毒已经过改造,保持对靶细胞感染的能力但不具有致病性,因而具有相对高的感染效率和使用安全性,其中又以腺病毒( Adenovirus,Ad) 载体最为常用。腺病毒载体的优点是宿主范围广,感染性强,可容纳片段较大的基因,能有效地把外源性目的基因导入多种靶细胞或组织中,并保证重组蛋白既高水平表达又具有较完全的功能。此外,腺病毒载体的构建和操作相对容易,近年来在基因治疗及其他生物研究中使用广泛。

为了深入研究Hsp70的生物学活性及其抗应激损伤的保护机制,黑龙江八一农垦大学动物生理学研究室在前期试验中构建了Wistar大鼠Hsp70重组腺病毒( Ad - CMV - Hsp70) 。本试验利用Ad - CMV - Hsp70感染BRL - 3A细胞,优化其对靶细胞的最佳感染浓度和作用时间,使BRL -3A过表达Hsp70,为探究Ad - CMV - Hsp70介导的Hsp70感染细胞的方法及Hsp70对大鼠肝细胞氧化应激的保护作用奠定基础。

1材料与方法

1. 1细胞系

BRL - 3A细胞( Buffalo大鼠肝细胞系) ,购自中国科学院细胞库。

1. 2主要试剂与仪器

HyClone改良型RPMI-1640培养基,北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司生产;Solarbio优质胎牛血清,北京索宝莱科技有限公司生产;IP细胞裂解液、蛋白抽提试剂和BCA蛋白浓度测定试剂盒,碧云天生物技术研究所生产;十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(二抗),Sigma公司生产;TRIzol,Invitrogen公司生产;Hsp70单克隆抗体(一抗),Abcam公司生产;β-actin单克隆抗体,Santa Cruz公司生产;倒置显微镜(型号为CK30),日本O-lympus公司生产;低速台式离心机(型号为TDL-5-A),上海安亭科学仪器厂生产;台式高速冷冻离心机(型号为TGL16M),长沙英泰仪器有限公司生产;紫外分光光度计,北京普西通用仪器有限责任公司生产;SmartSpecTMPlus核酸蛋白测定仪,美国Biorad公司生产;培养板、一次性细胞培养瓶,美国Co-ring公司生产。

1.3细胞培养

1. 3. 1细胞复苏将在液氮中冻存的BRL - 3A细胞取出后放入37 ℃恒温水浴锅中,不断摇晃,使其迅速融化; 用75%乙醇擦拭冻存管,彻底消毒后在无菌条件下将细胞悬液转移到15 mL离心管中; 加入10 mL细胞培养液( 10% FBS) ,洗涤,以1 000 r / min离心2 min; 弃上清液,再重复洗涤1次; 弃上清液,用10 mL细胞复苏液( 20% FBS) 悬浮细胞沉淀; 然后移至75 cm2培养瓶中,于37 ℃、5% CO2培养箱内培养; 次日用细胞培养液( 10% FBS) 换液,继续培养观察。

1. 3. 2细胞传代弃尽BRL - 3A细胞生长状态良好且爬满培养器皿底部的培养器皿中的培养液,PBS缓冲液冲洗3次后弃尽残存液体,用胰蛋白酶消化液( 0. 1 mL/cm2) 消化,当显微镜下监测到细胞隆起后迅速吸除消化液,并加入细胞培养液( 10% FBS) 终止消化反应; 然后用10 mL移液管轻柔吹打贴壁细胞,使其脱落并成为均匀的单细胞悬液。细胞计数后,根据结果适量稀释并接种到规定的培养器皿中, 继续常规培养,次日换液。所有步骤均使用稳定传代4代且处于对数生长期的细胞。

1. 4 β - 半乳糖苷酶原位染色

用腺病毒空载体( Ad - CMV - β - Gal) 感染BRL - 3A细胞,借助 β - 半乳糖苷酶原位染色方法比较感染效率,以此初步筛选病毒的最佳感染浓度和作用时间。

1. 4. 1细胞培养及病毒处理将基本长满细胞板且生长状态良好的细胞随机分组,每组均设3个重复孔。弃培养液,然后每组加入含相应浓度病毒的培养液,0. 2 mL/孔( 初次选用的病毒浓度梯度为2 ×109, 2 × 108,2 ×107,2 ×106,2 ×105pfu / mL,第2次筛选时浓度梯度为4 × 107,2 × 107,1 × 107,0. 5 × 107, 0. 25 × 107pfu / mL) ,边加边摇晃培养板,使病毒能均匀分布在细胞表面,然后继续常规培养,但每隔15 min轻柔摇晃培养板10 s,1 h后无需摇晃。病毒处理6 h后补充培养液,继续常规培养。初次筛选时,分别在病毒处理24 h和48 h后,各终止培养一批细胞,第2次筛选时在病毒处理48 h后终止培养。 无病毒组的细胞加入同体积无病毒的培养液,其余处理组与病毒处理组相同。

1. 4. 2 β - 半乳糖苷酶原位染色以lacZ编码 β - 半乳糖苷酶,这种酶能催化显色底物———无色的化合物5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚- β - D - 半乳糖苷( X - Gal) 产生半乳糖和一种蓝色产物( 5 - 溴- 4 - 靛蓝) ,从而可以通过光学显微镜观察到变成蓝色的表达β - 半乳糖苷酶的细胞。β - 半乳糖苷酶的原位染色步骤: 吸除细胞培养液,每孔加入0. 2 mL固定液, 室温固定10 min; 吸除固定液,用PBS缓冲液洗涤3次,每次3 min; 吸除PBS缓冲液,每孔加入0. 2 mL染色工作液; 37 ℃孵育20 min至2 h,直至部分细胞颜色变蓝,可用保鲜膜封住各孔防止蒸发; 倒置显微镜下观察,并随机选择视野计数、拍照,计算感染效率。计算公式: 感染效率= 染色阳性细胞数/总细胞数 × 100%。去除染色工作液,加入PBS缓冲液, 0. 4 mL / 孔,4 ℃ 保存,备用。

1. 5 mRNA丰度检测

1. 5. 1目的片段扩增采用TRIzol法提取BRL - 3A细胞总RNA,反转录生成cDNA。Hsp70的上游引物5' - GCTCGAGTCCTACGCCTTCAATA -3',下游引物5' - TCCTGGCACTTGTCCAGCAC -3',扩增片段大小为105 bp。以 β - actin为内参基因,上游引物5' - TCACCAACTGGGACG - 3',下游引物5' - GCAT- ACAGGGACAACA - 3',扩增片段大小为205 bp。所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR扩增条件: 94 ℃ 预变性5 min; 94 ℃ 变性30 s,58 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸1 min,共45个循环; 72 ℃ 再延伸10 min。扩增片段电泳后胶回收、转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞,质粒提取鉴定。同时将带有目的基因Hsp70和内参基因 β - actin的菌液送到上海生工生物工程技术服务有限公司测序,结果用生物信息学软件DNAstar进行同源性分析。

1. 5. 2荧光定量检测选用双标准曲线法,分别以目的基因Hsp70和内参基因 β - actin的标准品作为模板进行Real - time PCR反应,制作标准曲线。同时以各组BRL - 3A细胞的cDNA为待测样本,检测其目的基因Hsp70和内参基因 β - actin的mRNA丰度。PCR扩增条件: 95 ℃ 预变性2 min; 94 ℃ 变性10 s,58 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,共40个循环; 95 ℃ 再延伸30 min。在每个循环结束后进行荧光信号的采集,所有循环结束后进行溶解曲线分析。 Real - time PCR反应之后,所得数据用Line - Gene K荧光定量PCR仪内自带软件进行最大二阶导数法相对定量的计算。根据qRT - PCR结果,计算最佳感染条件的感染复数( MOI) 。

1. 6免疫印迹分析

收集细胞,用PBS清洗; 加细胞裂解液裂解细胞,提取总蛋白,应用Bradford比色法检测蛋白含量。 对每个样品槽内60 μL样本进行SDS - PAGE电泳, 通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶上转移到PVDF膜上,转印后的PVDF膜用5% 脱脂奶粉于4 ℃ 封闭过夜; 加入一抗( 浓度1∶5 000) ,37 ℃ 孵育1 h; TBST洗膜,加入浓度为1 ∶ 5 000的二抗,37 ℃ 孵育1 h; TBST洗膜,化学发光,显影,定影。图像经拍照后用Image J系统分析。

1. 7统计学分析

采用SPSS 17. 0统计软件处理试验数据,以ANOVA法对试验数据进行方差分析,检验各组差异的显著性,P <0. 05为有统计学意义。

2结果与分析

2. 1 β - 半乳糖苷酶原位染色

将感染不同浓度Ad - CMV - β - Gal和时间的BRL - 3A细胞,用 β - 半乳糖苷酶原位染色法比较感染效率。结果显示: 以1 × 107pfu / mL的Ad - CMV - β - Gal感染BRL - 3A细胞48 h后( 见209页彩图1) ,细胞仍然保持良好状态,且感染率( 67%) 较低浓度病毒组( 见209页彩图2) 高; 相比之下,虽然高浓度病毒能引起更高的感染率,但会引起更多的细胞死亡,且活细胞形态不良,见209页彩图3。相同浓度的Ad - CMV - β - Gal感染24 h的效果( 见209页彩图4) 不如48 h( 见209页彩图1) 。因此,以lacZ ( 编码 β - 半乳糖苷酶的基因) 为标签基因,用 β - 半乳糖苷酶原位染色法,初步筛选的病毒的最佳感染浓度为1 × 107pfu / mL ( MOI = 20 ) ,病毒作用时间为48 h。

2. 2 Hsp70 mRNA丰度检测

2. 2. 1 RNA纯度、浓度和完整性用TRIzol法从各组细胞中分别提取总RNA。经SmartSpecTMPlus核酸蛋白测定仪测定,RNA的OD260/ OD280值在1. 8 ~2. 0之间,浓度在6. 5 ~ 21. 7 μg/mL之间。说明所提取的RNA纯度较高,浓度适当。1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物的结果见图5。

1,2.Ad-CMV-Hsp70组;3,4.Ad-CMV-Null组;5,6.无病毒组。

由图5可知,每条泳道均呈现3条亮带,自上而下分别是28 S、18 S和5 S,28 S的亮度约为18 S的2倍,5 S条带亮度最暗,说明所提取的RNA样品有较好的完整性,无明显降解。

2. 2. 2PCR鉴定及序列分析PCR扩增产物经1. 0% 琼脂糖凝胶电泳检测的结果图见6。

由图6可知: β - actin内参基因和Hsp70基因的扩增产物大小分别为205 bp、105 bp,与预期结果相符,且条带清晰,无非特异性杂带; 其质粒测序结果与GenBank中的序列比对,同源性均为100% 。

M.DL-2 000 Marker;1,3.β-actin内参基因;2,4.Hsp70基因。

2. 2. 3荧光定量PCR结果1) Hsp70基因和 β - actin内参基因的熔解曲线见图7、图8。

由图7和图8可知,扩增体系良好,熔解曲线峰值均较高,尖耸,无杂峰,说明扩增产物特异性高。

2) mRNA相对表达量见表1。

由表1可知,同为作用48 h,浓度为1 ×107pfu / mL的Ad - CMV - Hsp70组Hsp70相对表达量,高于2 × 107pfu / mL的Ad - CMV - Hsp70组( P > 0. 05) 和4 × 107pfu / mL的Ad - CMV - Hsp70组( P < 0. 01) ; 而且也高于同浓度的Ad - CMV - Null组和无病毒组; 此外,随着病毒浓度的降低,无论是Ad - CMV - Hsp70组还是Ad - CMV - Null组,Hsp70相对表达量都在升高。1 ×107pfu / mL的Ad - CMV - Hsp70组, 48 h相对表达量明显高于72 h( P < 0. 01) 。因此,选用病毒浓度为1 ×107pfu / mL和感染时间为48 h,作为建立过表达Hsp70的BRL - 3A细胞处理条件,此条件下MOI =20。

注: 与48 h无病毒组比较,字母相同表示差异不显著( P >0. 05) , 字母不同表示差异显著( P <0. 01) 。

2. 2. 4免疫印迹结果Ad - CMV - Hsp70组、Ad - CMV - Null组及无病毒组Hsp70和GAPDH蛋白的检测结果见图9和图10。

1.Ad-CMV-Hsp70组;2.Ad-CMV-Null组;3.无病毒组。

注:**表示差异极显著(P<0.01)。

由图9和图10可知,Ad - CMV - Hsp70组比无病毒组Hsp70表达量高,差异极显著( P <0. 01) 。

3讨论

本试验采用 β - 半乳糖苷酶原位染色法优化腺病毒载体对靶细胞的最佳感染浓度和作用时间,以X - Gal为底物进行染色时,这种酶能够催化产生蓝色物质,便于观察和检测。基于lacZ基因的诸多优点,它已成为基因工程试验中一个常用的报告基因。 因此在试验中,首先使用带lacZ基因的重组腺病毒Ad - CMV - β - Gal对浓度和作用时间进行初筛。结果显示: 使用 β - 半乳糖苷酶原位染色法检测出由外源性基因lacZ编码的 β - 半乳糖苷酶,说明感染成功; 并且当Ad - CMV - β - Gal浓度为1 × 107pfu / mL( MOI = 20) 时,感染BRL - 3A细胞48 h,细胞状态保持良好且感染效果最好。在随后的qRT - PCR和Western - blot检测中,验证了以浓度为1 × 107pfu / mL的Ad - CMV - Hsp70 ( MOI = 20) 感染BRL -3A细胞48 h,Hsp70的mRNA丰度和蛋白表达量较其他浓度和作用时间要高( P <0. 01) ,从而确定了以浓度为1 × 107pfu / mL的Ad - CMV - Hsp70感染BRL - 3A细胞48 h,使其过表达Hsp70, 其MOI值与王莉梅等[2]、王澎[3]、杨柳芹等[4]报道的腺病毒载体MOI值相符。

虽然很多试验结果显示,使用腺病毒载体感染的方法能让目的基因在靶细胞上过表达,如Z. Q. Yuan等[5]利用腺病毒介导的Hsp70感染肠上皮细胞,检测到目的基因感染组Hsp70比对照组过表达。本次试验结果显示,Ad - CMV - Hsp70组较Ad - CMV - Null组和无病毒组在Hsp70 mRNA丰度上有较大差异,但Hsp70蛋白水平的差异不及mRNA水平。分析原因可能是,Hsp70属于一种应激蛋白,其mRNA在应激条件下稳定性极强,半衰期可达4 h,但是常温条件下却不稳定,半衰期只有15 ~30 min[6]。本试验中Ad - CMV - Hsp70组的Hsp70表达水平较其他组略高,但不及以往文献报道的明显,推测是Ad - CMV - Hsp70组很多过表达的mRNA在尚未翻译成蛋白质的时候就被降解。笔者认为,腺病毒载体感染目的基因过表达的效果,可能与目的基因的性质及被感染的靶细胞性质密切相关。

在不同条件下确定一次函数表达式 篇6

例1在弹性限度内,弹簧的长度y( 厘米) 是所挂物体质量x( 千克) 的一次函数. 一根弹簧不挂物体时长14. 5厘米; 当所挂物体的质量为3千克时,弹簧长16厘米. 请写出y与x之间的关系式,并求当所挂物体的质量为4千克时弹簧的长度.

解: 设弹簧的长度与所挂物体质量之间的函数表达式为: y = kx + b( k≠0)

所以在弹性限度内,y =0. 5x +14. 5.

当x =4时,y =0. 5×4 +14. 5 =16. 5( 厘米) .

答: 物体的质量为4千克时,弹簧长度为16. 5厘米.

例2如图,一次函数的图象l1与正比例函数的图象l2 交于点A,且l1过y上的点B,请分别求出这两个函数的表达式.

解: 设一次函数和正比例函数的表达式分别为y = kx + b和y = mx由图象信息知直线l1经过点A( 2,6) ,B( 0,3) 由此得一次函数y = kx + b的两对对应值: x = 2时,y =6; x =0时,y =3把它们代入y = kx + b中,得6 = 2k + b①,3 = b②; 把b = 3代入①中,得k =3/2所以一次函数的表达式y =3/2x + 3. 又直线l2也经过点A( 2,6) ,由此得正比例函数y = mx的一对对应值: x = 2时,y = 6. 代入y = mx中,得6 = 2m解得m =3. 故正比例函数的表达式y =3x.

例3声音在空气中传播的速度 ( 米/秒) ( 简称音速) 是气温 ( ℃) 的一次函数. 下表列出了一组不同气温时的音速.

( 1) 求音速与气温之间的函数关系式;

( 2) 气温在22℃时,某人看到烟花燃放5秒后才听到声响,那么此人与燃放烟花的所在地约相距多远?

( 2) 当x =22时,y =3/5×22 + 331 = 344. 2. 344. 2×5 = 1721( 米) . 所以此人与燃放烟花的所在地约相距1721米.

例4某商店购进一批单价为16元的日用品,销售一段时间后,为了获得更多利润,商店决定提高销售价格. 经试验发现,若按每件20元的价格销售时,每月能卖360件; 若按每件25元的价格销售时每月能卖210件. 假定每月销售件数y ( 件) 是价格x( 元/件) 的一次函数,试求y与x之间的函数关系式.

例5已知直线l与直线y = -2x平行,且与y轴交于点 ( 0,2) ,求直线l的解析式.

解: 设直线l为y = kx + b,

∵l与直线y = - 2x平行,∴k = - 2又直线过点( 0,2) ,

∴ 2 = - 2 × 0 + b,

∴ b = 2

∴原直线为y = - 2x + 2

表达条件优化 篇7

纵观数量众多的条件句表达范畴的前人研究, 其中关于习得方面的研究主要可以列举从语义功能 (スニーラット・ニャンジャローンスック 2001) , 句末语气制约 ( 堀2004) 以及母语迁移的视点出发 ( スニーラット・ニャンジャローンスック 1999) 进行的习得研究。

综上所述, 至今为止的前人研究当中, 尚缺乏对中国人日语学习者进行语法性判断测试的调查研究。

二、调查方法

本文以语法性判断测试为调查方法, 以中国人日语学习者为调查对象, 进行日语条件表达范畴习得的定量研究。本文的语法性判断测试依据前人研究中对“と”“たら”“ば”“なら”的语义分类制作成调查问卷, 并请学习者进行正误判断。计算学习者的得分情况, 并且进行对“と”“たら”“ば”“なら”四种表达范畴的分别计分, 考察这四种表达范畴的正用顺序以及习得情况。

三、结果和分析

本文参照庵 (2001) 与李 (2003) 对条件句表达范畴的分类, 将条件句表达范畴的用法做以下分类:

A.前件が完了してから後件が起きることを表す。

A-1仮定条件:｢ば｣、｢たら｣例⑤、⑩、⑬

A-2反事実的条件:｢ば｣、｢たら｣例⑥、⑭

A-3反複・習慣条件:｢と｣、｢ば｣、｢たら｣例④、⑪

A-4一般的条件:｢と｣、｢ば｣、｢たら｣例③、⑦、⑮

A-5確定的条件:｢と｣、｢たら｣例①、⑧、⑫

B.後件が前件よりも先行するような関係を表す。

B-1仮定的条件:｢なら｣例⑨

B-2反事実的条件:｢なら｣例②、⑯

文法性测试共16 问, 64 个句子, 每个句子的分值为1 分, 满分总计64 分。受验的43 名学习者同为大学三年级的日语专业学生。受验的43 名学习者的平均得分数为36.53 分, 中央值为37 分。依据中央值将43 名学习者分为上位群组和下位群组。分值在37 分 (包含37 分在内) 以上的分为上位群组, 分值在37 分以下的分为下位群组。下位群组共18 人, 平均值为31.5。上位群组共25 人, 平均值为40.16。语法性判断测试得分的平均值以及标准偏差如表2所示。

通过上位群和下位群的标准偏差值的对比可以得知, 由于下位群组的标准偏差值要较上位群组的标准偏差值大, 所以下位群组的分值不稳定, 也就是说, 在下位群组中最高分与最低分之间的差值要大于上位群组中最高分与最低分之间的差值。

另外, 本文通过分别计算出每个问题的正答率, 考察了“と”“たら”“ば”“なら”四种句式的正用顺序。根据64 个问题正确与否的标准将题目分成两组, 统计做出正确回答的人数, 计算正答率。结果显示本次调查中, 四种句式的正用顺序从高到低的顺序依次为“と”>“たら”>“なら”>“ば”。证明对于学习者来说, “と”句式的习得难度较低, 易于习得, 学习者对“と”句式的掌握程度要好于其他三个句式。相对来说, “ば”句式的习得难易度最高。“ば”句式的习得情况要落后于其他三种句式。

四、结语

本文以语法性判断测试为调查方法, 分析考察了中国人日语学习者关于“と”“たら”“ば”“なら”句式的习得情况。但是本文进行的语法性判断测试只对学习者对于条件句表达范畴的理解能力进行了横断的定量研究, 并未进行纵断的对比研究。并且以后的研究有必要聚焦于学习者对于条件句表达范畴的产出能力, 进行中国人日语学习者的习得研究。

参考文献

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[2]庵功雄.2001.新しい日本語学入門[M].スリーエーネットワーク.

[3]スニーラット・ニャンジャローンスック.1999.タイ語母語話者による条件表現｢と・ば・たら・なら｣の習得[J].言語文化と日本語教育 (18) .p:25-35.

[4]スニーラット・ニャンジャローンスック.2001.タイ語母語話者による条件表現の縦断研究―全体的な分析―[J].言語文化と日本語教育 (22) .p:38-49.

[5]堀恵子.2004.バ条件文の文末制約を再考する―日本語母語話者に対する適格性判断調査から―[J].言語と文明 (2) .p:108-135.麗澤大学大学院言語教育研究科論集.

甲醇合成工艺条件优化 篇8

甲醇合成采用的催化剂为KATALCO51-9。目前KATALCO51-9型催化剂在国内甲醇生产中应用较为广泛,市场占有率超过50%。因此,本研究不仅具有一定的理论意义,更具有较好的实际应用价值。

1系统简介

1.1合成系统组成

合成系统按功能主要划分为气源、反应装置、冷凝分离、分析检测等4个单元。各单元的组成如下。

(1)气源单元

CO、H2、CO2、N2、CH4等来自于前系统转化单元和变压吸附单元。

(2)反应装置

甲醇合成塔(D121、D122)。

(3)冷凝分离单元

进出口换热器(E121、E123A/B)、冷凝器(E122、E124)、气液分离器(D321、D322)、过滤器(H321A/B、H322A/B)、流量调节阀、压力调节阀、温度控制阀。

(4)分析检测单元

气体组分在线分析仪、在线热电偶、压力表、流量计等。

1.2总工艺流程

原料气CO、H2、CO2、N2、CH4等以一定的比例并配以不同量的循环弛放气经过不同的进出塔换热器后进入两合成塔,在一定温度、压力和催化剂作用下部分转化为甲醇。反应后的气体经冷凝、分离为气液两相物流。为了排掉合成反应过程中不能反应的惰性组分,合成系统必须放掉一部分弛放气。由流量计、在线分析仪测量元件,得到弛放气排放量、各组分浓度等实验数据,液相产品通过流量计分析检测单元得到所需实验数据。实验流程如图1所示。

D121—第一合成塔; D122—第二合成塔;D123—第一合成汽包; D124—第二合成汽包;E121—第一合成塔进出口换热器;E123A/B—第二合成塔进出口换热器;E122—第一合成塔冷凝器;E124—第二合成塔冷凝器;D321—第一合成塔气液分离器;D322—第二合成塔气液分离器;H321A/B—D321出口过滤器;H322A/B—D322出口过滤器;FV3503—粗甲醇流量调节阀;FV3301—合成回路压力调节阀;TV3401—第一合成塔入口温度控制阀;TV3402—第二合成塔入口温度控制阀;AI3701/3702/2201—气体组分在线分析仪;TC—合成塔入口温度控制显示表;PIC3302—合成回路压力控制显示表;FIC3503—粗甲醇流量控制显示表;J111/2—合成气压缩机;J121—合成回路循环压缩机

2测试前装置状况

试验是在装置开车轻负荷运行之后进行的,催化剂的状况及开车情况如下。

2.1催化剂的装填与还原情况

D121合成塔、D122合成塔底部分别装了ϕ6 mm瓷球和ϕ13 mm耐火球,每个塔装KATALCO51-9催化剂396桶,约重83.16 t。装填完成后,合成回路氮气充压到0.65 MPa,启动循环机,控制氮气循环量在38 500～43 000 m3/h,进行配氢、升温还原,直到合成催化剂升温还原全部结束,整个还原共计153 h。期间D121累计出水54.5桶(11 445 kg),D122累计出水56桶(约11 760 kg)。在催化剂还原期间,出口CO2间歇排放,控制出口CO2含量小于20%。还原结束后转入轻负荷运转。

2.2轻负荷运行

轻负荷运行是进入满负荷运行前的一个必须程序。催化剂活化后,初活性较高,一般高于耐热后活性30%,为防止催化剂床层超温,延长催化剂使用寿命,一般都需要经历轻负荷运行过程。另外,为保证实验结果前后的一致性,不因催化剂活性降低而影响到测试数据的可靠性,数据测试工作在催化剂耐热后,即轻负荷运行之后进行。催化剂还原结束后,系统用N2逐步升压至3.0 MPa,N2含量达到100%,催化剂床层温度达200 ℃,在较低温度情况下切入原料气,系统正式进入轻负荷运行阶段,时间约为1 d。

3试验结果与讨论

轻负荷运行之后,分别就温度、压力、进合成系统新鲜气量、氢碳比等工艺条件对甲醇合成CO、CO2、总碳转化率,粗甲醇产量,甲醇选择性以及精甲醇产量的影响进行了实验,并找出其中的规律,给出合理的解释。为了便于取点计算,以上所有转化率计算值都为总转化率,同时,安排了正交实验,就各条件对甲醇合成综合性指标(精甲醇产量)的敏感性进行分析,得出了影响程度的次序。

通常对每个工艺条件实验要求测定三到四个点,每个点的测定时间间隔至少2 h以上,这是充分考虑了某一个工艺参数调整后,系统恢复稳定需要一定的时间确定的,因此必须在系统重新稳定之后才可以测定实验数据。

3.1反应温度的影响

在(H2-CO2)/(CO+CO2)=2.25,进合成系统新鲜气量为321 850 m3/h,且两合成塔D121与D122的新鲜气比例为1∶2,合成系统压力P 7.55 MPa的条件下,考察了合成塔入口温度对KATALCO51-9催化剂甲醇合成反应性能的影响,考察结果如表1。

根据实验数据,温度对CO、CO2、总碳转化率的影响如图2所示,对粗甲醇产量的影响如图3,对选择性的影响如图4,对精甲醇产量的影响如图5。

由图2可以看出,合成塔入口温度在216～222 ℃之间,CO、总碳转化率呈增长趋势。CO2转化率呈先增加后下降趋势,在220 ℃出现最高点。

图3、4、5显示,在低温时粗甲醇产量低、选择性较差、精甲醇产量也低,以220 ℃开始,粗甲醇产量、选择性、精甲醇产量迅速增加,222 ℃达最高值。合成塔入口设计温度为230 ℃,由此可见,入口温度低于设计温度对甲醇合成有不利的影响。

合成甲醇主要化学反应为CO和H2的反应:

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CO2与H2发生以下反应:

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同时,反应过程除生成甲醇外,还伴随发生一些副反应,生成少量的烃、醇、醛、醚、酸和酯等化合物[3]。

甲醇合成主反应为强放热反应,温度升高,从热力学角度来看,降低了反应的平衡常数,使甲醇合成反应向着生成甲醇的逆方向进行,导致总碳转化率和甲醇产量下降。但从动力学角度来看,提升温度可以较大幅度提高甲醇合成过程中各反应的速率常数,因此各反应的反应速率升高,从而使相同时间内总碳转化率和甲醇产量还是升高。

另外,虽然温度升高对甲醇合成过程中正副反应速率有着等同的影响,但从图4可以看出,随着温度逐渐接近设计温度,甲醇的选择性明显提高,这对实际生产中减小甲醇精馏工段负荷、降低能耗,提高经济性非常有利。

由图5得知,该合成反应在入口温度为222 ℃时,精甲醇的产量最高。由于催化剂活性随着使用时间的增长会逐渐降低,所以目前在催化剂使用初期,催化剂活性最高,应控制在低于设计温度,如220 ℃。如若控制过高,虽然甲醇产量会增加,但由于此时催化剂活性高,会导致反应剧烈放热,引起催化剂床层过热,进而降低催化剂的使用寿命。随着催化剂使用时间的推移,活性慢慢降低,应逐渐提高合成塔入口温度,靠近设计温度,或略高于设计温度,以提高反应速率,保证甲醇的产率。如果催化剂初期就控制较高温度,等到催化剂后期则没有更多的提温空间,而不能保证甲醇的产率。

因此,实际工业生产过程反应器的操作温度要兼顾到催化剂使用的初期、中期和后期,根据反应状况,制定出合理的温度操作范围,实时调整操作温度。

3.2反应压力的影响

在(H2-CO2)/(CO+CO2)=2.25,进合成系统新鲜气量为321 850 m3/h且两合成塔D121与D122的新鲜气比例为1∶2,合成塔入口温度为222 ℃的条件下,考察了合成系统压力对KATALCO51-9催化剂甲醇合成反应性能的影响,考察结果如表2。

压力对CO、CO2、总碳转化率的影响如图6所示,对粗甲醇产量影响如图7,对选择性影响如图8,对精甲醇产量的影响如图9。

由式(1)和式(2)可知,合成甲醇反应是体积缩小的反应,压力提高,有利于反应向生成甲醇的方向进行;从动力学角度考虑,反应速率与反应物浓度的幂次方成正比[见式(4),(5)][4],压力提高,气体浓度增大,反应速率加快,这也有利于甲醇的生成。

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式中,undefined

从图6、7、9可以看出,随着压力的提高,CO转化率、CO2转化率、总碳转化率、粗甲醇以及精甲醇产量均呈上升趋势。从图8看出,甲醇选择性在合成压力7.55 MPa时最高,随后则呈下降趋势,主要原因是生成大分子副产物,如乙醇、甲醚等反应速率的增长速度更快,相对而言甲醇选择性降低。

现代甲醇合成多在7.0 MPa以上进行,压力升高,在其他工艺条件相同的情况下,必然要求合成气压缩机的输出功更大,能耗也就更高;当然,各设备的材料强度要求也会更高,初期投资相对更多。

3.3进合成系统新鲜气量的影响

在(H2-CO2)/(CO+CO2)=2.25,合成系统压力P 7.55 MPa和合成塔入口温度为222 ℃的条件下,考察了进合成系统不同的新鲜气量(两合成塔D121与D122的新鲜气比例不变,仍为1∶2)对甲醇合成反应的影响,考察结果如表3。

根据实验结果,进气量对CO、CO2、总碳转化率的影响如图10,对粗甲醇产量的影响如图11,对选择性的影响如图12,对精甲醇产量的影响如图13。

由图10可知,CO以及总碳转化率随着原料气进气量的升高而降低,这是因为随着合成系统原料气进气量的增加,气体流速增大,意味着单位反应气体与催化剂相对接触时间变短,所以CO以及总碳转化率随之降低。由于CO2在催化剂表面相对H2、CO吸附速率更快,原料气进气量的增加使更多的CO2占据了催化剂的表面,所以CO以及总碳转化率随进气量的增加呈下降趋势,而CO2的转化率呈增长趋势。

随着原料气流量的增加,精甲醇产量增加,见图13。进气量由312 000 m3/h增加到316 540 m3/h,即合成系统进气量增加1.6%,精甲醇产量增加1.9%。这是因为随着原料气进气量的增加,与单位催化剂接触的原料气增多,所以产量升高。因此,适当增加进气量有利于提高甲醇产量,但进气量的提高也会带来催化剂床层压降变大、合成气压缩机动力消耗增加等弊端。

在312 000～316 540 m3/h之间,随着进气量的增加,甲醇选择性上升,见图12。这可能是由于副反应的反应速率相对降得更快,致使甲醇选择性升高。之后随着原料气流量增加,甲醇的选择性呈下降趋势。

3.4氢碳比(H2-CO2)/(CO+CO2)的影响

在合成塔入口温度为222 ℃,进合成系统新鲜气量为321 850 m3/h,且两合成塔D121与D122的新鲜气比例为1∶2,合成系统压力P 7.55 MPa的条件下考察了氢碳比(H2-CO2)/(CO+CO2)对甲醇合成反应的影响,考察结果如表4。

氢碳比对CO、CO2、总碳转化率的影响如图14所示,对粗甲醇产量的影响如图15,对甲醇选择性的影响如图16,对精甲醇产量的影响如图17。

由图14可知,总碳转化率随氢碳比的增加而不断上升。氢碳比升高,意味着原料气中H2浓度的升高,而CO的浓度减少。从反应动力学考虑,这有利于总碳转化率的提高。

当(H2-CO2)/(CO+CO2)=2.14或2.5时,精甲醇产量都较大。氢碳比为2.14时,符合甲醇合成反应[式(1)与式(2)]要求的化学计量配比,但此时氢碳比低而不利于碳的转化反应。从图14、15、16可以看出,由于符合甲醇合成反应要求的化学计量配比,甲醇选择性较高,由于氢碳比低而不利于碳的转化,因此粗甲醇产量很小,但通过图17看出,此时的精甲醇产量很高,由此得出氢碳比为2.14时甲醇选择性提高占据主导地位,而CO、总碳转化率降低则次之,故最后表现为虽然碳转化率较低,但精甲醇产量还是很高。

当氢碳比为2.34时,精甲醇产量最小,虽然此时氢碳比的提高会导致碳转化率以及粗甲醇产量的提高,但由于此时偏离甲醇合成反应要求的化学计量配比,甲醇选择性很低,导致精甲醇产量降低,此氢碳比下甲醇选择性依然占据主导地位。

当氢碳比为2.50时,精甲醇产量又迅速增加,虽然此时氢碳比已远远偏离甲醇合成反应要求的化学计量配比而导致甲醇选择性降低,但此时氢碳比的提高会使碳转化率、粗甲醇产量迅速提高,导致精甲醇产量增加,此时氢碳比的提高使碳转化率、粗甲醇产量升高并占据主导地位。

通过图17看出,当(H2-CO2)/(CO+CO2)=2.50时,精甲醇产量最大。氢碳比控制在2.50较为合适。

氢碳比过低、过高对甲醇生产都是不利的。氢碳比过低不仅影响到甲醇产量,还会促使结炭反应的发生,影响催化剂的使用寿命;氢碳比过高,虽然甲醇产量升高,但带来的是由于甲醇选择性差导致精馏负荷增加、氢气回收负荷加大以及循环机能耗增加等不利结果。

3.5工艺条件对合成过程的敏感性分析

由上述分析可见,各工艺条件对甲醇合成均有不同程度的影响,为了找出主要影响因素,设计了三水平四因素的正交实验,实验配比如表5。

选择温度、压力、新鲜气量以及氢碳比等四因素对综合指标——精甲醇产量的影响进行了极差分析。“极差”是同一因素不同水平间的最大值与最小值的差。“极差”是衡量主要影响因素和次要影响因素的一个重要标准,“极差”越大,说明该因素对甲醇合成的影响越大;“极差”小,则说明该因素为次要因素。而且精甲醇产量指标是最大特性指标,则选使K最大的水平作为该因素的好水平。

正交实验结果和以精甲醇产量为指标对甲醇合成条件的极差分析结果见表6、7。

如表7,第一列温度因素K3>K2>K1,说明提高精甲醇产量,合成塔入口温度220 ℃水平要比218 ℃水平好,222 ℃水平还要比220 ℃水平好。同样,第二列压力因素的好水平是7.8 MPa,第三列氢碳比因素的好水平是2.5,第四列进合成系统原料气量因素的好水平是321 850 m3/h。

综合上述,最佳的组合为,温度为222 ℃,压力为7.8 MPa,氢碳比为2.5,进合成系统的原料气流量为321 850 m3/h 。由极差R确定各因素对指标的影响程度顺序。依照极差大小,各因素对精甲醇产量指标影响的大小顺序为:温度>进合成系统的原料气量>氢碳比>压力。

一般来说,当因素之间不存在交互作用时,通过计算分析得到的好条件要优于直接分析得到的好条件。如果存在交互作用,情况就比较复杂,需要配合其他方法再仔细分析,本文不考虑各因素之间的交互作用。

4结论

本研究工作得到下列主要结论。

(1)甲醇合成存在最佳的温度操作范围,温度过高或者过低不但会大幅度降低甲醇合成的转化率和产率,也会降低产物中甲醇的选择性,KATALCO51-9催化剂最佳操作温度为222 ℃。

(2)提高反应压力,有利于甲醇合成转化率和产率的提高,但甲醇选择性会有所降低。

(3)原料气流量适当增加会提高甲醇的选择性,增加精甲醇产量,但过多的提高进合成系统的原料气流量会使甲醇的选择性降低,同时也带来催化剂床层压降变大、合成气压缩机动力消耗增加等弊端。

(4)甲醇合成原料气(H2-CO2)/(CO+CO2)最佳比例为2.5。

(5)在选定的各工艺参数变化范围内,对精甲醇产量的影响因素从大到小依次为温度、进合成系统的原料气量、氢碳比、压力,最佳的工艺条件组合是温度为222 ℃,压力为7.8 MPa,氢碳比为2.5,进合成系统的原料气流量为321 850 m3/h。

参考文献

[1]张明辉.大型甲醇技术发展现状评述[J].化学工业,2007,25(10):8～12.

[2]Ipatieff V.N.,Monroe G.S..Synthesis of Methanol from Carbon Dioxide and Hydrogen over Copper-Alumina Cata-lysts.Mechanism of Reaction[J].J.Am.Chem.Soc.,1945,67(12),pp2168～2171.

[3]魏文德主编.有机化工原料大全(第二版)[M].北京:化学工业出版社,1999,804～822.

表达条件优化 篇9

选材：新颖鲜活

1. 相关名言素材

（1） 即使跌倒一百次，也要一百次地站起来。——张海迪

（2） 灾难是真理的第一程。——拜伦

（3） 生活是一面镜子，你对它笑，它就对你笑；你对它哭，它也对你哭。——萨克雷

（4） 并不是每一种灾难都是祸，早临的逆境往往是福。——夏普

（5） 不会从失败中找寻教训的人；他们的成功之路是遥远的。 ——拿破仑

（6） 苦难有如乌云，远望去但见墨黑一片，然而身临其下时不过是灰色而已。——里希特

名言素材仅仅是一种凭借，在名言的基础上还要生发出自己独特而富有个性的感悟。如果仅仅停留在别人论述的基础上，那这样的引用会矮化自己的文章。

如“张海迪曾经说过：‘即使跌倒一百次，也要一百次地站起来。’是的，只有爬起来，才可能站起来，而机遇永远都只垂青站着的人。”

2. 相关时事素材

（1） 麦当劳——3.15危机公关借鉴：众所周知，在国际消费者权益日来临的时刻，央视打假行动特别晚会，会成为全国民众关注的焦点。与此同时，让国内外企业紧张的一刻也将到来，因为，只有在315晚会的现场，你才能知晓谁将成为“被打”的对象，由此将带来一系列对被打对象不利的市场负面影响。我们看到太多在315晚会被曝光之后翻船的企业，麦当劳

却是险中求生，很巧妙地化解了一场在其他企业眼中实为难熬的危机。第一步：速度制胜，利用最新传播方式，及时向公众公开道歉并向相关监督部门表示感谢，诚意十足。第二步：决策制胜，及时向外界表明企业对事件的处理态度及行动措施。在被央视曝光之后，麦当劳能够就事件形式作出快速决策，这是体现企业管理团队工作效率的一个重要方面。第三步：感情制胜，争取更多基础消费者的同情心，让个案永远是个案。

在麦当劳被曝光的第二天，虽然国家相关部门已经约见麦当劳相关负责人，并对各个店面展开了前所未有的检查与检验，并发出整改通知，但是从麦当劳入店的消费人群来看，依然是“人满为患”。是消费者忽视了自身的消费安全权益，还是麦当劳被媒体小题大作，从市场的反映来看，显然是麦当劳胜利了。麦当劳并没有因此而陷入“翻船”境地，反而被央视的免费广告又火了一把。

（2） 高晓松的复出引得众人瞩目：出车祸固然让人同情，但大多数车祸，确实咎由自取。因为在路上的不小心，让自己在事业上遭遇低谷的明星大有人在，他们往往需要很长一段时间来重新修补自己的形象，从歌手林晓培醉酒驾车撞死人，到洛桑、牛振华酒后驾车导致车毁人亡，再到孔令辉酒后出车祸被扣了驾照，梁家辉酒后驾驶遭控告，吴宗宪酒后驾车事件轰动全台湾，相声演员刘伟醉驾导致追尾……而就是这段“关健”时刻，可能错过很多东西，甚至让自己事业最黄金的时间白白浪费。而高晓松却正好相反。因为在事发后认错态度较好，赢得了很多网友的支持。就搜狐娱乐所见，几乎所有媒体都在争相约他的采访。一时间，他成了人人争相哄抢的香饽饽。有传言称他出狱后身价不降反升，成为很多节目争相邀请的对象。

纵观近几年高考优秀作文的立意，情理兼具已成为普遍的亮点。所谓情理兼具，指作文的立意既要融注感性的韵味，也要透射理性的光辉。如果立意仅仅停留在感性的体验上，则会缺乏理性的睿智；如果只是阐释理性的思考，则会缺失感性的亲和。情理兼具，便能意趣横生。立意情理兼具的基本方法有二：一是让感性体验沉淀，从而探知立意的深层内涵；二是让理性思考灵动，从而增强立意的动人情韵。

除了名言素材、时事素材，还可以用课本素材、古典素材以及身边的鲜活素材。当然，素材的运用要力避撞车现象，就是运用通俗的古典素材，也要学会从更新的角度去做个性的解读。

语言：情理兼具

1. 让感性体验沉淀

其方法有二：一是缘事生理，即在叙事的基础上生发哲思。高考满分作文《忧与爱》一文中，叙写了虫落笔尖的情状，以小得不能再小的事件起兴，妙在刻画入微、精思入微、体察入微，遂使文章生发出无穷感慨，既有道家的“齐物”，佛家的“慈悲”，又自有顿悟而来的“忧与爱的哲学”的灵光。缘事生理，事例的叙述不同于记叙文的叙述与描写，议论文的叙述要简洁明了；道理阐述要力逼空话套话，要“靠船下篙”贴近事例进行入情入理的阐发。二是融理入情，即在抒情言语中融入哲理。如

满分作文《找回童年》，作者选取生活片段，诉说着童年的美好，表达了对现实的无奈。主旨句“美好的总是易逝的，但也总是永恒的。心是储存美好的最佳处所，童年的美好时刻依旧散发着芬芳，不管现实有多浑浊”则在感性抒情中投射深刻的理性思考。如果这两句换成“童年的时光总是美好的，徜徉在童年梦想，我如痴如醉；漫步在童年的世界，我如释重负。”这仅仅是感性的抒发，而缺乏理性的闪耀，立意肤浅。

2. 让理性思考灵动

其方法有二：一是以浅透深，即在阐释道理时，通过身边场景的亲近气息化解哲理的深奥，使立意既有层次又不失亲和。

如优秀作文《仰望星空与脚踏实地》，作者将抽象的道理通过形象记叙来生发：儿时的“我”仰望星空，爱做“向往星空”的梦，对美好的未来满是憧憬，可奶奶的一句“星空再美你一辈子也摸不到，瞎看半天也不能当饭吃”提醒了我圆梦需要脚踏实地，务实努力。文章以类似寓言故事的方式解读了作者对题意的理解，使得文章立意朴素而透辟。如果抽象地论述“理想与行动”、“信念与努力”等哲理问题，往往令读者近而远之，缺乏艺术感染力，立意就显得僵硬乏味。二是以情载理，即在感性抒发中蕴含丰富的哲理。如优秀作文《深阅读之美》，开头第一段，“一捧古卷”、“书香晕染”、“茶香缭绕”，寥寥数语，营造了温馨的读书氛围，也暗示了作者的观点——赞同深阅读。如果直接通过道理阐释揭示深阅读的好处，那么立意便缺乏诗意的韵味。作者在赞同深阅读的同时，对“浅阅读”也不是简单地予以否定，而是辩证地分析，将自己的观点流露在感性的叙写中，不着痕迹。作者称“浅阅读”是“一次眼睛的旅行”，“慰藉着人们忙碌的心”，在情感的诗意生发中透射深刻的哲理，使得文章具有较强的说服力和感染力。如果这一形象阐释换成 “浅阅读简单、实用、有趣，但是它只会给人表面的片刻的享受” 这一表述，则文章的立意便显得干瘪而浅俗。

锤炼好文章语言，尤为关键的是炼好主旨句。首先要将立意生活化。将看似高深的立意自然融入我们亲近的生活。比如“深阅读”便是“万籁俱寂之时，手捧泛黄的经典名著，心与文字眉目传情，神与作者作促膝长谈”；“浅阅读”则是“百无聊赖之时，随便看看时尚杂志，任意翻翻故事书”。然后将立意形象化。选用修辞使主旨句形象而富含哲理。

优秀作文《重拾遗落的厚重》则运用比喻打造出了这样情理兼具的主旨句：“文化快餐只能作为一种尝试，一种体验，它不能替代主食。重拾遗落的厚重，沉潜宁静，到知识的海洋中开拓一片全新的天地。”

围绕材料拟写的文章，有这样一个片段，其语言可谓情理兼具。

现在，“肯德基”已经逐步发展外卖业务，然而保守的“全聚德烤鸭”似乎真的被烤晕了，依然缺乏极富创意的营销策略。

说到底，“肯德基”成功营销的一个重要理念便是“亲民”，从大众的需要出发；与此同时，让大伙乖乖掏钱，最终将不起眼的鸡仔演化为神奇的餐饮帝国。

正宗“北京烤鸭”总是“高高在上”；“肯德基”则“全面渗透”，于是这场“PK”，“洋鸡”大胜“国鸭”并不意外。

蜜环菌培养条件优化 篇10

蜜环菌具有药用价值,对治疗腰腿疼痛、佝偻病、癫痫病均有功效。经常食用蜜环菌,可预防视力减退、夜盲、皮肤干燥,并可增强人体对某些呼吸道及消化道传染病的抵抗力。

蜜环菌营腐生为主,兼营寄生生活[6]。子实体一般7cm以上,丛生成伞状,具黄色或黄褐色的菌盖,直径5~15cm[7]。蜜环菌的菌丝体是蜜环菌的基本结构,一般以菌丝和菌索两种形式存在,并相互转换着侵染寄主[8]。

国外最早报道蜜环菌可以引起多种针叶树及阔叶树根瘤病,其寄主植物多达300属,但并非完全致病,相反有些被蜜环菌侵染的植物生长旺盛,有的必须有该菌侵染,植物才能正常生长发育[9]。由于中药天麻及猪苓必须依靠蜜环菌侵染提供营养才能生长繁殖,因此,引起国内外学者对该菌研究的极大兴趣[10]。近几十年来,国内外对蜜环菌进行了大量研究,结果证明蜜环菌发酵产物与天麻有类似的药物作用,具有镇静、抗惊厥、增强耐缺氧能力及增强肌体免疫功能等作用[11]。本试验通过对蜜环菌培养条件的优化,研究蜜环菌的生物学特性,为进一步利用蜜环菌资源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种为蜜环菌Armillariellasp.保存于实验室。马铃薯琼脂培养基(PDA培养基):马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫胺素10mg、琼脂20g、水100 mL;基础培养基(改良察氏培养基):葡萄糖20g、蛋白胨5g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、琼脂20g,加水1 000mL,pH自然。

1.2 方法

试验于2015年9-12月在黑龙江八一农垦大学实验室进行。

1.2.1不同碳源对菌丝生长的影响

以不加碳源的改良察氏培养基为基础培养基,供试碳源为:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维素、淀粉、甘露醇。培养基配制灭菌后倒入平皿,按常规无菌操作将大小一致的接种块接入平皿中心,每个处理5次重复,25℃恒温培养,观察其菌落形态变化,测其菌丝生长直径。

1.2.2不同氮源对菌丝生长的影响

以不加氮源的改良察氏培养基为基础培养基,供试氮源为:蛋白胨、酵母粉、尿素、豆饼粉、(NH4)2SO4、KNO3。每个处理5次重复,25℃恒温培养,观察其菌落形态变化,测其菌丝生长直径。

1.2.3温度对菌丝生长的影响

培养基采用PDA培养基,温度分别为10、20、25、30、37℃,共5个处理,每个处理重复5次,观察其菌落形态变化,测其菌丝生长直径。

1.2.4 pH对菌丝生长的影响

采用PDA培养基,用1mol·L-1NaOH和1mol·L-1HCl将培养基的初始pH分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,共6个处理,每个处理5次重复,25℃恒温培养,观察其菌落形态变化,测其菌丝生长直径。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对蜜环菌生长的影响

通过不同碳源的添加测定菌丝生长速率发现:供试的7种碳源中,葡萄糖为最佳碳源,最适合蜜环菌的生长(见表1),菌丝生长速率为17.5mm·d-1;该蜜环菌在利用蔗糖、麦芽糖这两种碳源时菌丝生长速率也较快,且二者生长能力差异不显著,但对淀粉的利用能力最差;尽管能够利用纤维素和乳糖,但菌丝的长势比较微弱(见表1)。

++++:菌丝生长旺盛;+++:菌丝生长中等;++:菌丝生长中等偏弱;+:菌丝生长稀少。下同。++++:exuberant grown;+++:medium grown;++:medium weak grown;+:scarce grown.The same below.

2.2 不同氮源对蜜环菌生长的影响

由表2可知,蜜环菌在所试不同氮源条件下都能生长,不同氮源条件下蜜环菌的生长状态差异显著。蛋白胨作为氮源,蜜环菌菌丝生长速率最大,为19.5mm·d-1,尿素作为氮源时蜜环菌菌丝生长速率最慢,为13.5 mm·d-1,无机氮硝酸钾、硫酸铵作为氮源情况下,蜜环菌菌丝生长速率分别为17.0、16.5mm·d-1。

2.3 温度对蜜环菌生长的影响

由图1可知,蜜环菌在不同温度下生长状况差异较大,在37℃ 下蜜环菌菌体无法生长,在10~30℃范围内蜜环菌菌丝均可生长,其中25和30℃下蜜环菌生长最好,二者差异较小,10~20℃次之。当温度低于20℃时菌丝生长速度缓慢,在20~30℃时菌丝生长较快,当温度高于30℃时生长速度下幅很大。

2.4 pH对蜜环菌的影响

从图2看出,蜜环菌在pH 3.0~9.0均可生长,其中pH 6.0时生长状况最好,在6.0处随着pH的升高或降低其菌丝生长速率减小。

3 结论

采用平板培养法,对蜜环菌在不同碳源、氮源、温度、pH条件下的生长状态做试验研究。通过试验可以看出,蜜环菌的生长对碳源的选择性高于对氮源的选择性,虽然多种不同碳源均能利用,但生长状况差别很大,表明蜜环菌对不同碳源的利用能力差别很大,其中葡萄糖作为碳源时蜜环菌生长最好,为最佳碳源。在对氮源的利用上,不管是无机氮还是有机氮,生长状况差别小于不同碳源间的差别,其中蛋白胨作为氮源时生长最好,为最佳氮源。在供试温度范围内,25~30℃为最适生长温度,37℃ 停止生长,在10℃低温条件下仍可生长。供试的pH范围内,pH6.0最适合蜜环菌生长,随着pH的升高或降低其菌落直径减小。

参考文献

[1]Kirk PM,Cannon PF,David JC,et al.Dictionary of the Fungi.9th Edition[M].CABI Publishing,2001.

[2]潘崇环,孙萍,龚翔,等.珍稀食用菌栽培与名贵野生菌的开发利用[M].北京:中国农业出版社,2004:223.

[3]徐锦堂.中国天麻栽培学[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版,1993.

[4]王秋颖,郭顺星,樊锦艳.不同蜜环菌菌株生物学特性及菌丝体多糖含量的研究[J].中国药学杂志,2001,36(9):588-590.

[5]李福后,王伟霞.5株蜜环菌产几种胞外酶活性比较[J].淮海工学院学报,2006,15(3):58-61.

[6]吴兴亮,连宾,邹方伦.贵州蜜环菌资源及其生态研究[J].贵州科学,2003,21(3):56-60.

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[8]Kibo T.Polysaccharides in fungi XXIX.Structural features of two antitumor polysaccharides from the friting bodies of Armillarea tabesens[J].Chemicaland Pharmaceutical Bulletin.,1992,40(8):2212-2214.

[9]郭顺星,徐锦堂.蜜环菌索发育的研究[J].真菌学报,1992,11(4):308-313.

[10]贺新生,吴钰娟.野生假蜜环菌生物学特性[J].食用菌,2008(2):19-21.