p-AKT蛋白论文（精选5篇）
p-AKT蛋白论文 篇1
慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)是一种多能造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病,Bcr/abl融合基因是CML发病的分子基础,伊马替尼是Bcr/abl的特异性抑制剂[1]。研究发现,甲基莲心碱(neferine,Nef)联合伊马替尼(ima- tinib,IM)能够增强K562/G01增殖抑制作用[2]。本实验研究甲基莲心碱联合伊马替尼对CML原代细胞Akt/p-Akt的表达影响,从中探讨甲基莲心碱联合伊马替尼对CML原代细胞敏感性影响的可能机制。
1资料与方法
1.1一般资料
收集中南大学湘雅医院门诊2012年10月-2013年2月初诊为慢性粒细胞白血病慢性期患者3例, 年龄18~59岁,平均33.75岁;Ph染色体阳性或Bcr/ abl融合基因阳性。
1.2主要仪器与试剂
伊马替尼(瑞士诺华公司惠赠),甲基莲心碱(华中科技大学药理学实验室惠赠),1640培基(Gib- co/BRL),小牛血清(杭州四季青公司),BCA蛋白分析定量试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所),蛋白分子质量标准(美国Genview公司),兔抗Akt抗体, 兔抗p-Akt(ser473)(美国Cell Signaling Technology公司),5×SDS- 蛋白上样缓冲液(江苏碧云天生物技术研究所)。
1.3实验方法
1.3.1细胞培养门诊收集的骨髓标本在3 h内于无菌操作台内以密度梯度离心法进行单个核细胞的提取和分离。调整细胞密度为5×106个/ml,于每孔1 600μl细胞悬液接种于6孔板,置于37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育4 h后,按分组加入药物,使终体积为2 000μl,药物终浓度及实验分组如下:CML细胞悬液+400μl无药组;CML细胞悬液+400μl Nef (4μmol);CML细胞悬液+400μl IM(1μmol);CML细胞悬液+200μl IM(1μmol)+200μl Nef(4μmol)。 按上述分组干预细胞后,置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48 h。
1.3.2抽提蛋白按上述方法处理CML原代细胞经48 h后,每组取1.5 ml,离心弃上清液,经PBS清洗两遍弃上清液,得细胞沉淀,向其中加入100μl RIPA蛋白裂解液,充分吹打后置冰上20 min,4℃, 12 000 r/min,离心10 min,吸取上清液,提取蛋白质。
1.3.3检测Akt蛋白的表达水平提取各组蛋白质,对其进行蛋白定量和变性,行10%SDS-PAGE电泳,转至聚偏二氟乙烯(polyviny-lidene fluoride, PVDF)膜,加入含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭; 将Akt和p-Akt抗体及内参稀释后,将目的和内参膜分别放入到Akt、p-Akt和内参的一抗工作液中,4℃ 孵育过夜;洗膜30 min,将洗好的反应膜转至对应的已稀释好的抗兔Akt二抗、抗兔p-Akt抗体及内参工作液中孵育1 h;洗膜30 min。采用ECL试剂盒进行显影(按A∶B按体积比为1∶1充分混合)。
1.4统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,实验数据以均数±标准差(±s)表示,资料符合正态分布且各组方差齐,直接用随机区组设计资料方差分析,若结果有统计学意义,进一步用LSD-t检验作两两之间比较;若资料不符合正态分布或方差不齐时, 用非参数检验的Fridman M检验,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
将p-Akt和Akt条带灰度与 β-actin的灰度比作为待测蛋白的相对表达量。 结果显示,Nef (4μmol)组、IM(1μmol)组及Nef(4μmol)+IM(1μ mol) 组,对Akt蛋白表达均无影响(P >0.05),而p-Akt蛋白表达均降低,Nef(4μmol)+IM(1μmol)组较IM(1μmol)组更降低p-Akt蛋白表达,差异有统计学意义(P <0.05)。见附表。
注:1)与Nef(4μmol)组比较,P <0.01;2)与IM(1μmol)组比较,P < 0.05
3讨论
慢性粒细胞白血病是由9号染色体的ABL基因易位与22号染色体的BCR融合,形成有酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合基因,进而引起慢性粒细胞白血病[3]。伊马替尼是第一代酪氨酸激酶抑制剂,通过与BCR-ABL激酶结合,使蛋白稳定在一个非活化构象而发挥功能[4]。国际研究中心(IRIS)研究干扰素和伊马替尼的临床试验结果显示,伊马替尼对初诊为慢性粒细胞白血病的慢性期患者的疗效优于干扰素和阿糖胞苷,是慢性粒细胞白血病的一线治疗药物[5]。
甲基莲心碱是从睡莲科植物莲成熟种子的绿色胚芽中提取的一种双苄基异喹啉生物碱,具有抗氧化、抗心律失常、抗血小板聚集、扩血管、降压及化疗增敏等药理作用[6]。研究显示,甲基莲心碱在无毒剂量下能增强伊马替尼对K562/G01细胞的增殖抑制作用[2，7]。
Akt是PI3K/AKT/ 通路中的关键基因,在慢性粒细胞白血病患者中,PI3K/Akt通路被bcr/abl基因持续激活,Akt磷酸化(p-Akt),p-Akt激活下游靶分子,使通道活性增加,影响骨髓基质粘附性,影响细胞增殖以及凋亡,对CML细胞的发生发展起调控作用[8,9]。本研究采用Western blot法检测Akt/p-Akt蛋白的表达水平,探讨甲基莲心碱联合伊马替尼对CML原代细胞影响及可能的增敏机制。实验结果显示,甲基莲心碱联合伊马替尼能降低p-Akt蛋白表达,作者推测,甲基莲心碱可增强伊马替尼对慢性粒细胞白血病原代细胞的敏感性,可能与降低p-Akt蛋白表达有关。本研究采用的病例标本检测还较少,还有待进一步研究。
p-AKT蛋白论文 篇2
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
选取2001 年1 月- 2010 年3 月解放军第82 医院149 临床部收治的乳腺癌患者,并收集其乳腺癌组织蜡块261 例和相应癌旁组织蜡块148 例,制成病理组织芯片,重新切片备用。 实验试剂鼠抗人pAkt单克隆抗体由RD SYETENS公司提供,即用型快捷免疫组织化学Max VisionTM试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供,即用型正常山羊血清、DAB显色剂由武汉柏世德生物技术有限公司提供。
1.2 仪器与设备
全自动组织芯片仪Mini Core购自英国Mitogen公司,BT- 320 型系列生物组织切片机购自湖北博太电子科技有限公司,BT- 310B型系列生物组织自动包埋机购自湖北博太电子科技有限公司,BT- 330 摊片烤片机购自湖北博太电子科技有限公司,HS- 150恒温箱购自南京泰斯特试验设备有限公司,芯片扫描仪购自日本Olympus公司。
1.3 实验方法
实验分组:本研究共纳入患者261 例,根据术后患者的复发情况,将其分为术后转移组( 114 例) 和术后未转移组( 147 例)。 入组标准:①年龄18~70 岁,女性;②乳腺癌术后,术式包括乳腺癌局部广泛切除术、乳腺癌改良根治术、乳腺癌根治术、前哨淋巴结活检术和腋淋巴结清扫术;③随访5 年以上( 包括术后5 年内死亡病例) ,资料完整者。排除标准:①乳腺癌行姑息性手术者;②随访不足5 年或资料不完整者。
1.3.1芯片微陈列设计
预先计算组织芯片待检测样本的数量,将组织芯片设计成2组,一组为癌组织芯片组,另一组为癌周围正常组织(与癌组织距离≥2.5 cm)芯片组,将癌组织芯片设计为在常规的载玻片上放置47个样本,癌周围正常组织芯片设计为95个样本。
1.3.2标本定位
分别对挑选出乳腺癌组织及其周围正常组织蜡块切片,进行HE染色,镜下观察准确定位后,在供体蜡块标本上标记,包括典型的癌组织和其周围的正常组织。
1.3.3组织芯片制作
①受体蜡块制备:制作成36 mm×26 mm×17 mm的空白蜡块,共8块:癌组织蜡块6块,正常组织蜡块2块;②受体蜡块打孔;③供体蜡块采集组织芯;④组织芯片;⑤重新塑形组织芯片,置于4℃冰箱中保存备用;⑥组织芯片的切片,厚度设计为4μm,置入-20℃冰箱冷冻保存备用。
1.3.4免疫组织化学染色
组织芯片室温下静置30 min,后60℃下烤片1 h。常规二甲苯脱蜡和乙醇梯度脱水,1×PBS液洗涤3次。抗原修复:组织芯片置于已煮沸的0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(p H 6.0)中高压锅继续煮沸,至高压锅排气2 min后,冷却至室温后1×PBS液洗涤3次。过氧化氢灭活内源性过氧化物酶,1×PBS液洗涤3次。山羊血清封闭液,37℃温育30 min后倾去封闭液。滴加一抗,置于4℃冰箱过夜。取出过夜组织芯片,1×PBS液洗涤3次。滴加生物素标记二抗,37℃温育30 min。取出组织芯片,1×PBS液洗涤3次,滴加新鲜配置的DAB显色液。⑩终止显色,苏木素衬染细胞核。盐酸酒精冲洗,氨水返蓝。常规乙醇梯度脱水,二甲苯透明。中性树脂封片留存。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0.0 统计学软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差( ±s) 表示,以个数和百分比描述分类变量, 组间比较使用四格表 χ2检验或Fisher精确检验, 各组间数据的比较依据资料的性质, 用t检验或方差分析,P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者一般资料
乳腺癌术后患者在转移复发组与未转移复发组之间,年龄差异无统计学意义( P >0.05) ;肿瘤大小( T) 、淋巴结转移( p N) 、TMN分期比较差异有统计学意义( P <0.01) 。 见表1。
2.2 各组间p-Akt的表达比较
乳腺癌癌旁正常组织、乳腺癌切除术后转移复发患者癌组织和乳腺癌切除术后未转移复发患者癌组织中p- Akt的表达见附图。 所有癌旁正常组织标本p- Akt的阳性表达率为11.4%,全部癌组织pAkt的阳性表达率为26.4%,两者间差异有统计学意义( P <0.05) ;转移复发患者乳腺癌组织p- Akt的阳性表达率为39.5%,未转移复发患者p- Akt的阳性表达率为16.3%,两者间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
注:1) 所有分期参考2015 年第2 版NCCN指南AJCC乳腺癌分期;2) 年龄P值由t检验计算得出,其余P值由 χ2检验或Fisher精确检验计算得出
A:乳腺癌癌旁正常组织;B:术后转移复发乳腺癌患者癌组织;C:术后未转移复发乳腺癌患者癌组织
2.3 p-Akt的表达与乳腺癌肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期的相关性
随着肿瘤大小、淋巴结转移数量和TNM分期的增加, 在复发组与未复发组中p- Akt异常表达呈逐渐上升的趋势( P <0.05) 。 分别对肿瘤大小、淋巴结转移数量和TNM分期分层分析,复发组和未复发组各亚组中,T1期、p N0期和Ⅰ期的p- Akt的异常表达差异有统计学意义( P <0.05) ,见表3。
2.4 乳腺癌术后转移复发的单因素Logistic回归分析
单因素Logistic回归分析发现,p- Akt的异常表达的与乳腺癌术后复发有显著的相关性( P =0.043,RR=1.638,95%CI:1.337,1.955) , 并且肿瘤大小、淋巴结转移数量和TNM分期也与乳腺癌术后复发有显著相关性( P <0.05) ,而年龄与乳腺癌术后转移复发无显著相关性( P >0.05) 。 见表4。
%
注:1) 百分比是指转移和未转移比例数分别占各分层组的百分比;2)P值是根据百分率由 χ2检验或Fisher精确检验
3 讨论
Akt( 又称Akt1) 是通过抑制细胞凋亡过程参与细胞存活途径的[6]。 Akt1 最初在转化逆转录病毒中被鉴定为癌基因Akt8[7]。 Akt是通过以下方式参与PI3K/Akt/m TOR途径和其他信号途径的:①结合磷脂:Akt具有一个PH结构域,该域与磷酸肌醇具有高亲和力,能结合任一PIP3 或PIP2[8],从而调节细胞的生长过程;②磷酸化:一旦经由PIP3 的结合正确地定位在膜上,Akt即可以通过其激活激酶磷酸化[9,10]。 除了是PI3- 激酶的下游效应,Akt也可以在一个非PI3- 激酶依赖的方式下激活。 ACK1 或TNK2,是一种非受体酪氨酸激酶,它可以通过其酪氨酸176 残基使Akt磷酸化[11]。 研究表明,c AMP的升高剂也可以在胰岛素的存在时通过蛋白激酶A( PKA) 激活Akt[12]; ③ 泛素化: 被泛素化的p- Akt( E17K) 可以比野生型的Akt更有效地向细胞核易位,这种机制可能有助于在人类诱发癌症[13];④脂质磷酸酶和PIP3:PI3K依赖Akt的活化可以通过肿瘤抑制因子PTEN来调节,其基本上可以作为PI3K的上述相反的调节[14]。Akt可以通过结合和调节多种下游效应器来调节细胞的存活和新陈代谢[13]。 BAD是一种Bcl- 2 家族的促凋亡蛋白。 Akt可以使BAD蛋白磷酸化[15],这使得BAD从Bcl- 2/Bcl- X复合体游离,失去促凋亡功能[16]。 Akt也可以通过调节IκB激酶( IKK) 激活NF- κB,从而引起的促存活基因的转录[17]。 Akt活化可以终止细胞周期停滞在G1期和G2相[19,20]。 Akt1 的也被牵连在血管生成和肿瘤发展。 虽然Akt1 在小鼠中虽然Akt1 的缺乏抑制生理性的血管生成,但它增强在皮肤和血管基质异常相关的病理性血管生成和肿瘤生长[21,22]。目前已有大量研究证实,Akt与肿瘤细胞的生存,增殖和侵袭相关联,不断激活Akt的肿瘤细胞可能依赖Akt而存活[23]。
本研究总体上表明,p- Akt在乳腺正常组织和乳腺癌组织中均被表达, 但是p- Akt在乳腺癌组织中总体上的表达显著高于正常乳腺组织中的表达,同时发生转移复发者癌组织中p- Akt的表达显著高于未发生转移复发者。 进一步通过分组亚层分析发现, 乳腺癌组织T分期为T1期时,p- Akt的表达在转移复发组和未转移复发组间的表达有显著差异,其他T分期两组间并无显著差异;乳腺癌组织p N分期为p N0期时,p- Akt的表达在转移复发组和未转移复发组间的表达有显著差异,表明p- Akt在乳腺癌组织和乳腺正常组织中的表达虽存在显著差异,但是在乳腺癌的早期该差异更为明显,提示笔者p- Akt是否是早期乳腺癌术后转移复发的一个分子标记物。 同时单因素因素Logistic回归分析结果也提示,p- Akt与肿瘤大小、 淋巴结转移数量和TNM分期均是乳腺癌术后转移复发的独立预测因素,这也与结果中两组患者一般资料存在显著差异相吻合。
p-AKT蛋白论文 篇3
1 实验材料与方法
1.1 材料
动物:健康清洁级成年雄性Wistar大鼠,体质量(350±20)g,实验前正常饲养1周。购自黑龙江中医药大学实验动物中心。动物许可证号:SCXK(黑)2013-0001。主要仪器:手术显微镜:Carl Zeiss;螺旋测微仪:由上海刀具刃具厂提供;BCD-208KS型恒温低温冰箱:中国青岛海尔公司;医用耳脑型胶(EC):由广州市香雪生物医学工程有限公司提供;生物组织包埋机:中国天津航空机电公司提供。华佗牌针灸针:由苏州医疗用品有限公司提供。主要试剂:2.5%戊二醛:由上海君瑞生物技术有限公司提供;4%的多聚甲醛:由上海紫一试剂厂提供;10%福尔马林:由南昌雨露实验器材有限公司提供;二甲苯:由上海紫一试剂厂提供;苏木素:由上海亨代劳商贸有限公司提供;伊红:由天津市赛瑞达生物工程有限公司提供;LY294002:由上海谱振生物科技有限公司提供;P-Akt免疫组化试剂盒:由武汉博士德生物有限公司提供;DAB显色试剂盒:由北京中杉金桥生物有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 脑出血模型的制备
根据大鼠脑立体定位图谱[1]确定右侧尾壳核位置。参照邹氏法[2]和Rosenberg方法[3]制作脑出血大鼠模型。
1.2.2 实验动物分组及处理
选用雄性Wistar大鼠54只,随机分为3组:模型组、针刺组(模型+针刺组),针刺组+抑制剂组(针刺组+LY294002),每组18只。
模型组:1、3、7天3个时相点,不治疗。针刺组:1、3、7天分别给予针刺百会透曲鬓治疗,留针30分钟,期间捻转3次,每次5分钟,以200 r/min速度捻针。针刺组+LY294002组(抑制剂组):脑出血造模前30分钟给药,LY294002 1 mg,日1次,腹腔注射;针刺百会透曲鬓穴。
1.2.3 观察指标测定
术后在相应时相点过量麻醉大鼠,快速灌注,断头取脑,部分标本将其放入4%多聚甲醛/0.1 M PBS固定液中固定石,蜡切片,常规脱蜡水化,苏木精5分钟,水洗,盐酸酒精分化20秒,充分水洗,弱氨水返蓝20秒,充分水洗并浸泡10分钟,伊红染色20分钟,梯度酒精脱水,二甲苯透明。常规染色,复染,封片。免疫组化法DAB染色,光镜下观察。pAKT阳性细胞呈棕黄色,计数阳性细胞数。
1.2.4 统计学处理
计量数据以均数±标准差(±s)表示,各实验组间的两两比较采用t检验,以P<0.05为有差异,以P<0.01为显著差异,均有统计学意义。
2 结果
p-Akt在大鼠脑出血后1天表达增多,3天达高峰后迅速减少,7天仍有表达。与模型组各时间点阳性细胞数比较,针刺组具有显著差异(P<0.01),与针刺组+LY294002比较有统计学意义(P<0.05);模型组各时间点阳性细胞数与针刺组+LY294002比较无意义(P>0.05)。
表1 各组大鼠脑组织p-Akt阳性细胞数比较(±s,n=6,%)
与模型组比较*P<0.05,**P<0.01;与抑制剂组比较△P<0.05;△△P<0.01
3 讨论
早期治疗是出血性脑血管疾病治疗的重中之重。神经细胞凋亡数量决定了脑损害的最终范围和临床患者的病情轻重程度,因此其显得尤为重要。细胞凋亡涉及信号转导、基因调控、凋亡效应执行三个阶段[4],而信号转导过程的激活是启动细胞凋亡的前提。p-Akt又称为蛋白激酶B(pkb),能使丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)磷酸化,能够介导多种生物学效应,是重要的抗凋亡调节因子。Akt的激活离不开磷酸化THr308和Ser473位点的氨基酸残基,而此过程却依赖于PI3k的磷脂产物,Akt被认为是PI3k的最直接的下游作用靶点,所以检测p-Akt水平可以反应Akt信号通路的活性状态。Akt在促进各型细胞生存信号转导过程中起中心环节作用[5],与多种细胞活动、物质代谢调节,特别是抑制细胞凋亡有密切联系,Akt激活的程度与促进和抑制凋亡的平衡有关[6]。脑出血后血黏度迅速升高以致血流减慢,导致脑供血不足,甚至引起脑组织局部坏死,从而产生大量的自由基,造成脑组织免疫炎性损伤,抑制丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)磷酸化[7],p-Akt受到影响,p-Akt在24小时内阳性细胞数增多,说明P-Akt在决定神经细胞的修复方面起重要作用。LY294002是一种能够阻断AKT信号传导通路的蛋白激酶抑制剂[8],它被广泛用于AKT信号传导通路的特性研究中。
头为诸阳之会,五脏六腑精气皆上注于头,头为阴经与阳经交界处故针刺头部穴位能调理诸经之气,疏通经络,气血通畅从而使全身机能得到改善。邹伟[9,10]教授提出了“百会透曲鬓”针刺法,认为“百会透曲鬓”区域主要分布在顶区、颞区、额区三部分,所以这一穴区具有调节全身阴阳平衡、疏通经络气血的作用。本文观察结果表明,头穴透刺治疗可明显增高脑出血大鼠脑组织Akt的阳性细胞数,活化AKT通路,起到促进细胞存活作用,从而为临床治疗提供实验基础。
摘要：目的:通过百会透曲鬓穴针刺治疗脑出血急性期大鼠,观察其脑组织中p-Akt蛋白表达的变化,探讨百会透曲鬓对脑出血后脑神经的保护作用。方法:选用雄性Wistar大鼠54只,随机分为3组,模型组、针刺组(模型+针刺组)、针刺组+抑制剂组(针刺组+LY294002),每组18只;按文献方法建立模型;针刺组采用百会穴向曲鬓穴透刺,头部顶区向颞叶、额叶透刺;造模,治疗后于1、3、7天3个时间点,取大鼠脑组织,免疫组化法检测脑组织中p-Akt蛋白表达。结果:p-Akt在大鼠脑出血后1天表达增多,3天达高峰后迅速减少,7天仍有表达。与模型组比较,针刺组各时间点p-Akt表达明显增多,(P<0.01);与针刺+抑制剂组比较,有统计意义(P<0.05)。结论:针刺百会透曲鬓穴能够增加脑出血急性期大鼠脑组织p-Akt蛋白的表达,而这一作用可被LY294002阻断,提示本针刺方法能够激活AKT通路,起到脑保护作用。
关键词：脑出血,头穴透刺,百会透曲鬓,p-Akt,大鼠
参考文献
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[4]葛宇松,刘雪松,薛俊燕,等,丁苯肽注射液预处理通过PI3K/AKT通路对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护机制[J].中风与神经疾病杂志,2013,30(1):32-36.
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[9]邹伟,于婷婷,王冬,等.头针透穴法对脑出血大鼠脑组织中β-catenin表达影响的实验研究[J].中医药信息,2014,3l(1):76-79.
p-AKT蛋白论文 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
子宫内膜癌标本取自东莞市厚街医院妇产科和病理科2009—2013年手术切除的子宫内膜样腺癌标本55例 (术前均未接受化疗及激素治疗, 且不合并其他恶性肿瘤) , 按FIGO进行临床分期:Ⅰ期22例, Ⅱ期19例, Ⅲ期14例;组织学分级:G1级29例, G2级14例, G3级12例;无肌层浸润20例, 浅肌层浸润 (<1/2) 16例, 深肌层浸润 (>1/2) 19例;无淋巴结转移46例, 有淋巴结转移9例:患者年龄38~70岁, 平均54.3岁。选取同期因功能失调性子宫出血行子宫切除术或诊刮术病人的异常子宫内膜30例:标本用10%中性福尔马林固定, 石蜡包埋, 有完整的临床和病理资料。选取同期因宫颈CIN行子宫全切术的20例患者的正常子宫内膜组织作为正常对照。
1.2 试剂
兔抗人PI3K、p-AKT、P27单克隆抗体, 免疫组化SP试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 结果判定
以细胞浆或细胞核内出现明确的棕黄色颗粒为阳性细胞。采用乳腺癌切片作为阳性对照, PBS代一抗作为阴性对照。结果判断标准:随机观察5个高倍视野, 每个视野计数100个细胞, 先根据阳性细胞数所占的百分数计分:<5%为0分, 5%~25%为1分, 26%~50%为2分, 51%~75%为3分, >75%为4分;再根据阳性细胞染色强度计分:无着色为0分, 淡黄色为1分, 棕黄色为2分, 棕褐色为3分;然后根据两者相加所得的总分进行结果判定:0~l分为阴性 (-) , 2~3分为弱阳性 (+) , 4~5分为中度阳性 (++) , 6~7分为强阳性 (+++) 。该研究在此划分类型的基础上将结果合并为阴性 (0~1分) , 阳性 (2~7分) 。
1.4 统计方法
实验数据应用SPSS15.0软件进行统计分析。免疫组化实验结果应用等级资料的秩和检验对相关组间进行显著性检验;采用Spearman相关分析法对PI3K、p-AKT和P27蛋白表达的关系进行相关性分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 PI3K、p-AKT、P27在不同子宫内膜组织中的表达
2.2 PI3K、p-AKT和P27在子宫内膜癌组织中的表达与临床病理参数的关系
该实验结果显示PI3K、p-AKT的表达与子宫内膜癌的临床分期和组织学分级有关, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 与患者年龄、淋巴结转移和肌层浸润深度无关, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。P27的表达与子宫内膜癌的组织学分级有关, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 与临床分期、患者年龄、淋巴结转移和肌层浸润深度无关, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。
2.3 PI3K、p-AKT和P27在子宫内膜癌组织中表达的相关性
55例子宫内膜癌病例中, PTEN、p-AKT表达同为阳性者8例, 同为阴性者3例, Spearman相关分析表明二者呈显著负相关, 差异有统计学意义 (r=-0.480, P<0.01) 。P27、p-AKT表达同为阳性者6例, 同为阴性者4例, Spearman相关分析表明二者呈显著负相关, 差异有统计学意义 (r=-0.403, P<0.01) 。
3 讨论
PI3K/Akt与子宫内膜癌PI3K/Akt通路广泛存在细胞中, 参与细胞生长、增殖、分化调节等各方面。磷脂酰肌醇-3羟基激酶 (PI3K) 是一个酯酶, 当细胞受生长因子等刺激因子刺激后, 细胞内PI3K可被G蛋白偶联受体、蛋白酪氨酸激酶受体或Ras蛋白激活, 激活后的PI3K对磷脂酰肌醇环上的3位羟基进行磷酸化从而产生磷酸化的磷脂酰肌醇.AKT是一种丝/苏氨酸蛋白激酶又称蛋白激酶B, 对细胞存活有重要作用。AKT转位到细胞膜以及AKT活化所需的308位苏氨酸 (Thr308) 和473位丝氨酸 (Ser473) 磷酸化是AKT活化的关键环节, 都是依赖于PI3K完成的[1,2]。PI3K突变促使恶性肿瘤的发生[3], 磷酸化的AKT通过作用于多种下游分子, 影响细胞周期进展, 促进细胞增殖, 抑制细胞凋亡, 从而导致肿瘤发生与发展。该研究结果显示PI3K、p-AKT在子宫内膜癌组织中呈高表达, 明显高于正常子宫内膜和子宫内膜增生症, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。因此推测PI3K过度激活, AKT磷酸化增加, 活性增强可能促使子宫内膜癌的发生, 此外该研究显示PI3K、p-AKT的表达与子宫内膜癌的临床分期和组织学分级有关, 但与患者年龄、淋巴结转移和肌层浸润深度无关, 表明PI3K、p-AKT的表达异常与子宫内膜癌的发展有关。
P27与子宫内膜癌P27是一种非特异的CDKIs, 调节细胞由Gl-S期转变, 主要抑制cyclin E-CDK2和cyclin A-CDK2复合物。P27在G0和G1期表达并在细胞开始进入S期时降低, 其在组织和肿瘤的非增殖部分呈现强阳性表达, 因此P27蛋白的稳定对于维持细胞的稳态和稳定性方面非常重要。P27蛋白的低表达在人类多种肿瘤中均有发现, 包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌和宫颈癌, 在许多恶性肿瘤中其降解增强提示肿瘤的预后不良[4], P27基因缺陷小鼠表现躯体庞大、多个器官增生、垂体肿瘤发生率增高[5]。P27降解减少伴随着子宫内膜细胞增生减少[6], 表明其在人类恶性肿瘤发病机制中的重要性。该研究结果显示P27在正常子宫内膜 (85.00%) 、子宫内膜增生症 (58.82%) 、子宫内膜癌 (21.43%) 中的阳性表达率呈逐渐下降趋势, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。P27的表达与子宫内膜癌的组织学分级有关 (P=0.02) , 与临床分期、患者年龄、淋巴结转移和肌层浸润深度无关, 证实了P27蛋白缺失在子宫内膜癌发病机制中的重要性。但有研究表明P27表达与肺癌的分期及淋巴结转移有关, 与该研究结果不同, 可能是不同肿瘤之间的差异造成的[7]。
PKB是PI3K下游的重要靶点, 它通过磷酸化细胞周期相关蛋白如P27、cyclin D、凋亡前蛋白等介导细胞事件。PI3K抑制者LY294002阻止细胞增殖, 导致G1期细胞积累, P27表达增加, 提示P27是PI3K/AKT通路的下游效应点[8]。该实验发现子宫内膜癌中P27蛋白表达明显下降, 而PI3K、p-AKT表达明显增加, P27与PI3K、p-AKT蛋白表达存在明显的负相关, 提示PI3K激活导致p-AKT活化增加, 活化的AKT可能通过下调P27的表达, 使子宫内膜细胞逃离凋亡, 不断增生, 导致子宫内膜癌的发生, 三者的共同作用促使了子宫内膜的发生发展。已有研究表明PI3K抑制剂LY294002、硫利达嗪通过PI3K/AKT通路抑制肿瘤的生长, 为恶性肿瘤的治疗提供了新的思路[9]。
综上, PI3K/PK通路在子宫内膜癌中的研究刚刚起步, 有关该通路及其上游刺激因子、下游信号因子与子宫内膜癌发生发展的关系将成为未来研究的热点, 为子宫内膜癌病因学研究及寻找新的治疗靶点提供新思路。
摘要：目的 研究子宫内膜癌中PI3K、p-AKT、P27的表达规律, 探讨三者与子宫内膜癌发生发展的关系。方法 应用免疫组化SP法检测正常子宫内膜、子宫内膜增生症、子宫内膜癌中PI3K、p-AKT、P27的表达, 分析它们与各项临床病理参数之间的关系及三者之间的关系。结果 PI3K、p-AKT、P27的表达在3组间比较均有显著差异 (P<0.05) , PI3K、p-AKT的表达与子宫内膜癌的临床分期和组织学分级有关 (P<0.05) , P27的表达与子宫内膜癌的组织学分级有关 (P<0.05) 。P27与PI3K、P27与p-AKT均呈负相关 (P<0.01) 。结论 PI3K、p-AKT、P27的表达与子宫内膜癌的发生和发展有关, 三者的表达异常参与了子宫内膜癌的发生。
关键词：子宫内膜癌,PI3K,p-AKT,P27,免疫组化
参考文献
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p-AKT蛋白论文 篇5
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2013年3-9月我院收治的确诊为子宫内膜恶性肿瘤患者42例为恶性肿瘤组, 均符合子宫内膜恶性肿瘤诊断标准[4], 年龄22~68 (45.7±14.6) 岁;分化程度:高度13例, 中度17例, 轻度12例;有无淋巴转移:淋巴结转移15例, 淋巴结无转移27例;TNM分期:Ⅰ期和Ⅱ期26例, Ⅲ期和Ⅵ期16例。另选取良性子宫内膜肿瘤患者42例为良性肿瘤组, 年龄24~67 (43.5±10.6) 岁;在我院体检正常的健康者20例为健康组, 年龄21~72 (45.2±14.7) 岁, 良性肿瘤组及健康组患者均无影响此次观察指标的癌变类疾病。3组患者年龄等一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 测量方法
对3组患者, 使用注射器分别在同肘的静脉血管取血2~3ml, 将所取血液静置于37℃的水浴锅中0.5h后, 在转速为3500r/min的条件下进行离心5min, 离心完毕, 迅速取上清液, 分别采用电化学发光罗氏检测方法测定血清CA153、CA72-A、CA125水平, ELISA试剂盒法测定血清中p-AKT、AKT水平[5]。
1.3 评定方法
血清CA153、CA72-A、CA125三者的水平采用临界值评定方法:对于临界值, CA153=25.00U/ml, CA125=35.00U/ml, CA72-A=8.20U/ml。以阳性为所测数据临界值小, 阴性为所测数据临界值大。血清中p-AKT、AKT水平以染色度和染色范围综合进行评定。分别以染色程度的有无深浅分为0分 (无色) , 1分 (浅度黄色) , 2分 (中度黄色) , 3分 (深度黄色) 。染色范围以所取恶性肿瘤组织为观察对象, 染色范围<1/4为1分, 1/4~1/2为2分, 1/2~3/4为3分, >3/4为4分。以染色度和染色范围乘积<2为阴性, >2为阳性。
1.4 统计学方法
计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清CA153、CA72-A、CA125、p-AKT、AKT水平比较
良性肿瘤组血清CA153、CA72-A、CA125、p-AKT、AKT水平均显著高于健康组, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;且恶性肿瘤组均显著高于良性肿瘤组和健康组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
2.2 各指标单独及联合检测子宫内膜恶性肿瘤的性质比较
CA153、CA72-A、CA125、p-AKT、AKT五种指标单独测定时准确性和特异性可观, 但敏感性较差, 而五个指标的联合检测, 准确性和敏感性比各组单独使用显著增加分别为88.9%和92.3% (P<0.05) , 而特异性一般或有所下降为72.5%。见表2。
3 讨论
CA153、CA72-A、CA125、p-AKT、AKT五种指标在恶性肿瘤患者, 良性肿瘤患者, 健康人中的阳性率呈下降趋势, 且差异均有显著性 (P>0.05) , 表明CA153、CA72-A、CA125、p-AKT、AKT水平均与子宫内膜恶性肿瘤具有明显相关性。在对各指标单独以及联合测定子宫内膜恶性肿瘤的准确性、敏感性、特异性比较时, 单独使用各指标进行测定的准确性和特异性可观, 但敏感性较差, 而联合测定的准确性和敏感性均显著高于单独测定, 但特异性一般, 表明使用指标联合检测子宫内膜恶性肿瘤的准确性更高, 敏感性更好。
注:与恶性肿瘤组比较, *P<0.05;与健康组比较, #P<0.05
综上所述, CA153、CA72-A、CA125、p-AKT、AKT水平与子宫内膜癌性肿瘤呈现明显关联, 且五种指标联合检测用于子宫内膜恶性肿瘤评定的准确性和敏感性均高于单独指标测定。
参考文献
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