KAP基因（共3篇）
KAP基因 篇1
山羊绒是绒山羊次级毛囊的衍生物[1],是山羊的内层毛被。角蛋白(Keratin)及其关联蛋白(KAP)是羊绒主要的结构蛋白,它们决定了绒毛的基本特性[2]。根据氨基酸的组成,KAP可进一步分为高硫氨酸、超高硫氨酸和高甘氨酸/酪氨酸蛋白,KAP6-KAP8是高甘氨酸/酪氨酸(HGT)KAPs[3]。富含高甘氨酸/酪氨酸的KAP在不同毛发中所占比例不同,会造成毛发性质不同。通过对绵羊的研究,把高甘氨酸/酪氨酸KAPs划分为高甘氨酸/酪氨Ⅱ型蛋白(KAP6)和Ⅰ型蛋白(KAP7、KAP8)[4]。人、小鼠、绵羊的角蛋白及其关联蛋白研究得较多[5,6,7,8],山羊的毛发角蛋白及其关联蛋白基因也有相关报道[1,2,9,10],但不同地区、不同品种山羊HGT KAPs比较的研究很少,而且都长绒的不同物种之间的研究也很少。赵俊星等证明了HGT KAP8.2可能是影响绒山羊产绒性状的基因之一[11]。因此作者选取毛发性质不同的马头山羊、吐根堡奶山羊、藏山羊和驯鹿的HTG KAP8.2基因为研究对象,看不同品种山羊和驯鹿的HTG KAP8.2基因序列在核苷酸和氨基酸水平的差异,同时探测其在皮肤中的表达。推测HTG KAP8.2对毛发性质的影响,为最终彻底了解HGT KAP8.2对绒毛生长调控的分子机制奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选取妊娠125d、十月份的阿尔巴斯白绒山羊,从体侧部剪去绒和毛;碘酒消毒,酒精脱碘后,用消毒刀片取体侧部皮样品,立即投入液氮中保存备用。另取一部分皮样用4%的多聚甲醛固定24h,包埋制片。质粒载体为pBluescriptⅡSK ,菌种为E.coli DH5α,克隆载体为PMD-19T Vector,大连宝生物工程有限公司购买。
1.2 PCR引物的设计合成与扩增根据
GeneBank中报道的绵羊与阿尔巴斯白绒山羊序列利用DNAStar软件设计KAP8.2的特异性引物,其序列分别如下:KAP8.2上游引物(P1):5' GAACACTCATCTCTTAACAAAAAT 3';下游引物(P2):5' GATTAATAGAGGTCAAATGTCCAG 3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增反应体积为50μL,其中10×Buffer(含Mg2+)3.6μL,浓度为10pmol/L的上游引物和下游引物各2μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL,DNA模板2μL (100ng/μL),2.5mmol/L dNTPs 2.5μL,加灭菌双蒸水至50μL。
PCR反应条件为:94℃预变性5min;94℃变性1min,51℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸7min。
1.3 KAP8.2基因的克隆与分析
利用DNA回收试剂盒回收的目的片段,将目的基因片段与PMD-19T载体在T4连接酶的作用下进行连接,转化到JM109大肠杆菌感受态细胞,涂布在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB平板上进行蓝白筛选,挑取白色单个菌落进行培养,用碱裂解法抽提重组质粒。用PCR法再次进行鉴定,鉴定为阳性的克隆委托大连宝生物公司和上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA测序。
1.4 原位杂交
将重组质粒经PCR,体外转录制备DIG标记的cRNA探针。石蜡切片6μm,二甲苯脱蜡后用100%～50%的乙醇、磷酸缓冲液水化;切片用蛋白酶K(10mg/mL) 37℃消化30min。甘氨酸终止10min,PBS洗脱10min,三乙醇胺作用15min,2×SSC洗脱10min,50%的去离子甲酰胺预杂交30min。然后与DIG标记的cRNA探针45℃杂交12～16h。2×SSC buffer、NTE洗片,20 mg/mL RNase A 37℃消化15min,与抗体结合4h,然后和碱性磷酸酶反应12h。最后NBT/BCIP显色,伊红复染,在显微镜下观察并照相。
2 结果与分析
2.1 三种山羊和驯鹿KAP8.2部分cDNA的测序结果及分析
以马头山羊、吐根堡奶山羊、藏山羊和驯鹿的基因组DNA为模板,P1、P2为引物分别进行PCR扩增,克隆测序并分析。其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分别见图1和图2。编码区核苷酸序列的同源性和氨基酸序列的同源性分别见表1、表2。
2.2 皮肤组织的原位杂交
a1. KAP 8.2mRNA在内蒙古白绒山羊10月皮肤中的表达(40×);a2. KAP 8.2mRNA在内蒙古白绒山羊10月皮肤中的表达(40×);a3. KAP 8.2mRNA在内蒙古白绒山羊125d皮肤中的表达(100×);b1.内蒙古白绒山羊10月皮肤的对照(40×);b2.内蒙古白绒山羊10月皮肤的对照(40×);b3.内蒙古白绒山羊125d皮肤的对照(100×)。a1. Expression of mRNA probe of KAP 8.2 on adult Arbas cashmere goat skin in October;a2. Expression of mRNA probe of KAP 8.2 on adult Arbas cashmere goat skin in October; a3. Expression of mRNA probe of KAP8.2 on 125 days Arbas cashmere goat skin;b1. Control for adult Arbas cashmere goat skin in October;b2.Control for adult Arbas cashmere goat skin in October;b3. Control for 125 days Arbas cashmere goat skin.
3 讨论
3.1 人发和不同品种的羊毛中富含高甘氨酸/酪氨酸蛋白的含量从3%～13%,针宴鼠羽毛中高达约40%[12]。人、狒狒、猩猩KAPs基因的差异可以证明KAP基因变异的速度很快,变异容易保留,这也可能是动物毛被类型各不相同的主要原因[13]。不同动物毛被类型HGT KAPs所占的比例不同。许多研究表明,富含高甘氨酸/酪氨酸的KAP在不同毛发中所占比例不同,也许是造成毛发性质不同的一个重要原因。在绵羊发现了羊毛中完全缺少高甘氨酸/酪氨酸KAP的有光泽的突变体就充分证明了这一点[14]。不同地区、不同品种山羊所产羊毛羊绒的特征变化很大,例如光泽度、柔软度、颜色、细度长度和拉力强度等,都是羊绒品质的重要指标。马头山羊毛稀无绒,毛被以白色为主,有少量黑色和麻色。吐根堡奶山羊被毛褐色或浅褐色。藏山羊产毛产绒,绒毛纤细。阿尔巴斯白绒山羊产毛产绒,被毛白色纤细。驯鹿冬毛十分浓密,长毛中空,贴身的绒毛厚密而柔软。毛发上的这些差异是由毛囊角蛋白及其关联蛋白的基因或蛋白序列的差异造成,还是有其他因素,其具体机制尚不清楚。在赵俊星等证明了HGT KAP8.2可能是影响绒山羊产绒性状的基因之一的基础上[11],本试验选取KAP8.2为研究对象,探测KAP8.2在核苷酸和蛋白序列上是否是造成马头山羊、吐根堡奶山羊、藏山羊、内蒙古阿尔巴斯白绒山羊和驯鹿毛发性质差异的原因。
本试验发现,四种山羊和驯鹿的KAP8.2基因的编码区在核苷酸和氨基酸水平保守性高,表明四种山羊和驯鹿的KAP8.2基因可能来源于同一个基因。其中,马头山羊和藏山羊序列的一致性最高,反映了KAP8.2基因编码区的核苷酸和氨基酸序列对两种毛质没有影响,不同可能是其它因素引起的。阿尔巴斯白绒山羊和驯鹿的序列一致性最高,说明KAP8.2基因可能是驯鹿和阿尔巴斯白绒山羊绒共性的诸多原因之一。四种山羊和驯鹿的KAP8.2基因没有内含子,甘氨酸和酪氨酸的含量均高于40%,富含苯丙氨酸而缺少半胱氨酸,与高甘氨酸/酪氨酸Ⅱ型蛋白相比,Ⅰ型蛋白KAP8.2的溶解性较低。
3.2 各种动物的KAP基因的表达模式是相似的,但表达程度却变化极大,如HTG KAP在人发上表达很弱,但在羊毛和鼠毛上却很强[15]。因此研究KAP基因的表达不仅要了解其表达模式,还要通过其表达强度推测表达的量,进而了解其参与毛纤维组成的重要程度,为最终彻底了解HGT KAPs对羊毛和羊绒生长调控的精细机制奠定基础。
原位杂交结果显示Kap8.2mRNA在胚胎125d和成年10月份皮肤的初级毛囊和次级毛囊的皮质层均有强烈的表达信号,说明个gKap8.2是绒山羊毛和绒皮质角蛋白的组成成分,直接参与了绒毛和粗毛的合成,对绒山羊毛和绒的生长有重要的作用。从10月份皮肤毛囊的纵切结果可以看出Kap8.2mRNA在毛的髓质层呈区段性表达,在其底部有微弱的信号。结果清晰可见毛干的表皮层、毛的内外根鞘、皮脂腺处都没有阳性信号,说明g KAP8.2不是这些部位的组成成分。
羊毛的主要部分圆柱形皮质层,是由细胞排列不同的两个半圆柱体所构成,一半细胞排列较松,另一半排列较紧。羊毛的卷曲性就与这种特殊的结构有关,当羊毛从毛囊中长出,接触空气后,两个半圆柱体的膨胀程度不一样,因而造成羊毛的卷曲。Kap8.2mRNA在皮肤初级毛囊和次级毛囊的皮质层表达,表达信号很强烈,说明Kap8.2是羊毛和羊绒皮质层的重要组成部分之一,对羊毛的卷曲有重要的影响。Kap8.2mRNA在次级毛囊中的表达信号更强烈,表达的面积占次级毛囊的比重很大,可见Kap8.2时是羊绒重要的组成部分,对羊绒品质也起着重大影响,其具体的影响机制有待于进一步研究。
KAP基因 篇2
经过20多年的选育,我国成功培育出新疆细毛羊,具有适应性强、耐粗饲、产毛量高、毛质好、净毛率高、体大、肉多、味美、遗传性能稳定等优良品质。如何更好地开发、利用新疆细毛羊这一宝贵遗传资源,对我国畜牧业的发展具有十分重要的意义。研究以新疆细毛羊为研究对象,选取高甘氨酸/酪氨酸KAPs家族的KAP6.1作为影响羊毛品质的候选基因,研究其在基因序列上与其他品种羊的差异,旨在为进一步寻找控制新疆细毛羊羊毛性状及品质的主效基因提供理论基础。
1 材料
1.1 试验动物
新疆细毛羊6只,来自新疆农垦科学院种羊场。
1.2 主要试剂及仪器
大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD18-T载体、Taq酶、dNTPs,均购自宝生物工程(大连)有限公司;质粒小量制备试剂盒、Genclean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,均购自上海捷瑞生物工程有限公司;T4 DNA连接酶、DNA MarkerⅠ和DNA MarkerⅢ,购自天根生化科技(北京)有限公司;Trlzol Raegent、焦碳酸乙二脂(DEPC),购自Invitrogen公司。
凝胶成像系统,美国UVP公司生产;PCR仪(型号为TC-5000),英国TECHNE公司生产。
2 方法
2.1 采样
在羊体侧部肩胛后缘局部剪毛,消毒,剪取约2 cm×2 cm大小的皮肤,迅速用灭菌生理盐水冲洗3次,置于经高压灭菌的5 mL EP管中,封口,装入液氮罐中保存。
2.2 皮肤中总RNA的提取及检测
根据Trizol Raegent试剂说明书提供的方法提取皮肤总RNA。取冻存的皮肤组织100 mg左右,加入Trizol Raegent试剂1 mL;匀浆后加入氯仿0.2 mL,离心后吸取上清液;加入预冷异丙醇0.5 mL,离心沉淀后弃上清液,用800 mL/L DEPC乙醇清洗沉淀,再用DNase酶解可能残余的基因组DNA。利用DEPC处理的灭菌三蒸水溶解提取的RNA,-80 ℃冰箱保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA。
2.3 引物设计及合成
参考GenBank中绵羊KAP6.1(登录号为AY483218.1)基因的序列,采用Primer Premier 5.0软件分别设计KAP6.1特异性引物,预测扩增片段长度为320 bp,包括KAP6.1基因全部开放阅读框(ORF)252 bp,由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。KAP6.1 引物序列:上游引物为5′-GGATCCATGTGTGGCTACTACGGGAACT-3′,下游引物为 5′-AAGCTTAGAACTGGTGAATCCTGGTGT-3′。
2.4 cDNA的合成
以新疆细毛羊皮肤中提取的RNA为模板,Oligo(dT)为引物,用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver 3.0试剂盒合成cDNA第1条链,获得样品RNA的cDNA(s),反应体系(20 μL):总RNA 2.5 μL, Oligo(dT)2 μL,dNTP 2 μL, RNase-free ddH2O 8 μL。70 ℃加热5 min, 5×first-strand Buffer 4 μL,RNasin 0.5 μL,禽源反转录酶(MLV)1 μL,42 ℃50 min,95 ℃5 min终止反应。
2.5 KAP6.1基因的扩增
以cDNA为模板进行PCR反应,反应体系(20 μL):cDNA 1 μL,dNTP 1.5 μL,Buffer 2 μL,KAP6.1引物各1 μL,Taq 1 μL,双蒸水12.5 μL。反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸35 s,共34个循环;72 ℃再延伸10 min;将PCR产物于4 ℃保存。
2.6 感受态细胞的制备
转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,克隆的筛选等步骤均按照《分子克隆实验指南》[6]提供的方法进行。
2.7 pMD18-T- KAP6.1重组质粒的制备
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后切下目的条带,用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带,回收产物与pMD18-T载体连接,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑取蓝白斑筛选的白色菌落进行菌液PCR鉴定,对鉴定正确的菌液提取质粒作进一步酶切鉴定。
2.8 测序
将鉴定正确的重组质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
3 结果与分析
3.1 新疆细毛羊皮肤总RNA的提取
采用紫外分光光度计检测提取的总RNA,其OD260/OD280=2.04,说明提取的RNA有较好的纯度,结果见图1。
1,2.新疆细毛羊皮肤总RNA提取结果。
3.2 KAP6.1基因的扩增
以cDNA为模板进行PCR扩增,获得长度为320 bp的片段,见图2。序列测定结果表明,获得的目的条带与原始序列的同源性为100%。
M1.DL-600 Marker Ⅰ;1.目的基因扩增结果;2.无模板对照结果。
3.3 重组质粒的鉴定
将采用RT-PCR方法获得的目的片段连接到pMD18-T载体上进行克隆。挑取单个白色菌落分别于2 mL液体培养基中培养过夜,并提取质粒作为模板进行PCR扩增,电泳后得到长度为320 bp的片段,与预期结果相一致,结果见图3。说明目的片段成功插入到pMD18-T载体中,所得重组子为含有KAP6.1基因cDNA插入片段的重组阳性克隆质粒。采用BamHⅠ和HindⅢ酶切KAP6.1与pMD18-T的重组质粒,可见1条长度为320 bp的条带与pMD18-T载体片段,结果见图4。
1～5,7～9.KAP6.1与pMD18-T重组体阳性克隆;6,10.KAP6.1 与pMD18-T重组体阴性克隆;M1.DL-600 MarkerⅠ。
M1.DNA Marker Ⅲ;1,2.KAP6.1与pMD18-T重组体双酶切; 3.空泳道;M2.DNA MarkerⅠ。
3.4 测序结果分析
对重组质粒测序得到长度为320 bp的KAP6.1基因序列,其中包括252 bp的完全编码区,共编码83个氨基酸,结果见图5。
下画线部分为引物序列,粗体部分为ORF区,加框部分为 起始密码子和终止密码子。
采用DNAMan 4.0软件对新疆绵羊KAP6.1基因编码区进一步分析可知:碱基组成为A(12.7%)、C(25.0%)、T(33.7%)、G(28.6%)。其中嘧啶碱基(C+T)占58.7%,嘌呤碱基(A+G)占41.3%,G+C含量为53.6%。对氨基酸序列分析结果表明:KAP6.1基因共编码8种氨基酸,根据含量由低到高依次为天冬酰胺、苯丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸,其中酪氨酸含量为21.69%,甘氨酸含量为37.35%,甘氨酸与酪氨酸占氨基酸序列的59.04%,属于高甘氨酸/酪氨酸型。
3.5 新疆细毛羊KAP6.1基因cDNA编码区分析
将新疆细毛羊KAP6.1基因编码区核苷酸序列与GenBank中绵羊(登录号为AY483218.1)、山羊(登录号为AY310749.1)、兔(登录号为M95718.1)和人(登录号为NM_181602.1)的KAP6.1基因进行比较,并计算序列间同源性大小,见图5、表1、表2。试验结果表明:新疆绵羊与绵羊亲缘关系最近,同源性为99.2%,与山羊的同源性为94.8%,有13处核苷酸差异,与人和兔的同源性分别为80.8%、75.1%。由核苷酸序列推导的氨基酸序列比较可知,新疆细毛羊KAP6.1基因编码的氨基酸序列与绵羊、山羊、兔和人的同源性分别为97.59%、91.57%、71.11%、64.29%。
3.6 物种间分子系统进化树分析
利用DNAMan 4.0、Mega 2.0等生物软件对新疆细毛羊、绵羊、山羊、兔和人的核苷酸序列分别构建分子间系统进化树,见图6。试验结果表明:新疆细毛羊与绵羊先聚在一起,再与山羊聚为一类,之后与兔和人聚在一起。
4 讨论
试验采用RT-PCR方法从新疆细毛羊皮肤中克隆得到长度为320 bp的KAP6.1基因cDNA序列,包含完整的编码区。初步分析结果表明,新疆细毛羊与其他3个物种KAP6.1基因编码区在核苷酸和氨基酸序列上同源性在64%以上,特别是新疆细毛羊与绵羊同源性达99.2%,与山羊有13处核苷酸差异,同源性为94.8%。
通过比较新疆细毛羊、绵羊和山羊的编码区序列发现:与绵羊相比,新疆细毛羊有2处核苷酸和氨基酸突变,首先是位于编码区第52位的碱基A突变为G,导致甘氨酸转变为丝氨酸,第124位的G突变为A,导致丝氨酸转变为甘氨酸。与山羊相比,新疆细毛羊有13处核苷酸发生突变和7处氨基酸突变,编码区第18位G突变为A,第27位T突变为C,第52位A突变为G,第83位C突变为G,第84位C突变为T,第85位T突变为G,第135位T突变为G,第159位T突变为C,第176位A突变为G,第187位T突变为C,第194位G突变为A,第198位A突变为C,第199位A突变为T,相应引起第18位甘氨酸转变为丝氨酸,第28位半胱氨酸转变为丝氨酸,第29位甘氨酸转变为半胱氨酸,第59位半胱氨酸转变为络氨酸,第63位脯氨酸转变为丝氨酸,第65位络氨酸转变为半胱氨酸,第67位半胱氨酸转变为丝氨酸。进一步分析发现,这些氨基酸的不同与物种间的进化关系是相似的,新疆细毛羊与绵羊相近,其次与山羊相近。
新疆细毛羊与绵羊、山羊、兔及人之间KAP6.1基因分子系统进化树的结果反映了各物种间的进化关系和亲缘关系,说明亲缘关系越近的物种同源性越高、遗传距离越小。该结果同新疆细毛羊与这些物种在被毛、蛋白以及DNA水平上的研究结果基本一致,与各物种在动物学上的分类结果也基本一致,说明KAP6.1基因编码区适用于不同物种间进化起源和种系关系的研究。序列分析结果表明:虽然不同品种羊的毛质有差异,但是KAP6.1基因在核苷酸和氨基酸水平上却高度相似,说明新疆细毛羊与山羊KAP6.1基因可能起源于同一个基因,同时也说明KAP6.1基因在核苷酸和氨基酸水平上对不同羊被毛的品质没有影响,绒毛品质和绒毛结构形成机理可能受其他因素影响。
在不同物种或在同一物种不同品种的被毛中KAP结构和含量变化较大。L.M.Flanagan等[7]对美利奴、罗姆尼和考力代羊研究发现:无论是品种间还是品种内,羊毛中角蛋白的含量均无明显变化,而高硫蛋白的含量变化较大,其次是高甘氨酸/酪氨酸蛋白。各种动物的KAP基因表达模式是相似的,但表达程度却变化极大。不同物种在KAP多基因家族数量和表达上成正比,KAP的含量决定羊毛品质。
由于KAP基因的变异只导致毛发蛋白发生变异,是非致死突变,因此突变可以比较容易地保留下来。蛋白的差异可能导致羊毛品质的不同,因此对新疆细毛羊KAP6.1基因的调控、表达及其功能的认识还需进一步研究。
摘要：根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP)6.1(登录号为AY483218.1)基因序列设计合成2个特异性引物,以新疆细毛羊为研究对象,从采集的皮肤组织中提取RNA进行RT-PCR反应,扩增出长度为320 bp的特异性片段,回收目的片段并连接至pMD18-T载体后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,检测阳性克隆、测序并进行分析。结果表明:试验成功克隆了新疆细毛羊KAP6.1基因,得到的长度为320 bp序列中包含252 bp的编码区序列。新疆细毛羊与绵羊亲缘关系最近,同源性为99.2%,与山羊同源性为94.8%,有13处核苷酸差异与人和兔的同源性分别为80.8%、75.1%。
关键词：新疆细毛羊,角蛋白关联蛋白(KAP)6.1基因,序列分析
参考文献
[1]MCLAREN R J,ROGERS G R,DAVIES K P,et al.Linkage map-ping of wool keratin and keratin associated protein genes in sheep[J].Mammalian Genome,1997,8:938-940.
[2]POWELL B C,SLEIGH M J,WARD K A,et al.Mammalian kera-tin gene families:organization for genes coding for the B2 high sul-phur proteins sheep wool[J].Nucleic Acids Res,1983,11:5327-5346.
[3]PLOWMAN J E.Proteomic database of wool components[J].J Ch-romatogr B,2003,787:63-76.
[4]COCKETTNE S S.Analysis of the sheep genome[J].Physiol Ge-nomics,2001,7(2):69-78.
[5]管峰,石国庆,刘守仁,等.角蛋白家族及其对羊毛生长发育的调控[J].生命的化学,2007,27(1):92-94.
[6]萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].金冬雁,译.北京:科学出版社,1992.
KAP基因 篇3
1材料与方法
1.1试验材料在宁夏中卫山羊选育场采集187只中卫山羊的耳组织,-20 ℃保存。
1.2 PCR试验方法
1.2.1 DNA提取利用《分子克隆试验指南》的酚氯仿法提取中卫山羊耳组织DNA。
1.2.2 PCR引物上海生工生物工程股份有限公司合成[10]。
上游引物:TCAGAAACATCCTCTTGCAG
下游引物:TAGGCTAAGACGGTGATG
1.2.3 PCR反应体系25 μL反应体系为:DNA模板1 μL, 上游与下 游引物各1 μL, PCR 2 × Master Mix混合液(购自北京天根生化科技有限公司,包含酶,d NTP,缓冲液等)12.5 μL,双蒸水9.5 μL。
1.2.4 PCR扩增程序95 ℃预变性5 min,循环 (94 ℃ 变性45 s, 58 ℃ 退火45 s, 72 ℃ 延伸30 s)35个,最后延伸72 ℃ 10 min。
1.2.5 SSCP过程PCR产物上样前变性,在8%聚丙烯酰胺凝胶(30%丙烯酰胺13 m L,超纯水30 m L, 10×TBE 5m L,10%AP 350 μL,TEMED 35 μL)中150 v电压电泳4 h,银染显带。
1.3数据统计分析利用SAS 8.2软件进行卡方检验;利用中国水产科学研究院黄海水产研究所种质资源与工程育种室发布的多态信息含量计算软件PIC-Calc 0.6进行多态信息含量计算。
2结果与分析
2.1 DNA提取和PCR结果使用酚氯仿法提取187只中卫山羊耳组织的DNA,均提取到合乎质量的DNA。
赵苗等(2008)[10]设计的KAP6.2序列上的 引物,在内蒙古绒山羊中扩增得到了362 bp的片段。利用相同引物对187只中午山羊的DNA进行PCR扩增,得到了符合目的片段长度,特异性良好的一条PCR带,见图1,可以用于后续SSCP分析。
1~3 为 3 个样品经 PCR 后的产物条带;DNA marker 条带长度由 2 000、1 000、750、500、250、100 bp;目的 362 bp
2.2 SNP分型结果经聚丙酰胺凝胶电泳,银染显带后,检测中出现的所有基因型如图2所示,共有5种,分别是AA、BB、AB、BC和BD。
从图2中可以看到,共有A、B、C、D 4种基因型,其中A和B下面一条带重合,C与B也有一条带重合,而D的两条带与A、B、C均不重合。理论上存在AA、BB、CC和DD共4种纯合子,6种杂合子, 但所测个体中上仅出现2种纯合子与3种杂合子。
2.3基因型频率和基因频率统计分析KAP6.2基因在187只中卫山羊中检测到5种基因型、4个等位基因,有AA和BB 2种纯合基因型,AB、BC和BD 3种杂合基因型,统计得到基因型频率和基因频率见表1。
从表1中可以看到基因型以AA、AB、BB三种为主,尤以AA最多,占到所有个体的一半。A、B是优势等位基因,A基因频率最高,为61%。
2.4多态信息含量计算见表2。
将等位基因及其频率按格式输入PIC-Calc 0.6的文件中,运行程序,计算得PI=0.45,为中等多态。
3讨论
3.1KAP6.2基因的多 态位点内蒙 古绒山羊KAP6.2由675个核苷酸组成,59~352共294个核苷酸编码96个氨基酸[11]。试验用引物扩增片段为11~372区段共362 bp的序列,包含了5’端、外显子和3’端[10]。图1结果显示,可得到条带清晰单一的目的片段。图2的SSCP结果显示,试验得到的条带可见,此段序列共4个等位基因,其中A、 C、D分别与B组成了3种杂合子。因此,B分别与A、C、D存在SNP差异,但A、C、D之间的SNP不一定是在同一个位点上,这需要进一步的测序验证。
赵苗等(2008)[10]利用相同引物进行的PCR-SSCP分析 , 结果显示 : 内蒙古绒 山羊中出 现了AA、 BB、AB型,除去影子带后,与本试验的A、B带型相同,但未出现本试验的C、D等位基因。赵俊星等(2007)[12]扩增序列为73~370区段,共298 bp, 包含了外显子和3’端序列,从SSCP图谱看,与本试验图有很大差别,SNP位点与本试验有差别。王杰等(2010)[7]设计藏山羊的SSCP扩增序列为73~ 359区段,共287 bp,全部在外显子区域,而且只得到两种基因型AA和AB型,其中AA型为优势基因型。由于其片段差异,且SSCP图谱非常不清楚, 无法与本试验的等位基因位点进行比较。
3.2中卫山羊KAP6.2基因杂合度通过PCR-SSCP方法对中卫山羊群体KAP6.2基因多态性分析,共检测出5种基因型,其中纯合基因型2种,杂合基因型3种,AA和AB是主要基因型,频率分别为0.51和0.21;群体的多态信息含量、杂合度均处于中等水平,表明中卫山羊群体的KAP6.2基因的选择程度不是很大,没有造成很大的近交纯合。赵俊星等[12]在3个山羊品种中检测的KAP6.2基因多态在0.35~0.38间 , 赵苗等[10]的多态信 息含量为0.17,均低于本试验的0.45。中等程度的多态信息含量有助于进行后续SNP多态与绒毛性状的关联分析。
4结论
利用一对引物在中卫山羊群体中检测到KAP6.2基因上存在中度程度多态,有4个等位基因,其中A为优势等位基因,这将为后续SNP多态与绒毛性状的关联分析提供依据。
摘要：角蛋白关联蛋白KAP基因家族是毛生长发育的重要基因,其中KAP6.2基因影响山羊的绒毛性状。为研究在中卫山羊群体中其对绒毛的影响,本试验采集187只中卫山羊耳组织样提取DNA,利用PCR-SSCP技术检测KAP6.2基因的SNP多态。试验检测到5种基因型,4个等位基因,其中AA(基因型频率为0.51)为优势基因型,A(等位基因频率为0.61)为优势等位基因。群体多态信息含量为0.45,为中等多态。试验结果显示KAP6.2基因在中卫山羊群体中存在中等多态性,这将为在中卫山羊群体中开展绒毛性状与KAP6.2基因多态性的关联分析提供遗传根据。