黄芩提取物

黄芩提取物（精选4篇）

黄芩提取物 篇1

黄芩为唇形科 (Labiatae) 植物黄芩 (Scutellaria baicalensis Georgi) 的干燥根, 是常用中药。主要生物活性成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素, 其中汉黄芩素生物活性广泛, 具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抑制肿瘤作用[1], 尤其是其抗肿瘤活性引起广泛研究。本实验拟通过对黄芩自身酶催化水解使汉黄芩苷转化为汉黄芩素, 以提高原药材中汉黄芩素的含量。用高速逆流色谱 (HSCCC) 制备汉黄芩素。高速逆流色谱是一种独特的液-液分配色谱分离技术, 两相液体互不相溶, 一相作为固定相, 另一相作为流动相, 待分离物质在两相中的分配系数不同而实现分离。目前用高速逆流制备汉黄芩素的研究较少, 本实验用溶剂体系对黄芩中汉黄芩素的纯化制备, 探索最佳纯化制备条件。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

电热套 (天津泰斯特仪器有限公司) ;玻璃层析柱 (40mm×600mm) ;1200高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司) ;高速逆流色谱仪 (上海同田生化技术有限公司HSCCC-TBE300A) 。

1.2 试剂与材料

乙醇、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、磷酸 (分析纯, 天津市福晨化学试剂厂) ;甲醇 (色谱纯, 国药集团化学试剂有限公司) ;双蒸水、超纯水, 自制。聚酰胺树脂 (国药集团化学试剂有限公司) ;汉黄芩素 (批号:MUST-12092303, 中国科学院成都生物研究所) ;黄芩药材 (购自安徽同泰药业有限公司) 。

2 实验方法

2.1 黄芩的提取纯化

取黄芩粉末50g, 精密称定, 置1 000mL容量瓶中, 加入pH为5的超纯水, 浸泡12h, 加入10倍体积95%乙醇, 提取2次, 每次2h。合并提取液, 过滤, 浓缩回收乙醇, 得到浸膏。浸膏加水, 使其呈混悬状态, 进行聚酰胺层析柱上样, 上样量2g/100mL, 依次用水、30%、60%、95%乙醇洗脱。将含有汉黄芩素的洗脱液合并, 浓缩干燥, 得到黄色粉末。

2.2 溶剂体系和样品溶液的配制

在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水 (体积比7∶3∶5∶5) 两相溶剂体系, 充分振摇后在室温下静置。分离上下相, 使用前分别超声脱气30min, 待用。取纯化粉末40mg, 用等体积的上下相溶剂体系溶解, 溶解液作为样品溶液, 备用。

2.3 高速逆流色谱法的分离制备

用最大流速 (9.99mL/min) 向HSCCC分离管中泵入上相, 待上相充满整个管路后, 调整主机转速为850r/min, 以2.0mL/min流速泵入下相, 待流动相从柱出口流出, 两相在分离管中达到动态平衡后, 注入样品溶液20mL, 在275nm波长下检测, 记录色谱图, 根据色谱图接收目标成分。

2.4 高效液相色谱分析条件

色谱柱:Hypersil ODS C18色谱柱 (250mm×4.6mm, 5μm, 大连依利特) , 流动相为甲醇-0.1%磷酸水 (54∶46) , 流速为1.0mL/min, 柱温30℃, 检测波长275nm, 进样量10μL。

2.5 标准曲线绘制

精密称取汉黄芩素 (纯度99.5%) 对照品1.83mg, 置于10mL容量瓶中, 用甲醇溶解, 摇匀, 至刻度定容, 作为对照品贮备液。分别进样5、10、15、20、25μL, 按上述色谱条件测定峰面积值。以进样量为横坐标 (X) , 以峰面积值为纵坐标 (Y) 进行线性回归, 得回归方程:Y=5 397.1 X-751.38, R2=0.999 9, 线性范围为0.915~4.575μg。

3 结果

3.1 黄芩提取纯化

本实验按上述提取方法得浸膏21.6g, 得膏率为43.2%, 浸膏经HPLC测得汉黄芩素含量为3.267%。提取浸膏过30~60目聚酰胺层析柱, 汉黄芩素存在于60%乙醇洗脱液中, 洗脱液浓缩干燥后得到5.1g黄色粉末, 经HPLC测得汉黄芩素含量为13.57%。

3.2 高速逆流色谱法的制备

一般用于HSCCC的溶剂系统, 应满足下列几个方面的要求[2]: (1) 不造成样品的分解或变性; (2) 足够高的样品溶度; (3) 样品在系统中有合适的分配系数值; (4) 固定相能实现足够高的保留; (5) 溶剂易挥发以方便后续处理。其中固定相的保留率要达到50%以上, 分配系数K值在0.5~2之间可以得到很好的分离效果。

汉黄芩素是一种黄酮类化合物, 极易溶于甲醇、乙醇、丙酮, 溶于醋酸乙酯和氯仿, 微溶于苯和水, 不溶于石油醚[1]。根据其性质, 本实验选择疏水性体系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水。根据文献[3], 将样品溶于等体积的上下相中, 分别取等体积的上下相进行HPLC分析, 根据公式:K=cs/cm (cs:溶质在固定相中的浓度;cm:溶质在流动相中的浓度) [2]从而计算汉黄芩素的分配系数, 选择汉黄芩素分离系数在0.5~2之间的体系, 进行高速逆流实验, 根据分离效果, 最后选定正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水比列为7∶3∶5∶5分配体系, 保留率R为77.73%。结果见表1。

通过以上条件进行HSCCC分离纯化, 结果见图3, 谱图显示汉黄芩素在2h左右出峰, 持续时间30min, 可以看出汉黄芩素峰与其前后峰均分开。从5.1g过聚酰胺层析柱纯化的黄芩提取物进一步纯化得到525mg汉黄芩素, 经HPLC分析其纯度为98.7%。HPLC色谱及其紫外光谱见图4。

4 讨论

黄芩中汉黄芩素含量较低, 据文献报道不同产地含量不同, 大约范围为0.01%~0.35%[4]。参考现有的提取方法和汉黄芩素的极性大小, 本实验采用自身酶水解法使汉黄芩苷转化为汉黄芩素, 加入4倍体积pH为5的水酶解12h[5,6,7,8]。4倍体积水不仅满足了水解的需要, 而且水解完成后基本上没有剩余水分;12h可以保证水解完全。汉黄芩素属黄酮类化合物, 因其本身所带有的酚羟基较多而在溶液中不稳定, 根据文献记载本实验选择pH为5的水进行水解;根据文献记载95%乙醇[9,10]能使汉黄芩素较充分地溶出, 故本实验采用95%乙醇进行提取。结果表明本实验的提取得膏率及其中汉黄芩素含量均较高。

黄芩粗提物的HPLC色谱 (见图1) 主要有2个物质的峰, 其中在25min左右的峰为汉黄芩素, 几乎没有看到汉黄芩苷出峰, 说明汉黄芩苷水解为汉黄芩素, 增加了汉黄芩素的含量。图2说明过完60目聚酰胺层析柱的提取物中弃除了一些杂质, 提高了汉黄芩素纯度, 为后面的HSCCC分离减轻了难度。

本实验HSCCC体系方法不仅可以把汉黄芩素完全分离出来, 也可以将前面出现的大峰物质及其后面的小峰物质分离出来, 表明本系统分离度良好。配备的固定相和流动相, 跑完一次样品差不多都可以用完, 不会造成其中一相过度剩余而浪费试剂。实验结果表明, 本方法简便、重现性好。

参考文献

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黄芩茎叶提取物纯化方法优选 篇2

关键词：黄芩茎叶,紫外分光光度法,纯化工艺,正交试验

黄芩为我国华北道地药材之一, 为唇形科植物黄芩, 又名山茶根、土金茶根。黄芩收载于《神农本草经》、《滇南本草》、《本草正》等, 是现代中国药典收载的常用中药。黄芩属于半野生半家种品种, 该品种年销量近万吨, 为四十种大宗药材品种之一。野生主要分布我国河北、山西北部, 内蒙中东部和东北三省大部, 河北承德, 内蒙古赤峰等几个最具规模的主产区, 是我国北方野生中药材的主要品种之一[1]。黄芩多数以根入药。而茎叶大多弃之不用。黄芩茎叶的主要化学成分包括野黄芩苷、黄芩苷、白杨素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷等黄酮类化合物[2]。何春年等[3]研究发现, 临床所用的黄芩根中主要含有以黄芩总黄酮为主的黄酮类活性成分, 而其茎叶也含有黄酮类等有效活性成分。黄芩茎叶具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、保护心肌缺血、降血压、降血糖等药理作用[4,5,6,7,8,9]。为了更有效地利用中药资源, 人们对黄芩茎叶进行提取纯化研究试验, 已达到制备高纯度的总黄酮, 以满足制剂研究的需要。近年来, 研究有关黄芩茎叶总黄酮提取、纯化的方法主要有以酸沉法为主, 但纯化方式略有不同, 黄芩茎叶总黄酮纯化工艺做了一定的研究, 但纯化方法之间没有进行比较, 哪个纯化方法更好, 结果难以定论。因此, 笔者在已有的研究基础上, 对黄芩茎叶总黄酮的纯化工艺做了系统的考察和比较。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AL204电子天平 (梅特勒-托利多) ;KQ-700DE数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ;DK-98-1水浴锅 (天津市中环试验电炉有限公司) ;TDL-40B离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;FW80型粉碎机 (天津市斯泰特仪器有限公司) ;, RE-5286A型旋转蒸发仪 (上海雅荣生化设备仪器有限公司) ;UV-2401PC紫外可见分光光度计 (日本岛津) ;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 (上海亚荣生化仪器厂) 。

1.2 试药

黄芩茎叶药材 (颈复康药业集团有限公司中药种植园采摘, 经颈复康药业集团有限公司高级工程师张雪荣鉴定为是唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥地上部分) ;野黄芩苷对照品 (中国药品生物制品检定所, 批号:110842-201206) ;水为二次蒸馏水, 甲醇 (色谱纯) , 其余试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩茎叶的提取

称取黄芩茎叶药材1000 g, 粉碎成粗粉。用60%乙醇提取3次。每次8倍量, 提取时间2 h, 提取后过滤, 合并滤液, 浓缩至乙醇无醇味, 将浸膏平均分为4份[10,11,12], 备用。

2.2 黄芩茎叶的纯化方法比较

2.2.1 酸沉法

取上述待纯化样品溶液1份, 加浓盐酸调p H 3.0~4.0, 静置后滤去杂质, 在40℃调p H至2.0, 保温, 静置2 h, 过滤, 沉淀用水洗至p H为中性, 干燥, 即得。并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量[13]。

2.2.2 酸碱法

取上述待纯化样品溶液1份, 加浓盐酸调p H 1.0, 放置15 h。离心, 取沉淀物进行干燥, 加水, 70℃水浴加热, 10%Na OH溶液调至p H 6.0。加入45%乙醇, 放置1 h, 抽滤, 沉淀用45%乙醇洗涤, 滤液加浓盐酸调到p H 1.0, 70℃下保温1 h, 放置10 h, 抽滤, 所得沉淀干燥, 即得。并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量[14]。

2.2.3 碱溶酸沉法

取上述待纯化样品溶液1份, 加入10%氢氧化钠溶液, 调p H至7.5。趁热滤过, 滤液加热, 缓缓加入20%硫酸溶液, 调p H值至2.0, 在60℃保温18 min, 静置0.5 h, 析出棕色沉淀物, 倾取上层液, 静置20 h后, 析出棕黄色沉淀物, 分取棕色沉淀物和棕黄色沉淀物, 低温干燥, 即得。并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量[15]。

2.2.4 重结晶法

取上述待纯化样品溶液1份, 加浓盐酸调p H 2.0, 55℃保温6 h, 滤过, 重结晶, 真空干燥, 即得。并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量。

2.3 黄芩茎叶样品测定结果

以转移率和纯度为考察指标, 分别采用酸沉法、酸碱法、碱溶酸沉、重结晶法四种方法, 结果见表1。

由表1可以得出酸碱法的转移率和纯度比较高, 所以笔者选择酸碱法并对之进行优选试验, 因素水平设计见表2, 结果见表3、4。

在预试验的基础上, 考察了因素A (碱调p H值) 、因素B (活性炭加入量) 、因素C (保温温度) 、因素D (保温时间) 4个因素, 以黄芩茎叶总黄酮为评价指标, 按正交试验L9 (34) 表设计试验优化最佳工艺组成和用量, 结果见表3。其中极差R反映各因素对指标影响的程度, 极差R越大, 影响程度越大, 本试验4个因素R值排列为A>B>C>D, 但各因素对纯化黄芩茎叶总黄酮的影响均不明显 (P>0.05) 。由表3数据可知, 碱调p H值用量是影响黄芩茎叶总黄酮提取物的主要因素。各因素水平分析结果为A:2>3>1;B:3>2>1;C:3>2>1;D:3>2>1, 所以本研究选择A2B3C3D3。

2.4 纯化工艺验证

称黄芩茎叶药材2000 g, 粉碎成粗粉。用60%乙醇提取3次。每次8倍量, 提取时间2 h, 提取后过滤, 合并滤液, 浓缩至乙醇无醇味, 将浸膏加浓盐酸调p H1.0, 放置12 h。离心, 取沉淀物进行干燥, 加水, 70℃水浴加热, 10%Na OH溶液调至p H 7.0。加入45%乙醇, 放置1 h, 抽滤, 沉淀用45%乙醇洗涤, 滤液加浓盐酸调到p H 1.0, 80℃下保温1.5 h, 放置10 h, 抽滤, 所得沉淀干燥, 即得。结果见表5。

2.5 样品含量测定

2.5.1 野黄芩苷对照品溶液的制备

精密称野黄芩苷对照品4.25 mg, 置25 m L容量瓶中, 加甲醇适量, 超声使之完全溶解, 放冷, 加甲醇至刻度, 摇匀, 制成浓度为0.17 mg/m L的对照液, 作为对照品溶液。

2.5.2 供试品溶液的制备

取纯化后的黄芩茎叶提取物研细, 精密称取10 mg于100 m L容量瓶中, 加甲醇适量, 超声20 min, 待冷却后用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 吸取2 m L至25 m L容量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 用0.45μm微孔滤膜滤过, 即得。

2.5.3 检测波长的选择

取对照品对照液和供试品溶液, 以相应试剂为空白, 照紫外-可见分光光度法 (《中国药典》2010年版) 在200~400 nm波长范围内扫描, 结果显示, 二者均在285 nm处有最大吸收, 因此选择285 nm作为测定波长。

2.5.4 标准曲线的绘制

精密量取上述野黄芩苷对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 m L至10 m L容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 得到系列对照品溶液。以甲醇为空白, 采用紫外分光光度法在285 nm下测定吸收度, 以吸收度A为纵坐标, 溶液浓度C为横坐标, 绘制标准工作曲线, 得到线性回归方程, 得回归方程为A=49.172C-0.0075, r=0.9997, 结果显示野黄芩苷在0.0064~0.0323 mg/m L浓度范围内呈良好线性关系。

2.5.5 精密度试验

精密量取上述野黄芩苷对照品溶液, 在285 nm处, 以甲醇为空白, 按照测定方法进行测定, 重复测定6次吸光度, 结果对照品溶液的平均吸收度值为0.2996, RSD值为0.52%, 精密度较好。

2.5.6 重现性试验

取本品100 mg, 研细, 精密称取9份, 分为3组, 每组分别为8、10、12 mg, 按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液;另取对照品溶液, 按上述测定方法分别测定野黄芩苷的吸收度, 记录吸收度值, 计算样品含量。样品平均含量为70.6%, RSD值为1.3%。重现性良好。

2.5.7 稳定性考察

取同一批号的供试品溶液, 分别在放置0、2、4、6、8 h后, 测定其吸收度。结果表明, 样品溶液在8 h内稳定性良好, RSD值为0.876%。

2.5.8 回收率试验

取本品100 mg, 研细, 精密称取9份, 每份约5 mg, 精密加入不同量的野黄芩苷对照品溶液, 按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液, 按上述测定方法测定各样品的吸收度, 计算回收率。结果见表6。

3 讨论

纵观我国中药资源的开发现状, 一方面资源不足, 一些蕴藏丰富的资源尚未得到合理开发和利用;另一方面, 又存在着严重的浪费和破坏, 严重制约了中医药事业的持续稳定发展。如何合理开发利用有限的中药资源, 减少中药资源的浪费, 关系到中药能否更好地为人类健康服务。药用植物不同部位的开发利用是合理利用有限的中药资源的有效途径之一。中药商品药材按照传统, 仅以某些特定部位入药, 其余多废弃不用。事实证明被弃部位或含有与入药部位相同的有效成分或有其他药效或用途。黄芩传统上以根部入药, 而产量为根部数倍的茎叶则弃之不用, 经研究发现黄芩茎叶的主要成分为黄酮类化合物, 确定黄芩茎叶黄酮的主要成分为野黄芩苷, 并且与黄芩根所含成分 (主要成分为黄芩苷) 有明显差异。

黄芩提取物 篇3

目前,报道的黄芩提取方法主要有煎煮法［8］、浸渍法［9］、回流法［10］、超声法［11］、微波法［12］等,其中传统的提取方法( 煎煮法、浸渍法、回流法) 存在提取时间长、效率低的缺点。微波法和超声法作为新技术在中药提取中的应用较为广泛,具有提取时间短、提取效率高的特点［13 － 14］。超声- 微波协同提取技术是近年来发展起来的一种新方法,具有快速、高效、环保、安全等特点［15］。利用超声- 微波协同提取黄芩苷的工艺研究尚未见报道。本试验利用响应面法对超声- 微波协同提取黄芩苷的工艺进行优化,旨在为黄芩苷的工业化生产提供参考。

1 材料

1. 1 药品与主要试剂

黄芩购自贵州省铜仁市药材市场,经铜仁职业技术学院梁玉勇教授鉴定为唇形科植物黄芩的根,经干燥后粉碎过60 目筛,备用; 黄芩苷对照品( 批号为110715 - 201318) ,购自中国药品生物制品鉴定所; 甲醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为重蒸水。

1.2主要仪器

高效液相色谱仪( 型号为Waters 2695) ,购自美国Waters公司; 电子分析天平( 型号为BP 211D) ,购自德国赛多利斯股份公司; 紫外- 可见分光光度计( 型号为UV - 2012PCS) ,购自尤尼柯上海有限公司;超声波清洗器( 型号为SK5200HP) ,购自上海科导超声仪器有限公司; 超声- 微波协同萃取仪( 型号为CW - 2000) ,购自上海新拓微波溶样测试技术有限公司; 旋转蒸发仪( 型号为RE - 52A) 、自动双蒸纯水蒸馏器( 型号为SZ - 93) ,购自上海亚荣生化仪器厂。

2方法

2. 1 HPLC法测定黄芩苷含量

2. 1. 1 色谱条件色谱柱为DIKMA Diamonsil C18柱( 4. 6 mm × 250 mm,5 μm) ; 流动相为甲醇- 水- 甲酸( 47∶53 ∶0. 5) ; 流速为1. 0 m L/min; 检查波长为280 nm; 柱温为25 ℃ 。理论塔板数按照黄芩苷峰计算应不低于2 500。

2. 1. 2 对照品溶液的制备精密称取60 ℃ 减压干燥4 h的黄芩苷对照品适量,加甲醇制成每毫升含黄芩苷0. 086 mg的溶液,即得对照品溶液。

2. 1. 3 标准曲线的绘制取对照品溶液,依次进样2,5,10,15,20 μL,以峰面积为纵坐标( Y) 、对照品溶液的进样量为横坐标( X) 绘制标准曲线。

2. 1. 4 供试品溶液的制备称取一定量的黄芩粉末5 g( 60 目) ,用一定浓度的乙醇在一定条件下进行超声- 微波协同提取,提取2 次,合并提取溶液,减压浓缩定容至250 m L; 精密吸取0. 3 m L至25 m L量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得供试品溶液; 以HPLC法测定峰面积,并计算黄芩苷提取得率。计算公式:黄芩苷提取得率= ( 提取液中黄芩苷含量/药材质量) × 100% 。

2. 2 单因素试验设计

2. 2. 1 乙醇浓度固定料液比为1 ∶15,提取时间为8 min,微波功率为700 W,提取次数为2 次,设乙醇浓度分别为40% 、50% 、60% 、70% 、80% ,考察乙醇浓度对黄芩苷提取得率的影响。

2. 2. 2 料液比固定乙醇浓度为70% ,提取时间为8 min,微波功率为700 W,提取次数为2 次,设料液比分别为1∶5,1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,考察料液比对黄芩苷提取得率的影响。

2. 2. 3 微波功率固定乙醇浓度为70% ,提取时间为8 min,提取次数为2 次,设微波功率分别为400,500,600,700,800 W,考察微波功率对黄芩苷提取得率的影响。

2. 2. 4 提取时间固定乙醇浓度为70% ,微波功率为700 W,提取次数为2 次,设提取时间分别为4,6,8,10,12 min,考察提取时间对黄芩苷提取得率的影响。

2. 2. 5 提取次数固定乙醇浓度为70% ,提取时间为8 min,微波功率为700 W,设提取次数分别为1,2,3 次,考察提取次数度黄芩苷提取得率的影响。

2. 3 响应面试验设计

在单因素试验基础上,采用Box - Behnken响应面设计法,以乙醇浓度( A) 、料液比( B) 、微波功率( C) 和提取时间( D) 为自变量,以黄芩苷提取得率为响应值,设计4 个因素3 个水平的响应面试验方案,响应面试验因素、编码及水平设计见表1。

3 结果与分析

3. 1 色谱图( 结果见图1) 与回归方程

由图1 可知,黄芩苷的保留时间约为15. 8 min。通过标准曲线得到回归方程为Y = 269 172X +28 947,r = 0. 999 9,结果在0. 172 ~ 1. 720 μg范围内呈良好的线性关系。

3. 2 单因素试验

3. 2. 1 乙醇浓度结果见图2。

由图2 可知,随着乙醇浓度的升高,黄芩苷提取得率随之增加,当乙醇浓度达到70% 时,提取得率达到最大值,之后再增加乙醇浓度,提取得率反而下降。这是因为黄芩苷为弱极性化合物,根据相似相溶原理,通过调节乙醇和水的配比改变乙醇溶液的极性,从而对黄芩苷提取效果有较大影响。因此,确定最佳的乙醇浓度为70% 。

3. 2. 2 料液比结果见图3。

由图3 可知,当料液比小于1∶15 时,黄芩苷提取得率随着料液比的增大而增加,在料液比为1∶15 时达到最大。随着料液比进一步增大,提取得率有所下降。这是由于溶剂过大时,超过- 微波协同的能量被提取溶剂大量吸收而不能完全作用于药材,从而影响黄芩苷的提取得率。因此,确定最佳的料液比为1∶15。

3. 2. 3 微波功率结果见图4。

由图4 可知,当微波功率小于600 W时,黄芩苷提取得率随着微波功率的增大不断增加,在微波功率为600 W时达到最大。随着微波功率进一步增大,提取得率反而下降。这是由于微波功率过大,一方面其强热效应可能破坏溶液中黄芩苷的结构; 另一方面高温使蛋白质凝固,黄芩苷不易破壁溶出。因此,确定最佳的微波功率为600 W。

3. 2. 4 提取时间结果见图5。

由图5 可知,黄芩苷提取得率随着微波时间的延长而升高,当提取时间达到8 min时,提取得率最大。随着提取时间的进一步延长,提取得率反而下降。这是由于微波时间过长造成黄芩苷的降解,从而导致提取得率下降。因此,确定最佳的微波时间为8 min。

3. 2. 5 提取次数结果见图6。

由图6 可知,随着提取次数的增多,黄芩苷提取得率增加,当提取次数超过2 次时,黄芩苷提取得率趋于平稳,考虑成本等因素,最后确定黄芩苷重复提取2 次为宜。

3. 3 响应面试验( 结果见表2)

利用Design - Expert 8. 0. 6 Trial软件对表2 中的试验数据进行多元回归拟合得到黄芩苷提取得率对乙醇浓度、料液比、微波功率、提取时间的二次多元回归模型方程: Y = 13. 04 + 0. 17A + 0. 62B + 0. 025C +0. 52D + 0. 15AB - 0. 052AC + 0. 018AD + 0. 56BC +0. 10BD + 0. 030CD - 1. 05A2- 1. 14B2- 0. 63C2-1. 26D2。二次多元回归模型的显著性检验见表3。

注: R2= 0. 963 7; 校正决定系数( Adjusted R2) = 0. 921 4; 信噪比( Adeq precision) = 7. 56。

由表3 可知,回归模型极显著,失拟项不显著,Adjusted R2= 0. 921 4 和Adeq precision = 7. 56 远大于4,说明回归方程拟合度和可信度均较高,可对黄芩苷提取得率进行较好预测。方程的一次项中乙醇浓度对黄芩苷提取得率的线性效应显著,而料液比和提取时间对黄芩苷提取得率的线性效应极显著; 二次项中乙醇浓度、料液比、微波功率、提取时间对黄芩苷提取得率的曲面效应极显著; 交互项中料液比与微波功率对黄芩苷提取得率的影响极显著。上述结果说明,各因素对黄芩苷提取得率的影响并不是简单的线性关系。响应面可直观反映各因素交互作用对响应值的影响,具体见292 页彩图7。由彩图7 可知,6 个响应面均为开口朝下的凸形曲面,说明响应值( 黄芩苷提取得率) 存在极高值。根据曲面陡峭程度可判断料液比与微波功率的交互作用对黄芩苷提取得率的影响显著。

通过对模型分析可知,黄芩中黄芩苷的最佳提取条件为: 乙醇浓度71% 、料液比1 ∶16. 64、微波功率616. 95 W、提取时间8. 44 min。在此条件下,黄芩苷的提取得率为13. 21% 。考虑到实际操作的便利,将最佳组合条件修正为: 乙醇浓度71% 、料液比1∶17、微波功率617 W、提取时间8 min。

3. 4 验证试验

为了验证响应面结果的可靠性,采用上述最佳提取条件平行提取3 次,得到黄芩苷平均得率为13. 18% ,与理论值的相对误差仅为0. 25% 。因此,基于响应面试验设计所得的最佳工艺参数准确可靠,具有实用价值。

4 讨论

动物生产中抗生素类药物的残留一直制约着畜牧业的健康发展。因此,寻求高效、无残留的绿色添加剂一直是科研工作者们不断努力的方向。黄芩苷因具有清热、抗氧化、提高机体免疫力、抑菌抗炎、改善动物生产性能等特点,在畜禽生产中有着较好的应用前景［16］。

超声- 微波协同萃取技术是直接将超声振动与开放式微波两种作用方式结合起来,充分利用超声波及微波的热效应、机械效应和空化效应等作用,使植物细胞破裂,细胞内有效成分自由流出,并加速被萃取物向萃取界面的扩散,使有效成分能在较低温度条件下以较快的速度被萃取,具有速度快、能耗小、溶剂用量小、萃取率高且不易造成物质结构破坏等优点,已被广泛用到中药提取中［17 － 19］。

黄芩提取物 篇4

1 试剂与材料

KQ-200VDB型双频数显超声机 (昆山市超声仪器有限公司) ;SYQ-DSX-280B灭菌锅 (上海申安医疗器械厂) ;BSi24S型电子分析天平 (北京赛多利斯公司) ;SHP-250B生化恒温培养箱 (天津市福元铭仪器设备有限公司) ;DHG-9078A型电热恒温鼓风干燥箱 (上海双旭电子有限公司) ;BCM-1600A双人双面超净工作台 (北京莱博联泰科技有限公司) 。

菌种为蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 标准菌株CMCC (B) 63302, 购自广东省微生物研究所;中药黄芩由赣州市人民医院中药房提供;培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂, 于121℃灭菌30min。

2 方法

2.1 中药提取物制备

2.1.1 超声提取液制备

称取一定量的黄芩药材粉末, 置于500mL广口烧瓶中, 加10倍量蒸馏水超声波提取2次, 每次20min, 超声功率200W, 合并提取液, 过滤。续滤液低温浓缩至1g/mL的生药提取液, 密封保存于4℃冰箱中备用。

2.1.2 传统水煎液制备

称取一定量的黄芩粉末, 置于500mL圆底烧瓶中, 加10倍量蒸馏水, 加热回流提取2次, 每次20min, 趁热过滤, 合并滤液, 浓缩至1g/mL的生药提取液, 密封保存于4℃冰箱中备用。

2.2 滤纸片制备[4]

采用试管稀释法, 用无菌水将两种提取液倍比稀释成不同浓度, 用打孔器将定性滤纸打成直径为7mm的小圆片若干, 高压蒸汽灭菌后, 放入不同浓度的样品液中浸泡15min, 取出晾干备用。

2.3 菌液制备

将试验菌种活化, 用无菌水稀释, 使菌悬液浓度达到1×108cfu/mL, 备用。

2.4 抑菌实验

取15mL经高压灭菌且冷却至50~60℃的牛肉膏蛋白胨培养基, 加至预先灭菌好的直径为9cm的培养皿中制成培养基平板。取菌悬液0.1mL, 用涂布器均匀涂布于培养基表面, 在培养基表面贴上4片浸药滤纸片和1片未浸药滤纸片, 每个浓度平行进行3次, 盖好皿盖, 置于37℃恒温培养箱中培养24h, 测定并记录抑菌圈直径, 计算其平均值。

2.5 统计学分析

采用SPSS软件对所得数据进行处理, 计量资料采用 (珚x±s) 表示, 采用t检验, P<0.05, 差异具有统计学意义。

3 结果

不同提取方式、不同浓度的黄芩提取液的蜡样芽胞杆菌抑菌圈直径均有所差异, 具体结果见表1。

(±s, mm)

结果表明, 黄芩的超声及水煎提取液对蜡样芽孢杆菌均有明显的抑制效果, 且同样浓度时, 超声提取液的抑菌效果强于传统水煎液。超声提取液在稀释至0.78%时仍有抑菌作用, 但稀释至0.39%时观察不到明显的抑菌环;水煎提取液稀释至1.56%时仍有抑菌作用, 但稀释至0.78%时观察不到明显的抑菌环。

4 结论

传统的黄芩有效成分提取法为水煎法, 但水煎法的提取时间较长, 提取率较低。超声提取技术具有快速、溶剂用量少、提取率高、成本低等诸多优点, 因而被广泛应用于中药有效成分的提取。研究结果表明[5], 超声提取法对黄芩苷的提取效率明显高于传统水煎提取法, 与本文的实验结果一致。

本文采用琼脂扩散法及试管对倍稀释法比较不同黄芩提取物对蜡样芽孢杆菌标准株的体外抑制效果。实验结果表明, 不同方法黄芩提取液对蜡样芽胞杆菌的抑制效果均较好, 且超声法黄芩提取液的抑菌效果明显优于传统水煎法, 但黄芩提取液对蜡样芽孢杆菌抑制作用的具体机制仍有待进一步研究。

摘要：目的:探讨不同方式黄芩提取液的体外抑菌作用。方法:以水为提取溶媒, 采用超声法及传统煎煮法对黄芩的有效成分进行提取, 比较两种提取液在体外对蜡样芽孢杆菌的抑制作用。结果:超声法黄芩提取液对蜡样芽孢杆菌的抑制效果明显优于传统煎煮法黄芩提取液 (P<0.05) 。结论:黄芩提取液具有良好的抑菌作用, 且使用超声法可以较好地对黄芩的有效成分进行提取, 值得推广应用。

关键词：黄芩,蜡样芽孢杆菌,抑菌作用

参考文献

[1]宋冬冬.黄芩的抑菌作用及有效化学成分探讨[J].中国医药指南, 2013, 11 (5) :77-78.

[2]郭京华.浅析黄芩有效化学成分及抑菌作用[J].中国实用医药, 2012, 7 (16) :195-196.

[3]张喜平, 周田美, 董晓勤.等.黄芩苷注射液体外抗菌作用实验研究[J].医学研究杂志, 2006, 35 (8) :39-41.

[4]刘月凤.蜂胶对蜡样芽孢杆菌的抑菌试验研究[J].陕西农业科学, 2012 (5) :23-24.