传染性支气管炎病毒

传染性支气管炎病毒（精选8篇）

传染性支气管炎病毒 篇1

鸡传染性支气管炎 (Avian Infectious Bronchitis, IB) 是一种由鸡传染性支气管炎病毒 (Infectious Bronchitis Virus, IBV) 引起的急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病, 呼吸道上皮细胞为IBV最初感染和主要的增殖部位, 部分病毒株可在感染鸡的肾脏、输卵管和肠道等组织器官的上皮细胞中增殖。其主要特征为:病鸡咳嗽、喷嚏、气管音;肾脏肿大、苍白、有大量尿酸盐沉积, 严重者呈现“花斑肾”。该病能感染不同日龄、品种和性别的鸡, 可导致雏鸡死亡;可引起蛋鸡产蛋数量和蛋的品质下降及肉鸡的增重和饲料报酬下降;IBV常伴有混合感染并可继发细菌性疾病。长期以来, IB给世界各国养禽业带来严重的经济损失。IBV血清型众多, 并且不同血清型之间较差保护性较差, 给IBV的预防带来诸多困难。随着IBV分子生物学研究、免疫机制探索以及病原变异机制探讨等工作的逐步深入, IB疫苗研究工作也取得了一系列进展。

1 IB灭活疫苗

Gough等1977年报道了用油乳剂灭活苗使IB得到有效控制, 但是, 由于IB存在众多血清型, 单价灭活苗并不能阻止IBV变异株引起IB的暴发。随后, Finney (1990) 等研究表明IB二价苗能刺激机体产生良好的抗体反应。王红宁、张联盟等1994年试制出传染性支气管炎 (呼吸型、肾型) 多价油乳剂灭活疫苗, 经区域试验证明, 该疫苗对鸡安全无副作用, 并能有效地预防肾型IB, 提高肾型传染性支气管炎疫区鸡群的成活率和生产效益。与IB弱毒疫苗相比, 灭活疫苗安全无副作用, 不存在散播病原和毒力返强的问题, 且能激发良好的体液免疫反应, 有效地预防IB。因为血清型的多样, 使用灭活疫苗时, 应用不同类型的多价灭活疫苗。灭活疫苗的不足之处是不能诱发机体产生细胞免疫、使用剂量大、需要配合佐剂、制备过程比较复杂, 因而成本较高, 即使全病毒灭活苗也需2次以上的加强免疫才能有效引发中和抗体的形成。

2 IB弱毒疫苗

弱毒疫苗是通过抗原性良好的毒株连续在鸡胚传代 (一般在25代以上) 致弱获得, 弱毒疫苗的关键是免疫原性和毒价, 所以应避免疫苗株过多的传代以防止其免疫原性降低。用于制备弱毒疫苗的毒株包括M41株、荷兰株、Arkansas株等。Mass型IBV被认为是世界范围内分布最广泛的血清型, 且对Mass型以外的异型毒株也能产生较好的免疫力。在弱毒疫苗使用中以H52和H120应用最广泛, 其次是Conn株强毒致弱的疫苗株。活疫苗生产成本低, 使用方便, 可通过饮水免疫和喷雾免疫的方式用作群体免疫。能有效激发机体的体液免疫和细胞免疫, 且局部免疫后能引起较高的局部抗体应答, 在保护商品化产蛋鸡方面具有良好的应用价值。此类疫苗也存在许多不足之处, 其致弱程度难以掌握;疫苗的运输、贮存和使用等的条件要求较高;疫苗株具有一定的致病性和传播能力, 接种后能引起轻度的呼吸道反应。除此之外弱毒苗存在毒力返强、不同血清型毒株交叉免疫效果差以及疫苗株与野毒株或是疫苗株与疫苗株发生重组的可能。这使得致弱活毒疫苗在理论和实践上都不可能从根本上彻底控制IB的流行。

3 IB基因工程疫苗

基因工程疫苗是利用基因工程方法或分子克隆技术获得带有病原体保护性抗原表位的目的基因, 将其导入原核或真核表达系统, 获得该病原的保护性抗原, 研制成疫苗或者采用基因缺失、基因突变等手段所获得的基因缺失疫苗或基因突变疫苗等。与常规疫苗相比, 基因工程疫苗具有廉价、生产规模大和利用活载体研究多价疫苗以及易于区分感染与免疫动物的抗体等优点。

3.1 基因工程亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗又称重组亚单位疫苗或生物合成亚单位疫苗, 是利用DNA重组技术, 将保护性抗原在原核或真核细胞中表达, 分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原肽链, 加入佐剂制成的疫苗。该类疫苗的主要优势为: (1) 安全性高, 绝大多数蛋白质不存在感染和致病作用; (2) 适合大规模生产; (3) 可以制成多价疫苗和多联疫苗, 降低生产成本, 简化免疫程序。Sang等研究了IBV核蛋白结构和功能, 证明N蛋白的C末端前120个氨基酸为T淋巴细胞的抗原表位, 能够诱导细胞毒性T细胞反应, 并对急性感染的雏鸡有保护作用, 证明IBV核蛋白有细胞免疫功能。廖明等将IBV Hotle S1基因正确地插入到Tn NPV基因组中构建了两个重组毒株:Tn NPV- (X3) S1.Hotle-OCC+、Tn NPV- (X3/4) S1.Hotle-OCC+, 后者使S1基因在昆虫细胞中得到了高效表达, 重组S1蛋白能够被鸡抗IBV血清特异性识别, 说明它具有类似天然蛋白的生物活性, 这对研制鸡传染性支气管炎基因工程疫苗意义重大。

3.2 IB核酸疫苗

核酸疫苗也称DNA疫苗, 是指一类将抗原基因重组到表达载体上的重组质粒疫苗, 经肌肉注射或黏膜免疫等方法导入宿主体内, 通过宿主细胞表达抗原蛋白, 诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答, 以达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗较传统疫苗有许多优点: (1) DNA疫苗作为一种重组质粒, 提纯方法简单, 适于批量生产; (2) DNA分子较稳定, 可制成冻干苗, 便于保存和运输; (3) 不存在毒力反强的危险, 比传统疫苗更安全; (4) 可制成DNA多价苗。S、S1和N基因均可作为靶基因用以构建核酸疫苗。步志高等 (1998) 构建了Mass型M41地方分离QD株S1基因DNA表达质粒ps VQDS1, 该质粒可诱导产生针对IBVM41株的中和抗体。陈洪岩等 (1999) 、刘思国等 (2001) 分别将IBVN基因和S1基因构建成真核表达质粒接种SPF鸡, 结果目的基因在鸡体内得到了表达, 鸡获得了一定的免疫力, 但保护作用不及IBV疫苗免疫力, 分析认为, 肌注质粒吸收不佳, 致使主要免疫原蛋白表达量不高, 而使免疫保护率不高。Kapczynski等 (2003) 将阿肯色州IBV血清型的S1基因DNA疫苗通过鸡胚内接种或肌注, 结果显示, 18日龄的鸡胚用含S1基因的DNA疫苗免疫, 3周后用弱毒疫苗加强免疫可使鸡得到完全保护, 而单独使用DNA疫苗不足以预防IBV。

3.3 IB活载体疫苗

重组活病毒载体疫苗是利用基因工程方法, 将一种病原免疫相关基因整合进另一载体基因组DNA的复制非必需片段中构建而成。在被接种的动物体内, 特定免疫原基因可随重组载体的复制而适量表达。常用的载体有痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒以及反转录病毒等。Binns等 (1986) 首先利用禽痘病毒作为载体表达了IBV S1蛋白并证明能够激发保护性免疫应答。Yu等 (2001) 用重组鸡痘病毒为载体表达了IBV C端N蛋白的120个氨基酸进行免疫原性研究, 结果显示, 痘病毒表达的衣壳蛋白C端的119个氨基酸是宿主保护抗原, 并且诱导了一些IBV株交叉保护免疫。Wang等 (2009) 构建了一株共表达IBV S1蛋白和γ-IFN的重组鸡痘病毒并免疫鸡, 结果显示, 虽然重组毒诱导的抗体水平低于疫苗株, 但对强毒的攻击产生了良好的保护作用。Johnson等 (2003) 利用禽8型腺病毒为载体构建了表达IBV S1基因的重组腺病毒, 对0日龄和6日龄鸡分别进行口服免疫, 35日龄时用同型或异型强毒株进行攻毒, 结果发现对气管的保护率达90%, 可以成为一种理想的新型重组活载体候选疫苗。Zeshan等 (2010) 利用Ad5为载体构建了一株表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白的重组腺病毒, 通过鸡胚内免疫后发现, 该重组毒能够诱导中和抗体和血凝抑制抗体, 并对强毒的攻击产生了很好的保护作用。

4 小结

IB血清型复杂, 相互间缺乏交叉免疫, 给疾病的预防造成困难。研制高效安全的IB疫苗, 减少该病带来的巨大经济损失, 成为广大科研工作者迫切需要解决的问题。随着分子生物学的不断发展, 人们逐渐对病毒的基因组结构及其主要免疫原基因的功能有了深入的了解, 开发IB基因工程疫苗, 以克服传统疫苗的不足之处, 已成为未来IB疫苗研制的方向。

传染性支气管炎病毒 篇2

【关键词】鸡；新城疫；传染性支气管炎；临床症状

1.新城疫

1.1流行情况

本病一年四季均可发生，但以春、秋季多发，这取决于不同季节不同的管理水平。如果鸡舍内通风不良，氨气浓度高，特别是鸡舍内温度控制不好，忽冷忽热，饲养密度过大，鸡群抵抗力下降，一旦有新城疫强毒株存在时就可引发本病流行。鸡新城疫在一个鸡群流行时，刚开始多数鸡处于潜伏期，以后的4~6天内，多表现急性死亡，病死率直线上升。随着鸡新城疫疫苗的广泛应用，高发病率、高死亡率的典型新城疫已不多见。目前生产中新城疫多表现为非典型性散发，临床症状与病变不典型，并多以混合感染形式发生。非典型新城疫多发于免疫鸡群的二免与三免间。病鸡群主要表现呼吸道症状和神经症状，呼吸困难、张口呼吸、甩头，与传染性支气管炎、慢性呼吸道病等症状很难区别。

1.2临床症状与病理变化

临床上有最急性、急性、慢性三种类型。最急性型多见于流行初期，常不见明显的临床症状就突然死亡。急性型病例，发病初期鸡体发热，精神沉郁，减料或不食，渴欲增加。随后出现咳嗽，甩头，呼吸困难，张口伸颈呼吸，怪叫。嗉囊胀满，提起病鸡倒，有酸臭液体从口中流出。下痢，排黄白色或绿色稀便，有时排出蛋清样粪便，并混有绿色。有的出现头颈震颤。慢性型表现为瘫痪，头颈向后或一侧歪斜，软颈，多伴有下痢，排黄白色、绿色稀便。典型鸡新城疫的主要病理变化为全身败血症样变化，以呼吸道和消化道最明显。腺胃乳头、小肠前段出血，尤其在十二指肠和浆膜处出血明显；盲肠扁桃体肿大、出血，岛屿状坏死隆起于粘膜表面。鼻腔、喉粘膜充血，内部充满污浊的粘液，偶有出血。

1.3防控措施

1.3.1做好消毒

養殖场大门口、鸡舍门口要设置消毒池，宽度和门口相等，前后长度起码要和车轮一圈的周长相等。先在消毒池里放置一些稻草或草苫子，再倒入2%~3%的氢氧化钠（小苏打）或5%的来苏儿。消毒液的注入量应以浸过草为宜，每天更换一次。鸡舍要严格消毒并按规定空舍2周后再上鸡，上鸡后坚持每天消毒一次，但在免疫前、中、后至少1天内不可带鸡消毒。

1.3.2制订科学的免疫程序

一般疫区，可在7日龄用新城疫Ⅳ系+H120点眼、滴鼻，每只1羽份；2~23日龄用新城疫Ⅳ系或克隆30三倍量饮水；本病流行严重的地区，33日龄再免疫一次，用克隆30或Ⅳ系4倍量饮水。流行地区建议8~9日龄用Lasota系苗点眼，同时注射新城疫油苗，24~25日龄用Lasota系苗3倍量饮水，36~38日龄用克隆-30疫苗4~5倍量饮水。免疫操作要规范，点眼、滴鼻要确保疫苗吸入后再放鸡；疫苗现兑现用，不能受热，半小时内用完；用疫苗的前后各1天内不用抗病毒药、清热解毒的中药，疫苗前后3小时内不用抗生素、电解多维、维生素C。

1.3.3早发现、早确诊、早治疗

对疑似新城疫病鸡群，鸡场应封锁隔离，彻底清洁消毒。对30日龄内的肉鸡，用鸡新城疫Ⅳ系苗5~10倍量肌注，勤换针头；多数鸡发病时，肌注高免蛋黄液（同时加入抗菌药物），注射抗病毒药物，或用干扰素，有时有效。管理中，要注意提高鸡舍温度3~5℃，并在饮水中加入多种维生素和电解质。

2.传染性支气管炎

传染性支气管炎病毒主要存在于病鸡呼吸道和肺中，也可在肾、法氏囊内大量增殖，在肝、脾及血液中也能发现病毒，主要通过空气(飞沫)经呼吸道传播，也可通过污染的饲料、饮水和器具等间接地经消化道传播。传播迅速，一旦感染，可很快传播全群。一年四季均可发病，寒冷季节多发。

2.1临床症状

主要有呼吸型、肾型、混合型三种类型。临床上以肾型传支多见，且危害最大。

（1）肾型传支主要经空气传播，一旦感染传播非常迅速。发病日龄主要集中在20-40日龄左右的肉鸡，但也有早期3日龄感染的个别病例，这除了与鸡舍环境的严重污染外，极有可能与种鸡感染传支病毒有关，因种蛋消毒不彻底病毒通过蛋壳而感染早期鸡雏。发病前，多受过冷应激。管理水平不同的鸡群，尤其是温度差异较大或昼夜温差较大的鸡群，死亡率差别明显，往往鸡舍温度高且昼夜温差小的鸡群死亡率较低。当然，通风、密度、饲料营养状况等因素也影响着鸡群的发病和死亡率。病鸡精神沉郁，常聚集在热源处。羽毛蓬松，缩颈垂翅。剖检可见机体严重脱水，皮肤与肌肉不易分离。发病鸡群呈双相性临床症状，即初期有2~4天的轻微呼吸道症状，随后呼吸道症状消失，出现表面上的“康复”，一周左右进入肾病变阶段，出现零星死亡，剖检可见肾脏肿大苍白，输尿管变粗，内有大量白色尿酸盐。病鸡拉白色米汤样稀粪，鸡爪干瘪。损伤生殖系统，引起输卵管的永久性退化，鸡群开产后发育、生长不均匀，出现闭产鸡，剖检输卵管严重萎缩。病理变化表现为气管、支气管、鼻腔和鼻窦粘膜充血，内充有浆液性、卡他性或干酪样渗出物。气管和鼻道有浆性或干酪样渗出物，粘膜水肿，雏鸡常见黄白色分泌物在支气管中堵塞。肾型传支病鸡还可见肾脏肿大、褪色，输尿管扩张变粗，内有尿酸盐沉积呈点状或网眼状白色外观，肾脏色泽苍白、肿胀如花肾样又称花斑肾。

（2）呼吸型传支主要通过呼吸道传播，各日龄鸡均易感染。发病日龄多在5周以下，全群几乎同时发病。雏鸡发病初期主要表现为流鼻液、流泪、咳嗽、打喷嚏、呼吸困难、常伸颈张口喘气。发病轻时白天难以听到，夜间安静时，可以听到伴随呼吸发出的喘鸣声。剖检时可见气管内有粘液或干酪样渗出物，气囊浑浊、变厚。

（3）混合型传支在6周龄以上鸡群均易发生。病鸡呼吸困难、打喷嚏、精神沉郁、闭眼、腹泻。鸡冠、肉髯发红、肿胀，有时可见咳嗽和呼吸啰音。剖检可见气管粘膜水肿，肾脏程度不一的肿胀、尿酸盐沉积、卵泡、输卵管充血、出血。

2.2预防措施

早期应用疫苗是预防该病的根本措施。在没有母源抗体或母源抗体水平很低的雏鸡群，防疫宜在5日龄以内进行。目前使用的疫苗为弱毒疫苗，使用最广泛的是鸡胚致弱的H120株和H52株；H120毒力弱，适用于1~3周龄雏鸡；H52毒力稍强，一般用于4~15周龄的青年鸡，免疫方法可采用滴鼻、饮水或气雾免疫，免疫期3个月。也可用新支二联苗(新城疫和传染性支气管炎)滴鼻、饮水。一般情况下，如果一个鸡场、一个饲养小区没有传染性法氏囊炎发病史，第一次传染性法氏囊炎免疫尽量使用法氏囊炎的弱毒苗，如果在冬春寒冷季节，还可以考虑去掉法氏囊炎在24日龄的二免(仅供参考)，以减少疫苗间的干扰及对肾脏的毒性。对肾传支多发的地区，可以在鸡20日龄左右，再加强一次肾传支的免疫，免疫的疫苗应含有肾型传支的疫苗株，如Ma5、28/86等，最好使用多价，至少应与第一次免疫所使用的疫苗毒株有所区别，以尽量扩大疫苗的保护范围。种鸡开产后，应每3个月加强一次肾型传支油苗的防疫，以使雏鸡有较高的母源抗体，抵御早期环境病毒的侵袭。

2.3治疗

发病后应避免一切应激因素，保持鸡群安静；提高舍温2~3℃，加强通风换气，夜间应适当亮灯，让病鸡适当活动饮水；避开任何伤肾药物的使用，如磺胺类药物、氨基糖苷类药物等；降低饲料中蛋白质水平，在全价饲料中加入20%~30%的玉米糁，并添加适量鱼肝油。有条件的鸡场多补充玉米和青菜；每天1~2次带鸡消毒。鸡群发生肾传支后，一是要考虑使用传支多价疫苗3倍量饮水。二是可使用利尿消肿和析解排泄肾脏输卵管尿酸盐的药物通肾，最好是刺激作用小的中药制剂，以减少死亡。且不可胡乱用药，更不可一味依赖抗病毒药物，耽误病情的同时，会增加肾脏的负担。

鸡传染性支气管炎病毒研究进展 篇3

1 IBV的病原

IBV有囊膜, 直径90~200nm, 属于单股正链RNA病毒, 大小约27kb, 主要编码3种结构蛋白, 纤突蛋白 (S蛋白) 、膜蛋白 (M蛋白) 和核衣壳蛋白 (N蛋白) ;IBV不同的血清型, 对不同组织的亲嗜性有所差异;IBV在不同地区有较多变异株, 所以要通过分子生物学手段, 鉴别不同毒株之间的差异, 来进行预防及诊断。

2 IBV的诊断

2.1 血清学诊断技术

IBV的血清学诊断技术有血凝及血凝抑制试验、琼脂扩散试验、免疫组化试验、免疫荧光试验和酶联免疫吸附反应 (ELISA) 等常规检测技术。血凝及血凝抑制试验 (HA/HI) 方法相对简单, 且判定容易, 但由于IBV无血凝性, 需经磷脂酶或者胰酶处理后, 才能使鸡红细胞凝集, 且滴定过程中测定的效价不规律, 与抗体保护力的对应性不高。琼脂扩散试验操作简单, 便捷, 对试验条件需求低, 但其对抗体检测的敏感性较低。免疫组化和免疫荧光对环境和试验条件要求较高, 且检测时间较长, 不常用于诊断;但是其特异性高, 并且定位准确, 常用于深入研究工作中。除以上几种方法外, 检测IBV的方法还有很多, 但由于各有缺点, 未被广泛应用。

目前最有效的血清学检测方法就是酶联免疫吸附试验 (ELISA) , ELISA检测方法有很高的特异性和敏感性, 并且操作简便, 判定容易, 对试验条件要求较低, 在临床诊断、生产和科研当中被广泛应用。ELISA检测方法众多, 包括间接ELISA、夹心ELISA、竞争ELISA和Dot-ELISA等, 这些ELISA方法的原理都是通过抗原的抗体的特异性反应来达到检测的目的。目前, 最常用的就是间接ELISA方法, 其主要通过重组IBV当中较为保守的蛋白, 来检测出对应的特异性抗体。许多公司都先后生产出相应的商品化试剂盒, 大量投入使用, 并且能够通过蛋白标签、结构蛋白和非结构蛋白的区分, 来鉴别疫苗产生的保护抗体还是野毒产生的感染抗体。夹心ELISA是应用双抗体检测抗原的方法, 竞争ELISA和Dot-ELISA即斑点ELISA既可以检测抗原也可以检测抗体, 目前常用的液相阻断ELISA试剂盒就属于竞争ELISA, 这些ELISA方法各有优点, 特异性好, 敏感性强, 非特异性因素消除完全, 为血清学诊断提供了新的检测依据。

2.2 分子生物学诊断技术

IBV的分子生物学诊断技术有反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 、核酸探针杂交技术、限制性内切酶片段长度多态性 (RFLP) 、环介导等温扩增 (LAMP) 等检测技术。核酸探针和RFLP检测技术较复杂, 且成本较高, 所以未被广泛应用。LAMP是一个新型的诊断技术, 由日本学者Notomi在2000年公开的一种新的基因诊断技术。LAMP检测技术特异性好、操作简便、且对检测设备要求低, 可以采取现场诊断。目前IBV检测最为广泛的分子生物学诊断技术就是RT-PCR诊断技术, 相对于血清学诊断, 在基因水平上的PCR检测技术更为敏感、快速和高检出率。RT-PCR, 主要是反转录病毒RNA, 生成c DNA, 通过特异性引物扩增, 得到大量的目的片段, 最后进行电泳观察目的条带的方法;随着技术的不断进步, 现在已有商品化的实时定量PCR (Real time-PCR) 试剂盒, 这种检测方法和RT-PCR相比, 更为灵敏和准确, 其原理和RT-PCR大致相同, 但Real time-PCR中, 加入了荧光信号, 伴随目的片段的不断产生, 结合在目的片段上的荧光基团和抑制荧光基团被剪切开, 荧光信号就会不断增强, 与此同时Real time-PCR仪就会搜集这些荧光, 从而检测和分析出目的片段的具体含量, 也可比较不同样品的病毒含量, 做到实时和定量。

随着这些诊断技术的不断更新和发展, 未来对IBV的检测将更为快速和准确, 为我们的养鸡业提供更科学更有效的诊断依据。

3 IBV的预防

IBV的疫苗主要有灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗。灭活疫苗免疫后, 产生抗体较慢, 需要多次免疫, 但是其抗体持续时间较长。弱毒疫苗对于机体的刺激, 和抗体的产生效果比较好, 但是有潜在的危险性。基因工程疫苗是利用分子生物学技术, 表达IBV的结构蛋白, 来刺激机体产生免疫保护, 虽然安全性比较好, 但和实际应用还有差距。核酸疫苗是疫苗研究的热点, 无论是细胞免疫, 还是体液免疫, 都表现出良好的效果;但有很多实验表明, 核酸疫苗刺激机体产生免疫应答的时间相对较长, 并且需要进行多次免疫, 而且核酸疫苗在机体的表达情况也不稳定;所以核酸疫苗虽然前景可观, 但仍处于研究阶段, 希望在未来能够有所突破。

综上所述, IBV的变异频繁, 血清型众多, 给IBV的预防带来了很大的难度, 而且没有特别有效的治疗方法, 所以对我们的养殖业有较大的危害。目前比较有效的预防方法, 还是采取综合防治措施, 加强饲养, 改善环境, 经常消毒等方法, 来减少IBV的危害。随着对IBV病原学的不断深入了解, 和科学技术的不断进步, 一定会有更为快速有效的诊断预防方法。

摘要：鸡传染性支气管炎病毒 (Infectious bronchitis virus, IBV) , 属于冠状病毒科、冠状病毒属。能够引发鸡的高度接触性和急性传染病, 鸡传染性支气管炎 (Infectious bronchitis, IB) 。综述鸡传染性支气管炎病原、诊断技术、目前免疫接种疫苗的种类和优缺点。

传染性支气管炎病毒 篇4

1 S蛋白的基因组结构

冠状病毒的S糖蛋白包括四个区域:在合成过程中裂解的信号区域、病毒粒子外的胞外区域、负责在脂质双分子层中固定S蛋白的跨膜区域以及胞质尾区域。鸡传染性支气管炎病毒的S蛋白 (1162个氨基酸) 由m RNA 5’端独特区编码产生, 由2~3个基团非共价连接成聚合物, 是构成冠状病毒最表层纤突的主要成分。S蛋白大部分位于囊膜外, 只有C端一小段疏水区埋入囊膜中。

S蛋白 (180k Da) 在宿主细胞内翻译后可裂解为等摩尔比的N端的S1 (90k Da, 520~538个氨基酸组成) 和C端的S2 (84k Da, 625个氨基酸组成) 两个亚单位。裂解后的S1与S2之间由二硫键连接, S1在纤突远端形成一个泡状结构, S2通过C端一个小的疏水跨膜片段嵌入病毒囊膜中, 形成纤突蛋白的柄, 将S1锚定在囊膜表面, 对所有的IBV毒株来说, S2的N端第一个氨基酸均为Ser。S2亚基与S1亚基非共价结合并包含了C末端跨膜的胞质尾区。S1亚基包含了S蛋白的活性结合受体。S2亚基的胞外功能域包含一个融合肽类区域和两个与S蛋白寡聚化有关的重复区域。这个短链的重复区与跨膜区邻近, 由一个亮氨酸拉链结构组成。Jackwood等对美国、欧洲和澳大利亚等国家的55株IBV毒株研究发现, IBV S蛋白裂解识别位点的一般序列为: (N) -Arg-Arg-Ser/Phe-Arg-Arg- (C) (RRS/FRR) , 裂解位点紧靠第2对Arg。但对中国某些IBV分离株的S1基因测序结果发现, 裂解位点发生了一定的变异, 其氨基酸序列以His-Arg-Arg-Arg-Arg (HRRRR) 为代表。

2 S蛋白的主要功能

S蛋白可以在内质网中形成寡聚体, 通过与膜蛋白的非共价互作植入病毒粒子膜。在病毒粒子合成以后, S糖蛋白与靶细胞受体结合并与细胞膜融合。S蛋白的生物学功能主要包括:

(1) S蛋白与宿主细胞膜上的糖蛋白受体的结合是IBV吸附细胞的前提条件, 而且只有当S蛋白被宿主细胞的蛋白酶切割为S1和S2两个亚单位时, 病毒囊膜才能与宿主细胞的细胞膜发生融合, 通过细胞间的融合传播病毒。据报道, 适宜的离子浓度和接近于中性的p H值可以诱导融合的发生。

(2) S1基因是IBV产生感染性、致病性的主要蛋白基因。Cavanagh.D等 (2001) 将IBV用尿素处理去除Sl亚单位后, 病毒虽能吸附至细胞上, 但失去感染性。

(3) S1蛋白能诱导抗致病性攻毒的保护作用。

(4) S1蛋白能诱导机体产生病毒中和抗体、血凝抑制抗体、交叉反应ELISA抗体及细胞介导的免疫应答。有人在研究S1和S2时发现, 用尿素处理IBV的S蛋白时, 若S1脱去, IBV不能诱导机体产生病毒中和抗体和血凝抑制抗体。

(5) S1蛋白是决定IBV血清型特异性抗原决定簇的主要蛋白, 在决定IBV的组织嗜性及其毒力方面具有一定作用。Ignjatovic等的研究发现各血清型毒株之间的差异主要是由S1基因变异造成的。Casais (2003) 利用反向遗传学技术, 用IBV M41-CK的S基因取代IBV Beau-R, 构建成嵌合病毒株Beau R-M41, 该嵌合病毒具有与S基因供体病毒M41-CK相同的组织嗜性, 与Beau-R组织嗜性则不同, 表明S基因是决定IBV不同组织嗜性的主要基因。

(6) S2蛋白除具有将S1蛋白锚定在病毒囊膜上的作用外, 还具有诱导产生交叉反应ELISA抗体和细胞介导的免疫应答, 并且在大多数IBV毒株中较保守, 可以用ELISA检测到, 据报道S2蛋白诱发产生交叉反应抗体的抗原决定簇具有免疫优势, 因此S2也可作为IBV疫苗, 并推测S2蛋白上有一可产生中和作用的抗原位点。

3 S蛋白的变异机制

有人认为S蛋白的基因突变是随机发生的, 病毒基因组上任何位置随时都可出现突变, 因此对IBV的克隆来说, 均存在一些具有突变潜质的病毒粒子, 并且IBV较其它RNA病毒更为明显。IBV RNA基因组因具有独特的先导引物转录机制, 因此有很高的错配率。这种高的错配率往往导致不同的病毒基因型共同存在于同一宿主体内, 而且每个病毒对宿主环境都有不同水平的适应。病毒复制过程的氨基酸突变率大致在10-3~10-5范围内。IBV基因组大约有3万个核苷酸, 使得不同毒株基因组的每一轮复制都有可能诱发一个至数个碱基发生突变。所以感染了IBV后, 动物在体内会产生许多变异株。

3.1基因突变

S1蛋白基因位于S基因的N端, C端为编码625个氨基酸的S2蛋白。大量的研究认为, S蛋白的抗原变异部位主要在S1基因。Kuster等发现, S1氨基酸同源性低于95%。Cavanagh等 (2001) 比较了英国的3个血清型的4个毒株与3个分离株的S1基因后发现, 7个病毒之间氨基酸的差别为2%~3%, 但是大部分S1氨基酸差别位于37~140bp和269~365bp处。Wang等 (2002) 在比较英、美、日、荷兰55年来20个毒株基因序列, 就基因重组进行深入研究发现, 不同型欧洲株之间的碱基差异遍布于整个S1基因, 说明了抗原差异来源于点突变的积累, S1的点突变仍可能在新的血清型发生上有重要的作用。

3.2基因重组

这种遗传信息的改变可能是冠状病毒在自然界中生存的一个重要机制。实际上, 在血清型截然不同的Ark型和M41型之间发生重组而产生的变异株已在1个M41免疫鸡群中发现。Kuster通过基因序列比较发现, 日本分离株KB8523是由M41型和D1466型重组而来。Wang (2002) 用Ark99型和M41型作为母本同时感染鸡胚、鸡胚肾细胞和鸡, 从中分离到了重组病毒, 并用RT-PCR方法和序列分析对重组病毒进一步加以证实。基因重组发生位点通常在起始密码子开始的前131bp处。IBV的变异往往不是以某一种形式发生, 常常是基因型变异和血清型变异交替发生, 或是同时存在。由于其病毒结构和基因组的特点, 在疾病传播的同时常伴随着病毒基因的变异和野生IBV株与IBV疫苗株之间的基因重组。

重组可以发生在不同野毒株同时感染一个动物体, 也可以发生在接种的活毒疫苗株与野毒株之间。IBV为适应环境免疫压力产生的基因重组, 以及发生基因插入、缺失和点突变均可造成IBV变异株的产生, 且一旦这种变异株在环境中能够长期存在, 就将成为决定IBV变异趋势的因素之一。

4血清学研究

由于在世界范围内缺乏标准化分类系统, 使得毒株的分类很杂。标准化分类系统往往建议一个毒株只能属于一个型, 但是, IBV基因组是一条高度变异的单链RNA, 其基因可由于点突变和重组而发生变异, 故传染性支气管炎病毒的血清型较多, 已达30余种之多, 而且新的变异株还不断出现。通过对S1基因分析, 可将病毒株分为5个不同类群:荷兰型、美国型、欧洲型、Mass型和澳大利亚型。已知的以侵害呼吸道为主的血清型有Corm、lowa97、JMK、Florida、Arkansas99等和以侵害肾脏为主的M41、Hotle、Gray、Australia等血清型。

1956年以前, IBV被认为只有一个血清型, 此后由美国首次分离出了许多不同于原始Mass型的Conn株病毒。Hoppins用嗜斑减数试验, 将16种IBV分离株分为8种血清型。Johnson等 (2003) 用血清中和试验, 将IBV分为10种血清型。Gavanagh (2001) 对60年代美国分离到的12株IBV作分析, 其中有3株与Mass血清型极为相似, Gough等首先报道英国存在一种新的特殊IBV血清型79/B, 而来自西班牙、德国、希腊和墨西哥可疑患鸡的血清样本中, 亦可发现抗此血清型IBV的抗体存在。Ignjtovic等对于1967~1994年从澳大利亚分离到的36株病毒株与H株参考株, 经检测共分为30余种不同的血清型。故世界各国IBV毒株的差异很大, 并且有着众多的变异株存在。我国IBV流行株因地区的不同也有差异, 但主要以Mass、T、Holt、Gray株为流行株, 并有大量变异株存在。由于血清型的多样性及新变型的出现, 目前常规疫苗H120, H52, Mass等单一毒株疫苗, 经常有免疫失败的报道。一般认为要有效控IB, 须确定本地区IBV的血清型, 选择保护率高的疫苗。

5防治

自IB被发现以来, IB的病型已由单纯的呼吸型增加为肾型、腺胃型、肠型、产蛋异常型及新报道的胸肌病变型, IBV的血清型也在不断增加, 新的致病性的IBV在不断出现, 基因重组是IBV基因变异的原因之一, 不同血清型间缺乏交叉保护或保护性极差, 使免疫预防复杂化以及费用增加, 也是IB不能得到有效控制的原因之一。目前的研究表明, IBV的变异在分子水平上主要在于该病毒组成的独特的转录合成机制及其造成的S1基因的点突变、插入、缺失和基因重组, 同时还与自然选择、多株免疫、高密度饲养形成的压力筛选及宿主免疫状况有关。

传染性支气管炎病毒 篇5

1 材料和方法

1.1 材料

IBV BD株, 从河北地区某疑似感染鸡传染性支气管炎病毒的鸡场分离;IBV M41标准毒株, 购自中国兽药监察所。SPF种蛋, 购自哈尔滨兽医研究所。氯仿, 天津市福晨化学试剂厂生产;异丙醇, 天津市永大化学试剂开发中心生产;Trizol总RNA提取试剂、M-MLV 5×Reaction Buffer、M-MLV Reverse Transcriptase (200 U/μL) 、EB, 北京天根生物公司生产;dNTP Mixture (10 mmol/L) 、RNase inhibitor (400 U/μL) 、10× EX Taq Buffer、EX Taq (5 U/μL) 、DL-2 000 Marker, 宝生物工程 (大连) 有限公司生产。

1.2 IBV BD株的分离、鉴定

1.2.1 病料的采集与处理

将采集的病死鸡和濒死鸡病变明显的肾脏与气管分别在灭菌的乳钵内剪碎, 加入Hank’s液充分研磨成匀浆, 接种肉汤及营养琼脂检菌, 3 000 r/min离心30 min;取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后, 加入青霉素、链霉素各1 000 IU/mL, 4 ℃作用12 h, 备用。

1.2.2 病毒的增殖与培养

将上步获得的接种材料常规接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔, 每胚0.2 mL, 置于37 ℃的电热恒温培养箱中孵育48～72 h;每天照蛋检查鸡胚活性, 弃去24 h内的死亡胚, 60 h后收集鸡胚于4 ℃冷藏24 h;收获尿囊液加入双抗, 12 000 r/min离心5 min;弃沉淀, 将上清液再次接种于9～11日龄的SPF鸡胚, 如此盲传至第9代, 至病毒稳定。

1.3 IBV RT-PCR检测方法的建立

1.3.1 IBV BD株RNA的提取

(1) 取IBV BD株第9代尿囊液进行冻融, 1 2000 r/min离心10 min; (2) 取0.2 mL上清液加1 mL Trizol, 室温放置5 min; (3) 加0.2 mL氯仿, 剧烈振荡15 s, 室温放置3 min; (4) 4 ℃、10 000 r/min离心15 min; (5) 吸上清液0.5 mL加入异丙醇0.5 mL, 颠倒数次混匀, 室温作用20 min; (6) 4 ℃、10 000 r/min离心10 min; (7) 弃上清液后, 加入75%乙醇1 mL, 悬浮沉淀; (8) 4 ℃、5 000 r/min离心3 min; (9) 倒出液体, 剩余少量液体短暂离心, 然后用枪头吸出 (不要吸出沉淀) ; (10) 室温放置晾干2～3 min, 加入9 μL无Rnase水反复吹打, 混匀, 充分溶解RNA。

M41标准毒株和对照鸡胚尿囊液按以上程序抽提RNA。

1.3.2 引物的设计与合成

根据GenBank中的30株IBV的M基因序列, 利用软件Primer Premier 5.0按其保守片段设计1对引物, 可扩增长约405 bp的核酸序列。 引物由宝生物工程 (大连) 有限公司合成。引物序列为上游引物 5′-GGGCCCGTAACATTCCAGTA-3′, 下游引物 5′-ATCCGCTTTGGTCACCAG-3′。

1.3.3 RT-PCR扩增

基因cDNA链的合成 (20 μL反应体系) 步骤:取下游引物 (20 μmol/L) 2 μL、RNA模板9 μL、10 mmol/L dNTP混合物 (中性pH值) 2 μL, 70 ℃加热5 min;迅速在冰上冷却2 min;简短离心后收集反应液, 加入5×First-Strand Buffer 4 μL、 0.1 mol/L DTT 1 μL、Rnasin (40 mol/μL) 1 μL, 轻轻混匀反应液, 42 ℃温浴2 min;加入TiANSCript M-MLV 1 μL (200 U) 并轻轻用移液器混匀, 42 ℃温浴50 min;95 ℃加热5 min终止反应, 置冰上进行后续试验或冷冻保存。

M基因PCR反应体系 (25 μL) :Template 1 μL, 上、下游引物各1 μL, 2×Master Mix 12.5 μL, 用ddH2O补至25 μL。

RT-PCR 反应程序:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min , 共30个循环, 72 ℃ 5 min;4 ℃保存。

1.3.4 琼脂糖凝胶电泳

用0.8%琼脂糖凝胶成像系统观察电泳图。将电泳图出现的目的条带的PCR产物送北京北三博远志生物技术有限责任公司进行纯化并测序。

1.3.5 IBV BD株M基因的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列分析

利用DNAStar 5.0分析软件对分离株M基因扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登陆的其他IBV毒株M基因核苷酸序列进行同源性比较分析。

1.3.6 RT-PCR 敏感性试验

将收取的IBV尿囊液离心后, 取上清液作连续10倍稀释, 用Trizol法提取病毒RNA进行RT- PCR扩增, 观察结果。

1.3.7 RT-PCR 临床检测

取临床送检已确诊为鸡传染性支气管炎的肾脏12份, 按1∶1加入Hank’s液反复冻融, 3 000 r/min离心, 取上清液, 用Trizol法提取病毒RNA进行RT-PCR扩增, 观察结果。

2 结果与分析

2.1 IBV BD株的分离鉴定

接种BD株病毒后, 鸡胚呈现一系列变化, 传至第4代接种BD株和M41标准株的鸡胚, 60 h后胚体均出现典型的病变:鸡胚停止生长, 蜷缩呈球形, 羊膜水肿、增厚并紧贴胚体, 尿囊液增量, 卵黄囊皱缩, 剖开胚体, 肾脏肿大并有白色尿酸盐沉积, 肝脏也有不同程度的坏死, 接种后第6～7天可出现侏儒胚。第1代接毒鸡胚于接毒后第5天死亡率为40%, 剩余鸡胚最晚于接毒后第9天死亡。随着代次的增加死亡率升高, 死亡时间缩短, 传至第9代到接毒3～4 d死亡率可达90%。

2.2 IBV RT-PCR 检测方法的建立

2.2.1 BD株M基因RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

PCR产物经过0.8%琼脂糖电泳, 得到了大小为400 bp的扩增片段, 与预期IBV M目的基因相同, M41标准毒株也扩增出同样大小的条带, 而对照鸡胚尿囊液则未扩增到 (见图1) 。

1.阴性对照;2.M41标准株;3.BD株;4.DL-2 000 Marker。

2.2.2 BD株M基因RT-PCR产物的序列测定

将BD株M基因扩增片段的核苷酸序列与GenBank上发表的IBV其他毒株进行序列对比, 得知BD株与近100株IBV毒株的同源性为96%～100% 。其中BD株同M41标准株、Australia-T株和IB地方分离毒BJ2株、B01株、YL2株M基因核苷酸的同源性为100%;同地方分离毒WG株、FF2株、IBV-p65株、IBV-EP3株、W118株M基因核苷酸的同源性为99%;同Holland 52株、H120株、SAIB4株、SAIBWJ株和IB地方分离毒GX2-98株、HaN2-95株、SD1-97株M基因核苷酸的同源性为97%。由以上结果可以确定此次所研究的BD株分离毒为IBV。

2.2.3 RT-PCR 敏感性的测定

将IBV尿囊液上清液作连续10倍稀释, 共作1×10-1～1×10-6 6个稀释度, 用同样的方法提取每个稀释度样品的RNA , 分别以各稀释度样品的反转录产物为模板, 以P1、P2为引物, 用1%琼脂糖凝胶电泳, 可见6条按稀释度由粗到细、由明到暗呈梯度分布的电泳条带, 每条带大小均为400 bp左右。

2.2.4 RT-PCR 临床检测

取临床疑似为IB患鸡的9份病料, 经RNA提取和PCR扩增, 结果可见8份病料均扩增出了400 bp左右的电泳条带, 只有1份病料为阴性 (见图2) 。

1～9.临床疑似为IBV的病料;10.DL-2 000 Marker。

3 讨论

(1) 研究将IBV M蛋白作为研究对象, 利用现有的计算机软件对已知的30株不同的IBV M基因序列进行了同源性分析, 确定出扩增的靶序列, 并以此段序列为模板设计了1对可扩增405 bp的引物。这对引物长度较适中, 符合PCR引物设计要求, 从而建立了利用反转录-聚合酶链式反应检测IBV的方法。试验结果表明, 该法具有良好的特异性, 检测与鸡病毒性疾病相关的病毒如IBDV、NDV等均为阴性结果, 没有出现交叉反应;检测临床疑似的IBV病料, 阳性检出率为88.9%。此方法与常规病毒分离法相比具有简便、快速、准确率高的优点。IBV血清型众多, 主要是由于S基因的变异造成的, 所以S基因具有型特异性。如果下一步对BD株病毒进行分型, 就需要针对S1基因的特异性设计1对特异性引物, 便可比较精确地鉴定出BD株分离病毒的血清型。

试验通过分子生物学方法抽提病毒RNA, 经RT-PCR成功扩增到目的基因, 经测序将其结果与GenBank中收录的IBV M基因序列进行Blast比对分析, 结果表明扩增到的目的基因与预期的目的基因序列相符合, 因此试验成功扩增到了IBV M基因部分片段, 说明试验所分离的BD株病毒是IBV。通过对扩增出的M基因片段与GenBank上其他IB毒株 M基因核苷酸序列进行同源性比较, 可以发现BD株M基因片段与近100株IBV M基因核苷酸序列的同源性可达95%以上, 说明M基因序列相当保守, 这与王晶钰等[1]的研究结果也很一致。

(2) 抽提RNA病毒核酸时应注意的问题。对IBV基因组进行RT-PCR扩增, 有两点需要特别注意:一是所提核酸的纯度与完整性;二是引物的设计。不同毒株不同基因对病毒基因组RNA的纯度与完整性要求不同, 由于IBV基因组的固有特点, 在病毒裂解后再纯化RNA, 很难获得高纯度的完整基因组RNA。因此, 解决这个问题只有尽可能地纯化病毒, 在病毒裂解、RNA暴露步骤以后, 要尽量减少操作步骤与操作时间, 降低RNA的断裂与降解机会。试验中每次进一步纯化病毒之前进行一次RT-PCR, 这样可能会节约许多纯化步骤。

RNA的提取是此次试验的关键, RNA的纯度对于RT-PCR的扩增有很大的影响, 防止RNA酶感染又是成功扩增的关键。在病毒RNA的提取和cDNA的合成过程中, 最关键的问题是防止RNase对RNA 的降解作用。由于RNase无处不在, 而且耐高温, 在试验中所用器皿和用水均经0.1%DECP处理, 所有操作尽可能在冰上进行并使用一次性无菌手套, 尽量防止细菌污染, 因为手和细菌是RNA酶最主要的潜在污染源[2]。枪头、离心管必须经过DEPC处理, 且试剂以新购买的为最佳。提取RNA的过程中必须严格操作, 操作者必须戴一次性手套, 最好在超净工作台上进行。在RNA的提取过程中动作一定要轻柔, 以防止RNA断裂, 并且动作要快, 操作要简单。提取的RNA最好马上进行反转录, 否则要马上放入-80 ℃冰箱中保存, 以免造成RNA降解。试验采用商品化的Trizol提取试剂从尿囊液中提取RNA, 在样品裂解过程中, Trizol可保持RNA的完整性, 同时裂解细胞、溶解细胞内容物, 提取时间较短, 可在短时间内处理大量的样品, 且提取的总RNA没有DNA和蛋白质的污染。

参考文献

[1]王晶钰, 罗艳, 邓小敏, 等.鸡肾型IBV分离株M基因的克隆与特性分析[J].中国预防兽医学报, 2007, 29 (8) :591-595.

传染性支气管炎病毒 篇6

目前针对IBV的检测方法主要有病原分离、RT-PCR、IBV Real-time PCR检测方法、基因芯片检测方法等, 以上方法虽然也可达到检测结果准备、敏感、特异高的特点, 但是操作过程复杂且需要较为昂贵的仪器, 不适合在基层推广使用。针对上述方法的缺陷, 本试验旨在建立一种快速、简便、经济实用的IBV检测方法。

RT-LAMP检测方法是近年来的一种新的快速检测技术, 该方法操作简单, 无需要昂贵的仪器设备, 本试验初步建立了IBV RT-LAMP检测方法, 为临床快速检测IBV的感染奠定基础。

1 材料和方法

1.1 毒株

传染性支气管炎疫苗毒株 (H120) 、鸡新城疫疫苗 (Lasota系) 、鸡传染性法氏囊疫苗毒株 (B87株) 、禽流感 (H5N1 re-4毒株) 均采购于相关疫苗公司;传染性喉气管炎病毒 (ILTV) 来源于哈尔滨兽医研究所相关实验室。

1.2 试剂

U-LAMP通用型DNA快速扩增试剂盒和Smart Green染料为北京美来博公司产品;TRIzol试剂为Invitrogen公司产品。

1.3 引物的设计

参照Gen Bank中IBV的基因保守序列, 同时参考文献设计LAMP引物, 其中包括2条外引物F3/B3和2条内引物FIP/BIP, 引物由上海生工公司合成, 引物序列, 见表1。

1.4 RT-LAMP反应体系的优化

分别对RT-LAMP反应体系中引物浓度、镁离子浓度、引物比例、酶含以及反应温度和反应时间等进行优化, 多次重复试验以确定最佳反应条件。同时向扩增产物中直接加入Smart Green染料1μL, 混匀后将反应管置于凝胶成像仪中观察荧光结果。

1.5 特异性试验

分别提取传染性支气管炎毒株 (IBV) 、鸡新城疫病毒 (ND) 、鸡传染性法氏囊病毒 (IBDV) 、禽流感病毒 (AIV) 、传染性喉气管炎病毒 (ILTV) 的基因, 以提取的上述RNA或DNA作为模板模板进行RT-LAMP反应。

1.6 敏感性试验

将鸡传染性支气管炎病毒分别稀释10-1~10-8八个梯度, 提取核酸之后, 分别用荧光RT-PCR方法和优化后的RT-LAMP诊断方法进行检测, 并比较两种方法的检测结果。

2 结果与分析

2.1 IBVRT-LAMP反应体系的确立

确定反应体系为:10μL 2×U-LAMP Mix, 2μL 25m M Mg Cl2, 2μL模板RNA, 2μL引物混合物 (1.6μM FIP, 1.6μM BIP, 0.2μM F3, 0.2μM B3) , 1.5μL Bst DNA聚合酶, 1μL AMV酶, 加水补至20μL。将反应体系混匀, 置于63℃水浴锅中作用1h, 80℃10min灭活Bst DNA聚合酶。该体系下的反应产物于2%琼脂糖凝胶上电泳可见LAMP反应的清晰的阶梯状条带, 且加入Smart Green染料后, 反应产物在紫外灯下显现荧光, 而阴性对照无荧光反应。

2.2 特异性试验

以本试验建立的RT-LAMP反应体系扩增IBV、IBDV、AIV、ILTV的基因, 结果均为阴性, 而对IBV的扩增结果表现为阳性 (见图1) 。

注:1~7泳道分别为DNA2000 Marker;IBV;IBDV;ND;ILTV;AIV;阴性对照

2.3 敏感性试验

本试验所建立的RT-LAMP方法对IBV的RNA最小检测限为10-6, 而普通RT-PCR方法对IBV的RNA的最小检测限为10-4 (见图2、3) , 表明RT-LAMP方法的敏感性是普通RT-PCR方法的100倍。

注:1~6泳道分别为DNA2000Marker;10-4;10-5;10-6;10-7;阴性

注:1~8泳道分别为DNA2000 Marker;原倍;10-1;10-2;10-3;10-4;10-5;阴性

2.4 结果可视化效果实验

将反应后的产物加入1μL Smart Green I, 混匀后, 在紫外光下观察结果。加入Smart Green I染料后, 阳性产物在紫外灯下显现绿色的荧光, 而阴性对照则无荧光反应。如图所示: (见图4)

注:1~5管分别为IBV;ND;IBD;AIV;阴性对照

3 讨论

基于LAMP诊断技术建立的诊断方法其反转录和核酸扩增过程均可以在恒温水浴锅中就可以完成, 不需要特殊的仪器设备, 检测结果应用荧光染料实现肉眼可视化, 并且反应具备灵敏特异、简单快速的优势, 因此该技术非常适用于基层兽医实验室的日常监测和突发疫病的快速诊断。

传染性支气管炎病毒 篇7

IBV属于冠状病毒科,病毒基因组为单股RNA, 易发生基因突变,导致病毒血清型众多、致病性复杂[6],目前IBV仍在不断变异,不时出现新的基因型并引起抗原性变异[7,8,9,10]。在临床上,IB与新城疫、禽流感、传染性喉气管炎等疾病的症状相似,这给疾病的诊断造成了困难。目前,检测IBV的方法有血清学、分子生物学等方法[11,12,13],但这些方法在特异性、 敏感性和时效性等方面都有缺陷。近年发展起来的Real - time RT - PCR技术具有快速、灵敏、特异、定量等优点。本研究旨在建立快速检测IBV的Real time RT - PCR技术,现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1毒株

IBV H120系、新城疫病毒 ( NDV) La Sola系、禽流感病毒( AIV) 、传染性喉气管炎病毒( ILTV) 、马立克病毒( MDV) 和传染性法氏囊病毒( IBDV) ,均由广西区动物疫病预防控制中心保存。

1.2主要试剂和仪器

一步法荧光定量RT - PCR试剂盒、胶回收试剂盒、DNA/RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、p MD18 - T载体,均购自Ta KaRa公司; DH5α 感受态细胞,购自Tiangen公司; 荧光定量PCR仪( 型号为ABI Step One Plus) ,ABI公司生产。

1.3引物与TaqMan探针的设计与合成

根据Gen Bank收录的IBV基因序列保守区域, 设计1对特异性引物及相应的Taq Mam探针。引物序列: 上游引物5' - AGCAGCAATCTATTCATC - 3', 下游引物5' - CCAAGAACTTGAATGATTC - 3',扩增片段长度 为77 bp。 探针序列: JOE - TCTCAGAACTCGTGGCAGCA - BHQ1,探针的5' 端以荧光报告基团JOE标记,3'端以荧光淬灭基团BHQ1标记。 引物和探针均由宝生物工程( 大连) 有限公司合成。

1.4病毒RNA的提取与cDNA合成

参照DNA/RNA提取试剂盒说明书提取鸡胚尿囊液中的总RNA,按照DNA/RNA提取试剂盒说明书用下游引物进行反转录来合成病毒c DNA。

1.5阳性标准模板的制备

对获得的c DNA进行PCR扩增,PCR反应体系: 上、下游引物各0. 2 μmol/L,5 × PCR Buffer 10 μL, Ta KaRa Ex Taq HS 0. 5 μL,c DNA 10 μL,用dd H2O补至50 μL。PCR反应条件: 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,共30个循环; 72 ℃ 7 min。 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收目的DNA片段,将目的片段与p MD18 - T载体于16 ℃ 连接过夜,转化DH5α 感受态细胞,经质粒PCR鉴定为阳性后命名为IBV - P,用核酸蛋白分析仪测定阳性质粒浓度,并换算成拷贝数。

1.6Real-timeRT-PCR方法的建立

1. 6. 1Real - time RT - PCR反应体系与反应条件的优化参考一步法荧光定量RT - PCR试剂盒推荐的反应体系和条件,在相同浓度模板和反应体系中, 采用矩阵法确定引物和探针的最佳浓度。在以上参数优化的基础上,进行荧光定量RT - PCR循环参数的优化,整个优化过程综合考虑Ct值、荧光强度、重复性等,确定反应条件。

1. 6. 2标准曲线的建立对阳性质粒标准品进行10倍梯度稀释,取浓度为3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝/μL的阳性质粒标准品作为模板,根据优化后的体系和条件进行Real - time RT - PCR反应,建立标准曲线,并得出反应的扩增效率和曲线的相关系数。

1. 6. 3敏感性试验取浓度为3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝/μL的阳性质粒标准品作为模板,根据优化后的体系和条件进行Real - time RT - PCR反应,同时以常规RT - PCR反应作为参比方法,检测其灵敏度。

1. 6. 4特异性试验分别取IBV、NDV、MDV、IBDV、AIV、ILTV的等量样 品提取病 毒RNA ( 或DNA) ,采用所建立的Real - time RT - PCR方法进行检测。

1. 6. 5重复性试验取5个10倍梯度稀释的阳性质粒标准品,按照所建立的Real - time RT - PCR方法分别进行批内、批间检测的可重复性试验。批内检测时,每个浓度设3个重复; 批间检测时,进行3次独立检测,每次间隔10 d,计算Ct值的平均值和变异系数( CV) 。

1.7临床样品的检测

对广西区动物疫病预防控制中心收集、保存的185份历年鸡肺脏、气管、脾脏等组织进行检测。将每份样品分成2份,提取病毒核酸,其中一份进行Real - time RT - PCR检测,另一份进行常规RT -PCR检测,以评价其临床实用性。

2结果与分析

2.1阳性质粒浓度的计算

经测定阳性质粒的OD260/ OD280= 1. 81,则质粒浓度为0. 094 μg/μL,其拷贝数为3. 1 ×108拷贝/μL。

2.2Real-timeRT-PCR方法的建立

2. 2. 1Real - time RT - PCR反应体系与反应条件的建立经优化确定了最终反应体系与反应条件。 反应体系: ( 总体积为20 μL) : 2 × One Step RT - PCR Buffer Ⅲ 10 μL,Ta KaRa Ex Taq HS 0. 4 μL,Prime-Script RT Enzyme Mix Ⅱ 0. 4 μL,Rox Reference Dye Ⅱ( 50 × ) 0. 4 μL,上游引物、下游引物、探针各0. 8 μL,模板RNA 3 μL,加双蒸水补至20 μL。反应条件: 42 ℃ 反转录5 min; 92 ℃ 预变性10 s; 92 ℃ 3 s,54 ℃ 收集荧光30 s,共40个循环。

2. 2. 2Real - time RT - PCR标准曲线的建立通过Real - time RT - PCR反应得到检测IBV的标准曲线,见图1。阳性质粒标准品具有良好的线性关系, 相关系数( R2) = 0. 997,扩增效率( E) = 1. 142。

2. 2. 3敏感性试验结果经检测: Real - time RT -PCR反应的最低检出限为3. 1 × 101拷贝/μL,见图2; 常规RT - PCR反应的检 测极限为3. 1 × 103拷贝/μL,见图3。Real - time RT - PCR与常规RT -PCR相比,敏感性高100倍。

2. 2. 4特异性试验结果经测定,仅IBV出现扩增曲线,而NDV、ILTV、IBDV、MDV、AIV和空白对照均未出现扩增曲线,说明针对IBV设计的检测引物和探针特异性好。

2. 2. 5重复性试验结果见表1。

由表1可知,批内检测变异系数为0. 38% ~0. 76% ,批间检测变异系数为0. 86% ~ 1. 35% ,均小于2. 00% ,说明所建立的Real - time RT - PCR方法具有良好的可重复性。

1 ~ 7. 3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝 /μL; 8. 阴性对照。

M. DL - 500 bp Marker; 1 ~ 7. 3. 1 × 101~ 3. 1 × 107拷贝 /μL。

2.3临床样品的检测结果

利用建立的Real - time RT - PCR方法,对广西区动物疫病预防控制中心收集、保存的185份病料核酸进行检测,结果显示,检出IBV 2份,阳性率为1. 08% ,检测结果与常规RT - PCR结果一致。

3讨论

本研究建立的检测IBV的Real - time RT - PCR方法特异性好,只从IBV阳性病料中检测到特异性的扩增信号,不与检测的其他常见家禽传染病病毒发生特异性反应。试验所建立的标 准曲线的R2= 0. 997,E = 1. 142,说明核酸拷贝数的对数值与Ct值之间有极显著的线性关系,优化的体系和条件很好地满足了试验要求。重复性试验得出组内和组间变异系数为0. 38% ~ 1. 35% ,说明此方法具有很好的准确性和重复性,可以稳定地用于IBV核酸的定量检测。试验建立的曲线可检测到3. 1 × 101拷贝/μL的初始模板量,检测敏感 性比常规RT - PCR提高100倍。检测量大,一次可以检测96份样品,整个反应都在密闭系统内进行,避免了样品间的污染。检测速度快,从样品处理( 包括RNA的提取、PCR等) 到试验结束,大约需要4 h,比其他血清学检测方法节省时间,准确性高。Taq Man探针只与特异性模板发生反应,假阳性率低,与SYBR GreenⅠ相比,不需要考虑引物二聚体和其他非特异性扩增[4]。

4结论

鸡传染性支气管炎 篇8

是由冠状病毒属传染性支气管炎病毒引起的急性高度接触传染性的呼吸道病, 鸡是本病的唯一自然宿主。

2 症状

病初看不到症状, 突然出现呼吸系统病状, 迅速波及全群为本病的特征。雏病鸡表现为伸颈、张口呼吸、咳嗽、有特殊的呼吸声响, 尤以夜间听得更清楚。严重时, 精神萎靡, 食欲废绝, 羽毛松乱, 翅膀下垂, 昏睡、怕冷, 常挤在一起。流出粘性鼻液, 流泪、消瘦。两月龄以上或成年鸡主要呼吸困难、咳嗽、喷嚏, 气管有罗音。产蛋鸡的产蛋量下降25%~50%。同时产软壳蛋, 畸形蛋或粗壳蛋, 蛋白稀薄如水, 蛋白和蛋黄分离等。有的病毒株还侵害肾脏, 引起肾炎、肠炎, 可见急剧下痢症状。

3 病变

大支气管周围小面积的肺炎;气管内卡他或浆液性或干酪样的渗出物;有时可见到肺尖部有出血斑;产蛋鸡卵黄液化, 成熟卵泡充血、出血, 输卵管萎缩。肾变病型的常见肾高度肿大、苍白, 眼观呈花斑状, 肾小管和输尿管内充塞大量白色的尿酸盐, 呈内脏型痛风, 并可见有肠炎的病变。

4 防治

4.1 疫苗

3~5日龄雏鸡H120疫苗滴鼻或加倍剂量饮水免疫;免疫后到1~2月龄时, 须用H52疫苗加强免疫。使用方法见说明书。

4.2 治疗