扶芳藤提取物（精选4篇）
扶芳藤提取物 篇1
脑缺血损伤的影响因素很多,包括内源性谷氨酸的大量释放、神经细胞内钙离子的超载、凋亡因子的表达失控、线粒体的损伤等。此外,包括IL-6在内的多种细胞因子参与了脑缺血损伤中的炎症反应,并在再灌注损伤过程中发挥着关键作用。本实验通过线栓法制备大鼠急性脑缺血再灌注模型,利用扶芳藤提取物预防给药并观察其对再灌注损伤过程中的IL-6水平的影响,以期进一步了解扶芳藤在治疗脑缺血疾病中的作用。
1 材料与方法
1.1 药物的制备
取扶芳藤1kg,加入相当干药材10倍量的水,在不锈钢锅内煮开后1h,过滤,保留滤液;药渣再加以8倍于生药量的水,煮开后文火煎30min,过滤去渣,合并2次滤液,浓缩至相当于原生药量的容量即1000m L时,取出冷却;然后加入95%食用乙醇,边加边搅拌,直至药液中含乙醇为80%时,放置48h,在前24h内搅拌3~4次,后静置24h,过滤去渣,滤液在旋转回收器中回收乙醇至无醇时,将无醇的液体加热,浓缩成2.0g生药/m L的药物,保留于4℃冰箱,使用时再用双蒸水稀释成所需浓度。
1.2 给药方式及途径
药物组给予扶芳藤提取物灌胃,每100g大鼠每日药量为2mg,1次/d,共2个月。各组最后一次给药均在手术前1h进行。
1.3 动物与分组
Wistar大鼠96只,雌雄各半,3~5月龄,体重250~300g,由广西医科大学动物实验中心提供,许可证号:SCXK桂2003-0003。随机分为3组:(1)假手术组;(2)脑缺血再灌注模型组(以下简称模型组);(3)脑缺血再灌注给药组(以下简称给药组)。以上各组均按缺血再灌注3h、6h、12h、24h4个时点分成4个亚组,每个亚组8只大鼠,分笼饲养,自由进食,喂标准颗粒饲料,饮自来水。
1.4 动物模型的制作
采用改良Zea Longa′s法[1]制作大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occulusion,MACO)模型。大鼠用10%水合氯醛(0.35m L/100g)腹腔注射麻醉,仰卧固定,颈部正中线切口,沿胸锁乳突肌内缘钝性分离肌肉和筋膜,直到分离出左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,用动脉夹暂时夹闭颈内动脉,结扎颈外动脉近心端及颈总动脉,然后在距颈总动脉近分叉3~4mm处剪口,将直径为0.235mm的钓鱼线自切口轻轻插入,插入深度约为(18.5±0.5)mm,缝合皮肤,皮外留线长约10mm。缺血2h后,将钓鱼线向外轻轻拨出10mm,即可实现再灌注。大脑中动脉闭塞(MACO)模型制作成功的标准:大鼠苏醒后表现为:(1)提尾离地时右前肢内收屈曲;(2)在地板爬行时向右侧划圈;(3)站立时向右侧倾倒。假手术组按上术方法施行,但仅分离至颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉后即施行缝合术,不插入钓鱼线。
1.5 标本收集
每只模型成功的大鼠按不同缺血时间点分明过度麻醉,开胸暴露心脏,将灌流针头经左心室插入主动脉,先后快速灌入200m L含有0.01%肝素的生理盐水及200m L4%多聚甲醛固定液。断头取脑,切开两半球,距额极2.5mm向后切取2.5mm的损伤侧脑组织,用电子秤称重后放入玻璃匀浆器,加入10倍于脑组织重量的4%多聚甲醛进行组织匀浆,将匀浆以2000r/min转速离心10min,取上清,封存,置-20℃冰箱待测。
1.6 指标检测
IL-6的测定采用双抗体夹心间接酶联免疫吸附法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA),ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司,严格按照试剂盒说明书进行操作。
注:与假手术组比较,*P<0.01;与缺血再灌注组比较,▲P<0.01
各组实验数据以均数±标准差表示,组间采用t检验,用SPSS14.0 for Windows软件进行统计。P<0.05为组间差异具有统计学意义。
1.7 统计学处理
2 结果
扶芳藤提取物对缺血再灌注不同时间点大鼠脑组织中IL-6含量的影响见表1,与假手术组比较,缺血再灌注3h、6h、12h、24h模型组脑组织中IL-6含量明显升高。与模型组比较,扶芳藤提取物可降低缺血再灌注3h、6h、12h、24h组IL-6水平。
3 讨论
IL-6是一种糖蛋白,其分子量介于21~28k D之间,多种淋巴样细胞和非淋巴样细胞如T细胞、B细胞、单核细胞、血管内皮细胞、肝细胞、纤维母细胞、成骨细胞均能产生IL-6,颅内IL-6的主要来源常被认为是中枢神经系统(CNS)中的星形胶质细胞[2]。IL-6的表达在脑组织损伤过程中发挥着双重作用,正常生理浓度或低水平表达的IL-6对神经元具有保护和促进修复的作用,但快速的IL-6含量增高则可加剧神经元、胶质细胞及内皮细胞的损伤[3]。Wang等[4]通过对大鼠缺血皮质IL-6、c-fos,及zif268m RNA的表达研究发现,MACO后IL-6-m RNA的表达,3h显著增加,12h达到顶峰并持续到24h;提示IL-6可依此时间段增加蛋白质分子的表达并参与炎症反应。本实验中缺血再灌注模型组IL-6在不同时点的表达与文献资料相似,并提示缺血再灌注损伤可能与IL-6的持续高表达有关。
扶芳藤是卫矛科卫矛属植物,主要分布于我国西南各省区,具有止血化瘀、舒筋活络的功能,近年来被证实对脑缺血再灌注损伤有一定的拮抗作用,祝美珍等[5]实验表明扶芳藤合剂预防给药能对抗脑缺血再灌注损伤过程中c-fos蛋白的表达,肖健等[6]则表明上述合剂能拮抗TNF-α的产生。本实验结果表明,扶芳藤提取物预防给药后,大鼠脑缺血再灌注3h、6h、12h、24h的脑组织中的IL-6含量下降,提示其有减缓大鼠脑缺血再灌注损伤的可能性,但由于大鼠脑缺血再灌注过程中引起IL-6表达的因素很多,并且IL-6引起脑组织损伤的机制尚不明朗,因此扶芳藤提取物对脑组织的保护作用还需进一步研究。
摘要：目的探讨扶芳藤提取物对大鼠急性脑缺血再灌注损伤过程IL-6表达的影响。方法取Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组和用药组,Longa法制作大鼠急性脑缺血再灌注损伤模型,用酶联免疫标记法测定脑组织与血清中IL-6的浓度。结果扶芳藤提取物能降低再灌注3h、6h、12h、24h后大鼠脑组织与血清中IL-6的表达。结论扶芳藤提取物对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与其抑制脑组织与血清中IL-6的过度表达有关。
关键词：扶芳藤提取物,脑缺血,IL-6
参考文献
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小叶扶芳藤的组织培养研究 篇2
1.1 小叶扶芳藤概述
小叶扶芳藤[Euonymus fortunei (Turcz.) Hand.Mzt.f.minima (Simon-Louis) Rehd.]属卫矛科扶芳藤属植物, 常绿木质藤本, 亦称蔓卫矛、爬行卫矛。茎匍匐或攀缘, 叶革质, 对生。聚伞花序, 花绿白色种子有桔红色假种皮[1], 是我国北方城市冬季美化用珍稀彩色植被植物品种[2]。小叶扶芳藤原产于中国, 主要分布于陕西、山西、河南、山东、安徽、江苏、浙江、江西、湖北、湖南、广西、云南等省区[4]。小叶扶芳藤在园林绿化中主要作为地被植物, 生长期和绿期长, 耐寒, 耐干旱, 耐盐碱, 耐阴, 耐贫瘠, 用途比较广泛, 也可修剪整形造型, 是优良绿化及水土保持植物, 也可以作为药物产品和优良牧草饲料的开发, 有时也可作茶饮。
1.2 研究的目的
本研究的目的就是利用组织培养方法保证小叶扶芳藤苗的种质纯正, 避免混杂。通过对小叶扶芳藤的组织培养, 选出最适合小叶扶芳藤培育的最佳培养基及最适合其生长分化的植物激素的最佳的浓度配比, 以便今后在小叶扶芳藤的扩繁中可以快速高效的繁育小叶扶芳藤这一优良的灌木物种, 使其尽早在我国北方城市立体绿化、地面绿化、沙荒地治理及绿地景观造型中发挥重要作用。
2 组织培养的研究内容和方法
2.1 研究内容
利用不同的培养基进行组织培养, 筛选出最佳的培养基;利用植物激素的不同浓度的配比进行组织培养, 筛选出适合小叶扶芳藤分化的最佳的植物激素浓度配比。
2.2 研究方法
2.2.1 材料来源
于2006年4月10日在吉林市绿化处苗圃地采取, 在实验室水培, 4月12日开始接种。
2.2.2 MS培养基的配制
培养基的配制主要采取以下步骤。
(1) MS培养基母液的配制。各个药品要分别称量, 溶解, 加水定容1000mL, 见表1。
(2) 溶解琼脂和蔗糖。每配500mL培养基, 则用天平准确称取5g琼脂和15g蔗糖, 将琼脂放入小锅中, 加入约400mL的蒸馏水, 在电炉上加热溶解, 同时用玻璃棒不断搅拌, 直至沸腾, 停止加热, 再把蔗糖放入锅中, 搅拌充分后, 将液体倒入大烧杯中。
(3) 加入MS培养基母液。分别向大烧杯中加入大量元素、微量元素、铁盐、肌醇、有机物质母液和不同量度的植物激素 (NAA和6BA) 。
用移液管准确称取各种母液加入培养基中: (1) 大量元素母液 (10倍) , 50mL; (2) 微量元素母液 (200倍) 2.5mL; (3) 铁盐母液 (200倍) 2.5mL; (4) 有机物质母液 (200倍) 2.5mL; (5) 肌醇母液 (100倍) 5mL; (6) 植物激素母液。根据培养目的, 可采用不同浓度的植物激素。具体培养基编号及植物激素浓度, 见表2。
(4) 调整pH值。将配制的培养基定容至500mL后, 用精密pH试纸测试pH值, 并用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调整pH值至5.8~6.0之间。
(5) 培养基的分装与封口。将已经调好的溶液分装到洗刷干净的50mL的三角瓶中, 每瓶约分装20mL, 最后用锡纸封口。
(6) 培养基灭菌。将三角瓶摆放在高压灭菌锅中, 接通电源加热, 当温度达到121℃, 在压力达到0.11MPa时, 灭菌15min。
2.2.3 小叶扶芳藤消毒、接种及无菌操作
(1) 接种工具及培养皿的清洗与消毒。植物组织培养最基本的要求是各个操作都应该从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养过程中最大量的工作之一就是洗涤培养瓶和其他培养器皿。
试验过程中, 先用洗涤剂把所需要的器皿洗一遍, 再用自来水冲洗干净, 将洗干净的器皿置于150℃烘箱烘干后, 贮存于防尘橱中, 然后才能用于试验, 避免材料遭受污染。
(2) 植物材料的表面灭菌。植物生长在大自然中, 处处都有杂菌的滋生, 因此, 从外界选取的材料都不同程度的带有各种微生物, 采来用于组织培养的植物不能直接进行培养, 必须经过表面灭菌处理, 获得无菌材料才能进行培养。
首先, 刷洗、冲洗植物材料。将摘取的小叶扶芳藤的芽放入干净的烧杯中清洗数次, 之后再用蒸馏水冲洗。
其次, 将清洗干净的植物材料连同烧杯一起放在超净工作台上, 先用75%的酒精消毒30s, 再用0.1%升汞消毒9min, 在浸泡的过程中要用干净的玻璃棒不断搅拌, 使植物材料和消毒液充分接触, 以实现彻底杀菌。然后将废液倒掉, 小心不要将植物材料倒出, 再用无菌水漂洗5次, 漂洗完毕便可以接种了。
(3) 接种前的准备工作。接种前先将接种室用紫外灯照射灭菌2h, 然后用75%的酒精棉球将超净工作台和双手擦干净。将事先经高压锅灭菌的镊子、剪刀、器皿用75%的棉球擦净, 再放到酒精灯上灼烧, 放凉后立即使用, 每次用过的镊子、剪刀都要灼烧灭菌, 避免植物材料交叉感染。
(4) 接种。把烧杯中已经处理干净的植物材料放于超净工作台上, 将三角瓶去掉皮套靠近酒精灯火焰, 将瓶口在酒精灯火焰附近燎数秒, 然后用镊子夹一芽轻轻插入瓶内的培养基上, 镊子灼烧后放在器皿上, 再轻轻套上锡纸和皮套。特别注意的是在接种期间不要讲话, 而且在操作的过程中要不断的给镊子和剪刀消毒, 除了去掉皮套和套上皮套外都要尽量接近酒精灯火焰, 保证消毒彻底。
2.2.4 植物材料培养及培养条件
将装有接种植物材料三角瓶放到培养室中培养, 温度保持25±1℃, 采用自然光照。
2.2.5 试验观察记录
4月12日接种, 则从4月14日开始对其进行观察, 并对组织培养的染菌情况、生长分化情况做以详细的记录。
3 组织培养试验结果与讨论
利用不同的培养基进行组织培养, 结果见表3。
从表3可以看出, 以MS培养基培养的效果较好些, 35d后的诱导率达71.4%。
利用不同浓度的植物激素对小叶扶芳藤进行组织培养, 筛选出适合小叶扶芳藤分化的植物激素浓度配比, 结果见表4。
从表4可以看出, 对于小叶扶芳藤分化的最佳植物激素浓度配比为MS+6BA (2mg/L) +NAA (0.1mg/L) , 其诱导率为86.2%;其次是MS+6BA (2mg/L) +NAA (0.05mg/L) , 其诱导率为80.5%。
在小叶扶芳藤组织培养的实验过程中培养基的pH值为5.8~6.0, 这为实验的成功提供了良好的基础条件。良好的外植体也是实验成功的关键, 无菌操作在植物的组织培养的过程中, 可以说是至关重要的一步。
4 结语
通过对小叶扶芳藤组织培养的初步研究, 得出以下结论:在对小叶扶芳藤进行的1/2MS与MS培养基的组织培养的对比实验中, 得出MS培养基的培养效果更好些;培养基植物激素浓度配比为MS+6BA (2mg/L) +NAA (0.1mg/L) 对于小叶扶芳藤组织培养分化效果更好些。
参考文献
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扶芳藤提取物 篇3
1材料与方法
1.1材料
1.1.1药物及试剂:扶芳藤原药材由广西中医学院制药厂科研所提供, 经广西中医药大学赛恩斯新医药学院苑敏教授鉴定, 药材用12倍量60%乙醇, 提取2次, 每次1 h, 3.8 g生药/g;实验时以蒸馏水配成所需浓度;云南白药 (批号:20080629) , 云南白药集团股份有限公司;109 mmol/L枸橼酸钠溶液 (批号:20060323) , 广东达濠精细化学品公司;凝血酶原时间 (PT) 试剂盒 (批号:105090) , 北京莱博生物实验材料研究所;活化部分凝血活酶时间 (APTT) 试剂盒 (批号:111021) , 北京莱博生物实验材料研究所;凝血酶时间 (TT) 试剂盒 (批号:111027) , 北京莱博生物实验材料研究所;纤维蛋白原 (FIB) 试剂盒 (批号:1110131) , 北京莱博生物实验材料研究所。
1.1.2实验动物:昆明种小鼠, 体质量18~22 g, 雌雄兼用, 购自广西医科大学实验中心, 合格证号:SCXK桂2009-0002, 标准饲料喂养, 自由摄食, 自由饮水。医学实验动物环境设施合格证号 (桂) 医动字第12006号, 使用许可证号SYXK (桂) 2003-0001。
1.1.3实验仪器:Sysn ECA-150型全自动血凝仪, 日本东亚医用电子仪器有限公司;TU-1901型紫外可见分光光度计, 北京普析通用仪器有限责任公司。
1.2方法[3]:取健康昆明种小鼠60只, 体质量 (20±2) g, 雌雄兼用, 随机分成5组, 12只/组。即空白对照组 (生理盐水, NS) 、阳性药对照组、扶芳藤醇提液高、中、低三个剂量组。空白对照组给予等容积NS, 阳性对照组给予云南白药1 g/kg, 用药组高剂量组 (18 g生药/kg) , 中剂量组 (9 g生药/kg) , 低剂量组 (4.5 g生药/kg) , 灌胃给药 (ig) , 给药容量为20 m L/kg。每天给1次, 连续7 d。末次给药后1 h, 拔眼球取血1.5 m L, 缓慢注入含0.5 m L 109 mmol/L枸橼酸纳溶液的塑料试管中, 充分混匀。以3000 rpm离心15 min去除血小板, 分离血浆, 采用Sysn ECA-150型全自动血凝仪, 测定凝血四项:凝血酶原时间 (PT) 、激活部分凝血酶原时间 (APTT) 、凝血酶时间 (TT) 、纤维蛋白原含量 (FIB) 。
1.3统计学方法:采用统计学软件SPSS17.0进行统计学处理, 数据结果以均数±标准差表示, 组间比较采用方差分析, 以P<0.05具有统计学意义。
2结果
云南白药与扶芳藤醇提液高、中、低剂量组均能明显缩短实验小鼠PT、APTT和TT, 提高血浆FIB, 与空白对照组比较有显著性差异 (P<0.05或P<0.01) 。结果见表1。
3讨论
止血过程是复杂的生理功能, 包括血管收缩、血小板聚集和血液凝固三个因素。如外伤出血, 则见局部血管收缩, 血小板在血管破裂处凝集, 破裂并释放出血管收缩物质及“凝血因子”, 而组织液及血浆中的一些凝血因子 (因子Ⅴ, Ⅶ, Ⅷ, Ⅸ, Ⅺ, Ⅻ等) 也受到激活而参与血凝过程, 于是血块形成, 出血停止[4]。
凝血酶原时间 (PT) 测定, 属于检测外源性凝血途径的筛选性试验, 主要用于筛选检测外源凝血系统因子Ⅶ、Ⅴ、Ⅹ和相关因子的抑制物的试验[5,6,7];活化部分凝血活酶时间 (APTT) 测定, 反映Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ等内源凝血途径因子的活性, 是内源性凝血系统较敏感和常用的筛选方法[8];纤维蛋白原 (FIB) 由α、β、γ三对不同多肽链所组成, 多肽链间以二硫键相连。在凝血酶作用下, α链与β链分别释放出A肽与B肽, 生成纤维蛋白单体。在此过程中, 由于释放了酸性多肽, 负电性降低, 单体易于聚合成纤维蛋白多聚体。进一步在Ca2+与活化的Ⅷ因子作用下, 单体之间以共价键相连, 则变成稳定的不溶性纤维蛋白凝块, 完成凝血过程[9];凝血酶 (TT) 时间测定是检测凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统功能的一个关键试验[10]。
本实验结果显示, 扶芳藤醇提液各剂量组均可不同程度的缩短APPT及PT时间, 表现为同时影响小鼠的内源性和外源性凝血系统起而到促凝作用;本品使凝血时间时间缩短FIB含量增高, 提示本品的止血作用可能与影响小鼠纤维蛋白溶解系统有关。扶芳藤药用历史悠久, 历代本草对它的功效均有论述。本实验通过初步的凝血研究, 扶芳藤醇提液能明显缩短小鼠血浆TT、PT、APTT, 增加FIB含量, 有较为显著的凝血作用, 但其成分复杂, 要明确其凝血作用具体机制, 尚待进一步深入研究。
摘要：目的 研究中药扶芳藤的凝血作用。方法 实验动物随机分为6组, 即空白对照组、阳性对照组、扶芳藤醇提液高、中、低剂量组, 测定扶芳藤醇提液对对小鼠凝血酶时间 (TT) 、凝血酶原时间 (PT) , 活化部分凝血活酶时间 (APTT) 和纤维蛋白原 (FIB) 的影响。结果扶芳藤醇提液能明显缩短小鼠TT、PT、APTT, 增加FIB含量。结论 扶芳藤醇提液具有显著的凝血作用。
关键词：扶芳藤,凝血时间,凝血四项
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扶芳藤提取物 篇4
关键词：病态窦房法综合征,复方扶芳藤合剂,窦房结,Cx45,Cx43,Cx40
病态窦房结综合征 (sick sinus syndrome, SSS) 是由于心脏窦房结及其周围组织的结构与功能的病理改变, 导致心肌起搏功能和/或心肌传导束冲动传导障碍, 产生各种心律失常的综合征。窦房结 (atrionector) 是心脏的最高起搏点。窦房结由P细胞、T细胞和心房肌细胞所组成:P细胞 (起搏细胞、窦房结细胞) 形圆小 (5μm~10μm) 、色淡苍白 (pale) 、分化程度低、类似原始心肌细胞。具有自动起搏的特性。窦房结细胞联结包括P-P细胞 (起搏细胞) 、P-T (移行细胞) 、T-T细胞、T-心房肌细胞之间的连接, 其连接方式包括缝隙连接 (gapjunction, GJ) 、桥粒 (desmosome) 和黏着连接 (adhering junction) 三种。缝隙连接蛋白 (connexin, Cx) 是构成细胞间GJ的分子基础。缝隙连接由连接蛋白家族跨膜蛋白组成, 研究已确定在心脏表达的Cx家族成员主要有Cx43、Cx40、Cx45。
中医学根据SSS的临床表现, 多将其归属于“心悸”、“头晕”、“胸痹”、“厥证”、“脉迟症”、“脉结代”等范畴。复方扶芳藤合剂主要由扶芳藤、人参、黄芪等药组成, 有益气行血, 温补心脾肾之功。在临床中发现扶芳藤合剂对SSS有较好的疗效, 其作用机制尚未明了。本实验在成功建立家兔SSS模型的基础上, 通过观察扶芳藤合剂对窦房结细胞Cx45、Cx43及Cx40蛋白表达的影响, 探讨其治疗病态窦房结综合征的分子机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性家兔40只, 体重 (2.5±0.5) kg, 由广西中医药大学实验动物中心提供, 常规饲养, 自由进食进水。
1.2 实验药品和试剂
复方扶芳藤合剂由广西中医学院制药厂提供 (规格:每支10mL) ;心宝丸, 广东省药物研究所制药厂生产 (规格:每丸60mg) , 以蒸馏水配成0.2g/mL供家兔灌胃用。CX45、CX43蛋白特异性一抗 (Rabbitanti-45, Rabbitanti-43, Rabbitanti-4, 美国Sigma公司)
1.3 实验仪器
电生理仪, 常用手术器械, DF-5A心脏电生理刺激仪 (苏州市东方电子仪器厂) , 针形四极心电电极 (广西中医药大学实验中心提供) , DH-140动物人工呼吸机 (浙江医科大学仪器实验厂) , BMJ-1型生物组织包埋机 (上海京工实业有限公司) , RM2315切片机 (德国Leica公司) , 奥林巴斯BX51T生物显微镜 (型号BX51T -32F01, 日本OLYMPUS公司) , 奥林巴斯显微照相机 (型号C-7070, 日本OLYM-PUS公司) 。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组与给药方法
将40只大耳白兔按随机数字表随机分为正常组 (A组) 、模型组 (B组) 、复方扶芳藤合剂高剂量组 (C组) 、复方扶芳藤合剂低剂量组 (D组) 、心宝丸组 (E组) , 每组8只。正常组不进行造模, 其余各组于模型成功后第5天开始灌胃给药, 连续2周, 每天1次。C组给予复方扶芳藤合剂3.6g/ (kg·d) , D组给予复方扶芳藤合剂0.9g/ (kg·d) , E组给予心宝丸0.3g/ (kg·d) 。A组、B组以等体积的生理盐水灌胃。
1.4.2 SSS模型制作
取以3%戊巴比妥钠30mg/kg耳缘静脉麻醉。四肢皮下固定针形心电电极并连接至BL-420F生物机能实验仪, 记录体表心电图。气管插管连接呼吸机, 潮气量22mL。沿胸骨正中右缘2mm~3mm剪断第2~4肋骨, 纵行开胸, 注意避免损伤右胸膜, 经纵隔打开心包, 暴露右心房及右心耳。用干棉签拭干心脏窦房结区 (右上腔静脉与右心房交界处) , 用20%甲醛溶液浸润2mm×3mm棉球外敷窦房结区3min~5min, 当出现心率较湿敷前下降30%~50%, 出现窦性停搏、快慢综合征、窦房阻滞或结性逸搏为窦房结急性损伤模型成功标志。取出棉球, 持续观察1h, 待心率稳定, 青霉素生理盐水冲洗胸腔, 逐层关胸。
1.4.3 窦房结取材
行窦房结电生理功能检测后于耳缘静脉注入空气栓塞致死, 迅速取出心脏并用生理盐水冲洗, 分离出右心耳及上、下腔静脉, 剪开上、下腔静脉, 于上腔静脉入口以下至从腔耳角向外下沿界嵴到下腔静脉口这一区域切取窦房结组织, 将组织修剪为3mm×4mm的组织块, 浸泡于4%多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋、切片。
1.4.4 窦房结组织Cx45、Cx43、Cx40蛋白表达的检测
采用SABC三步法:切片常规脱蜡至水, 3%的H2O2以消除内源性过氧化物酶活性, 蒸馏水洗3次。再将切片浸入0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液 (pH=6.0) 微波炉中加热3 min, 冷却后PBS洗涤2次, 5%BSA室温下封闭20min, 滴加适当 (50μL) 稀释一抗 (兔抗鼠多克隆抗体) 4℃过夜;PBS冲洗, 滴加生物素化三羊抗兔IgG, 37℃20min, 冲洗后滴加试剂SABC, 37℃20min, 再次冲洗后DAB室温显色, 镜下控制反应时间, 及时终止。苏木染色、脱水、透明、封片。对照组设计:以PBS代替一抗为阴性对照。阳性为棕黄色, 阴性不显色。用Image-pro plus 6.0图像分析系统, 每张切片随机选取3个高倍视野测定免疫组化图像中平均光密度。
1.5 统计学处理
用SPSS 19.0软件包进行统计学处理。数据用均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较用单因素方差分析, P<0.05为有统计学意义, 检验采用双侧检验。
2 结果
手术造模后模型组窦房结组织Cx45、Cx43及Cx40蛋白表达下降, 明显低于正常组, 经过药物干预后, 复方扶芳藤合剂大、小剂量中药组窦房结组织Cx45、Cx43及Cx40蛋白表达增高, 其中, 大剂量组窦房结组织Cx45、Cx43及Cx40蛋白表达明显高于模型组 (P<0.05) ;而大剂量组与心宝丸组比较, 窦房结组织Cx45、Cx43及Cx40蛋白表达差异无统计学意义 (P>0.05) 。小剂量组干预后窦房结组织Cx45、Cx43及Cx40蛋白表达较模型组增高, 其中Cx40较模型明显增高 (P<0.05) 。详见表1。
3 讨论
窦房结是哺乳动物心脏传导系统的重要组成部分, 是控制心脏电活动的中心, 窦房结细胞间相互连接的独特性便决定着细胞间电传导的特殊性。在窦房结组织中, Cx主要有两个职能:①维持心脏正常节律;②将冲动传到心房且不受超激化的影响[1]。已证实在心脏表达的Cx家族成员主要有Cx43、Cx40、Cx45。运用免疫组化和电生理方法研究窦房连接区GJ特征, 结果兔窦房结中央P细胞表达Cx40, 在结周围混合表达Cx43、Cx40[2]。Coppen等[3]对兔心脏免疫组化共聚焦显微镜观察研究发现Cx45和Cx40窦房结中央表达, 窦房结与界嵴交界区大部分区域显示在界嵴表达Cx43心肌细胞与结区表达Cx 45和Cx40细胞有明显的分界线, 然而在心脏内面窦房结周围与界嵴的过渡带共同表达Cx43和Cx45。窦房结组织损伤后, 必将影响窦房结细胞间的特化连接, 引起细胞间电偶联与机械耦联异常使窦房结功能下降, 导致相应传导速度和各向异性传导发生改变, 从而出现传导减慢及传导阻滞等现象, 引起各种心律失常, 故对Cx表达的干预情况, 可以作为评价治疗病态窦房结综合征药物作用之一。
病态窦房结综合征动物模型较多, 各有不同的特点, 用甲醛溶液湿敷窦房结区建立病态窦房结综合征模型的方法被广泛用于基础实验研究。此法操作简单, 容易被实验人员掌握, 对窦房结损伤程度较轻, 损伤后去除甲醛溶液, 心肌组织功能还能一定程度的恢复, 因此, 实验进程容易能被实验人员掌控。在实验过程中采用从胸骨右缘纵行开胸, 经纵隔打开心包, 可以避免破坏胸膜腔, 减少了气胸等并发症的发生[4]。
中医学里没有“病态窦房结综合征”的病名, 根据其临床表现, 多将其归属于“心悸”、“头晕”、“胸痹”、“厥证”、“脉迟症”、“脉结代”等范畴。对其病机, 古代早有论述。如《素问·痹论》亦指出:“脉痹不已, 复感于邪, 内舍于心”, “心痹者, 脉不通, 烦则心下鼓”, 《濒湖脉学》云:“迟而无力定虚寒, 代脉都因元气虚, 结脉皆因气血凝”。中医学认为病态窦房结综合征以阳气虚衰为本, 即以心阳虚、肾阳虚、脾阳不足为主;寒凝气滞、血瘀、痰浊为标, 乃本虚标实之证。血瘀、寒凝、痰湿等标实均因阳气不足而成, 而阳虚则为气虚之甚, 故病窦之治应以益气助阳为法, 尤应以大补元气为治疗关键。
复方扶芳藤合剂主要由扶芳藤、人参、黄芪等药组成, 扶芳藤补肾强筋, 行气活血;现代药理发现扶芳藤具有良好的心血管药理作用, 可延长小鼠心肌缺氧的存活时间, 抑制血栓形成, 改善去甲肾上腺素 (NA) 所致的肠系膜微循环障碍, 并可扩张耳廓微血管。人参大补元气, 现代药理研究认为, 人参含有人参皂苷等多种有效成分, 具有强心、升压、兴奋心脏, 增强心肌收缩缩, 提高心率的作用。黄芪补益心气, 填补胸中宗气, 以助心阳而令血行。现代药理研究表明其主要成分有改善心功能, 改善心肌代谢等作用。人参、黄芪还具有强心、升压、提升心率及扩张血管, 增加冠脉血流量, 改善心肌缺血, 改善微循环与抗血小板聚集等作用。诸药合用, 共奏益气行血, 温补心脾肾之功, 使心气充裕, 心阳振奋, 心肌鼓动有力, 心率增加, 诸症缓解。同时, 复方扶芳藤合剂是具有抗心肌缺氧、抗衰老、抗应激、改善微循环等作用。
本研究结果提示, 大剂量的复方扶芳藤液对窦性心律失常有明显的调节作用, 研究显示大剂量复方扶芳藤液能提高心率, 其治疗机制可能与降低窦房结恢复时间 (SNRT) 、校正窦房结恢复时间 (CSNRT) 、窦房传导时间 (SACT) , 提高窦性心律, 促进窦房结组织Cx45、Cx43及Cx40蛋白表达有关。小剂量的复方扶芳藤液对窦性心律失常也有一定的调节作用, 研究显示小剂量复方扶芳藤液也能提高心率, 降低SACT、SNRT、CSNRT, 提高窦性心律, 促进窦房结组织Cx45、Cx43及Cx40蛋白表达, 实验数据虽然与模型组比较差异无统计学意义, 但在小剂量的基础上适当再增加剂量可能对窦房结病变的预防有意义, 因此小剂量的复方扶芳藤液需要进一步研究。
本次试验研究能证实复方扶芳藤合剂对SSS有良好的疗效, 并进一步揭示其分子作用机理, 必将扩大复方扶芳藤合剂的临床应用范围, 从而产生巨大的经济效益和社会效益。鉴于中药治疗的多靶点性, 该药的其他药理作用尚待进一步挖掘并加以证实。
参考文献
[1]Jongsma HJ.Diversity of gap junctional proteins:Dose it play a role in cardiac excitation[J].Cardiovasc Electrophysiol, 2000, 11:2008-2230.
[2]Verheule S, Marian JA, Van Kempen, et al.Gap junctions in the rabbit sinoatrial node[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001, 280:2103-2115.
[3]Coppen SR, Kodama I, Boyett MR, et al.Connexin 45, a majory connexin of rabbit sinatrial node, is coexpressed with connexin 43in the restricted zone at the nodal-crista terminals border[J].J Histochem Cytochem, 1999, 47 (7) :907-918.