淋巴管生成（共6篇）
淋巴管生成 篇1
关键词：大肠癌,淋巴管,转移
大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤, 在我国其发病率逐年上升, 但其术后5年生存率仍在50%左右。究其原因, 淋巴道转移是影响大肠癌预后最主要的因素之一。近年来, 有学者提出肿瘤周围淋巴管的新生及结构异常可能在肿瘤淋巴道转移及其发生、发展过程中起重要的作用[1], 因此, 大肠癌淋巴道转移的规律和机制, 特别是新生淋巴管 (lymphangiogenesis) 问题已经成为该领域新的研究热点, 现对大肠癌新生淋巴管的研究进展综述如下。
1 淋巴管内皮细胞标记物的选用
近年来, 随着一些淋巴内皮细胞生长因子, 如血管内皮生长因子C、D (VEGF-C、VEGF-D) , 以及淋巴内皮标志物, 如淋巴管内皮细胞酪氨酸激酶受体 (VEGFR-3) 、淋巴管内皮透明质酸受体-1 (LYVE-1) 、Podoplanin等的发现, 使得对肿瘤淋巴管生成的研究逐渐增多。在大肠癌淋巴管生成的研究中, 常用的淋巴内皮标志物有: (1) VEGFR-3是第一个被发现的淋巴管内皮标记物, 它是一种酪氨酸激酶受体, 其配体VEGF-C和VEGF-D是淋巴管内皮生长的重要调节因子。VEGFR-3在胚胎发育早期一过性地表达于静脉血管内皮细胞表面, 出生后只表达于淋巴管内皮细胞, 许多研究证明VEGFR-3是淋巴管特异性标记物。但研究发现, VEGFR-3不仅表达于淋巴管内皮, 而且也表达于某些肿瘤的微血管内皮及肿瘤细胞中, 因此, 用VEGFR-3鉴别淋巴管和血管的特异性有限[2]。 (2) LYVE-1是淋巴内皮细胞特异性分子标志之一, 其位于淋巴管内皮细胞上的含有322个氨基酸残基的膜蛋白, 其配体是透明质酸。LYVE-1与CD44糖蛋白同源, 在淋巴管腔面和外表面有同等表达, 其生理功能是将透明质酸通过淋巴内皮转运至淋巴。LYVE-1并非淋巴管内皮细胞所特有, 也可表达于人和鼠的正常肝血管窦及部分肿瘤微血管中。 (3) Podoplanin是一种肾小球足状突细胞膜粘蛋白, 起控制足细胞形态的作用。1999年首次报道它仅表达于淋巴管内皮, 其后有学者用抗Podoplanin抗体标记微淋巴管获得成功[3], 从而成为一种新的淋巴管内皮标记物。目前认为Podoplanin不仅存在于淋巴管内皮细胞及良性血管瘤和血管肉瘤内, 而且也存在于某些非内皮细胞, 如成骨细胞、肾足细胞及肺泡Ⅱ细胞。它主要表达于小淋巴管, 而不表达于具有平滑肌结构的大淋巴管。Katharina等[4]研究发现, 通过CD34和Podoplanin双重染色可以区分淋巴管和毛细血管。 (4) Desmoplakin是一种表达于细胞间连接处的桥粒蛋白, 又称为桥粒相关转膜糖蛋白。它只表达于淋巴管内皮细胞而不表达于血管内皮细胞, 是一种新的淋巴管内皮标记物。研究发现, 表达Desmoplakin的内皮细胞具有淋巴管内皮细胞的超微结构特点, 因此, 可以认为Desmoplakin作为淋巴管内皮细胞标志物具有可靠性及特异性, 可用于研究人体正常组织中淋巴管的分布特点。Ebata等[5]采用免疫组化及免疫电镜等方法比较了Desmoplakin、5’-核苷酸酶、层黏连蛋白及第Ⅷ因子等物质在淋巴管内皮与血管内皮上表达的差异性, 结果显示淋巴管内皮细胞可特异性表达
Desmoplakin。
综上所述, 目前发现的淋巴管标志物中仍有一些与血管内皮间存在交叉反应, 并具有组织器官分布差异。周显礼等[6]采用免疫组化法研究几种淋巴管特异性标记物在30例结肠癌、肺癌、胃癌和喉癌中的表达情况, 结果LYVE-1只表达于淋巴管内皮, Podoplanin主要表达于淋巴管, 此外在少数小静脉上也有表达, VEGFR-3则同时表达于淋巴管与小血管, 在癌细胞的胞浆中也可呈阳性表达, 因此认为LYVE-1、Podoplanin可以作为肿瘤组织内淋巴管的特异标记物。郭嫦媛等[7]研究发现, 免疫组织化学技术下Podoplanin染色可以作为标记淋巴管的理想实验方法。总之, 我们认为在大肠癌淋巴管生成研究中, LYVE-1、Podoplanin、Desmoplakin等标志物特异性较高, 必要时需联合应用多个分子标志物, 并结合淋巴管的形态特征作为判断依据, 才能保证研究结果准确可靠。
2 大肠癌淋巴管生成与转移的关系
近年来, 随着血管内皮生长因子C (VEGF-C) 的发现, 使癌周有淋巴管增生的观点引起了更为广泛的关注。但有关大肠癌淋巴管生成与转移方面的报道不多, 结果也不一致。Petrova TV等[8]运用实时定量RT-PCR检测大肠癌的淋巴管内皮标记物, 发现VEGFR-3、Prox-1和5’-核苷酸酶在大肠癌中的表达明显高于正常的黏膜, 说明了大肠癌中淋巴管的生成明显增加。郑林辉等[9]采用体视学原理测定不同临床期别大肠癌微淋巴管密度值, 通过定量分析发现大肠癌组织伴有微淋巴管新生, 且随着病程的发展而增多, 肿瘤临床期别越晚, 其最多截面平均面积、平均周径逐渐增大, 提示微淋巴管形成在大肠癌转移中起着重要作用。Ohno等[10]用5’-核苷酸酶标记淋巴管, 结果发现大肠癌患者的微淋巴管计数 (MLC) 在瘤周明显高于瘤内和正常组织, VEGF-C高表达的部位MLC增加, 提示新生淋巴管可能导致肿瘤转移, VEGF-C的表达与淋巴管生成相关。Maeda K等[11]对内镜下切除的T1结、直肠癌标本在手术前进行了免疫组化研究, 发现有淋巴结转移的肿瘤比没有淋巴结转移的肿瘤更易观察到VEGF-C表达, 而且多变量分析证明VEGF-C表达是淋巴结转移的独立的预测指标。许天文等[12]通过对94例大肠癌患者分析, 发现其中53.2%的患者VEGF-C表达阳性, VEGF-C在淋巴结转移阳性中表达与阴性中表达有统计学意义, 并与淋巴管浸润与Dukes’分期密切相关。Kazama S等用免疫组化方法检测了大肠癌和正常粘膜的VEGF-C表达, 结果发现89%的患者VEGF-C存在表达过度, 在浸润性癌中VEGF-C的表达与淋巴浸润、淋巴结转移和肿瘤大小密切相关。而Duff等应用ELISA检测了大肠癌病人和正常人血浆中VEGF-C的含量, 发现大肠癌病人血浆VEGF-C水平明显高于正常人, 晚期病人血浆VEGF-C水平有高于早期病人的趋势, 但无统计学差异。由此推测, VEGF-C促进大肠癌淋巴管的生成, 并通过这些新生的淋巴管促进肿瘤的转移。有研究认为VEGF-C促进淋巴道转移的机制是: (1) VEGF-C促进淋巴管内皮细胞分泌趋化因子或类似的物质, 这些物质吸引肿瘤细胞的迁移刺激瘤细胞进入淋巴管[12]。 (2) VEGF-C是强的脉管通透因子, 能增加淋巴管的通透性及内皮细胞的迁移, 进而增加癌细胞的浸润。 (3) 分泌VEGF-C的癌细胞通过淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR-3的亲和作用, 使肿瘤细胞特异性地黏附到淋巴管内皮细胞上[12]。值得一提的是, 也有学者得到相反的结论, 如Parr C等[13]应用RT-PCR研究报道大肠癌组织VEGF-A和VEGF-C m RNA水平高于正常粘膜组织, VEGF-D m RNA水平则低于正常粘膜组织。虽然转移淋巴结与VEGF-Am RNA表达有相关性, 但VEGF-C、Dm RNA水平升高与淋巴结转移与否无关。总之, 新生淋巴管在大肠癌发生发展中的作用目前还存在争议, 仍有待进一步研究和探索。
3 展望
许多研究表明, VEGF-C及VEGF-D可与表达于淋巴管内皮细胞的VEGFR-3结合, 诱导VEGFR-3酪氨酸激酶磷酸化, 导致淋巴管生成、增生和扩张, 从而导致恶性肿瘤细胞容易向区域淋巴结转移。因此, 可以设想通过应用免疫方法或基因技术来抑制或阻断VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信号通路, 就能抑制肿瘤淋巴管生成, 这将可能成为肿瘤生物治疗的新靶点。在小鼠体内已经证实m F4-31c1能抑制VEGFR-3介导的肿瘤相关淋巴管生成及淋巴结转移, 并且对已存在的淋巴管功能无影响。Shmizu等研究发现, VEGF-C的中和抗体可抑制VEGF-C高表达肿瘤细胞淋巴转移的发生。Fairooz等在已有转移的结肠癌患者的化疗药中加入了VEGF的单克隆抗体, 结果治疗效果比单用化疗药明显提高。由此可以预见, 抗淋巴管生成将有望成为未来大肠癌治疗的新途径。
淋巴管生成 篇2
1 淋巴管生成的分子机制
淋巴管的新生过程大体分为4个步骤:即淋巴内皮细胞的激活、增殖、迁移和淋巴管管腔的形成。
通过VEGF-C与 受体VEGFR-3结合介导的信号传导通路是淋巴管生成的主要机制, 其过程为: VEGFR-3与配体VEGF-C结合, 可导致VEGFR-3发生磷酸化, 从而发挥酪氨酸激酶活性, 进而活化细胞骨架蛋白Paxillin, VEGFR-3能直接启动内皮细胞内的信号传递→对应的基因被激活→产生信使RNA→特异性的蛋白质被大量合成→淋巴管内皮细胞增殖、分化、迁移、抗凋亡等一系列生物学活动, 最终诱导淋巴管内皮细胞肌动蛋白重组, 刺激其增殖形成新生淋巴管[1]。
2 微淋巴管和微血管的鉴别
肿瘤发生淋巴结转移时可能通过以下两种途径实现的:①肿瘤细胞侵入血管, 通过血液循环到达血液循环和淋巴循环的交叉点, 进入淋巴液, 而后被淋巴结捕获并在其内增殖, 形成淋巴结转移;②肿瘤细胞直接侵袭淋巴管, 随淋巴循环到淋巴结。因此研究淋巴管和肿瘤转移的关系时须准确的区分微淋巴管和微血管, 精准的进行淋巴管计数为前提。以往对淋巴管和血管的鉴别, 通常是从微淋巴管和微血管的酶活性差异和组织形态学差别进行鉴别, 或是利用放射性同位素示踪淋巴管。近年来, 免疫组化技术应用于淋巴管生成的研究成为热点, 免疫组化技术因其特异性强、敏感度高、操作简单方便等优点, 被广泛应用于基础研究中并为淋巴管生成在肿瘤生物学研究提供了实际可行的技术手段。
随着淋巴管内皮特异性标记物的发现, 使得淋巴管更易于观察识别及与血管进行区分, 这为研究淋巴管生成在肿瘤生物学中的作用提供了必要的条件, 目前研究较多的淋巴管内皮标记物有以下几种:①血管内皮细胞生长因子受体-3 (VEGFR-3) :它属于受体酪氨酸蛋白激酶家族, 是最早应用于标记淋巴管上皮的标志物, 与淋巴管的发育密切相关, 是淋巴管生成的重要调节因子。据 Veikkola[2]报道, 皮肤中定向表达VEGFR-3 转基因的鼠胚皮下淋巴管增生、扩张;而敲除 VEGFR-3 基因或可溶性 VEGFR-3 转基因的鼠胚, 则出现皮下淋巴管发育不全。②淋巴管内皮透明质酸受体-1 (LYVE- 1) :它是第一个被发现的具有淋巴管鉴定特性的透明质酸 (HA) 受体与CD44糖蛋白是同源化合物[3]。以往的研究认为, 在脉管系统中, 它在血管内皮细胞上不表达, 几乎只特异性地表达在淋巴管内皮细胞上[3], 随着研究的不断深入发现LYVE-1在肝、脾的血窦内皮细胞以及胎盘合胞体滋养层细胞均有表达[4], 使它定向表达于淋巴细胞特异性受到了挑战, 但LYVE-1的非特异性表达仅局限于有限的组织、细胞中。目前它最重要的作用是作为淋巴管上皮的标志物来标记淋巴管, 用以检测肿瘤内部是否存在新生淋巴管及其分布特征[14]。③prospero同源转录因子 (Prox-l) :它是哺乳动物的同源异型盒转录因子的基因产物, 是淋巴管发育的重要调控因子。虽然Prox-1可定向表达于肝脏、心脏、胰腺、晶状体等多种组织的非内皮细胞中[5], 但作为淋巴内皮细胞标记物, 它的特异性高于VEGFR-3[6], 它在淋巴管生成过程中, 起到诱导淋巴内皮细胞增殖和决定淋巴管内皮细胞表型的作用[7]。④podoplanin:它是一种小分子黏液样跨膜蛋白, 于所有血管内皮均不表达, 在淋巴结内高度内皮化的小静脉上这种蛋白也表现为阴性, 主要表达于微小淋巴管。Katharina等[8]研究发现, 通过CD34和podoplanin双重染色可以区分肿瘤标本内的微淋巴管和微血管, 目前它已成为一种新兴的淋巴管内皮标记物。⑤桥粒相关转膜糖蛋白 (desmoplakin) :它属于细胞间桥粒黏附蛋白的一种, Ebata等[9]通过横向比较desmoplakin、5′-核苷酸酶、层黏连蛋白等物质在淋巴管内皮与血管内皮上表达的差异性, 发现desmoplakin选择性的表达于微淋巴管。此后, 在应用desmoplakin抗体鉴别炎症及肿瘤组织中的淋巴管内皮的过程中发现用desmoplakin标识淋巴管取得了良好的效果, 是比较理想的淋巴管内皮的特异性标志[9]。⑥癌胚抗原M2A单克隆抗体 (D2-40) :它是小分子唾液酸糖蛋白, 在小淋巴管内皮细胞上有固定的抗原决定簇, 在微血管内皮细胞和管壁有平滑肌细胞的成熟淋巴管上不表达, 因此, 可用它来标识多种肿瘤的新生微淋巴管[10], 现研究发现应用D2-40作为标记物进行免疫组化染色可以避免在固定标本的过程中所致的组织收缩和肿瘤细胞聚集而造成的假性淋巴管浸润或因瘤栓堵塞淋巴管腔所致漏诊的发生, 在判断原发性肿瘤淋巴管浸润上与HE方法相比有更强的特异性、更高的敏感度[11]。
3 微淋巴管生成与乳腺癌转移的关系
恶性肿瘤的淋巴管生成和淋巴结转移是个复杂的过程, 有多个信号传导通路、多个细胞因子参与, 受多种因素影响。肿瘤生长到一定程度时分泌某些淋巴生长因子, 在肿瘤内部和肿瘤周围形成有功能的新生淋巴管, 通过肿瘤与正常组织之间的移行区癌灶和癌周淋巴管的增生、扩张为癌细胞的转移提供的通道, 实现其淋巴道转移。
乳腺是淋巴分布丰富的组织, 乳腺癌最易早期发生淋巴转移, 虽然前哨淋巴结活检技术已被广泛应用于乳腺癌淋巴结转移的判断和临床分期, 但由于此方法无法观察到微淋巴管, 所以在乳腺癌新生淋巴管的形成中以及新生淋巴管在肿瘤淋巴道转移中所起的作用方面的研究中应用甚少[12]。Valtola等[13]在乳腺导管内癌的标本中发现VEGFR-3在癌细胞填塞的导管基底膜毗邻淋巴管中表达, 在浸润性乳腺癌中微淋巴管密度比正常乳腺组织显著增加。Skobe等[15]对转染VEGF-C的乳腺癌细胞系的裸鼠原位种植模型研究显示:表达VEGF-C上调的肿瘤内见开放的淋巴管, 其淋巴管密度 (LMVD) 约为正常对照组的4.6倍;瘤周淋巴管明显扩张、增粗, 肿瘤中央部位可见淋巴管浸润 (LVI) , 认为恶性肿瘤内部存在新生淋巴管, VEGF-C可能通过与淋巴管内皮细胞上固定抗原决定簇结合, 激活信号传导系统, 从而促进肿瘤内淋巴管的生成, 进而促进肿瘤细胞淋巴转移, 因此, 淋巴管的生成是肿瘤发生淋巴转移的前提。Schoppmann等[16]通过抗Podoplanin及抗CD34双重染色法对乳腺癌标本的微淋巴管及微血管进行标识, 发现乳腺癌瘤内新生淋巴管和瘤周微淋巴管密度 (LMVD) 和微淋巴管浸润 (LVI) 与乳腺癌淋巴结转移相关, 微淋巴管浸润是发生淋巴结转移最主要的因素。
4小结
乳腺癌早期以淋巴结转移为主, 淋巴结转移是决定乳腺癌的分期和选择治疗方案的关键之一, 是影响乳腺癌疗效和导致患者死亡的重要因素。然而目前对乳腺癌淋巴道转移的研究远远落后于血道转移的研究, 其主要原因是由于以往过分强调血管生成对癌灶转移的重要性而掩盖了淋巴管生成对肿瘤转移的作用;未发现特异性和敏感性很好的鉴别淋巴管内皮细胞的标记物而使得人们对淋巴管生成的鉴定较为困难。治疗乳腺癌从抗淋巴管生成方向入手, 抑制乳腺癌淋巴管新生、及时发现乳腺癌微转移, 对提高乳腺癌患者术后的生活质量改善预后具有重要作用。
淋巴管生成 篇3
1 资料与方法
1.1 临床资料
收集我科2006～2008年经病理确诊为喉鳞状细胞癌患者的癌内组织、癌周组织及正常组织标本各30例, 切取后立即置于液氮中30 min, 然后-70℃低温冰箱中保存备用。
1.2 方法
全部标本均用10%中性甲醛溶液固定, 石蜡包埋, 制成厚5μm切片。淋巴管特异标记D2-40对30例喉癌癌内组织、癌周组织及其相应正常组织进行免疫组织化学染色检测淋巴管密度 (LVD) 。
1.3 结果计数
参照Ohno M等[2]报道方法进行淋巴管密度计数;淋巴管密度计数方法为每张切片先在低倍镜下先选取喉癌癌内组织、癌周组织、以及周围正常组织阳性染色脉管最丰富区, 确定5个管腔着色最密集的区域, 然后在高倍光镜视野400倍下分别对淋巴管进行计数, 每例数5个视野, 然后取其平均值进行统计学分析。
1.4 统计学分析
统计学处理采用SPSS 10.0统计分析软件, 采用t检验。
2 结果
2.1 各组标本淋巴管的形态学观察
在正常组织切片上淋巴管数量较少, 呈点状 (横切面) 或条状 (纵切面) ;癌周组织切片上的淋巴管亦呈点状或条状, 但数量明显丰富, 形态不规则, 长短不一, 有些有分支, 有腔淋巴管数目增多, 管腔增粗或扩张, 少数管腔不完整 (图1) ;癌内组织切片上也可以见到增生的淋巴管, 但数量少于癌旁组织, 且以无腔淋巴管为主, 表现为较多的条状物, 主要分布于癌间质和癌巢边缘, 呈环状包围癌巢, 排列有一定的方向性 (图2) 。
2.2 免疫组化结果
喉癌癌内组织LVD为[ (7.73±3.11) 个/HP×400], 癌周组织LVD为[ (13.49±5.49) 个/HP×400], 两组相比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 二者均明显高于正常组织的[ (4.39±2.02) 个/HP×400] (P<0.01) 。
(免疫组织化学染色×200)
(免疫组织化学染色×200)
2.3 颈淋巴结转移组与颈淋巴结未转移组的淋巴管差异
与颈淋巴结未转移组相比, 在颈淋巴结转移组转癌内组织的淋巴管表现为数量丰富, 形态不规则;而癌周组织淋巴管则表现为数量更加丰富, 有腔淋巴管数目明显较多, 管腔扩张。从数量上看:颈淋巴结未转移组的癌内和癌周淋巴管密度平均分别为[ (5.18±1.46) 个/HP×400]和[ (8.42±1.91) 个/HP×400];而颈淋巴结转移组的淋巴管密度平均分别为[ (9.83±2.41) 个/HP×400]和[ (17.71±3.49) 个/HP×400], 两组比较, 无论癌内组织还是癌周组织, 其差异均具有统计学意义 (P<0.01) 。
3 讨论
淋巴转移是癌转移中最常见的形式, 由于近年来各种癌经淋巴道转移模型的建立、淋巴管的结构及分布与癌转移关系的研究等, 在一定程度上为探索肿瘤转移的发生机制和规律提供了理论依据。一般认为各种癌经淋巴道转移的基本过程为癌细胞在原发灶的快速生长并从原发灶释放脱落, 浸润及侵入毛细淋巴管, 运行到局部淋巴结内大量增殖并形成新的癌灶。在此过程中癌细胞侵入毛细淋巴管是最重要的环节之一, 而正是癌周毛细淋巴管的增殖与扩张为其提供了必要条件, 同时这也是淋巴道成为癌转移主要途径的重要因素[3]。
本研究着眼于以前在喉癌中研究较少的细胞转移重要通道之一的淋巴管及目前关于淋巴管研究中存在的争论问题, 应用D2-40标记淋巴管内皮细胞, 同时研究喉癌不同区域组织的淋巴管改变, 结果表明在喉癌的癌内组织和癌周组织均可以见到淋巴管, 并且和正常组织相比均有明显改变, 尤以癌周组织表现更加明显, 表现为数量明显增加, 形态不规则, 有些有分支, 有腔淋巴管数目明显增多, 管腔增粗或扩张, 少数管腔不完整;经定量分析, 癌内组织和癌周组织的淋巴管密度均明显高于正常组织, 并且在颈淋巴结转移组中明显高于颈淋巴结未转移组, 其差异具有统计学意义, 这些结果表明, 无论是癌内组织还是癌周组织, 喉癌淋巴管形态的改变和密度的增加都可以促进颈淋巴结的转移。因此, 本文作者认为正是大量增殖、扩张的淋巴管为癌细胞的转移提供了更多的机会。Marchetti等[4]在对膀胱癌的研究中也发现, 在膀胱癌初期浸润至黏膜上皮下方时淋巴道转移发生率较低, 而在膀胱癌浸润至黏膜深层后淋巴道转移发生率显著增高;进一步研究证明, 在膀胱组织紧邻黏膜上皮下方的区域内没有淋巴管, 仅在接近黏膜肌层处发现少量淋巴管, 而在黏膜深层、肌层和浆膜下层其毛细淋巴管数量依次增多。由此可见, 癌细胞经淋巴道转移的发生率与淋巴管密度密切相关。
一般认为, 在正常生理状态下, 淋巴管系统仅有部分毛细淋巴管处于功能活动状态, 参与淋巴液的形成和运输, 而大部分毛细淋巴管具有潜在的储备功能, 处于关闭状态[5]。由于肿瘤组织内没有毛细淋巴管, 缺乏有效的淋巴引流, 大量的液体积聚于癌周, 加上重度的炎症反应, 导致局部组织间隙增大, 关闭的管腔随之增大, 并伴随组织间隙内的液体内流而进一步扩张, 使原有的毛细淋巴管更加扩张。而且近年来的研究发现, 癌细胞内高表达的淋巴管生长因子 (VEGF-C) 通过旁分泌作用与位于淋巴管内皮细胞膜上的特异性受体结合, 可促使毛细淋巴管大量增殖、扩张, 并增加其渗透性。
综上所述, 喉癌癌内和癌周组织都存在淋巴管生成, 并且均与喉癌患者的颈淋巴结转移密切相关。本研究为进一步研究喉癌转移的机制、过程和防治提供了理论依据。利用淋巴管密度检测进行喉癌患者转移潜能的评估以及利用抗淋巴管生成疗法进行喉癌转移的预防和治疗可能会成为一种新的临床策略, 但有待进一步研究。当然, 喉癌淋巴管的改变仅仅是喉癌转移过程中的一个方面, 关于喉癌转移的机制需要更加全面、深入地探讨。
摘要：目的:探讨喉癌癌周淋巴管密度 (LVD) 与其临床病理特征的关系。方法:选取30例喉癌组织, 用免疫组织化学法以单克隆抗体D2-40标记淋巴管内皮细胞, 光镜下观察癌内、癌周及正常组织的LVD。结果:喉癌癌内组织LVD为[ (7.73±3.11) 个/HP×400], 癌周组织LVD为[ (13.49±5.49) 个/HP×400], 两组比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 二者均明显高于正常组织的[ (4.39±2.02) 个/HP×400] (P<0.01) 。结论:癌周LVD在喉癌的扩散转移中起重要作用, 可作为选择喉癌治疗方式及预测其淋巴结转移及预后的重要指标。
关键词：喉癌,淋巴管密度,转移
参考文献
[1]刘学忠, 萧世强.影响喉癌预后的因素[J].国外医学:耳鼻咽喉科分册, 1990, 14:28-30.
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淋巴管生成 篇4
色胺酮是一种吲哚喹唑啉类生物碱,存在于多种植物中。有研究报道,色胺酮有抗炎症、抗过敏等药理学功能[11,12,13]。因此,笔者猜测色胺酮对过敏性皮炎有一定的治疗作用。笔者通过对TSLP信号通路中MDM2、P53、TSLPR等进行验证,初步探讨色胺酮在过敏性皮炎中的药理机制,为色胺酮治疗肥大细胞相关过敏性皮炎提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验仪器和试剂
1.1.1 实验仪器
蛋白免疫印迹法(Western blot)设备电泳仪、转膜仪、玻璃胶版等(美国Bio-rad公司),聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(美国Bio-rad公司),实时荧光定量PCR系统(美国ABI公司),倒置显微镜(日本Olympus公司),冷冻离心机、酶标仪、Nano Drop分光光度计(美国Thermo公司)。
1.1.2 实验试剂
色胺酮(Tryptanthrin,TR)(美国Sigma公司,纯度≥98%,SML0310),二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解稀释色胺酮,置于-20℃冰箱冷冻保存,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine,Brd U)(美国Sigma公司),重组TSLP(美国RD Systems公司),胎牛血清、伊思考夫改良杜尔贝可细胞培养基(iscove's modified dulbecco's medium,IMDM)(美国Gibco公司),Brd U、MDM2、P53、PARP、半胱天冬酶-3、β-actin抗体(美国Santa公司),人源肥大细胞系-1(human mast cell line,HMC-1)细胞来自美国菌种保藏中心细胞库。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
含10%胎牛血清的IMDM(加青霉素和链霉素)培养HMC-1细胞,置于孵箱37℃、5%二氧化碳CO2,平均2~3 d传代1次,取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 细胞处理和分组
色胺酮由DMSO稀释于-20℃冰箱冷冻备用,TSLP蛋白经转染试剂处理进入肥大细胞。实验细胞主要分为3组:空白对照组为DMSO空白和空载质粒转染;TSLP刺激组为转染重组TSLP蛋白处理;色胺酮处理组为TSLP刺激合并转染重组TSLP蛋白后,加入不同浓度色胺酮处理。
1.2.3溴脱氧尿苷渗入试验
采用台盼蓝细胞计数方法,各处理组细胞1×104个,设置3次重复,加入Brdu作用3 h,磷酸缓冲盐溶液冲洗1次,经固定、解链、封闭后,一抗4℃孵育过夜,二抗孵育1 h。通过免疫比色法比较各组细胞增殖情况。
1.2.4 噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]比色法
MTT比色法检测细胞活力,计数生长对数期的肥大细胞约1×105个/L,传入96孔板,分为空白处理组、0.1、1.0和10.0μmol共4组,每组8个复孔,并与MTT溶液(5 mg/ml)37℃孵育4 h。终止培养后,每孔加入200μl DMSO,溶解甲瓒结晶。酶标仪检测各孔在540 nm处的吸光度值。
1.2.5 Western blot检测
收集各处理组的肥大细胞,RIPA裂解液4℃裂解30min,最大转速离心5 min,收集蛋白,并进行蛋白定量。5×loading加入蛋白液中95℃煮10 min,视定量结果加入样品,经10%分离胶分离90 min,100 V恒压转膜100 min。5%的脱脂牛奶封闭1 h,4℃过夜孵育蛋白一抗。第2天,TBST溶液洗膜3遍,5 min/次,室温孵育二抗1 h,洗膜3遍,7 min/次;加入A、B发光液后,暗室操作曝光。随机选取曝光蛋白条带3处位置进行蛋白灰度分析,进行各处理组蛋白水平比较。
1.2.6 实时荧光定量PCR反应
采用Trizol抽提RNA的方法进行总RNA的提取,RNA提取在通风厨中进行。各处理组细胞经1 ml Trizol处理后,将裂解物吸置于离心管中,加入200μl氯仿,颠倒震荡数10下。4℃、12 000 r/min离心10 min,缓慢吸出400μl上清液放置于新的离心管中。加入等体积的异丙醇充分混合后,4℃、最大转速离心10 min。弃上清,加入75%乙醇1ml,洗涤沉淀,4℃、12 000 r/min离心5 min。弃上清液,吸净酒精,并在通风厨中放置,待残留的酒精液体完全挥发后,视沉淀加适量的无RNA酶H2O,70℃煮10 min。测定RNA浓度,取2μg RNA进行反转录PCR反应。各处理组设置3重复,采用2-△△CT方法对数据进行分析,GAPDH为内参蛋白。见表1。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,计量资料均采用数±标准差(±s)表示,组间的比较用单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 色胺酮对HMC-1肥大细胞活力和增殖的影响
MTT比色法结果显示,0.1、1.0和10.0μmol的色胺酮分别处理HMC-1细胞后,各组OD值比较,经单因素方差分析,差异无统计学意义(F=0.785,P=0.512),细胞活力未受到影响。见表2。
溴脱氧尿苷实验结果显示,TSLP刺激组与空白对照组渗入Brd U的细胞含量比较,经t检验,差异有统计学意义(t=8.557,P=0.001),TSLP刺激组比空白对照组含量高;10.0μmol色胺酮单独处理后,色胺酮刺激组和对照组比较,经t检验,差异无统计学意义(P>0.05);在TSLP刺激后,并于1.0和10.0μmol色胺酮处理组中,色胺酮处理组和TSLP刺激组渗入Brd U的细胞含量比较,经t检验,差异有统计学意义(t=6.532和9.910,P=0.003和0.001),0.1μmol色胺酮处理后,差异无统计学意义(P>0.05),1.0和10.0μmol色胺酮处理组中渗入Brd U的细胞含量高于TSLP刺激组。见图1A。
Ki-67m RNA检测结果显示,TSLP刺激组与空白对照组比较,经t检验,相对Ki-67m RNA水平,差异有统计学意义(t=68.663,P=0.000),TSLP刺激组水平高于空白对照组;经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮再次处理后,各组与TSLP刺激组相对Ki-67m RNA水平比较,经t检验,差异有统计学意义[t=9.390、18.164和42.819,P=0.001、0.000和0.000],经色胺酮处理后,细胞中相对Ki-67 m RNA水平升高。见图1B~D。
2.2 色胺酮抑制HMC-1细胞中MDM2和P53蛋白水平的表达
Western blot结果表明,在TSLP刺激后,HMC-1细胞中MDM2和P53蛋白水平升高,经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮处理后,MDM2蛋白水平降低,P53蛋白水平升高,且浓度越高,变化越大。蛋白灰度结果显示,TSLP刺激组与空白对照组MDM2和P53蛋白水平比较,经t检验,差异有统计学意义(t=36.947和55.118,P=0.000),TSLP刺激后MDM2和P53蛋白水平降低;经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮处理后,与TSLP刺激组比较,经t检验,差异有统计学意义(MDM2蛋白:t=52.693、57.034和57.808,P=0.000;P53蛋白:t=42.866、9.550和16.977,P=0.000、0.001和0.000),MDM2蛋白水平受到抑制,P53蛋白水平升高。见图2。
1)与空白对照组比较,P<0.05;2)与TSLP刺激组比较,P<0.05
2.3 HMC-1细胞中凋亡标志蛋白半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白在色胺酮的作用下的表达
Western blot结果表明,半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白水平在TSLP的刺激后降低,经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮处理后,蛋白水平回升。蛋白灰度分析显示,与空白对照组半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白水平比较,经t检验,差异有统计学意义(t=8.033和27.587,P=0.001和0.000),半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白在TSLP刺激后水平降低;经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮处理后,与TSLP刺激组半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白水平比较,经t检验,差异有统计学意义(半胱天冬酶-3:t=8.379、9.273和18.864,P=0.001、0.001和0.000;PARP剪切蛋白:t=13.629、31.576和21.330,P=0.000),半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白水平升高。见图3。
2.4 色胺酮降低TSLP上游信号通路中IL-7Rα和TSLPR m RNA水平
实时荧光定量PCR结果显示,TSLP刺激组与空白对照组m RNA水平比较,经t检验,差异有统计学意义(t=6.307和9.874,P=0.003和0.001),TSLP上游信号蛋白IL-7Rα和TSLPR m RNA水平在TSLP刺激后均升高;经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮处理后,色胺酮处理组与TSLP刺激组m RNA水平比较,经t检验,差异有统计学意义(IL-7Rα:t=3.141、6.563和5.529,P=0.035、0.003和0.005;TSLPR m RNA:t=2.948、8.017和7.626,P=0.042、0.001和0.002),两者m RNA水平均降低。见图4。
1)与空白对照组比较,P<0.05;2)与TSLP刺激组比较,P<0.05
1)与空白对照组比较,P<0.05;2)与TSLP刺激组比较,P<0.05
1)与空白对照组比较,P<0.05;2)与TSLP刺激组比较,P<0.05
3 讨论
肥大细胞与过敏性皮炎密切相关,在皮肤损伤部位,肥大细胞不断聚集,最终导致皮肤炎症[14,15,16];有报道称TSLP在过敏性皮炎患者皮肤损伤部位高度表达[17],近年来,更有研究发现,TSLP可调控肥大细胞增殖,加剧肥大细胞调节的疾病,如过敏性皮炎[8]。色胺酮具有潜在的抗过敏药效,因此,笔者对色胺酮在TSLP促肥大细胞增殖进程中发挥的药理机制进行探索,以期为色胺酮治疗过敏性皮炎提供理论依据。本研究结果证实,色胺酮可抑制TSLP促HMC-1肥大细胞的增殖,初步结果表明,色胺酮可通过抑制MDM2蛋白表达,提高P53蛋白水平,进而引起凋亡标志蛋白半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白水平升高,激活细胞凋亡;另外,通过对TSLP上游信号通路的检测发现,IL-7Rα和TSLPR m RNA水平在色胺酮的作用下降低。
Brd U是一种胸腺嘧啶的衍生物,在DNA合成S期,可代替胸腺嘧啶参与DNA新链合成,并稳定存在细胞核内,供于检测。本研究发现,色胺酮抑制Brd U嵌入TSLP刺激的肥大细胞。研究报道,Ki-67m RNA水平的检测可作为细胞增殖活性的一个标志[18],而笔者对Ki-67水平的检测同样证实色胺酮可抑制TSLP促肥大细胞增殖。
MDM2参与P53蛋白的降解,并在P53蛋白稳态中发挥关键作用[19]。相关研究结果证实,MDM2和P53通路调节细胞增殖和凋亡[20]。本实验结果显示,色胺酮抑制MDM2、P53蛋白水平升高,表明色胺酮在MDM2和P53通路中发挥作用。
半胱天冬酶在调控细胞凋亡进展中发挥关键作用[21],在细胞凋亡发生时,半胱天冬酶-3将113 k D的PARP蛋白分别剪切至89和24 k D片段大小[22],另外,半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白也被报道参与过敏反应[23,24];近年来,色胺酮被报道在白血病细胞中发挥抑制细胞增殖并引发细胞凋亡的作用[25]。本实验通过对半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白的表达水平检测发现,在HMC-1肥大细胞中,色胺酮处理后两者蛋白水平升高,提示色胺酮可加速在肥大细胞中的凋亡进展。
IL-7Rα和TSLPR在TSLP上游信号通路形成异质二聚体复合物,促使TSLP发挥作用[6],为进一步探索色胺酮在肥大细胞中的药理机制,笔者检测两者m RNA水平表达,实时荧光定量PCR结果显示,m RNA水平降低,提示色胺酮可抑制两者在转录水平上的表达。
值得注意的是,实验过程中0.1μmol色胺酮处理组与TSLP刺激组TSLPR m RNA水平比较,差异无统计学意义。其原因可能为:①实验操作误差;②低浓度色胺酮药力低效,提示在临床上对色胺酮的使用浓度需谨慎。
淋巴管生成 篇5
关键词：临床护理路径,淋巴细胞生成素,重症肌无力,生活质量,免疫功能
重症肌无力 (myasthenia gravis, MG) 是一种以神经肌肉传导障碍为特征的自身免疫性疾病, 其在发病中主要涉及到了乙酰胆碱受体抗体 (anti-acetylcholine receptorantibody, ACh R-Ab) 介导、补体参与、细胞免疫依赖的自身免疫性疾病, 是自身免疫耐受失败的结果[1]。流行病学调查显示我国的重症肌无力多见于青壮年, 发病率有逐年升高的趋势, 导致的致残率与病死率都比较高, 临床上以眼外肌受累首发, 逐渐波及球部和四肢肌肉[2]。在治疗中, 目前治疗重症肌无力的传统药物主要是糖皮质激素 (glucocorticosteroid, GC) 、大剂量免疫球蛋白 (intravenous high dose of immunoglobulin, IVIg) 等免疫抑制剂, 其副作用大, 并且有一定的依赖性。而当前采用胸腺切除术越来越多, 但是也存在手术创伤大、出血较多、术后复发多、对患者循环呼吸功能干扰较大等缺点[3]。众所周知, 调控和维持机体自身免疫耐受的主要免疫细胞是CD4+CD25+调节性T细胞 (CD4+CD25+regulatory T cells, Tregs) , 为此将机体的Tregs进行干预将诱导自身免疫性疾病, 若将其回输则有治疗作用[3]。淋巴细胞生成素胸腺五肽 (thymopentin 5, TP5) 是胸腺生成素Ⅱ (thymopoietin, TP) 第32~36位氢基酸残基片段, 具有诱导T淋巴细胞分化, 达到调节免疫功能的作用[4]。临床护理路径是临床路径在护理实践中的应用, 其在应用上是以患者为中心的一种护理模式, 不仅有助于提升患者的临床护理质量, 也将对患者的院内和院外护理提供理论和实践参考[5]。本研究探讨了临床护理路径配合淋巴细胞生成素在重症肌无力患者预后改善中的应用, 现报道如下:
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择在哈尔滨医科大学附属第二医院神经内科2009年2月~2013年12月收治的重症肌无力120例, 纳入标准:根据典型的肌无力临床表现, 新斯的明试验, 肌电图检查确诊;术后住院时间≥7 d;均未使用过任何免疫抑制剂治疗;年龄20~80岁;患者知情同意并经过伦理委员会批准。排除标准:胸部CT检查示胸腺增生或胸腺不正常;合并胸腺瘤者。其中男63例, 女57例;年龄22~79岁, 平均 (46.89±5.12) 岁;病程3~36个月, 平均 (16.58±3.36) 个月;疾病类型:眼肌型80例, 全身型40例;疾病程度:根据美国重症肌无力协会 (Myasthenia Gravis Foundation of America, MG-FA) 制订的临床分型标准进行判断, Ⅰ型10例, Ⅱ型60例, Ⅲ型38例, Ⅳ型12例。根据入院顺序将其分为治疗组与对照组各60例, 两组一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 治疗方法
所有患者均给予淋巴细胞生成素结合手术治疗, 在手术中, 第一切口选择在右腋中线第7肋间, 先置入胸腔镜探查胸腺位置, 后确定第二切口为右腋前线第3肋间, 第三切口选择右锁骨中线第5肋间。寻找右侧膈神经, 给予保护;然后于膈神经前方纵行切开纵隔胸膜, 分离后逐渐分离胸腺组织, 电凝止血。完整分离胸腺右叶、胸腺左叶, 尽量清除前纵隔脂肪。完成止血后予止血纱布填塞及生物蛋白胶喷洒。术后常规留置胸腔引流管后关胸。在药物辅助治疗中, 术后给予强的松联合胸腺五肽治疗, 强的松的剂量为0.1~0.5 mg/ (kg·d) ;胸腺五肽 (海南翰宁药业) 的剂量为1 mg/d。
1.3 护理方法
对照组采用围术期的常规护理, 即整床护理。治疗组在常规护理基础上, 给予以临床护理路径为主的护理干预, 具体的临床路径见表1。在临床路径的实施中, 专业组长每天检查实施情况与记录, 护士长不定期检查实施情况, 促进质量改进。
1.4 观察指标
1.4.1 重症肌无力的疗效评价
显效:症状消失, 停用所有药物, 恢复日常生活;有效:症状部分缓解, 需要继续服用药物维持治疗, 辅助日常生活;无效:症状无改变甚或恶化, 药物用量无变化, 日常生活不能独立。
1.4.2围术期指标观察
观察两组的气管拔管时间、胸管引流时间与术后住院时间。
1.4.3 免疫指标测定
所有患者在术前与术后7 d应用流式细胞仪检测并分析患者免疫功能的相关的细胞因子浓度, 包括肿瘤坏死因子 (TNF) -α、白介素 (IL) -4等, 其中TNF-α被看作是Th1分泌的细胞因子, IL-4被看作是Th2分泌的细胞因子, 试剂盒都来自BD公司, 严格按照试剂盒说明书操作。
1.4.4 生活质量评价
在出院时采用SF-36量表即健康调查简表 (MOS 36 item short form health survey, SF-36) 进行随访生活质量调查, 包括心理功能、社会功能、躯体功能和物质生活状态四个维度, 分数越高, 生活质量越好。
1.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行分析, 计量资料数据以均数±标准差 (±s) 表示, 采用独立样本t检验与秩和检验。计数资料以率表示, 采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组围术期指标对比
两组都顺利完成治疗, 且气管拔管时间、胸管引流时间与术后住院时间对比, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。
2.2 两组疗效对比
干预后治疗组与对照组有效率分别为98.3%和88.3%, 治疗组总体效果明显高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表3。
2.3 两组免疫功能指标的变化比较
经过观察, 干预后两组的血清TNF-α与IL-4值明显升高, 组内比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。同时干预后治疗组血清TNF-α与IL-4值明显高于对照组, 组间比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表4。
注:与同组干预前比较, *P<0.05;TNF-α:肿瘤坏死因子-α;IL-4:白细胞介素4
2.4 两组生活质量比较
术后随访6个月, 治疗组心理功能、社会功能、躯体功能和物质生活状态评分明显高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表5。
3 讨论
重症肌无力为乙酰胆碱受体抗体介导、细胞免疫依赖性、补体参与引起神经肌肉传导阻断的自身免疫性疾病, 其在临床上主要表现为骨骼肌易疲劳, 活动后加重为症状特点, 以眼外肌受累首发, 可出现呼吸肌无力, 严重者可导致死亡[6,7]。作为一典型的器官特异性自身免疫性疾病, 它的发生可能也是机体免疫功能失平衡的结果[8,9]。
当前随着电视胸腔镜器械和设备的不断发展与完善, 电视胸腔镜已成为许多胸内疾病的治疗手段, 其具有微创、手术时间快、恢复快等特点[10]。而辅助的药物治疗意义重大, 胸腺是诱导T细胞分化、成熟的器官, T细胞在胸腺发育过程中形成对自身抗原的耐受。如果胸腺结构或功能异常, 胸腺不能消除或抑制针对自身抗原T细胞的克隆, 可激活自身免疫应答, 而TP5主要通过影响细胞因子的分泌, 尤其是调节Th1细胞因子而发挥作用的, 从而改善预后[11]。并且电视胸腔镜手术借着数个小切口连接具有电视影像相结合的内视镜施行手术, 使手术在微小的切口下完成, 一般术后无明显并发症。本文两组都顺利完成干预, 两组的气管拔管时间、胸管引流时间与术后住院时间对比差异无统计学意义 (P>0.05) 。
当前由于康复措施的缺失与医疗资源不足等因素, 我国重症肌无力患者面临术后生活质量下降的严峻威胁, 常规住院教育和出院指导的护理方案不能满足患者对健康服务的复杂需求[12,13]。而实行临床路径可以使护士在围术期不再是盲目机械地执行医嘱或等医生指示后才为患者实施护理, 而是根据路径表设置的项目针对性地进行护理。同时患者也了解相关的治疗和护理计划, 规范了医护人员的诊疗行为, 也让患者有信心面对治疗, 从而改善预后[14]。并且重症肌无力的病程呈慢性、持续性发展, 需要持续性与针对性地干预, TP5被证实对多种疾病具良好的免疫调节作用, 其能显著升高循环中淋巴细胞, 能诱导粒细胞的分化成熟。本文干预后治疗组与对照组有效率分别为98.3%和88.3%, 治疗组总体疗效明显高于对照组 (P<0.05) 。
通过检查分析, 在重症肌无力患者外周血中存在着活化的ACh R特异反应T细胞, 不仅在患者外周血中的CD4+T细胞上呈现高表达, 而且与患者的发病程度有明显关系[15]。增强红细胞的免疫功能, 增加巨噬细胞的吞噬功能, 提高自然杀伤细胞活力;提高IL-2的产生水平与受体表达水平, 能明显缓解肌无力症状[16,17]。干预后两组的血清TNF-α与IL-4值明显升高, 组内比较差异明显 (P<0.05) 。同时干预后治疗组的血清TNF-α与IL-4值明显高于对照组, 组间比较差异明显 (P<0.05) 。表明TP5对多种免疫疾病都有较好的免疫调节作用, 但其免疫调节的具体机制还有待探讨。同时临床护理路径是综合多种护理的延续性与综合型护理干预措施, 也提高了医院管理水平, 促进医院规范化的管理, 使得医疗服务质量持续改进[18,19,20,21]。本文术后随访6个月, 治疗组的心理功能、社会功能、躯体功能和物质生活状态评分明显高于对照组, 对比差异明显 (P<0.05) 。
淋巴管生成 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
所有标本来自聊城市中医院行胸外科手术切除肺叶的非小细胞肺癌存档蜡块54例, 所有患者均知情同意, 并通过伦理委员会的批准。观察组:其中男性36例, 女性18例, 年龄≥60岁的31例, <60岁的23例;高中分化36例, 低分化18例;≤3 cm的20例, >3 cm的34例;鳞癌24例, 腺癌30例, 有淋巴结转移的31例, 无淋巴结转移的23例。所有病例术前均未经治疗。所有病例切片均经HE染色, 由2名有经验的医生光镜下复诊, 有争议者第三者复核后确定。对照组:选择20例肺良性病变手术切除标本, 其中肺大泡15例, 肺结核3例, 炎性假瘤2例。
1.2 方法
slug兔抗人单克隆抗体, 为迈新公司及奥博森公司采购。切片机:美康HM325, 脱水机:常州中威TSJ-3, 光学显微镜:日本产OLYMPUS, 照相机:日本产CANON A640, 恒温孵育箱:常州冠军ZD-85, 烤箱、冰箱、烧杯、染缸等。多聚赖氨酸处理的切片用于免疫组化染色, 切片常规脱蜡至水, 充分水化。抗原修复:柠檬酸盐缓冲液高压高温抗原修复, PBS洗3 min×3。除去PBS, 切片上滴加试剂B (多聚酶结合物) 室温孵育20 min。PBS洗3 min×3。滴加新鲜配制的DAB液显色, 约5~15 min。自来水冲洗, 终止显色。苏木素染核l~2 min。脱水透明, 中性树胶封片。
1.3 统计方法
应用SPSS 16.0统计软件包分析数据, 计数资料采用率进行比较, 组间比较采用χ2检验。
2 结果
2.1 C-erb B-2的免疫组织化学检测结果
2.1.1 C-erb B-2在非小细胞肺癌及肺良性病变中的表达
4例非小细胞肺癌组织病理切片中, C-erb B-2阳性表达率达74.07%, 20例肺部良性病变的组织切片中, C-erb B-2阳性率为15%, 两者比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
2.1.2 C-erb B-2在非小细胞肺癌有淋巴结转移和无淋巴结转移组织中的表达
非小细胞肺癌病理组织中, 淋巴结转移组阳性率为80.65%, 无淋巴结转移组阳性率为65.22%, 淋巴结转移组的阳性率明显高于无淋巴结转移者, 二者之间差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。
2.2 VEGF的免疫组织化学检测结果
2.2.1 VEGF在非小细胞肺癌及肺良性病变中的表达54例非小细胞肺癌肺癌组织病理切片中, VEGF阳性表达36例, 阴性18例, 阳性表达率为66.67%, 肺良性病变中, VEGF阳性2例, 阴性18例, 阳性表达率为1 0%, 两者比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表3。
2.2.2 VEGF在非小细胞肺癌有淋巴结转移和无淋巴结转移组织中的表达
在54例非小细胞肺癌的病理组织中, 淋巴结转移组阳性率为51.62%, 无淋巴结转移组的阳性率为39.13%, 转移组明显高于未转移组, 二者之间差异有统计学意义。
3 讨论
非小细胞肺癌占所有肺癌的75%~80%。非小细胞肺癌早期可无症状, 周围型肿瘤患者可无局部症状。非小细胞肺癌的临床表现复杂多变, 可以由原发肿瘤、胸内蔓延、远处转移和副肿瘤综合征引起[4]。胸部增强CT是常用的非小细胞肺癌影像学诊断方法。不同分型的非小细胞肺癌CT表现各有特点。中央型肺癌表现为支气管腔内肿块、支气管腔狭窄、支气管壁增厚、肺门肿块等直接征象, 阻塞性肺炎、肺不张等继发征象及肺门淋巴结肿大等[5]。
免疫系统可能有刺激肿瘤生长的作用, 这种刺激效应可能是由于淋巴细胞激活其他产物对肿瘤生长的直接作用所致[6]。人们目前尚不清楚在肿瘤中刺激性或抑制性反应何者占优势, 这些可能与肿瘤抗原的特征、抗原递呈方式以及宿主免疫细胞相互作用的初始部位有关。
肿瘤的免疫治疗分为主动免疫治疗和被动免疫治疗两种类型[7]。主动免疫治疗是指用制备抗原刺激荷瘤宿主, 使宿主发生免疫反应, 从而消除肿瘤或抑制肿瘤的生长。主动免疫治疗又可以分为非特异性主动免疫治疗和特异性主动免疫治疗两种。早期的肿瘤免疫治疗多应用非特异性主动免疫, 该方法要用免疫佐剂进行免疫刺激, 如卡介苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑等[8]。用肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物进行治疗也需和免疫佐剂联合使用。这些免疫治疗大多数不成功, 现在很少使用。早期开发肿瘤疫苗进行肿瘤主动免疫现仍是研究的热点, 目前尚无实质性的突破。在肿瘤被动免疫中使用独特的单克隆抗体治疗B细胞淋巴瘤和T细胞白血病已取得了令人满意的效果, 是肿瘤治疗今后研究的方向之一[9]。
通过该研究发现, 54例非小细胞肺癌组织病理切片中, C-erb B-2阳性表达40例, 阴性表达14例, 阳性表达率达74.07%, 两者比较有显著差异 (P<0.05) 。54例非小细胞肺癌肺癌组织病理切片中, VEGF阳性表达36例, 阴性18例, 阳性表达率为66.67%, 肺良性病变中, VEGF阳性2例, 阴性18例, 阳性表达率为10%, 两者比较有显著生物学差异, 通过以上数据我们不难看出, , C-erb B-2与, VEGF在肺癌中的阳性率显著大于良性病变者。学者张劲男等[10]探讨了慢病毒介导的si RNA干扰乳腺癌MCF-7细胞MIF对VEGF-C表达的影响, 研究结果发现, 在乳腺癌患者中, VEGF-C表达阳性率89.75%, 与该研究结果一致。
通过该研究结果发现, VEGF、c-erb B-2与非小细胞肺癌的发生发展中密切相关, 并在此过程中起到一定的调控作用, VEGF、c-erb B-2表达增强预示着患者较易发生淋巴结转移, 提示患者预后不佳, 有助于早期判断预后。
摘要：目的 探讨VEGF、c-erb B-2与NSCLC血管生成及淋巴道转移的相关性。方法 方便选取聊城市中医院2004—2012年非小细胞肺癌存档蜡块54例作为观察组, 对照组选择20例肺良性病变手术切除标本, 观察两组的VEGF、cerb B-2水平。结果 54例非小细胞肺癌组织病理切片中, C-erb B-2阳性表达40例, 阴性表达14例, 阳性表达率达74.07%, 两者比较有显著差异 (P<0.05) 。54例非小细胞肺癌肺癌组织病理切片中, VEGF阳性表达36例, 阴性18例, 阳性表达率为66.67%, 肺良性病变中, VEGF阳性2例, 阴性18例, 阳性表达率为10%, 两者比较有显著生物学差异。结论VEGF、c-erb B-2与非小细胞肺癌的发生发展中密切相关, 并在此过程中起到一定的调控作用, VEGF、c-erb B-2表达增强预示着患者较易发生淋巴结转移, 提示患者预后不佳, 有助于早期判断预后。
关键词：VEGF,c-erb B-2,NSCLC,血管生成,淋巴道转移
参考文献
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