精子活动力

精子活动力（通用10篇）

精子活动力 篇1

摘要：目的 探讨在宫腔内人工授精(IUI)过程中,处理后A、B级精子总数、精子正常形态率与IUI临床妊娠率的关系。方法 回顾该院2009年1月1日～8月31日330周期IUI的资料,比较了处理后A、B级精子总数、精子正常形态率对IUI临床妊娠率的影响。结果 ①治疗周期中排卵前后两次授精A、B级精子总数均≥(10×106)和均<(10×106)相比,其临床妊娠率分别为21.6%和9.0%,差异有显著性(P<0.05);若排卵前授精≥(10×106),排卵后<(10×106),其临床妊娠率为15.1%,与上述两组相比亦差异有显著性(P<0.05);②精子正常形态率<6%与精子正常形态率6%～10%、≥10%相比,其临床妊娠率差异有显著性(P<0.05)。结论 ①用于宫腔内人工授精的精液需要有10×106以上的A、B级精子总数,且排卵前授精和排卵后授精有相似的重要性;②用于宫腔内人工授精的精液精子正常形态率≥6%可获得较高的临床妊娠率。

关键词：活动精子总数,精子形态,宫腔内人工授精,临床妊娠率

男性不育是世界范围内困扰许多育龄夫妇的一个重要问题。据世界卫生组织调查,15.0%的育龄夫妇存在不育问题,其中有50%由男性不育引起。在现代辅助生殖技术中,人工授精技术日渐成熟,且应用非常广泛,宫腔内人工授精(intrauterine insemination,IUI)是治疗不孕症较早使用的手段之一,至今已得到广泛开展,但由于IUI的妊娠率较低,本文回顾性分析了我院2009年1月1日~8月31日330周期IUI的结果,比较了处理后A、B级精子总数、精子正常形态率与IUI临床妊娠率的关系。报告如下:

1 材料与方法

1.1 研究对象

回顾中信湘雅生殖与遗传专科医院2009年1月1日~8月31日330周期IUI的资料,妊娠周期均使用促排卵药物,进行严格的筛选,选择女方年龄<35岁、各项检测指标正常、输卵管至少有一条通畅的不孕夫妇。

1.2 方法

1.2.1 精液采集

受检者禁欲3~7 d,在本中心取精室通过手淫方法采集精液后置于干净的一次性取精杯中,然后立即在37℃恒温箱里静置,待其完全液化后进行检测。

1.2.2 密度梯度离心法优选高活动力的精子

(1)单层法(精液A+B<10×106):取2 m L 70%Sperm Grad沿管壁缓缓加入一支15 m L离心管底部;将混有2.5 mL F-10的已液化的精液沿管壁缓慢加入液体表面,注意应保持其与70%Sperm Grad液之间的界面清晰;室温下1 200 r/min离心20 min;弃上清液,留试管底部约0.3 mL液体,将其转移至装有4.5 mL F-10和0.5 mL血清的离心管内,充分混匀,再以1 200 r/min离心10 min;弃上清液,留取试管底部0.5 m L液体,充分混匀后在超净工作台内取其中10μL镜检。(2)双层法(精液A+B≥10×106):取1.5 mL 90%Sperm Grad液加入到一支15 mL离心管底部,再沿管壁缓慢加入1.5 mL 45%Sperm Grad液,注意两液面之间应保持清晰的界面;将混有2.5mL F-10的已液化的精液缓慢加入已配制的精子分离层中,注意保持精液与分离层的界面清晰;室温下,以1 200 r/min离心20 min;弃上清液,留试管底部约0.3 mL液体,将其转移至装有4.5 mL F-10和0.5 mL血清的离心管内,充分混匀,再以1200 r/min离心10 min;弃上清液,留取试管底部0.5 mL液体,充分混匀后在超净工作台内取其中10μL镜检。

1.2.3 改良巴氏染色法分析精子形态(WHO第四版的精液质量分析标准)

取液化精液0.5mL,加入生理盐水1.0 mL,5 000 r/min、3 min离心两次去除精浆,用生理盐水调整精子密度至(40~60)×106/mL,取20μL于清洁的载玻片上,均匀涂片后待其自然干燥,采用WHO第四版所推荐的改良巴氏染色方法进行染色,油镜下计数200个或以上精子的形态,求出每份精液样本的正常精子形态百分率。改良巴氏染色的正常形态精子标准是只有头、颈、中段和尾部都正常的精子才认为是正常,按此标准即头部椭圆形,精子头部长度为4.0~5.0μm,宽为2.5~3.5μm,长宽之比为1.50~1.75;顶体界限清晰,占头部的40.0%~70.0%;中段稍细,宽度<1μm,约为头部长度的1.5倍;尾部直、均一,比中段细,非卷曲,长度之约为45μm;如有胞浆小滴须大于正常头部大小的一半。根据这个分类标准,所有形态学处于临界状态的精子均列为异常。异常精子包括顶体过小、顶体过大、梨形头、圆形头、锥形头、不规则形头、头部空泡、颈部粗、颈部非对称性的接在头部、尾部弯曲(>90°)、尾部卷曲等[1]。

1.2.4 宫腔内人工授精

(1)IUI术前检查:IUI患者均来自我院门诊,接受IUI的妇女术前预先做妇科检查、子宫内膜诊断性刮宫、双侧输卵管通水试验、两个月经周期的基础体温测定和宫颈黏液评分。如有疾病者应先做相应治疗。(2)排卵监测:28 d月经周期者,于周期10~12 d开始来院进行排卵监测;测试基础体温并记录;根据宫颈外口开放程度、黏液拉丝度、羊齿状结晶、黏液量等生物体征评估排卵期;采用阴道B超,监测卵泡发育;血清E2及尿LH峰测定。(3)IUI操作:实施IUI的妇女在排卵前后进行授精,授精后均卧床0.5h[2]。

1.3 统计学处理

原始数据用SPSS13.0软件进行统计分析,各组率的比较采用χ2检验,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

治疗周期中排卵前后两次授精A、B级精子总数均≥(20×106)、(10×106)~(20×106)和(5×106)~(10×106)、<(5×106)相比,差异有显著性(P<0.05),按照卫生部176号文件“卫生部关于修订人类辅助生殖技术与人类精子库相关技术规范、基本标准和伦理”,IUI应达到15%的临床妊娠率,以A、B级精子总数(10×106)对表二分组。

2.1 活动精子总数对宫腔内人工授精临床妊娠率的影响

治疗周期中排卵前后两次授精A、B级精子总数均≥(10×106)和均<(10×106)相比,其临床妊娠率分别为21.6%和9.0%,差异有显著性(P<0.05),见表1;若排卵前授精≥10×106,排卵后<10×106,其临床妊娠率为15.1%,与上述两组相比差异亦有显著性的(P<0.05),见表1。

2.2 精子形态对宫腔内人工授精临床妊娠率的影响

精子正常形态率<6%与精子正常形态率6%~10%、≥10%相比,其临床妊娠率差异有显著性(P<0.05),见表2。

3 讨论

IUI是将精液经体外处理后获得一定数目的高活动力的精子,再用非性交的方式将这些精子经导管注入排卵期的女方子宫腔内,让精子和卵子自然结合以获得妊娠的一种辅助生殖技术,符合正常的生殖生理过程,具有经济、创伤小、操作简单的优点。

IUI的适应证有:(1)男性因少精、弱精、精液液化异常、性功能障碍、生殖器畸形等所致的不育;(2)女性因宫颈黏液分泌异常、生殖道畸形及心理因素导致性交不能等不孕;(3)免疫性不育;(4)原因不明的不育[2]。

宫腔内人工授精有利于精子获能,并且避免了不良的宫颈因素对精子游动的影响,缩短了精子游动的距离,从而增加了受孕的机会。对不育症(少精、弱精)患者来说,从精液中回收一定数量活动力强的精子是IUI获得妊娠的重要环节。通过对精液处理去除精浆中不利于授精的因素,减少或去除精浆内的前列腺素、免疫活性细胞、抗精子抗体、细菌与碎片,减少精液的黏稠性,促进精子获能,改善精子授精能力,富集较高活力的精子达到符合要求的精子密度,以高于自然受精条件下精子的密度使精子和卵子在输卵管中得以直接相遇,增加受孕率。因此,经体外处理的精液的质量与妊娠率有密切关系[2]。

影响IUI成功的因素很多,男性精液参数是重要因素,一般认为,要想达到预期的IUI妊娠率,精液处理后活动精子总数(post total motile sperm,PTMS)必须达到一定的数量,但到底数值为多少,各文献报道不一致,目前多数文献认为PTMS>10×106/m L时,可以获得较高的IUI临床妊娠率[3,4,5,6,7,8,9,10]。《人类辅助生殖技术规范》规定,人工授精的注入精子数应大于1 000万。

为了探讨在IUI过程中,处理后A、B级精子总数、精子正常形态率与IUI临床妊娠率的关系,便于将来更好向病人提供有益的咨询和作出合理的选择,本研究回顾了我院生殖中心2009年1月1日~8月31日330周期IUI的资料,比较了处理后A、B级精子总数、精子正常形态率对IUI临床妊娠率的影响。将治疗的330周期分成4组:PTMS<5×106/m L,5×106/mL≤PTMS<10×106/mL,10×106/mL≤PTMS<20×106/mL和PTMS≥20×106/mL。各组妊娠率分别是7.1%、11.5%、19.4%和22.2%,前两组与后两组间差异具有显著性(P<0.05),显然只有当PTMS≥10×106/m L时,患者才有可能获得较为理想的妊娠率。

卵子必须与精子适时结合才可授精,IUI的时机是妊娠率高低的基本条件。一般排卵发生在注射HCG 36 h左右,卵子从卵泡排出后只能生存24 h,且大多数排卵时间并不同步,会持续几个小时,授精时间只有16~18 h,第1次授精可以提供高活动力的精子给最先排出的卵,而第2次授精则可以给随后排出的卵子增加活动精子,从而提高妊娠率[4]。

本研究对两次授精的研究结果表明:治疗周期中排卵前后两次授精A、B级精子总数均≥(10×106)和均<(10×106)相比,其临床妊娠率分别为21.6%和9.0%,差异有显著性(P<0.05);若排卵前授精≥(10×106),排卵后<(10×106),其临床妊娠率为15.1%,与上述两组相比差异亦有显著性(P<0.05)。

精液常规分析(包括精子密度、精子活动率、精子活动力等)是临床上评价男性生育能力的主要检查项目,人类精液常规受各种因素的影响,变化较大。目前尚无一种方法可以确切地评价男性生育能力,临床上往往采用一组精液检测结果综合分析而作出判断。精子形态学分析是近年来才在我国逐渐被重视的用于评价男性生育力的检测指标之一,精子形态的分类最初由MACLEOD等[11]于1951年提出,此后众多的研究者提出了多种对精子形态的分类方法,一直以来,精子形态在男性不育症中所起的作用很有争议,部分学者认为精子形态对预测IU的妊娠率有意义[7,8,9,10,11,12,13],本研究结果表明:精子正常形态率<6%与精子正常形态率6%~10%、≥10%相比,其IUI临床妊娠率差异有显著性(P<0.05)。

IUI较为经济、更符合正常生殖生理,当原发性男性不育病因治疗无效时,通常先尝试IUI治疗,但与IVF-ET和ICSI相比,后者的适用范围更广,获得的妊娠率也更高。因此,如能事先对就诊的不孕夫妇进行筛查,使通过IUI受孕机会较小的病例,直接求助疗效更为可靠的其他辅助生殖技术,就可以避免不必要的IUI治疗对患者造成身体、精神和经济上的损害。

虽然本研究调查的病例数非常有限。本组也没有调研女性因素对妊娠率的影响,而据报道这些参数均与IUI妊娠率有一定的关系,这都有待于在将来的工作中做进一步研究。

笔者认为注入活动精子数与IUI临床妊娠率密切相关,用于宫腔内人工授精的精液需要有(10×106)以上的A、B级精子总数,且排卵前授精和排卵后授精有相似的重要性,根据我院IUI精液处理的回收率,单层法50%~70%,双层法15%~40%,上游法10%~30%,精液处理前应有相应的活动精子总数;用于宫腔内人工授精的精液精子正常形态率≥6%可获得较高的临床妊娠率。

精子的导航功能 篇2

在谈到人类精于为何能在较短的时间内，顺着子宫摸到输卵管开口，再沿着输卵管前进，通过输卵管狭部，与卵巢排出的卵子“楼台相会”而结合。这从解剖学的观点来看，只不过是尺把长的一段路程，但对那么丁点儿大的连肉眼都看不见的精子和卵子来讲，似乎不亚于“万里长征”。令人奇怪的是，在通常情况下女子每月只有一侧卵巢排一只卵子，那成百万千万的精子怎么会知晓这次是哪条输卵管有卵子呢?莫不是精子们也知道“兵分两路”去围堵两条输卵管而万无一失?否则，那成群的精子若向那条没有排卵的输卵管游去的话，岂不是全都扑个空吗?但事实上并非如此。要讲清这个道理，还得从鱼类生殖功能去寻找答案。

众所周知，鱼类是体外受精，那雄鱼把成熟的精子排放到水里，雌鱼也把成熟的卵子排放到水中，在一片汪洋的大海里，那鱼的精子不但能找到卵子，而且还要区别与它同类的卵子才相结合，繁衍下代，丝毫没有差错。这真比大海捞针还难得多，但它们都各自找到并完成受精的任务。这似乎比人类精子顺着子宫、输卵管寻找卵子还更为困难得多，这实在是一种惊人的本领!其间究竟是什么奥妙呢?

美国科学家经过多年的研究发现，鱼类、人类乃至所有动物的精子都有这种本领。原因是人的鼻子里能够闻到气味的一种小型化学分子受纳器并非鼻子所独有，在人类和动物的精子上也有类似功能。因此，精子依靠这种本领可闻到卵子发出的一种特有香味，引导精子向卵子存在的方位游去，从而得以结合。科学家研究揭示了这一科学之谜，也许有人会这样说“这真是吃饱饭没事干”，那未免是冤枉了科学家，抑或是自我的无知。殊不知科学家正在研究一种方法，使精子丧失闻到卵子发出香味的这种功能，使精子无法找到卵子，因而精卵无从结合，从而达到安全避孕的目的，岂不美哉善哉!

精子活动力 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年5月至2010年7月期间, 南方医科大学附属顺德第一人民医院不孕不育专科门诊收治不育症患者的精液标本496例, 患者年龄22~46岁, 平均 (29.42±6.61) 岁。所有患者均为结婚一年以上。精子计数板 (Makler Counting chamber) 采用以色列产的Sefi-medica Instruments。

1.2 精液标本采集方法

检查前禁欲3~7d, 采用手淫的方法取精液于干燥洁净广口瓶内, 置于37℃水浴箱内液化后进行检测。

1.3 精子形态分析方法

取液化后的精液于载玻片上, 拉薄涂片, 采用乙醚酒精固定后, 经改良巴氏染色方法染色, 封片后镜检, 按照WHO的标准[3]计数200个以上精子, 分别计算正常形态精子、头部缺陷、中段缺陷、尾部缺陷及混合缺陷精子的百分率, 并由两名实验室专业人员进行阅片。

1.4 精液常规分析

取10μL液化后精液于精子计数板上, 按照WHO技术规范进[4]行操作。

1.5 评价指标

根据WHO规定[5], 正常男性精液常规分析参考值为:精液量≥2m L, 精子密度≥20×106/m L、精子活动力a级精子≥25%或a级+b级精子≥50%。

1.6 统计学分析

数据采用SPSS 12.0软件进行统计学处理和分析, 资料采用t检验和χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精液常规分析及精子形态学分析结果

4 9 6例患者的精液经常规分析:精子活力正常为4 8.7 9% (242/496) , 精子活力不足为51.21% (254/496) 。496例患者精子形态学分析:正常形态精液占29.64% (147/496) , 畸形精子症占70.36% (349/496) 。

2.2 精子形态在精子活力低下与正常中的比较结果

与精子活力正常组相比, 精子活力低下组的精子形态正常比率明显下降, 且畸形精子的比率明显升高, 差异均具有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

3 讨论

注:与精子活力正常组相比, *表示P<0.05

近几年随着人们对人类生殖问题认识的提高以及男科学研究的飞速发展男性不育的发现率逐步增高, 已引起男科学工作者的高度重视。随着医学科学的发展, 男科学的迅速崛起, 以及不育症的患者增加, 简单精液常规检查已经不能满足临床发展的需要, 也不能全面、客观地反映患者的真实情况, 更不能评价睾丸功能。已有研究证明, 精子形态正常百分率与精子活力之间具有正相关关系, 且精子形态异常率增高可以导致精子运动能力的下降, 进而引起男性不育[6]。

精子形态学是为了了解正常精子与生理及病理范围内的变异精子所占的比例, 是反映男性生育能力的一个重要指标。精子形态学需要经过染色鉴别, 正常的精子应该含有一椭圆形的头端和鞭子一样的尾部, 头端呈圆形或者过大, 尾部曲缩的精子都是异常精子, 其速度减慢, 不能到达输卵管, 而无法与卵子结合[7]。在以往的精液检验中, 常将精液中的“圆形细胞”都报告为“白细胞”, 实际上这些圆形细胞大约70%是生精细胞, 从而缺乏鉴别能力, 造成临床误诊, 当前虽然有所改观, 但仍然不理想, 因此, 在精液的检验中应重视用染色方法, 油镜观察, 不能停留在过去的认识和分类, 应该依精子凋亡形态和生精细胞凋亡形态进行分类。精子质量的分析已成为临床上了解男性生育能力的重要检测项目, 而精子形态学分析则是近年来才受到重视的, 也被认为是反映男性生育能力的重要指标之一[8]。

本研究结果表明, 496例患者的精液经常规分析:精子活力正常为48.79% (242/496) , 精子活力不足为51.21% (254/496) 。496例患者精子形态学分析:正常形态精液占29.64% (147/496) , 畸形精子症占70.36% (349/496) ;与精子活力正常组相比, 精子活力低下组的精子形态正常比率明显下降, 且畸形精子的比率明显升高, 差异均具有统计学意义 (P<0.05) 。由此可见, 精子形态与精子活动力呈正相关, 在男性不育症患者中进行精子形态的观察具有十分重要的临床诊断价值。

摘要：目的 探讨精子形态与精子活动力的相关性, 以及其在男性不育症中的诊断意义。方法 对496例男性不育患者精液标本采用Makler精子计数板进行常规分析, 并用改良巴氏染色法进行精子形态学分析。结果 496例患者的精液经常规分析:精子活力正常为48.79% (242/496) , 精子活力不足为51.21% (254/496) 。496例患者精子形态学分析:正常形态精液占29.64% (147/496) , 畸形精子症占70.36% (349/496) ;与精子活力正常组相比, 精子活力低下组的精子形态正常比率明显下降, 且畸形精子的比率明显升高, 差异均具有统计学意义 (P<0.05) 。结论 精子形态与精子活动力呈正相关, 在男性不育症患者中进行精子形态的观察具有十分重要的临床诊断价值。

关键词：精子形态,精子活动力,不育症,诊断

参考文献

[1]刘德一, 朱伟杰, Gordon BHW.精子功能检测对选择IVF或ICSI治疗不育症的临床意义[J].生殖与避孕, 2004, 24 (4) :193-194.

[2]王书佳, 李慕军.精子形态学在男性不育中的研究进展[J].医学综述, 2009, 15 (10) :1540-1543.

[3]Kruger TF, Menkveld R, Stander FSH, et al.Sperm morphologic features as a prognostic factor in in-vitro fertilization[J].Fertil.Steril, 1986, 46 (6) :1118-1123.

[4]World Health Organization.WHO Laboratory Manual for Exami-nation of human semen and Semen-Cervical Mucus Interaction[M].Cambridge, UK:Cambridge University Press, 1999.

[5]叶应妩, 王毓三, 申子瑜.全国临床检验操作规程[M].3版.南京:东南大学出版社, 2006:321-991.

[6]刘居理, 罗明, 熊国保等.精子形态与精子活力的相关性分析[J].现代诊断与治疗, 2009, 20 (2) :71-72.

[7]蒋敏, 陈新敏, 岳焕勋等.精子形态学分析在男性不孕症诊断中的应用[J].中国优生与遗传杂志, 2007, 15 (6) :106-107.

可乐：精子剿杀剂？ 篇4

科学验证才是硬道理 奇思妙想当然也需要科学验证。1985年，美国哈佛医学院妇产科的Umpierre、Hill和Anderson为一验其真伪，便在实验室内倒腾开来。他们向三支装有可乐的试管中，加入冷冻的精子。经过观察，欣喜的结果出炉：精子数量减少;可乐能影响精子活力。相关结论以读者来信形式，发表在当年11月21日刊出的《新英格兰医学杂志》。此论断一出，顿时引起轩然大波。

两年后，台北荣民总医院的洪传岳在看到这篇论文后，决定用更缜密的实验去验证。他们选用了2种品牌5种不同配方的可乐：可口可乐中的经典型、新型、无咖啡因型、健怡型，还有百事可乐。通过跨膜迁移的实验方法，将混有精子的可乐滴在薄膜上（能允许精子通过），薄膜下方放置生理盐水。一小时后，他们观察到：至少七成精子活力依旧，能成功穿越薄膜，不会被可乐杀死。这项刊登在《人体毒物学》杂志上的研究结果，推翻了美国学者的观点。换言之，房事后用可乐冲洗阴道，以求达到避孕的目的，不但不可能达到目的还容易引起生殖器感染。

多喝可乐也不行？作为碳酸型饮料（即在饮料中加入二氧化碳）的一种，可乐还会添加焦糖、色素等其他成分。当然，它还含有那不到1%由某些神秘物质组成的保密配方。据称，该配方已保密逾百年，但2000年欧洲食品科学研究院透露，神秘物质包括野豌豆、生姜、含羞草、橘子树叶、古柯叶、桂树和香子兰的皮等提炼物、过滤物和染料。正是它们，让可乐的口味独具一格。而在相关配料中，咖啡因吸引了大家的注意力。所以，又有传闻说，可乐中的咖啡因成分具有杀精作用，不可多喝。这是真的吗？

2003年，在美国生殖医学年会上，来自巴西的Fabio Pasqualotto通过对750名男同胞的研究后认为，喝咖啡的男性，其精子活跃度反而更好。在其中发挥关键作用的就是咖啡因。但美国亦有学者认为，每天饮用三杯咖啡就会影响男子的生育能力。结论莫衷一是，目前仍无确切公论。

精子活动力 篇5

关键词：精子膜表面抗精子抗体,精液常规参数,影响因素

随着社会的进步, 不孕不育越来越受到了人们的重视[1], 近年来, 我院通过临床实践证实, 精液精子膜表面抗精子抗体 (Antisperm antibody, AsAb) 并不影响精液分析的各项参数, 精液各项参数的分析不宜用于男性免疫因素不育的诊断, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2011年1月~2012年5月期间在我院生殖中心就诊的男性不育症患者1051例, 年龄20~48 (34.27±4.69) 岁。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集

采集精液前所有患者均禁欲2~7d, 采用手淫法完整将精液收集在干燥洁净的容器中, 标本采集完成后立即放在37℃的水浴箱中, 待其完全液化即可进行检测。

1.2.2 常规精液分析

依据WHO的精液分析标准方法, 以精液量≥2ml、精子密度≥20×106/ml、a级+b级≥50%作为正常参考值。

1.2.3 精子膜表面AsAb的检测

采用混合抗球蛋白反应试验法。首先在洁净的载玻片上加已液化的新鲜精液5ul, 再加入致敏微球5ul, 使其混合均匀后再加入抗人IgG抗血清5ul, 同样使其混合均匀, 之后在25~35℃温度下孵育3min, 然后在400X显微镜下判读结果, 间隔10min后再次进行观察。

2 结果

1051例患者中共检出AsAb阳性90例, AsAb阳性率为8.56%, 抗体结合部位以头部为主, 占52.6%, 根据患者检测结果中精子膜表面AsAb是否呈阳性, 将1051例患者分为阳性组和非阳性组, 两组患者的精子密度、精子存活率、精子活力 (a级+b级) 均无显著性差异 (P>0.05) 。

3 讨论

抗精子抗体是机体产生的与精子表面抗原特异性结合的抗体, 它可以凝集精子细胞, 抑制精子通过宫颈黏液流向宫腔内的迁移, 进而降低生育能力。

有关研究指出, 精子膜表面抗精子抗体导致男性不育的原因主要有以下几个方面: (1) 精子膜表面抗精子抗体具有制动作用, 能够降低男性的精子活力[2]。 (2) 精子膜表面抗精子抗体具有粘附作用, 导致男性精子与女性的宫颈黏液相互附着, 使得精子无法到达子宫[3]。 (3) 精子膜表面抗精子抗体能够抑制顶体酶的释放, 进而导致精子无法与卵细胞相结合[4]。 (4) 精子膜表面抗精子抗体具有毒性作用, 使得男性精子的存活率降低[5]。

近年来, 精子膜表面抗精子抗体对精液常规参数的影响受到了医学领域的广泛关注, 在我院的本次研究中, 1051例患者中共检出AsAb阳性90例, AsAb阳性率为8.56%, 抗体结合部位以头部为主, 占52.6%, 根据患者检测结果中精子膜表面AsAb是否呈阳性, 将1051例患者分为阳性组和非阳性组, 两组患者的精子密度、精子活率、精子活力 (a级+b级) 均无显著性差异 (P>0.05) , 这说明精液精子膜表面AsAb并不影响精液分析的各项参数, 因此精液各项参数的分析不宜用于男性免疫因素不育的诊断, 在以后的临床工作中, 我们还要继续探索更加有效的诊治手段, 力争为每一位患者都提供最为可靠的诊断以及治疗, 从而给更多的家庭带来欢笑。

参考文献

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[2]王璟琦.抗精子抗体的检测方法[J].山西医科大学学报, 2002, 33 (1) :93-95.

[3]辛楠, 徐野, 王丽梅, 等.280例不育症男性精奖浆抗精子抗体IgA与精子参数的研究[J].中国优生与遗传杂志, 2009, 17 (6) :105.

[4]祝茹, 彭弋峰, 方祥, 等.2379例不孕不育患者的抗精子抗体分析[J].中国优生与遗传杂志, 2008, 16 (2) :107-108.

精子活动力 篇6

1 材料与方法

1.1 试验动物及仪器、试剂

大白、长白、杜洛克种公猪, 由浏阳仁和种公猪站提供。

美卡精子密度仪, 意大利美的科卡动物育种公司制造。血细胞计数板、显微镜等常规试验器具与试剂由湖南农业大学临床实验室提供。

越丰1 号长效稀释液由济南洛克工贸有限公司提供。

1.2 试验设计

1.2.1 精液的采集与处理

用手套采精法采集公猪精液, 采精前注意剃除包皮周围的被毛, 舍弃射精初期的部分和凝胶部分。将精液过滤后用稀释液作梯度稀释, 分装在集精瓶中, 置于17℃恒温箱中保存。每个品种分别采10 头公猪精液, 在12h内进行检测。

1.2.2 密度的测定

血球计数板法:先按1:200 的比例进行稀释, 取20μL稀释好的精液转移到计数板上, 5min后在400 倍显微镜下进行计数。选取位于计数板中心的5 个大格的精子数量, 通过换算得出每毫升的精子数量。

精子密度仪测定法:用稀释液将仪器校零后, 吸取0.2m L混匀的新鲜精液注入测试瓶中, 然后加入9.8m L稀释液, 通过移液器混匀后盖上测试瓶盖子;按READ/DIRECT键, 等待显示屏上出现一个透光系数, 对比说明书得出所测样品的精子密度。

1.3 统计学方法

所得数据采用EXCEL和SPSS17.0 统计软件分析, 用“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 精子密度仪检测的可重复性和一致性

注:P>0.05 表示差异不显著

从表1 可知, 同一样品连续检测12 次, 其精子密度变化很小, 数据之间的差异不显著 (P>0.05) , 表明该仪器可重复性良好。变异系数也显示该检测系统具有较好的一致性。

2.2 精子密度仪检测与血球计数法的比较

注:P>0.05 表示差异不显著

注:P>0.05 表示差异不显著

注:P>0.0 5 表示差异不显著

通过对比分析可知, 精子密度仪与计数板检测结果之间有直线回归关系, 且不同品种公猪精液中的回归方程有所不同, 杜洛克为y=0.6502x+0.0128, 大白为y=0.8364x+0.0511, 长白为y=0.86x-0.0102。回归关系均达显著水平 (P<0.05) , 其中大白与长白的回归方程很相似。 (式中:y为实际密度, x为系统检测密度) 。

从表2、3、4 可以看出, 精子密度仪换算后结果与计数板所测的猪精子密度结果无显著差异 (P>0.05) , 相关性较好, 表明精子密度仪测定猪精子密度有较高的准确性, 可以代替计数板法在生产应用中的使用。

3 讨论

目前常用的检测精子密度的方法有血球计数法、分光光度法和流式细胞仪法[5,6,7]。血球计数法因为操作繁琐, 重复性差[8], 在生产应用中较少使用;流式细胞仪法虽无此缺点, 但其仪器昂贵, 在养殖场中也极少见到[9]。利用分光光度法测定精子密度的方法始于上世纪七八十年代, 其具有快速、简便的优点, 但由于当时的技术条件不成熟, 导致其准确性不高。随着养殖技术的不断提高和一次性滤纸应用使得分光光度法在猪精子密度检测中的应用成为了可能。美卡精子密度仪是由意大利美的科卡动物育种公司出品, 用来测定家畜精液中精子密度的一种较先进设备, 其原理为在特定波长下测定待检样品的吸光度, 通过吸光度与精子密度的函数转换, 对样品进行定量分析。

利用美卡精子密度仪检测猪精子密度的结果需要转换的原因是其设定的程序并非是检测猪精子密度, 所以需要进行矫正。通过对精子密度仪的重复性和一致性研究发现, 该仪器可重复性良好, 具有较好的一致性。应用精子密度仪对不同品种公猪精液进行检测, 对比计数板的结果发现二者具有显著的直线回归关系。经换算, 精子密度仪与计数板法所测结果无显著差异, 表明其准确性较高。测得的密度值偏大可能是因为测定用的玻璃杯在使用过程中有一些磨损导致透光率下降或者操作时间较长, 水分蒸发所导致。试验结果显示, 大白猪和长白猪的回归方程相似, 与杜洛克的回归方程有较大差异, 这可能与品种有关。有报道[10]指出, 杜洛克公猪的精子活率和运动能力显著高于大白猪和长白猪。另外, 不同品种公猪的睾丸大小、精子畸形率也不一样[11,12], 但究竟是何原因还有待进一步深入探究。试验数据表明, 美卡精子密度仪对精子密度很高的精液和精子密度较低的精液准确性不理想, 而对精子密度在0.6~2.7 亿/m L的精液测定结果最可靠。因此, 在检测精子密度之前, 建议将原精进行适当4~8 倍稀释。种猪常温精液标准中对精子密度的要求是大于1 亿/m L, 说明美卡精子密度仪能适用生产实际中的需要。

综上所述, 美卡精子密度仪具有准确、快速、简便等优点, 能取代复杂而繁琐的血细胞计数法在生产实际中的使用, 这不仅能提高实验人员的工作效率, 还能使精液得到较好的稀释, 从而提高精液产品的质量和农户的生产效益。随着养殖条件的不断提高, 美卡精子密度仪的应用将逐步扩大。

参考文献

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[11]玉荣, 包花尔, 斯日古楞.不同月龄、不同品种种公猪精液品质的比较试验[J].中国畜牧兽医文摘, 2014, (7) :43-44.

精子活动力 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

整群选取2012 年2 月—2014 年5 月在云南省第一人民医院收治的72 例男性不育症的患者, 将其作为临床研究对象, 采用随机的方式分为实验组36 例和对照组36 例。 实验组男性36 例, 年龄23~47 岁, 平均 (35.34±6.31) 岁, 不育时间 (4.3±1.3) 年, 女方36 例, 年龄22~42 岁, 平均年龄 (32.65±6.46) 岁;对照组男性36例, 年龄20~46 岁, 平均年龄 (36.44±5.36) 岁, 不育时间 (4.7±1.8) 年, 女方36 例, 年龄23~41 岁, 平均年龄 (32.68±6.43) 岁。 男性外周血染色体与Y染色体微缺失基因无异常, 根据世界卫生组织推荐的诊断依据:行两次精液检查, 进行质量检测, 无精子的诊断必须至少经过3 次精液离心沉淀检查, 经诊断性睾丸穿刺见活动精子, 所有女性配偶均排除排卵障碍、内分泌因素等所致的不孕, 可伴有或不伴有输卵管因素存在。 两组患者的年龄等一般资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。

1.2 治疗方法

实验组:实行ICSI治疗前, 前2 个月男方左旋肉碱2 g/d和乙酰左旋肉碱1 g/d (商品名:勃锐精, 美国西格玛托 (Sigma-tau) 制药有限公司, 以下简称复方左旋肉碱, 产品厂家厂名:西格玛, 厂址:意大利, 商品条形码:74574910005, 产品标准号:FDA, 5 g/包, 主要成分左旋肉碱、乙酰左旋肉碱、果糖、柠檬酸、维生素B12、硒、辅酶Q10、维生素C、锌、叶酸等) , 饭后凉水冲服, 早晚2 次, 连续服用2 个月。

对照组:男方不服用任何药物。

两组女性的超促排卵方案相同, 均实行Gn RHa/FSH ( 或HMG) 方案控制性超排卵, 获成熟卵4~6 h内行ICSI治疗, 经18~20 h后观察受精的情况, 24~48 h再检查卵裂的情况, 选择最优质的胚胎2~3 枚72 h后移植宫腔。 术后15 d后行尿和血h CG的检查, 若为阳性者, 3~4 周后B超检查宫腔内有妊娠囊、 胎芽及胎心者为临床妊娠。

1.3 统计方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析。 计量资料采用t检验, 以均数±标准差表示;计数资料采用 χ2检验, 以百分比 (%) 表示, 以P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组治疗前后的精液的比较

实验组治疗前后的相比, 在精子浓度、精子向前运动百分率、精子活率方面, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.2 两组受精率、优质胚胎率、临床妊娠率的比较

经统计分析, 实验组的受精率、优质胚胎率、临床妊娠率均比对照组的高, 差异具有统计意义 (P<0.05) 。

3 讨论

随着现代科技的不断进步, 辅助生殖技术亦有了很大的发展与突破[1,2], 具有代表性的ICSI技术的临床使用, 使不育的男性的治疗有了重大的突破。 ICSI是绕过了女性阴道子宫颈等对精子的自然选择, 直接将精子注射入卵子, 在这个过程中极有可能影响了精子的完整, 包括遗传物质等, 从而影响到以后的胚胎的发育及妊娠成功率等。

该研究选用了不育的男性患者在进行ICSI前3 个月口服左旋肉碱, 进而提高临床ICSI技术及妊娠的成功率, 结果显示:在进行ICSI前3 个月口服左旋肉碱的实验组的受精率、优质胚胎率、临床妊娠率均明显高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。牛玉森[3]对国内外的文献进行了Meta分析, 发现应用左旋肉碱后, 治疗组的精子浓度、精子活率、前向运动精子率、妊娠率均高于对照组。 左旋肉碱是1905 年由俄国科研者在肌肉中提取, 主要存在人体的心肌、附睾、骨骼肌中, 有研究显示, 左旋肉碱不仅在男性的生育方面有着密切的关系, 在心脏、肝肾疾病的发病和治疗中亦起着重要的作用[4,5]。 左旋肉碱在附睾中以游离左旋肉碱和乙酰左旋肉碱形式存在, 通过转运脂肪酸和磷脂等功能, 从而促进精子的发育, 有研究表明[6], 服用左旋肉碱后的男性精子运动百分率与活率都明显的提高 (P<0.05) 。资料表明, 30%左右的男性不育的精液活性氧比较高, 活性氧可以导致精子DNA线粒体的损伤, 使睾丸组织内的氧化与抗氧化系统失衡, 进而影响精子的质量, 左旋肉碱可以保护精子的细胞膜与DNA与活性氧引起的损伤对抗[7]。 ICSI只是单纯的把精子注入卵子, 但是对精子的质量等不能有改善, 因此, 在进行ICSI技术时服用左旋肉碱可以增加双链DNA精子, 保护了精子的DNA完整, 增加了正常精子的受精成功率, 利于优生优育[8,9]。

综上所述, 口服左旋肉碱与卵胞浆内单精子注射可明显提高男性精子的受精率与临床妊娠率, 可以选择性作为临床辅助治疗男性不育症, 值得临床推广应用。

参考文献

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精子活动力 篇8

1资料与方法

1.1纳入标准

1研究对象为接受TESE治疗的非阻塞性无精子症患者。2文献中至少报道了一个本研究涉及的结局指标,能从中提取或计算获得INHB对TESE结果的真阳性值、假阳性值、真阴性值和假阴性值等原始测量数据。

1.2排除标准

1资料质量较差或重复发表。 2综述、评论等体裁,动物实验。3只有摘要而缺乏全文,或者有全文未提供充分原始数据且索要无果。4文献研究样本量小于10。

1.3结局指标

1敏感性;2特异性;3诊断优势比(OR);4汇总受试者工作特征曲线下面积(AUC)。

1.4检索策略

检索策略采用主题词与自由词相结合的方式,以 “Non -obstructive azoospermia”、 “Spermatozoa”、 “Spermatids”、 “Inhibin”、 “FSH” “Inhibin -beta Subunits”、 “Sperm Retrieval ”、 “Testicular sperm extraction ” 为英文检索词,以“非梗阻性无精子症”、“睾丸精子抽吸”、 “ 抑制素B ” 、 “ 卵泡刺激素 ” 为中文检索词 , 计算机检索Cochrane Library、Pub Med、EMBASE、中国知网 (CNKI)、 万方数据库 (Wanfang data)、 中国生物医学文献数据库(CBM)、中国博士学位论文全文数据库、 中国优秀硕士学位论文全文数据,手工检索相关资料及各论文参考文献目录,收集符合纳入标准的研究, 文献检索起止时间均为从建库至2014年11月。

1.5质量评价

由两名评价员根据纳入标准、排除标准独立筛选文献,提取研究资料并互相核对数据。 提取内容包括试验设计方法、期刊名称、第一作者、研究年份、国别、 研究类型、例数、年龄、INHB阈值、真阳性值、假阳性值、真阴性值和假阴性值等评价指标,对有分歧而难以确定是否纳入的研究通过 讨论或由第三方协助确定。 采用QUADAS工具对纳入文献进行质量评价[4]。

1.6统计学方法

采用Meta-Di Sc1.4软件[5]对数据进行分析,检验水准为 α=0.05。 通过计算敏感性和特异性的Spearman相关系数判断各研究间是否存在阈值效应;通过I2评估各研究间异质性的大小,I2>50%提示存在统计学异质性,采用随机效应模型分析,反之则提示不存在统计学异质性,采用固定效应模型分析。 汇总受试者工作特征曲线,计算AUC,AUC越接近1,诊断价值越高[6]。

2结果

2.1纳入研究的基本特征

本研究共检索到相关文献945篇,通过阅读文题及摘要排除重复文献及符合排除标准的文献904篇, 进一步阅读剩余的41篇文献全文, 排除不符合入选标准的文献32篇,最终纳入9项研究,943例患者。 纳入的9项研究中有7项为前瞻性研究;各个研究间INHB阈值不同,INHB波动为6.25~53.00 ng/L。 纳入研究的质量评价得分为5~8分,文献质量较高。 各试验的基本特征见表1。

注:INHB:抑制素 B;NR:未报道

2.2 Meta分析结果

敏感性与特异性呈负相关(r = -0.133,P = 0.732), 各研究间不存在阈值效应。 敏感性异质性检验I2= 84.3% 、特异性I2=90.3%、诊断优势比I2=86.7% ,I2均大于50%,提示各研究间存在统计学异质性,采用随机效应模型进行Meta分析。 分析结果显示:合并后的敏感性 为0.69(95%CI:0.64~0.73),特异性为0.78 (95%CI:0.75~0.82), 诊断OR为10.66 (95%CI:3.90~ 29.11),AUC为0.8057。 见图1~4。

3讨论

无精子症是是男性不育的原因之一,分为梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症。 梗阻性无精子症是指睾丸有生精功能但不能通过输精管道排出,如附睾梗阻、输精管梗阻和射精管梗阻。 非梗阻性无精子症是由于各种原因引起的睾丸生精功能障碍导致的无精子症,通过常规方法很难找到精子。 因此,无法采用丈夫的精子来自然受孕或进行辅助生殖。 非梗阻性无精子症占无精子症的60%左右,比梗阻性无精子症更多见,但治疗起来却更困难。 引起非梗阻性无精子症的原因很多:下丘脑垂体病变,常见的有先天性性腺功能低下;遗传性原因,如克氏综合征、Y染色体微缺失; 睾丸病变,如隐睾、腮腺炎致睾丸炎、放化疗后睾丸功能衰竭、生精停滞、唯支持细胞综合征等。

诊断非梗阻性无精子症的方法较多,常用的有体格检查、性激素检测、染色体检查、INHB检测、睾丸活检等。 体检发现睾丸体积偏小、质地软,一般都提示睾丸生精功能异常。 性激素中INHB水平低下提示睾丸生精功能低下,卵泡刺激素(FSH)异常升高提示睾丸生精功能障碍。 染色体检查可以发现一些遗传性疾病。 睾丸活检是了解睾丸生精功能最直接、最准确的方法,但有创伤。 随着显微外科技术的发展,如今可以通过TESE使部分患者获得精子,进行辅助生殖,得到生物学上属于夫妻双方的孩子。

非阻塞性无精子症患者通过TESE获取精子进行卵细胞浆内单精子注射是 治疗非阻塞性无精子症的主要方法,但通过TESE获取精子的成功率只有40%~60%,还有可能带来副作用,如睾丸缺血性萎缩、 继发性血清睾酮水平低下等,甚至精神伤害,筛选试验清楚地表明FSH不能再作为辅助生殖领域中无精子症患者TESE选择的指引[17]。 非梗阻性无精子症患者在睾丸中可能保留着某些生精功能的区域,但尽管如此,一些与精子恢复率相关联的临床和组织病理参数仍无法准确地预测每个患者的TESE结果。 即使在一侧睾丸活检中精子缺乏,也并不能代表睾丸中精子的完全缺乏,重复多次活检可获得精子,提示存在局灶性睾丸精子生成不足。 非阻塞性无精子症患者使用TESE获取精子配合卵细胞浆内单精子注射术治疗 , 涉及夫妇双方的治疗,丈夫要接受手术进行睾丸精子恢复治疗,妻子要进行卵巢刺激取卵治疗。 这就更强调了预测TESE成功因素的重要性。

INHB是由睾丸支持细胞及精曲小管内生精细胞共同分泌的由 α 和 β 两个亚基组成异质二聚体多肽激素,FSH是由垂体分泌并唯一作用于睾丸支持细胞的性激素,能选择性正反馈刺激支持细胞分泌INHB, 同时INHB对FSH分泌起着负反馈调节作用,有研究认为在此反馈环中负反馈作用强于正反馈作用[16]。 张锋等[17]认为INHB是一个反映支持细胞和精子生成能力的更为直接的血清标志物,可以区分非梗阻性无精子症患者TESE的成功与失败。 Goulis等[18]认为在区分基于睾丸活检的精子生成完全受损或部分受损方面, INHB比FSH更具有意义。 Von Eckardstein等[19]认为与INHB或FSH单独使用相比,两者一起使用是评估非阻塞性无精子症患者生精状态更为敏感的预测指标, INHB单独或与FSH联合使用对于考虑做TESE的男性来说具有一定的临床意义。 本研究结果显示,INHB对TESE成功获取精子预测的敏感性为69%,特异性78%,说明漏诊率为31%,误诊率为22%。 汇总受试者工作特征AUC及诊断OR是衡量诊断方法准确性的综合指标,AUC为0.8057,诊断OR为10.66,说明INHB对预测TESE获取精子的成功率有一定的预测能力。

睾丸活检显示非阻塞性无精子症可表现为三种病理类型:生精功能低下、成熟阻滞和唯支持细胞综合征,其中唯支持细胞综合征是较为严重的生精功能异常,TESE取精成功率低。 邓永键等[20]认为INHB不适合评价非阻塞性无精子症患者中的生精功能低下、 精子成熟阻滞状态,但对于唯支持细胞综合征,血清INHB具有较高的诊断准确性 ( 敏感性97% , 特异性85%,临界值为28.55 pg/m L)[21]。 Mitchell等[7]研究INHB对TESE成功获取精子预测能力敏感性和特异性分别为60%及83%,与本Meta分析结果一致,可能是纳入研究的病例中除唯支持细胞综合征还包含其他病理类型患者。 由于受试人群存在地域、人种等差异,故血清INHB的正常参考值范围波动较大,本Meta分析纳入文献的阈值波动范围在6.25~53.00 ng/L之间,存在一定的异质性,降低了本研究的可信度。 此外,本研究选择的文献涵盖不够全面,存在一定的选择偏倚; 各个研究纳入患者的病因构成存在差异,由此可能存在疾病谱偏倚。

为了强悍的精子　　 篇9

我说：“我已经料到了，你继续说吧。”老婆嫣然一笑后道：“问了医生，医生说长时间在电脑面前坐卧、经常喝酒抽烟都会导致这种状况，你三样都占全了，所以从今往后你要减少在电脑面前坐卧的时间，不能再继续抽烟喝酒，而且要天天和我去跑步锻炼身体……”

我一个身强力壮一年不进一次医院不得一次感冒又欲望正常的男子竟然身上揣的都是哑弹，我心里有些难过，当即脸上就有些挂不住了，挂不住的表现是脸颊微红，眼神中透露出假装出来的无所谓的眼神。老婆看了看我，自然知道我心里在想什么，她对我说：“当然了，这次检验有很多意外发生，所以结果可能不太准确。”她的这句话我深以为然。可她接着又说：“但是仍旧能够反映出一定的问题，问题就是我们之所以总怀不上，可能不是我一个人的问题，现在看来有可能你的问题还大一些。”形势发生了一百八十度的大转变，我突然觉得自己矮了一截。我一如往常对待别人提出的要求一样对老婆说：“嗯，听你的。”她听到我的回答后就哼着《翻身农奴把歌唱》扭着水蜜桃型的屁股走了。

先前，家人亲戚都把没有孩子的责任归于她，这样一来我竟有了她为我背了好几年黑锅的愧罪感。我是个善良的人，最不愿意的就是让别人因我的原因而受委屈或者是连累到别人。要不愧罪而死，只有两条路，一是赶紧有个孩子，二是开始关怀精子兄弟姐妹让他们尽快强悍起来再次化验。无论走哪条路，我都得痛苦得过上一阵子，这个一阵子还有可能会很长很长。

精子载体转基因技术的研究 篇10

1 精子载体介导基因转移的原理

1.1 精子具有吸收外源DNA的能力

Lavitrano和French发现, 成熟精子头部具有吸收外源DNA的能力。其吸收区域是具有特异性的, 该区域位于精子头部的顶体后区 (post-acrosomal region) , 即靠近精核的区域[1]。DNA分子与精子特异结合是一种离子作用, 这一过程不依赖特定的序列。而且除DNA外, 其它一些带负电的分子如肝素 (heparin) 、硫酸右旋糖苷 (dextransulphate) 及等电点低于7的蛋白都可以特异与这一区域结合。经分析发现, 精子头部蛋白抽提物中有一种30～35KD的蛋白质, 这种蛋白只存在于哺乳动物如小鼠、猪、牛、人以及鱼类和海胆纲动物中。通过GelShift分析发现, 纯化的30～35KD蛋白可与DNA形成DNA-蛋白复合体。

1.2 外源DNA的内化与整合

Ⅱ型主要组织相容性复合体分子 (MHCⅡ) 可能在精子-DNA结合中起作用, 其证据MHCⅡ基因敲除小鼠的精子细胞与DNA结合的能力比野生型小鼠精子的结合力低[2]。但是, 利用MHCⅡ单克隆抗体并不能在精子头部检测到MHCⅡ分子。因此, 精子细胞吸收外源DNA的能力是否依赖MHCⅡ分子还有待进一步证明。此外, CD4分子是T淋巴细胞的一种表面标识抗原, 免疫荧光和Western分析证明它也存在于野生型小鼠的精细胞表面。尽管CD4基因敲除小鼠的精子能结合外源DNA, 但外源DNA不能进入精子核内, 即失去进一步内化 (internalization) 的能力, 表明存在于精子表面的CD4分子能促进与精子结合的外源DNA内化[3]。

外源DNA的精子核内化过程是一个精密的过程, 有许多特定因素的参与。其大体过程如下:外源基因在无抑制因子Ⅰ的影响下与精子表面的30～35KD大小的DNA结合蛋白结合, 这一过程受精子发生过程中MHCⅡ表达的间接调控。然后, DNA-DNA结合蛋白复合物激活精子表面CD4抗原与之进一步结合形成复合物, DNA-DNA结合蛋白-CD4抗原复合物随后在某种未明机制下穿过质膜和核孔到达核基质。在这里DNA结合蛋白-CD4抗原复合物从DNA-DNA结合蛋白-CD4抗原复合物中释放, DNA整合到染色体之中, DNA结合蛋白-CD4抗原复合物重新回到精子质膜中进行新一轮的基因结合内化过程。

外源DNA进入精子细胞后, 紧密地与核支架结构 (nuclear scaffold) 结合, 并与精子基因组DNA整合重排[4]。整合过程并不是随机的, 而是有选择的。整合多在核基质区 (nuclear matrix-associated DNA, MAR) , 其次, 整合位点一端为拓扑异构酶II的识别序列[5]。这种酶识别序列与核支架区 (scaffold-associated regions, SARs) 的DNA序列同源, 而且拓扑异构酶Ⅱ优先选择与含SAR序列的DNA结合[6]。这不仅说明这种酶在非同源重组中可能起一定作用, 而且整合位点可能就在SAR区域[7]。

2 精子载体介导基因转移的途径

目前应用精子为载体介导基因转移获得转基因动物主要通过以下途径来实现的:体外精子转染法和体内精子转染法。体外精子转染法又可以分为精子与外源DNA直接共孵育法, 体外电穿孔导入法和脂质体介导转染法;体内精子转染法又可以分为输精管注射转染法、曲细精管注射转染法、睾丸注射转染法等。

2.1 体外转染法

2.1.1 恒温共孵法:

此法是精子载体法制备转基因动物最早使用的方法。大量研究表明动物精子具备自发结合和内化转运外源DNA的能力, 将精液与DNA直接混合37℃恒温共孵20～40 min, 采用这种直接孵育的方法使外源DNA结合并内化到精子中, 精子结合内化外源基因后仍保持很好的活力。此法最早于1971年由Brackett[8]发现, Bracket研究首次证实精子具有吸附结合外源DNA能力, 并将外源DNA在受精时携带进入卵母细胞。18年后, 意大利科学家Lavitrano[9]应用此法得到阳性转基因小鼠。之后Lavitrano又与美国波士顿大学合作使用该法, 在所进行的75批实验中, 转基因阳性率为7.4% (130/1755) [10]。该实验不仅从正面肯定了精子介导基因转移的可行性, 也从侧面证实了众多阴性结果存在的合理性。

2.1.2 体外电穿孔法和脂质体法:

由于精子质膜的特殊性, 适合一般细胞的转染方法, 为了提高转染效率有学者用体外电穿孔法和脂质体法直接将外源基因转移到精子内部。电穿孔法是利用核酸带电的特点, 通过外加一个瞬时高压, 使DNA瞬时加速后进入精子内部。电击对精子细胞的影响有两方面:一方面可短暂打开细胞膜上的某种通道, 有利于外源基因的进入, 但另一方面电击对精子细胞又是一种损伤, 当电击超过一定强度时, 就有可能对精子造成损伤甚至死亡, 进而影响精子的受精能力和胚胎的发育能力[11]。

脂质体法是将外源DNA用脂质体包裹好后, 精子与包裹外源DNA脂质体共孵育, 由于细胞膜是脂质双分子层, 因此细胞膜与脂质体发生融和, 使外源基因发生转移到精子内。阳离子脂质体是广泛应用的转移DNA的有效手段之一, 因其表面带有阳离子, 可与带负电的DNA形成脂质体一DNA复合物。阳离子脂质体一DNA复合物进入细胞的3种模式: (1) 通过与带负电荷的细胞质膜融合后, 释放出包裹的核酸分子; (2) 通过细胞内吞作用进入, 随后与核内体膜发生融合; (3) 通过细胞质膜上形成的小孔进入。与其它方法相比, 脂质体法有转染效率高、毒性小等优势[12,13,14]。

2.2 体内转染法

2.2.1 输精管内注射转染法:

输精管内注射转染法是将含目的DNA的重组质粒纯化后用脂质体包裹, 然后通过手术, 用微量进样器将DNA-脂质体复合物注入雄鼠输精管内, 再用阳性转染雄鼠与雌鼠交配。在转染过程中, 外源DNA能从注射部位扩散到输精管全长, 完成对成熟精子的转染。

该方法的主要优点是操作简便, 且对动物的交配不造成明显的影响, 但此法受精子存活时间的限制, 转染后必须短时间内交配, 否则携带外源DNA的精子会被来自附睾的精子所稀释从而降低转染效率。由于每次输精管注射只能产生一批转染精子, 而且被转染的是已失去增殖能力的成熟精子, 因此, 该法难以得到可长期产生阳性转染精子的雄性动物。此外, 研究人员发现精浆中被称为抑制因子Ⅰ的成分对转染有抑制作用, 因此输精管内注射法被认为是转染效率有限的方法。

2.2.2曲细精管内注射转染法:

对生殖细胞的修饰和改造是建立转基因动物最理想的一种方式, 而精原细胞便是其中最具潜力的一种途径。精原细胞 (spermatogonia) 是精子形成的前体细胞, 在睾丸微环境中可以像ES细胞一样具有增殖、分化潜能。在雄性动物出生后, 精原细胞一直处于不断分裂增殖状态, 不断地增殖和分化成精子细胞。通过合适的手段将外源基因导人精原细胞中, 就有可能将外源基因带入子代基因组中。例如, 在体视显微镜下, 将含有外源基因的转染液注入到曲细精管中, 或者注入后再结合电穿孔的方法, 通过转染精原细胞使成熟精子中携带有外源基因, 再利用转染的精子通过自然交配制备转基因动物。相对于ES细胞和显微注射方法更简便易行, 且不需要专用设备。目前已有通过该法建立转基因小鼠的多个报道[17]。

2.2.3 睾丸内注射转染法:

睾丸内注射转染法是在曲细精管注射转染法的基础上改进的一种更简捷、更有效的新途径, 其通过对睾丸组织的生殖干细胞和未成熟精子进行外源DNA转染后, 将动物进行自然受精, 产生出转基因动物。研究表明, 通过对睾丸进行多次打点注射, 能将外源基因转入曲细精管内, 并经渗透作用整合到精原细胞和精母细胞的染色体中, 从而获得大量的转染精子, 在附睾中积累后, 进一步提高了转染的成熟精子数量。与体外孵育相比, 在转染过程中, 外源DNA的导入既不会受到精浆中抑制因子I (IF一I) 的影响, 同时转染后的精子细胞在附睾中经生理状态调整后活力没有减弱, 又避免了体外孵育时, 因精子存活时间限制和外源DNA附着于精子头部等因素所导致精子活力下降和受精能力下降, 从而大大提高了获得转基因动物的机率。而且, 注射雄体的这种保持能力也很强, 注射后7个月, 仍可通过Southern的方法从睾丸、附睾及输精管中的精子里检测出外源基因。

3 精子载体转基因技术的应用

精子载体法介导基因转移技术因其操作简便、经济、易于推广等优点, 在医学、药物学、畜牧业等领域中显示出了诱人的开发价值。最近几年, 有许多研究人员借助该项技术建立了各种具有特定目的和用途的转基因动物。目前该技术在生物反应器制药、异种器官移植、建立转基因疾病动物模型、改善牛奶质量等方面显示出广阔的应用前景。

4 结束语

由于精子载体法在转基因动物的制备中具有简便易行、耗费低、转染率高和适应性广等特点, 吸引着众多研究者不断地进行探索改进。经过近20年的研究, 人们已不再争议这种转基因方法的可靠性。迄今为止, 精子载体法已在12种动物中获得了转基因后代[18], 其中包括小鼠、家兔、牛、猪和鸡等。但是不同试验之间转基因效率还存在很大的差异, 而且未能获得足够的数据对此作出解释。如能对此法作进一步的研究, 很有可能使转基因动物的商业化生产成为可能。

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