黄芪提取物（精选8篇）
黄芪提取物 篇1
黄芪为豆植物蒙古黄芪Astrangaluj.membranaceuj (Fisch) Gge·Var·mongholicus (Bge﹒) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch·) Bge的干燥根。具有补气固表, 利尿脱毒排脓, 敛疮生肌之功效, 用于气虚乏力, 食少便溏, 中气下陷, 久泻脱肛等症[1]。
1 仪器与试药
V—530型紫外分光光度计, 高效硅胶G薄层预制板 (10cm×10cm, 青岛海洋化工厂) , 氧化铝 (中性, 层析用, 天津市化学试剂三厂) , 黄芪甲苷对照品 (中国药品生物制品检定所, 批号0781—200109) 黄芪为市售药材, 为蒙古黄芪经市所中药室鉴定, 试药均为分析纯。
2 色谱条件
2.1 层析条件[2]
吸附剂为高效硅胶G薄层预制板展开剂为氯仿一甲醇一水, (65∶35∶10) 置冰箱中静置过夜, 取下层溶液;显色剂:10%硫酸乙醇溶液;喷雾后, 105℃烘约7min。
2.2 扫描条件
单波长扫描入s=520nm;Sx=3;狭缝1.25mm×1.25mm;反射法锯齿扫描。
3 方法与结果
3.1 正交试验
取黄芪切成等段, 分成9份, 各取5.0g按表1中条件, 采用L9 (34) 正交表安排试验进行提取, 浓缩成等体积水煎液, 取水煎液浓缩至干, 求算浸出物率, 见表2。
3.2 供试品溶液的制备
精密量取一定量上述水煎液, 置蒸发皿中, 水浴中液缩至30~40m L加氧化镁24g拌匀, 水浴中蒸干, 置索氏提取器中, 加甲醇110m L回流提取6h, 甲醇液回收至干, 残渣加水10m L溶解, 放冷, 加入到已处理好的氧化铝D101大孔树脂柱中 (内径12mm装大孔树脂12cm高, 上端加氧化铝5g) , 用水120m L洗脱, 弃去水液, 再用40%乙醇40m L洗脱, 弃去洗脱液。继用70%乙醇100m L洗脱, 收集洗脱液蒸干, 再用甲醇溶解并转移, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 即为供试品溶液。
3.3 黄芪甲苷的测定
3.3.1 标准曲线制备
精密称取黄芪甲苷对照品, 加甲醇制成每1 m L含1 m g的溶液, 依次精密吸取对照品溶液1, 2, 3, 4, 5, 6μL, 分别点于同一硅胶G薄屋板上, 按上述条件展开, 扫描, 测定, 以黄芪甲苷对照品浓度对峰面积分值作直线回归, 得回归方程为y=1906.36+5642.31, r=0.9997。
3.3.2 供试品溶液的测定精密吸取供试品溶液1, 2μL, 分别点于同一硅胶G薄板上, 按上述条件测定, 收外标两点法, 计算黄芪甲苷得率, 结果见表2。
3.4 方差分析见表3。
由方差分析表和正交试验结果可以看出, 因素B对黄芪甲苷的得率有显著影响。各因素的影响次序为B>A>C;各因素不同水平的影响次序为A1>A2>A3, B1>B2>B3;C1>C3>C2, 因此最佳提取工艺为A1B1C1即煎煮2次, 每次加水12倍, 煎煮2h。
3.5 重复性试验
注:F 0.05 (2, 2) =19
对同样样品进行5次重复提取, 按上述色谱条件平行试验, 测定RSD为:5.0%。
3.6 稳定性试验
精密吸取对照品溶液5μL于薄层板上, 展开, 测定, 每隔30min扫描一次, 表明黄芪甲苷在显色后3h内测定是稳定的。
3.7 加样回收率试验
采取加样回收法, 精密吸取已知含量的供试品5份, 分别精密加入黄芪甲苷对照品, 按上述色谱条件提取、测定、计算回收率;98.31%、95.58%、96.10%、96.69%、97.98%平均回收率为:96.7%, RSD为1.1% (n=5) 。
4 讨论
4.1 提取方法考察
提取中药材成份的常用方法有冷浸提取、回流提取、索氏提取和超声波振荡提取等, 分别对这些提取方法进行考察。结果表明, 在相同的提取时间内, 索氏提取最为适合。
4.2 黄芪甲苷的最佳提取工艺为
每次加水12倍, 煎煮2次, 每次2h。
4.3 本法对单波长 (λ5=520nm) 和双波长 (λs=520nm) , (λR=700nm) 的测定结果进行了比较, 结果基本一致, 考虑能更简便省时, 在保证测定结果准确可靠的前提下, 选用了单波长扫描法。
4.4 本法层析条件至关重要, 须保证展开剂的饱和效果, 并对层析温度有所控制。实验中, 采用5 7%的湿度, 温度在2 5℃以下展开效果为佳。
4.5 本实验在供试品溶液制备时, 采用了净化方法即先用氧化镁吸附供试品中的杂质, 然后再用氧化铝—大孔树脂柱洗脱净化, 处理后的供试品溶液点样后, 薄层板上斑点无背景干扰, 含量测定稳定。
摘要：目的考察黄芪的最佳提取工艺。方法通过正交试验, 以黄芪甲苷的得率为指标, 考察加水量、煎煮时间及次数对提取效果的影响。结果黄芪的最佳提取工艺为煎煮2次, 每次加水12倍, 煎煮2h。结论最佳提取工艺提净率高、简单、方便。
关键词：黄芪,正交试验,黄芪甲苷
参考文献
[1]中华人民共和中药典 (一部) [S].北京化学工业出版社:2005:212-213.
[2]王宝琴, 苏健, 鲁静.黄芪甲苷的检测在中药质控中的应用[J].中国中药杂志, 1996, 21 (3) :161.
黄芪提取物 篇2
关键词 丁香 ；黄芪 ；提取液 ；圣女果 ；保鲜
分类号 S379.2
圣女果又称珍珠小番茄，味清甜，无核，口感好，营养价值高且风味独特，兼具食用与观赏价值。其果皮薄，易失水、易受病菌侵染，在常温条件下只能保存5～7 d。由于易腐烂变质，对圣女果的运输和贮藏造成很大的影响。化学防腐剂对果蔬的保鲜效果良好，但长期大量使用不但有损人体健康和造成环境污染，而且高频率地使用单一种类的防腐剂会使病原菌产生抗药性，降低防腐剂的防治效果。天然提取物进行果蔬保鲜的安全性远高于传统的化学保鲜剂，在全球倡导绿色环保的今天，开发环保无毒无害的天然保鲜剂是当前食品开发的主要任务之一。
黄芪为豆科草本植物黄芪的根，是应用广泛的中草药，黄芪提取物对多种致病菌有不同程度的抑菌作用[1-3]，同时对水果有良好的保水作用[4]。丁香是桃金娘科植物丁香的干燥花蕾，是我国传统中药，含有丰富的丁香酚，具广谱、高效的抑菌效果，对食品的腐败菌及致病菌均有良好的抑制和杀灭效果，无任何化学残留和副作用，符合人们对食品保鲜的绿色、环保要求[5-11]。鉴于圣女果皮薄易失水易受病菌感染，本研究选取抑菌效果好的黄芪和丁香为原料，对其提取物进行不同配比，通过不同配比保鲜液对圣女果保鲜效果的比较，筛选出保鲜效果最佳的保鲜剂配比。
1 材料与方法
1.1 材料
圣女果，购于当地市场，选取大小均一，表面无机械撞伤，无病虫害，成熟度基本一致的圣女果果实。丁香、黄芪，购于广东省中山市益源药店，粉碎过40目筛，80℃烘干备用。
1.2 方法
1.2.1 植物提取物的制备
丁香提取物的制备：取丁香粗粉100 g装入500 mL圆底烧瓶，加入400 mL蒸馏水充分湿润后浸泡24 h，煮3 h后过滤，滤渣再加400 mL水煮1 h，合并2次滤液定容至1 000 mL，保存备用。黄芪提取物的制备[12]：取黄芪粗粉100 g装入500 mL圆底烧瓶，加入300 mL蒸馏水充分湿润后，煮2 h后，过滤，滤渣用同法提取1次，合并滤液，定容至1 000 mL，保存备用。复合液配置：将丁香提取物和黄芪提取物按照1∶1、1∶2、1∶3、2∶3、2∶1、3∶1、3∶2比例进行配置，备用。
1.2.2 保鲜方法
将圣女果在不同配比的复合液中浸泡1 min后取出，晾干，放置于消过毒的一次性塑料盒中，常温条件下贮藏。另以蒸馏水浸泡圣女果1 min为空白对比。每处理30粒果，设3次重复。每隔1 d进行随机取样分析。
1.2.3 生理指标的测定
腐烂率：每隔1 d统计不同处理腐烂的圣女果果数，并计算腐烂率。腐烂率 = 腐烂的果数/初始总果数×100%。维生素C含量：采用碘量法，每处理随机选取3个果进行检测。失重率：处理前进行果实的初称重，处理后每隔1 d称量每果的重量，利用差重法计算失重率。每处理用果5个，重复3次。感官指标：各处理圣女果的果实硬度、果皮色泽、舒展程度的情况，感官品质的好坏采用评分制，感官品质最好的为5，依次降低（表1）。
2 结果与分析
2.1 不同配比保鲜剂对圣女果腐烂率的影响
圣女果皮薄汁多，在运输和储存过程中容易受机械挤压或霉菌感染。与空白对照相比，不同配比保鲜剂处理后，圣女果的腐烂率均有所降低（图1）。如图1所示，空白对照、丁香黄芪配比为1∶1、1∶2、1∶3和3∶1保鲜的圣女果均在处理第4 天开始腐烂，且第4 天空白对照的腐烂率（25%）最高，1：2配比保鲜剂处理过的圣女果腐烂率（10%）次之。2∶3、2∶1配比处理的圣女果自第6天开始腐烂，3∶2处理的圣女果自第10天开始腐烂。
2.2 不同配比保鲜剂对圣女果失重率的影响
实验结果表明，不同处理的圣女果在贮藏期间失重率变化情况不同（图 2）。空白对照和1∶3配比处理的失重率始终高于其他配比的失重率（P< 0.05）。对丁香黄芪1∶1、1∶2、2∶3、3∶1、3∶2、2∶1的配比而言，除第4 天配比3∶1处理的圣女果失重率显著高于其他配比（P<0.05）外，其他时间段内，丁香黄芪1∶1、1∶2、2∶3、3∶1、3∶2、2∶1配比处理的圣女果的失重率均不存在差异（P>0.05）。
2.3 不同配比保鲜剂对圣女果Vc含量的影响
刚采摘的圣女果由于还没有完全成熟，Vc含量比较低，随着果实的进一步成熟，Vc含量逐渐升高。待果实完全成熟后，随着保存时间的延长，Vc含量逐渐下降。实验结果（图3）显示，在处理的第10天，空白对照的Vc含量最低（18.05 mg/hg），且显著低于配比为2∶3（22.80 mg/hg）、3∶1（21.66 mg/hg）、3∶2（23.48 mg/hg）、2∶1（23.37 mg/hg）处理果实的Vc含量（P<0.05）；空白对照的Vc含量与配比为1∶1（20.90 mg/hg）、1∶2（19.38 mg/hg）、1∶3（20.52 mg/hg）处理果实的Vc含量差异不显著（P> 0.05）。
2.4 不同保鲜处理后圣女果感官品质变化
nlc202309040459
贮藏期间，圣女果外观变化主要表现为色泽、硬度和果皮舒展3个方面。不同配比保鲜剂处理的圣女果，在贮藏期间外观变化差异显著（表2），主要表现为果皮出现黑斑和黄斑的时间和面积。其中空白对照和配比3∶1处理的果实从第4天开始，果皮表面出现黑斑，其他处理从第6天开始也陆续有黑斑出现。空白对照第8天的圣女果果皮变黄，皮下有液体渗出，已失去商品价值，只有丁香黄芪3∶2保鲜剂处理的果实外观好。
3 结论
通过对不同配比保鲜液处理的圣女果在贮藏期间腐烂率、失重率、维生素C含量及感官品质的比较发现，丁香黄芪提取液的7种不同配比保鲜液保鲜效果有显著差异，其中丁香黄芪配比为3∶2的保鲜剂保鲜效果最佳，该配置的保鲜液能显著推迟圣女果腐烂，降低圣女果的失重率，抑制Vc的降低。同时，该处理圣女果的感官品质佳。
通过对圣女果不同贮藏期感官品质的观察发现，圣女果的腐烂主要是病菌感染，当果皮出现黑斑后，黑斑处会有菌丝出现。丁香提取液具广谱的抑菌作用。丁香黄芪配比为3∶2的保鲜剂保鲜效果好与该保鲜剂中丁香含量高。
参考文献
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[12] 肖崇厚.中药化学[M]. 上海： 上海科学技术出版社，1996：326.
黄芪提取物 篇3
1 材料、仪器与试剂
1.1 材料
研究中所用黄芪均为荚膜黄芪, 产地为宁夏回族自治区金山地区。
1.2 仪器
研究中使用的仪器有:红外光谱分析仪PE-580、722型可见分光光度计、30~400 mm砂芯层析仪、索氏提取器、水浴锅、粉碎机FW-100型等。
1.3 试剂
黄芪甲甙标准品购自国家标准物质中心, AB-8树脂购自拿开大学化工厂, 溴化钾 (KBr) 为优级纯试剂, 其余试剂均为国产分析纯试剂。
2 实验
2.1 提取
2.1.1 索氏提取[3]
对黄芪进行粉碎, 完全过30目标准筛后充分混匀。取3 g黄芪粉碎物置于含有50 m L甲醇的索氏提取器中, 过夜。79℃水浴浸提6 h后, 彻底回收甲醇, 少量蒸馏水溶解浸提产物, 转至分液漏斗中采用乙醚进行脱脂, 直至无色, 挥发尽乙醚后, 采用树脂吸附法纯化产物。
2.1.2 回流提取
对黄芪进行粉碎, 完全过30目标准筛后充分混匀。取8 g黄芪粉碎物, 74℃下用甲醇回流提取3次, 3次提取的中的甲醇用量和提取时间分别为:第一次甲醇, 黄芪 (v∶m) =10∶1, 过夜浸泡后回流提取2 h;第二、三次方法相同, 甲醇:黄芪 (v∶m) =8∶1, 回流提取1.5h, 合并第二、三次的提取液, 彻底回收甲醇, 少量蒸馏水溶解浸提产物, 转至分液漏斗中采用乙醚进行脱脂3次, 乙醚用量分别为20、20、10 m L, 挥发尽乙醚后, 分别采用萃取法和树脂吸附法纯化产物。
2.2 纯化
2.2.1 萃取法
用饱和的正丁醇在分液漏斗中萃取提取液, 共3次, 正丁醇用量分别为20、20、15 m L, 合并3次萃取的溶液, 彻底回收正丁醇, 即得黄芪皂甙粗品。
2.2.2 树脂吸附法
将提取液通过树脂柱, 采用蒸馏水冲洗树脂柱, 再采用80%乙醇溶液洗脱, 将乙醇洗脱溶液收集并彻底挥发乙醇, 即得黄芪皂甙粗品。
3 红外光谱分析
采用红外光谱分析仪对得到的粗品进行检测, 具体方法为:用优级纯溴化钾 (KBr) 试剂将提取到的黄芪皂甙粗品和黄芪甲甙标准品分别压制成片状, 用红外光谱分析仪对压片进行分析, 检测粗品中黄芪皂甙的含量。结果显示, 通过树脂吸附获得的黄芪皂甙粗品的红外光谱吸收峰与黄芪甲甙标准品的吸收峰更为接近, 这也说明提取得到的产物是黄芪皂甙, 同时树脂吸附法的提取纯化效果更好。
4 黄芪皂甙分析方法
4.1 制备黄芪甲甙标准曲线
于1/100 000天平上称取黄芪甲甙标准品, 精确到0.005 1 g, 无损失转移至10 m L容量瓶中, 无水乙醇溶解并定容。向带塞的反应管中分别加入0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 m L黄芪甲甙无水乙醇溶液, 补充无水乙醇到0.75 m L, 加入0.75 m L 8%香兰素 (w/v) , 冰浴状态下加入7.50 m L 72% (v/v) 硫酸, 混匀后62℃水浴20min, 冷却并混匀后在分光光度计上进行测定。取不含黄芪甲甙的试管作参比, 在λ=544 nm下测定吸光值, 得浓度与吸光值的回归方程, A=2.1389×C-0.0015, R2=0.9998, 所有测定需在30 min内完成。
4.2 皂甙含量的测定
取黄芪皂甙粗品于250 m L容量瓶中, 无水乙醇溶解并定容, 混匀后吸取0.05 m L于具塞刻度试管中, 加入0.75 m L的8%香兰素 (w/v) , 冰浴状态下加入7.50 m L72% (v/v) 硫酸, 混匀后62℃水浴20 min, 冷却并混匀后在分光光度计上进行测定。取不含黄芪甲甙的试管作参比, 在λ=544nm下测定吸光值, 按照标准曲线回归方程计算黄芪皂甙含量。索氏提取联合树脂吸附法得到的黄芪皂甙的含量为1.25%, 回流法提取联合正丁醇萃取得到的黄芪皂甙的含量为1.46%, 回流法提取联合树脂吸附法得到的黄芪皂甙的含量为1.17%, 三者差异不大。
5 结语
目前, 使用的黄芪皂甙方法有很多, 主要应用的有水浸提取法和醇提取法, 后者较前者更为有效。本研究发现, 索氏提取法和回流提取法2种方法对黄芪皂甙的提取差异不大, 可按需选择。树脂吸附法较萃取法的纯化效果更佳, 另外树脂具有再生能力, 可经适当处理后再次使用。因此, 建议提取黄芪皂甙时可先采用索氏提取法进行粗提取, 再通过树脂吸附纯化, 这样可以得到纯度较高的黄芪皂甙且节约成本。
摘要：通过4步骤实现黄芪中黄芪皂甙的提取分离和纯化, 4步骤分别为索氏醇提、回流醇提、萃取纯化、树脂吸附纯化法对黄芪皂甙进行了提取分离。利用红外光谱分析仪对提取和纯化产物进行检测分析。
关键词：黄芪皂甙,黄芪,提取分离,纯化,工艺研究
参考文献
[1]姚美村, 齐莹, 毕开顺, 等.黄芪药效物质基础研究[J].中国野生植物资源, 2000, 19 (2) :33-36.
[2]阎巧娟, 韩鲁佳, 江正强, 等.黄芪皂甙的提取方法[J].中国农业大学学报, 2000, 5 (6) :61-65.
黄芪提取物 篇4
1 仪器和试药
1.1 仪器
Agilent 1200液相色谱仪 (Agilent公司) , AlltechELS3300蒸发光散射检测器 (Grace公司) ;UV-2501PC紫外可见分光光度计 (日本岛津公司) ;BS423S型电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司) ;SHZ-D (III) 型循环水真空泵 (巩义市予华仪器有限责任公司) ;101-1-BS电热恒温鼓风干燥箱 (上海跃进医疗器械厂) ;KQ-250B型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ;旋转蒸发器RE-52-99 (上海亚荣生化仪器厂) ;WS70-1型红外快速干燥器 (上海浦东跃欣科学化工厂) ;真空干燥器。
1.2 试药
党参 (批号:130221;产地:山西;广州致信中药饮片有限公司, 经鉴定为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula (franch.) Nannf.的干燥根) , 黄芪 (批号:130101;产地:甘肃;广州致信中药饮片有限公司, 经鉴定为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.var mongholieus (Bge.) Hsiao的干燥根) 。D-无水葡萄糖对照品 (批号:110833-200503, 中国食品药品检定研究院) ;黄芪甲苷对照品 (批号:110781-200613, 中国食品药品检定研究院) ;乙腈为色谱纯, 水为蒸馏水;正丁醇、甲醇、硫酸、苯酚均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 样品溶液制备
分别称取黄芪、党参药材各100g, 加10倍药材量水进行回流提取, 提取3次, 每次1h, 提取液滤过, 合并滤液, 浓缩并定容至1 000mL容量瓶中, 作为样品溶液。
2.2 供试品溶液制备
2.2.1 多糖供试品溶液制备
精密吸取“2.1”项下样品溶液50mL, 加水定容至500mL, 滤过, 精密吸取续滤液2mL, 加水定容至100mL, 作为多糖供试品溶液。
2.2.2 黄芪甲苷供试品溶液制备
取“2.1”项下样品溶液50mL, 浓缩至20mL, 移至分液漏斗中, 用水饱和正丁醇萃取3次, 每次20mL, 合并正丁醇液, 蒸干, 残渣加甲醇溶解并定容至20mL, 摇匀, 滤过, 精密量取续滤液5mL, 加甲醇定容至25mL, 摇匀, 即得黄芪甲苷供试品溶液。
2.3 多糖含量测定
2.3.1 对照品溶液制备
取于105℃下干燥至恒重的无水葡萄糖对照品24.93mg, 置于50mL容量瓶中, 加纯化水溶解并稀释至刻度, 作为葡萄糖对照品溶液。
2.3.2 检测波长选择
取葡萄糖对照品溶液0.1mL于10mL干燥容量瓶中定容。取2.0mL溶液置于具塞干燥试管中, 加入5%苯酚溶液1.0mL, 摇匀, 然后沿管壁缓慢加入浓硫酸5.0mL, 摇匀。于沸水浴中加热15min, 取出, 冰水浴冷却至室温;另取供试品溶液和纯化水各2.0mL同上操作, 其中以纯化水作为空白液。采用分光光度法 (中国药典2010年版一部附录ⅤA) , 用紫外可见分光光度计于200~800nm范围内进行扫描。结果显示, 葡萄糖对照品溶液和供试品溶液最大吸收波长均为490nm。结果见图1、图2。
2.3.3 葡萄糖标准曲线绘制
精密量取对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于10mL干燥容量瓶中定容。再分别量取2.0mL置于具塞干燥试管中, 按“2.3.2”项下方法自“各加入5%苯酚溶液……”操作。于最大波长490nm处测定吸光度, 以吸光度 (A) 对检测浓度 (C, mg/mL) 进行线性回归, 得回归方程:A=12.71C+0.049, R=0.976, 葡萄糖在49.86~498.6μg范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2.3.4 换算因子测定
取干燥至恒重的黄芪、党参多糖混合物20mg, 置于100mL容量瓶中, 加纯水至刻度, 精密吸取1.0mL, 按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液, 按“2.3.2”项下方法测定吸光度。根据回归方程求出葡萄糖浓度, 按下式计算出换算因子F=121.25 (n=3) 。
F=W/ (C×D)
其中, W为黄芪党参多糖重量 (mg) , C为多糖中葡萄糖的浓度 (mg/mL) , D为多糖的稀释倍数。
2.3.5 多糖含量测定
精密量取供试品溶液各2.0mL于试管中, 按照“2.3.2”项下从“各加入5%苯酚溶液1.0mL……”开始, 同法测定, 在490nm处分别测定吸收度值, 并计算多糖含量。
2.4 黄芪甲苷含量测定
2.4.1 对照品溶液制备
精密称取五氧化二磷低温真空干燥24h的黄芪甲苷对照品10.80mg, 置于10mL容量瓶中, 加甲醇溶解并定容至刻度, 再精密量取1mL, 置于5mL容量瓶中, 加甲醇定容至刻度, 作为对照品溶液。
2.4.2 色谱条件
色谱柱为Dikma C18 (250mm×4.6mm, 5μm) , 流动相为乙腈-水 (30∶70) , 流速为1.0mL·min-1, 柱温为25℃, 进样量为20μL, 检测器雾化室温度为50℃, 气体流量1.5L·min-1;黄芪甲苷峰保留时间约为17.4min, 对照品及样品色谱见图3、图4 (图中1为黄芪甲苷) 。
2.4.3 线性关系考察
分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液2、5、10、15、20μL注入液相色谱仪中, 按“2.4.2”项下色谱条件测定色谱峰面积, 以黄芪甲苷浓度为横坐标 (x) , 峰面积积分值为纵坐标 (y) , 计算回归方程y=5.675x+2.654 7, r=0.996 9。结果表明黄芪甲苷在21.6~216μg·mL-1溶度范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.4.4 精密度试验
精密吸取黄芪甲苷对照品溶液适量, 按“2.4.2”项下色谱条件重复进样6次, 黄芪甲苷峰面积积分值的RSD=0.98% (n=6) , 表明仪器精密度良好。
2.4.5稳定性试验
取黄芪甲苷对照品溶液, 按“2.4.2”项下色谱条件进样, 于0、4、8、16、24h进样测定, 黄芪甲苷峰面积积分值的RSD=1.02% (n=5) , 表明对照品溶液在24h内稳定性良好, 能满足测定要求。
2.4.6 回收率试验
精密称取黄芪提取物 (批号:130814, 含量为4.32%) , 采用加样回收试验法, 按标示量的80%、100%、120%进行试验, 共测定3组浓度9份样品, 黄芪甲苷的平均回收率为99.11%, RSD=0.87% (n=6) , 表明该方法回收率符合要求。
2.4.7 含量测定
取“2.2.2”项下供试品溶液, 用微孔滤膜 (0.45μm) 滤过, 注入液相色谱仪, 按“2.4.2”项下色谱条件, 测定黄芪甲苷色谱峰面积积分值, 计算黄芪甲苷提取率。
2.5 黄芪党参提取工艺优选
文献报道黄芪、党参中含有的多糖类和皂苷类物质具有很强的药理活性, 这些成分多为水溶性成分, 因此选用以水为溶剂的加热回流法, 优选黄芪党参的提取工艺。
通过单因素试验方法对加液量、提取时间、提取次数进行考察, 并根据单因素的考察结果, 设计正交试验方案, 筛选较优提取工艺。
2.5.1 正交试验
采用L9 (34) 正交试验设计, 以多糖和黄芪甲苷提取率为指标, 对影响黄芪党参提取率的加液量、提取时间、提取次数等因素进行考察, 试验设计见表1。
根据因素设计表, 分别取处方量黄芪和党参药材各100g, 按L9 (34) 实验条件进行正交试验, 过滤提取液, 滤液合并, 减压浓缩至1 000mL。按“2.2.1”项下条件制备多糖供试品溶液, 按“2.3.2”项下方法测定吸光度, 计算多糖含量;按“2.2.2”项下方法制备黄芪甲苷供试品溶液, 过0.45μm微孔滤膜, 按“2.4.2”项下色谱条件, 测定黄芪甲苷色谱峰面积积分值, 计算黄芪甲苷含量, 正交试验结果见表2, 方差分析结果见表3。
根据正交试验表和极差分析结果可知, 影响黄芪党参提取率的因素由大到小排列为C>A>B, 且提取次数对两药的提取率有显著性影响。综合分析, 黄芪党参较优的提取工艺方案为A2B2C3, 即加10倍药材量水, 提取3次, 每次1.5h。
2.5.2 验证试验
分别称取黄芪、党参药材各100g, 平行称取3份, 根据“2.5.1”项下最优条件回流提取:加入10倍药材量的溶剂, 提取3次, 每次1.5h, 按“2.3.2”及“2.4.2”项下检测方法进行测定, 结果测得多糖的平均含量为 (24.58±0.26) g/100g, 黄芪皂苷含量为 (102.51±0.14) mg/g, 表明优选工艺合理可行。
3 讨论
黄芪甲苷紫外吸收较差, 为末端吸收, 用紫外检测器测定存在灵敏度低、重现性差等问题。ELSD是近几年应用在色谱方面的新型检测器, 为质量通用型检测器, 其响应值取决于被测物质颗粒的数量和大小, 对紫外末端吸收物质具有较高的检测灵敏度, 已成为中药分离分析的重要工具。在选择色谱条件的过程中, 黄芪甲苷的检测选择乙腈-水 (30∶70) 为流动相, 分离效果好, 峰形对称, 保留时间适宜, 杂质峰达到基线分离。
注:综合评分= (多糖含量/最高含量) ×50%+ (黄芪甲苷含量/最高含量) ×50%;多糖含量为100g药材所含多糖的重量;黄芪甲苷含量为每克药材所含黄芪甲苷的mg量。
注:*F0.1 (2, 2) =9。
本研究中黄芪党参提取工艺的优选以多糖类和皂苷类物质为指标, 提取有两种思路: (1) 同时提取多糖和皂苷类成分; (2) 分别提取多糖类和皂苷类成分, 再进行合并。通过分析有效部位理化性质可知, 黄芪中皂苷多为环阿屯烷型三萜皂苷, 且分子中含有较多羟基、羧基, 亲水性较强[3];多糖类成分水溶性强, 一般不溶于乙醇, 故确定多糖类和皂苷类成分均以水为溶剂同时提取, 在节约溶剂的同时提高效率。在单因素实验中发现, 黄芪党参的粉碎粒度对有效成分提取率影响较小, 结合工业化生产的需要, 确定药材不粉碎, 直接进行提取。
参考文献
[1]李淑芳.中药黄芪药理作用研究进展[J].湖北中医杂志, 2013, 35 (6) :73.
[2]冯佩佩, 李忠祥, 原忠.党参属药用植物化学成分和药理研究进展[J].沈阳药科大学学报, 2012, 29 (4) :307-310.
黄芪提取物 篇5
关键词：黄芪,丹参,碳粒廓清,免疫功能
肾病综合征以肾小球基底膜通透性增高为主的征候群,其临床特征为全身水肿,大量蛋白尿,低蛋白血症和高胆固醇血症,其中大量蛋白尿是最根本的变化[1],现代医学多采用激素及细胞毒药物治疗,但治疗中容易出现毒副作用及并发症,且会复发。临床上已有用黄芪丹参注射液治疗肾病综合征,黄芪丹参是具有广泛药理作用的中药,二者在肾病治疗中应用广泛[2]。本实验通过研究黄芪丹参对小鼠机体免疫系统的影响,探讨黄芪丹参的免疫作用,为临床治疗提供药理学依据。
1 仪器与试药
1.1 药物
黄芪、丹参,购自广州清平药材市场,由广州中医药大学中药学院中药标本中心张秋镇老师鉴定,黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥切片;丹参为唇形科多年生草本丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥切片。黄芪和丹参加水煎煮3次,合并煎液,过滤,浓缩至每100 ml药液相当于原生药100 g,置于冰箱备用;金匮肾气丸,北京同仁堂科技发展股份有限公司,批号:0930113;中华墨汁,北京一得阁墨汁有限责任公司。
1.2 实验动物
KM小鼠,体重18~22 g,购自广州中医药大学实验动物中心,合格证号:SCK(粤)2008-0001。
1.3 仪器
T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司生产;EL204型电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司生产;T500型电子天平,常熟市双杰测试仪器厂生产。
2 方法与结果
2.1 方法
取60只健康KM小鼠,18~22 g,雌、雄各半,随机分为5组,各12只,分别为空白对照组,黄芪丹参水提液低剂量组(0.25 g/ml)、中剂量组(0.50 g/ml)、高剂量(1.00 g/ml)组,金匮肾气丸阳性对照组,适应性喂养1周后,称重,每天灌胃给药1次(0.2 ml/10 g)。于第14天给药后1 h,对小鼠尾静脉注射20%墨汁(0.1 ml/10 g),注射后立即计时,分别于2 min和12 min时从小鼠内眦静脉丛取血20μl,并将其加到2 ml0.1%Na2CO3溶液中,在680 nm处测光密度值(OD),计算各组廓清指数K值,然后将小鼠处死,取小鼠的肝脏、脾脏及胸腺,并用滤纸吸干表面的血液,用电子天平称其重量,进行小鼠脾脏系数、胸腺系数和吞噬指数α的计算[3]。各数值按下列公式计算:
K=(lg OD1-lg OD2)/(T2-T1);其中OD1和OD2:分别为两次采血所测光密度;T2-T1为两次采血时间差。
α=K1/3×体重/(肝重+脾重)
脾脏系数=脾脏重量(mg)/体重(g)
胸腺系数=胸腺重量(mg)/体重(g)
肝脏系数=肝脏重量(mg)/体重(g)
2.2 统计学方法
所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。计量资料用形式表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有高度统计学意义。
2.3 结果
2.3.1 黄芪丹参提取液对小鼠免疫器官的影响
与空白对照组比较,金匮肾气丸阳性对照组,黄芪丹参水提液中、低剂量组的脾脏系数、胸腺系数、肝脏系数比较有显著性差异(P<0.01);黄芪丹参水提液高剂量组脾脏系数、胸腺系数、肝脏系数有显著性差异(P<0.05),上述结果表明,黄芪丹参水提液能增加正常小鼠免疫器官的重量。见表1。
与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01Compare with the control group,*P<0.05,**P<0.01
2.3.2 黄芪丹参提取液对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬廓清能力和速度的影响
与空白对照组比较,金匮肾气丸阳性对照组,黄芪丹参水提液中、低剂量组的廓清指数与吞噬指数比较有显著性差异(P<0.01),黄芪丹参水提液高剂量组亦有显著性差异(P<0.05),表明黄芪丹参水提液能提高正常小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬廓清能力和速度。见表2。
与空白组比较,*P<0.05,**P<0.01Compare with the control group,*P<0.05,**P<0.01
3 讨论
黄芪重要的有效活性成分为黄芪多糖(APS),通过对犬脾脏T淋巴细胞Th1型和Th2型细胞因子m RNA表达的整体调节来促进细胞免疫[4];丹参主要是通过它对细胞因子、抗体及免疫复合物、免疫细胞的作用,发挥对免疫应答的内调节作用[5]。有研究发现,中药黄芪和丹参不能提高CD4+、CD25+、T细胞及CD4+、FOXP3+、T细胞的比例,但能提高CD4+、CD25+、FOXP3+、T细胞的比例[6],这提示其能促进CD4+、T细胞向着调节性T细胞分化,提高调节性T细胞/效应性T细胞的比例,从而增强机体免疫能力。临床上黄芪丹参提取液能有效治疗肾综合征出血热,能够有效的缩短尿蛋白消失的时间,减轻肾损害,同时能改善血液流变学、血脂和微循环[7,8]。因此,黄芪丹参提取液用于临床提高肾病综合征患者机体免疫能力有一定的理论依据。
金匮肾气丸能显著降低慢性束缚致应激大鼠下丘脑β-内啡肽免疫反应强度;调节腺嘌呤合卵清蛋白致肾阳虚变应性鼻炎大鼠血清Th1和Th2细胞因子的表达,具有调节免疫功能的作用,对部分免疫性疾病有一定的防治作用[9]。
实验结果显示,黄芪丹参水提液能显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞的廓清指数和吞噬指数,增加免疫器官重量,说明黄芪丹参提取液具有促进小鼠免疫功能的作用,可增强小鼠体液免疫功能,提高小鼠体质,并呈明显量效关系。本试验中黄芪丹参水提液有效成分黄芪多糖、黄芪苷、丹参酸、丹参素等可能通过影响小鼠脏器淋巴细胞增殖反应、细胞因子和细胞内信息分子的释放,促进小鼠的发育及脾脏组织形态学变化;而高剂量的黄芪丹参提取液作用不如中低剂量原因可能提取液浓度过高而抑制了机体的吸收。以上结果表明,黄芪丹参提取液有提高机体免疫系统的作用,但黄芪丹参临床应用于肾病综合征的治疗作用和作用机制有待进一步研究。
参考文献
[1]杜鹃.黄芪与复方丹参注射剂联合治疗肾病综合征的疗效观察[J].黑龙江医药科学,2006,29(1):60.
[2]肖利军,李爱平,郭金宝.肾病综合征应用黄芪和丹参联合治疗的临床观察[J].中外健康文摘,2009,6(3):66-67.
[3]才玉婷,李孟全,梁忆红,等.咳尔康口服液对小白鼠碳粒廓清功能的影响[J].牡丹江医学院学报,2009,30(5):16-17.
[4]邱河辉,赵娟,刘凤华,等.黄芪多糖对犬脾淋巴细胞细胞因子mRNA表达的影响[J].中国兽医杂志,2010,46(6):6-8.
[5]王启容.丹参对多种细胞固子调节研究[J].中药药理与临床,1999,15(4):39-41.
[6]董文毅,胡刚正,张博,等.黄芪等12味中药在体外培养中对人调节性T细胞分化的影响[J].世界华人消化杂志,16(24):2770-2774.
[7]于春艳,董艳丽.丹参、黄苗联用治疗肾综合征出血热对提升血小板计数减少尿蛋白的疗效观察[J].中国实用医药,2007,2(33):119.
[8]王彩红,徐辉.黄芪和丹参注射液联用对早期糖尿病、肾病、肾功能的影响[J].中国社区医师,2009,11(212):110.
黄芪提取物 篇6
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
枯草芽孢杆菌菌种,河南牧业经济学院生物工程系生物技术教研室保存;黄芪,购于郑州市健康人大药房;营养肉汤和营养琼脂培养基,购于北京澳博星生物技术有限公司;恒温摇床和恒温培养箱,购于宁波莱福科技有限公司;50 L不锈钢发酵罐,购于镇江东方生物技术设备有限公司。
1.2 菌种的活化
将枯草芽孢杆菌甘油冻存管置室温,融化后用无菌接种环挑取少量菌种用划线接种于营养琼脂培养基上,37℃倒置培养24 h,然后转接至营养肉汤培养基,置于恒温摇床中37℃、160 r/min振荡培养24 h,备用。
1.3 黄芪提取液的制备
准确称取适量黄芪,分别加5,3,3倍水,煮沸3次,每次约40 min,分别留取每次滤液,最后合并3次滤液并浓缩至生药黄芪含量1 g/m L,保存,备用。
1.4 黄芪添加量及发酵条件
首先确定黄芪提取液的添加量,即每毫升培养基中含生药黄芪0.5 g。由之前试验所确定的最适条件进行发酵:温度为37℃,培养基初始p H值为8.0,装液量为100 m L(500 m L三角瓶),接种量为3%,恒温摇床转速160 r/min[3,4]。
1.5 发酵培养基的正交试验设计
见表1。
初始培养基配方:每100 m L培养基中,黄芪生药含量为0.5 g/m L,玉米为2.4 g,麸皮为3.8 g,摇瓶培养所得发酵液活菌含量约为2.0×108cfu/m L;50 L发酵罐扩大试验所得发酵液活菌数约为1.1×109cfu/m L,活菌含量较低。为提高发酵液中活菌含量,考虑规模化生产的实用性,引入豆粕这一新成分,使培养基的营养更加全面,以期得到较好的结果。以发酵后发酵液中枯草芽孢杆菌数量为指标,选取玉米、麸皮、豆粕的添加量进行正交试验,确定三种营养成分的最适添加比例。采用L9(34)正交试验设计,接种枯草芽孢杆菌,发酵时间为48 h。对试验结果进行极差分析,确定三个因素中的主要影响因素。
1.6 发酵液中活菌数及芽孢率的测定
活菌数的测定:采用平板菌落计数法,将发酵好的菌液,取1 m L稀释至10-6、10-7倍,取1 m L稀释液于无菌平板,然后加入适量营养琼脂培养基,摇匀,培养基凝固后37℃倒置培养24 h,查出平板菌落数,每组3个重复。根据公式(每毫升活菌数=平板上菌落数×稀释倍数)计算发酵液中活菌总量。
芽孢率的测定:发酵后(菌数不再增长,镜检视野内无菌体或少量存在),将发酵液置于80℃水浴锅中20 min,此后操作同平板菌落计数法测定活菌数[5]。芽孢率=(芽孢的数量/活菌总数)×100%。
1.7 发酵罐扩大试验
为进一步确定试验结果的实用性,利用全自动不锈钢发酵罐及筛选后的培养基进行扩大试验,并检测产品质量(活菌数)。发酵条件:温度为37℃,培养基初始p H值为8.0,装液量为70%,接种量为3%,电机转速为250 r/min,发酵时间为40 h。
1.8 防腐剂及贮存时间对枯草芽孢杆菌存活率的影响试验
见表2。
%
注:重复3次。
2 结果与分析
2.1 培养基正交试验结果
见表3。
由表3可知,在黄芪提取液添加量相同的情况下,5组的活菌含量最高(8.34×108cfu/m L),9组的活菌含量最低(4.14×108cfu/m L),最高活菌数是最低活菌数的2.01倍,与初始培养基培养芽孢杆菌所得发酵液相比,活菌数提高了3倍多。其他组的活菌数为4.91~6.32×108cfu/m L,由此确定5组的营养成分组合最佳,即每100 m L培养基中含豆粕2.0 g、玉米2.0 g、麸皮2.5 g。由极差R值可以看出,在三个因素中,豆粕的极差最大(5.18),说明豆粕添加量是影响活菌数的主要因素;麸皮的极差最小(3.30),说明在三个因素中,麸皮对活菌数的影响最小(极差越大说明对活菌含量的影响越大)。因此,试验因素对活菌数的影响由大到小为A>B>C。由于各组芽孢率均较高,测定芽孢率的误差较大,在此只对芽孢率的结果做出范围说明。
2.2 发酵罐扩大试验结果
发酵结束后,用平板菌落计数法测定发酵液活菌数,测定活菌数为1.86×109cfu/m L,芽孢率大于90%,与初始配方配制的培养基相比活菌数增加了70%。说明引入豆粕并进行正交试验改良的培养基更适合本株枯草芽孢杆菌的生长;与摇瓶培养相比,活菌数大幅提升,说明发酵罐生产工艺可以提高发酵液中枯草芽孢杆菌的数量。
2.3 防腐剂及贮存时间对枯草芽孢杆菌存活率的影响结果
见表4。
由表4可知:保存150 d后,测得各样品活菌数对照组为1.81×109cfu/m L,叠氮钠试验组分别为1.77×109,1.78×109,1.75×109cfu/m L,硫柳汞试验组分别为1.76×109,1.76×109,1.75×109cfu/m L。对照组存活率为97.30%,叠氮钠试验组分别为94.14%、97.26%、95.11%,硫柳汞试验组分别为94.12%、95.14%、94.59%。由以上数据可知,在发酵液制成后存放5个月,枯草芽孢杆菌的有效活菌数仍然较高,存活率在95%左右,说明防腐剂及贮存时间对枯草芽孢杆菌存活率的影响不大,发酵液可以长时间保存,并且可以根据实际需要添加合适种类和剂量的防腐剂。
109cfu·m L-1
3 讨论
1)研究证明,黄芪提取液可以发酵培养枯草芽孢杆菌,低浓度的黄芪多糖可以有效提高芽孢杆菌数量,而高浓度黄芪多糖则抑制芽孢杆菌的生长[6,7]。本试验采用枯草芽孢杆菌发酵高浓度黄芪提取液,主要是为了在保持培养基中黄芪提取液较高含量的情况下提高芽孢杆菌的数量,使发酵产物适用于实际的动物生产。培养基是影响微生物生长的一个非常重要的因素,不同微生物对营养物质的需求是不同的[8,9]。利用正交试验确定枯草芽孢杆菌发酵黄芪提取液的最佳培养基,各成分中豆粕对活菌数的影响最大。研究表明,在枯草芽孢杆菌生长过程中,需要大量氮源,并且氮源是影响发酵结束时活菌数的一个非常重要因素[10]。本试验中,豆粕是主要氮源,从试验结果可以看出,对本株枯草芽孢杆菌生长影响较大的是豆粕添加量,添加量不同发酵液中活菌数的差异较大。
2)培养基是否适用于大规模生产,主要考虑两方面因素:一方面是其对微生物生长的影响,另一方面则是培养基原料成本的高低。与摇瓶培养相比,发酵罐扩大培养使活菌数提高了1倍。可能主要是由于外界条件变化对标准化的生产设备影响较小,发酵条件比较稳定;另外发酵罐的通气量比较充足,更适宜菌体的生长;同时,本试验采用廉价易得的农副产品,价格低廉,效果良好适用于生产。
3)枯草芽孢杆菌在生长的后期能形成芽孢,而芽孢的含水量低(40%),富含大量特殊的吡啶二羧酸钙和带有二硫键的蛋白质,以及具有多层次厚而致密的芽孢壁,使其具有耐热、耐高压、耐酸碱的特性,这也可能是其在添加防腐剂的条件下长期保存仍具有高活力的原因[11]。一些研究也表明,芽孢杆菌具有很强的抗逆性,在条件恶劣的条件下或长时间保存仍具有较高的活力,这与笔者研究结果是一致的[12,13]。
4 结论
黄芪提取物 篇7
1 材料与仪器
黄芪, 已炮制饮片, 产于山西辉源县;95%乙醇, 浓硫酸, 葡萄糖 (分析纯) , 苯酚 (80%, 使用时稀释到5%, 避光保存) , Na2CO3/Na HCO3缓冲液。C型玻璃仪器气流烘干器;HH-6数显恒温水浴锅;7200型分光光度计 (上海尤尼柯仪器有限公司) ;LD5-2A低速离心机北京医用离心机厂。
2 方法与结果
2.1 黄芪多糖的提取
2.2 黄芪多糖的含量测定
依据3种设计方法, 分别取2g黄芪样品, 研磨成粗粉, 加水20mL, 用Na2CO3/NaHCO3缓冲液调节pH值;调恒温水浴温度, 当水浴温度达到所需温度时开始计时, 再按实验设计的加热时间进行加热;到时间取出过滤, 离心取上清液, 量取体积, 采取酚硫酸法测定黄芪多糖含量。以回归方程中求出供试液中葡萄糖含量, 按公式计算出样品中多糖的含量。
2.3 3种设计方法提取黄芪多糖对照实验结果
2.3.1 球面对称设计提取所得多糖含量 (表1)
利用数据处理软件, 将上述数据处理后得:药材最佳条件:水浴温度:77.3℃;水浴时间:2.15h;pH值:10.85。理论上按此条件提取ASP, 应得率为6.73%。将最佳提取条件进行3次实验, 实际得多糖6.55%。
2.3.2 均匀设计提取所得多糖含量 (表2)
将上述数据处理后得:药材最佳条件:水浴温度:96.42℃;水浴时间:2.20h;pH值:8.24。理论上按此条件提取ASP, 应得率为7.5%。将最佳提取条件进行3次实验, 实际得多糖5.62%。
3 结语
黄芪提取物 篇8
我国传统医药由中医药、民间草医草药和民族医药三部分组成, 其中传统中药目前研究较为深入, 而其它许多丰富的民间、民族用药尚未得到更深入的研究利用, 其中具有潜在药用价值的创新药物资源, 值得药学工作者发掘和研究。
药用黄芪为豆科植物膜荚黄芪A s t r a-g a l u s.m e m b r a n a c e u s (F i s c h) B g e.或蒙古黄芪A s t r a g a l u s.membranaceus. (Fisch) Bge.Var.Monghoicus (Bge) Hisao的干燥根, 在我国资源分布广泛, 品种繁多。黄芪味甘、性微温, 具有补气升阳、固表止汗、利尿消肿、托毒排脓、敛疮生肌之功效。现代药理学研究表明, 黄芪可增强机体免疫功能, 具有强心降压、降血糖、利尿、抗疲劳、抗辐射、抗衰老、抗菌抗病毒、抗肿瘤以及镇静、镇痛等作用[1~6]。其化学成分众多, 主要包括皂苷类、黄酮类、多糖类以及氨基酸类等, 其中皂苷为其主要活性成分。文献报道, 黄芪皂苷类成分在生药中的含量为 (0.095~0.223) %, 目前已成为评价黄芪药材及其药物制剂质量的指标成分[7]。
本文拟对黄芪总皂苷的提取分离工艺及分析方法作如下综述。
1 黄芪中的皂苷类成分
黄芪皂苷具有降血压、镇痛和调节机体代谢等作用。根据文献报道, 至今已经从黄芪中分离鉴定出40多种黄芪皂苷, 其结构属于四环三萜或五环三萜类皂苷, 苷的糖主要有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等, 多与苷元3, 6位相连, 有些苷的某些羟基乙酰化。主要有:黄芪皂苷Ⅰ~Ⅷ、异黄芪皂苷Ⅰ~Ⅱ、乙酰黄芪皂苷、棉毛黄芪皂苷Ⅰ~ⅩⅥ、胡萝卜皂苷和大豆皂苷等[2,6,8,9]。
2 提取技术
2.1 溶剂提取
溶剂提取主要包括传统的浸提和回流提取、索氏提取。其中浸提法多采用水、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿等作为提取溶剂, 不仅耗时, 费溶剂、工艺繁琐, 而且易存在溶剂残留。而回流提取与索氏提取由于提取温度高, 时间长, 因此在提取过程中常伴随分解、沉淀等反应的发生, 容易破坏对光和热不稳定的化学成分, 难以保证产品质量的稳定性。
2.1.1 水提法
刘昌福等[10]采用正交设计法, 以黄芪甲苷为检测指标, 重点考察了水量、煎煮时间、煎煮次数等因素, 得出黄芪甲苷最佳提取工艺条件为:用10倍量的水将药材煎煮两次, 每次时间为1.5h。
2.1.2 醇提法
岳显文[11]采用正交设计法, 以黄芪皂苷提取收率为检测指标, 对黄芪皂苷的醇提工艺参数进行优化。得出黄芪皂苷最佳提取工艺条件为:用80%乙醇将药材常压回流提取两次, 第一次乙醇用量10倍, 回流1.5h, 第二次用乙醇用量8倍, 回流1h。
2.2 微波萃取
微波萃取或称微波辅助萃取作为一种新型的提取分离方法, 具有良好的发展前景。由于其选择性高、提取时间短、溶剂耗费少、污染较低, 并且回收率高, 已在环境分析、化工、农业等领域得到了非常广泛的重视。
李莉等[12]采用微波辅助提取法提取黄芪甲苷, 综合考察了萃取功率、时间、乙醇浓度、PH值、溶剂用量、微波处理时间等因素对提取收率的影响, 得出黄芪甲苷的最佳微波辅助乙醇提取工艺条件为:先将黄芪药材用微波辅助提取法提取第1次, 之后用乙醇回流提取法提取第2次。微波功率为70 W/g, 微波照射20分钟, 乙醇浓度为60%, 微波预处理时间五分钟, 溶剂用量6倍, PH值为12。此法所得黄芪甲苷收率高出传统煎煮法约43%, 而且提取时间短, 节约能源消耗。
胡如桂等[13]采用微波水提法提取黄芪皂苷, 重点考察药材粒径、微波功率以及提取时间对提取工艺的影响大小, 实验得到黄芪皂苷的最佳微波水提工艺为:黄芪60目, 微波功率800W, 20倍水量提取两次, 每次十五分钟。此法所得黄芪皂苷的收率远高于传统乙醇回流法, 且提取速度显著加快水作为提取溶剂也大大降低了提取成本。
2.3 超临界CO2提取
超临界CO2萃取作为分离技术中一个最活跃的领域, 以其无需提取溶剂、“绿色”无污染著称。超临界CO2萃取临界温度低, 提取原料中的活性成分可以有效地保存而不被破坏, 特别适合热敏性和易氧化分解成分的提取。此外, 超临界CO2萃取法还具有产率高、时间短, 萃取所得产品纯度高、产量大、无有机残留物等优点。
蒙英等[14]采用超临界CO2萃取技术提取黄芪皂苷粗品时, 考察了黄芪粉碎目数、夹带剂用量和种类, 以及萃取的压力、时间、温度等对黄芪甲苷提取收率的影响。得到的最佳萃取工艺条件为:黄芪60目, 95%乙醇作为夹带剂, 用量为4m L/g, 萃取压力35MPa, 温度45℃, CO2流量为3.7L/h, 萃取2.5h, 此条件所得黄芪甲苷提取率为0.234mg/g。
2.4 柱前衍生化法
由于黄芪甲苷具有较强末端紫外吸收, 使得高效液相色谱法所使用的常规紫外检测器的实验结果精密度与准确度较低。为了提高黄芪甲苷紫外吸收的灵敏度, 加强其在非末端吸收波长处的紫外吸收, 增强抗干扰能力, 可采用柱前衍生化法对黄芪甲苷分子进行预处理。崔颖等[15]就以吡啶-苯甲酰氯为衍生化试剂, 将黄芪甲苷分子中的羟基进行了苯甲酰化, 之后结合溶剂萃取、柱层析分离纯化等手段, 实现了提取活性成分、消除干扰物质的目的。
2.5 树脂吸附法
阎巧娟[16]等将黄芪的乙醇提取液富集浓缩后, 通过树脂柱分离皂苷粗品的方法取代了传统的正丁醇萃取法, 实验结果表明, 树脂吸附法的提取分离效果好, 而且树脂作为可再生材料, 克服了回收正丁醇耗能多的缺点, 明显优于正丁醇萃取法。所得黄芪皂苷粗品精制后, 经制备薄层色谱法分离即可得黄芪甲苷。
2.6 超滤法
20世纪60年代发展起来的超滤技术是一种膜分离技术, 主要用于分离、提纯和浓缩。袁小红等[17]将黄芪、三七等药材加水煎煮三次, 药液合并后浓缩至1:1比例, 再经两次高速离心 (20 000转/分) 处理后配液, 滤纸过滤后用超滤膜超滤, 收集超滤液即得。
3 黄芪总皂苷的分离工艺
一直以来, 中药有效成分的分离纯化都是天然产物提取分析中的重要研究课题, 也是一项相当复杂的工作。常用的分离提纯方法有溶剂萃取、结晶和蒸馏。各种色谱技术也显示出越来越重要的作用。随着人们对中国传统中药活性成分药理作用的日益重视, 新的分离和提纯方法不断涌现。
黄芪总皂苷的纯化工艺主要有大孔吸附树脂纯化[18]和大孔吸附树脂结合碱水解[19]两种工艺。
李春红等[18]通过考察大孔树脂的种类、洗脱溶媒、洗脱体积、上样流速、样品液浓度等因素, 得出大孔树脂富集纯化黄芪总皂苷的最佳条件为:采用AB-8型大孔树脂, 黄芪提取液浓度为0.1g/ml上柱, 上样量为3 BV, 流速为1.0ml/min解吸时先用4 BV蒸馏水淋洗, 再用4 BV 50%乙醇解吸, 收集50%乙醇洗脱液, 得黄芪总皂苷提取物浸膏, 黄芪总皂苷收率可达52.1%。石忠峰[19]等考察了AB-8大孔吸附树脂对黄芪总皂苷进行吸附纯化的工艺条件, 60%乙醇提取, 树脂吸附后用不同体积分数的乙醇梯度洗脱, 发现黄芪总皂苷主要集中在体积分数为40%~80%的乙醇部位。大孔吸附树脂对黄芪总皂苷的动态吸附率为10.78mg/m L;不同浓度Na OH溶液去除杂质效果也不同, 以0.1%Na OH溶液的洗脱效果较好。
4 黄芪总皂苷的分析方法
4.1 紫外分光光度法
李春红等[18]采用紫外分光光度法测定黄芪甲苷的含量。精密称取干燥的黄芪甲苷对照品3毫克, 置5毫升容量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀。分别精密吸取上述溶液 (0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0) 毫升置10毫升具塞试管中, 水浴挥干溶剂, 再分别精密加入0.2毫升新制的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8毫升高氯酸, 摇匀, 置70℃水浴中加热15min后立即放冰浴中冷却3min, 加入冰醋酸5ml, 摇匀, 放置10min后, 在30分钟内以第一管溶液作为空白对照, 于波长584 nm处测定吸光度, 根据标准曲线得出溶液中黄芪甲苷的含量。
4.2 HPLC法
赵强强等[20]采用高效液相法测定黄芪中黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、乙酰黄芪皂苷Ⅰ等3种皂苷的含量, 色谱条件为:Welc C18色谱柱 (4.6mm×250mm, 5μm) , 流动相为乙腈和水, (0~13) min, 22%~32%乙腈, (13~30) min, 32%~34%乙腈, (30~55) min, 34%~60%乙腈;流速1m L/min, 柱温:30℃。三种皂苷的回归方程和相关系数如下:黄芪皂苷ⅠY=1.6601X+5.0058, r=0.9997, 线性范围为:2.24~11.20μg;黄芪皂苷ⅡY=1.646 5X+5.222, r=0.9998, 线性范围为1.74~8.72μg乙酰黄芪皂苷ⅠY=1.646 5X+4.776 1, r=0.999 6, 线性范围为: (1.86~9.32) μg。
高建等[21]建立HPLC-ELSD法测定当归补血总苷 (黄芪、当归) 中的黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅱ的含量。色谱条件为:Kromail C18色谱柱 (4.6mm×250mm, 5μm) ;流动相为乙腈∶水 (37.5∶62.5) , 流速0.8m L/min。ELSD参数为:漂移管温度100℃;N2流速2.60L/min。结果表明:黄芪甲苷平均回收率为98.8%, 线性范围为 (0.85~6.76) μg (r=0.999 2) , RSD为1.50%。黄芪皂苷Ⅱ平均回收率为95.7%, 线性范围为 (1.05~8.4) μg (r=0.999 4) , RSD为2.70%。
5 展望