培养及鉴定

培养及鉴定（精选9篇）

培养及鉴定 篇1

动物转基因技术是在20世纪80年代初发展起来的。在改良畜禽生产性状、提高畜禽抗病力以及利用转基因畜禽生产非常规畜牧产品(如人药用蛋白和工业用酶)等方面显示了广阔的应用前景[1]。转基因动物制作的方法主要有显微注射法、逆转录病毒法、精子载体法、胚胎干细胞法和原生殖细胞法等[2]。但目前转基因体细胞核移植技术以其产生的转基因后代遗传背景及遗传稳定性一致,不需选配就可建立转基因群体的优势而被广泛采纳[2]。

不同细胞类型转基因供核体细胞的克隆动物相继产生,充分表明不同分化类型的体细胞在卵母细胞胞质的作用下均有完全重建而重新发育成新个体的潜能。但如何简便、快速、高效地制备丰富的转基因核供体细胞是成功获得转基因动物的关键技术之一[3]。目前,由于胎儿成纤维细胞具有取材方便、生长快、分化程度相对较低、体外传代次数相对较高、转基因效率高等特点成为用于生产转基因克隆动物的首选体细胞系。由胎儿成纤维细胞提供核供体相继产生了转基因克隆绵羊[4]、山羊[5]、牛[6]以及基因定点修饰的绵羊[7]和猪[8]。

研究通过组织块贴壁培养的方法分离培养草原红牛胎儿成纤维细胞,并设计性别特异性引物对其进行体外培养,以获得用于转基因克隆牛制作的核供体转基因细胞,为高效率、低成本制作转基因克隆牛奠定基础。

1 材料与方法

1.1 胎儿组织的获取与处理

草原红牛胎儿来自吉林省农业科学院畜牧科学分院草原红牛保种场。具体胎儿获取方法:将妊娠40 d母牛电击屠宰,迅速剖腹摘取怀孕子宫,为防止污染,将胎儿与子宫一同置于装有37 ℃生理盐水的保温瓶中带回实验室。用手术剪在PBS液中剥除胎膜,将分离的牛胎儿用含500 IU/mL 青霉素、500 mg/mL 链霉素的PBS 液冲洗3 遍后,移入无菌操作台处理。

1.2 组织块的贴壁培养

胎儿成纤维细胞的分离培养参照李扬的组织块贴壁法进行,并稍作改动。简要方法:首先用手术剪去除胎儿头、四肢、内脏,保留躯干,将胎儿躯干部用手术刀切成1～3 mm3的小块,用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液冲洗2遍,分别接种于含完全培养液的直径为35 mm细胞培养皿中,然后将培养液吸干,放入培养箱中培养5 h,使组织块充分贴壁,待贴壁完全后,小心加入完全培养液,置于38.5 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.3 成纤维细胞的纯化及传代培养

待细胞铺满培养瓶底后,采用胶原酶消化法将上皮细胞和成纤维细胞分开,具体做法:吸出瓶内的培养液,用无菌PBS液清洗2遍后加入0.5 mg/mL的胶原酶,使消化液浸没细胞,将培养瓶放在倒置显微镜下观察,发现成纤维细胞变圆、部分脱落时,立即加入2 mL含血清的培养基终止消化;用弯头吸管轻轻吹打成纤维细胞生长区域,再用少量培养基漂洗1次;然后将消化液吸出,转移至新的培养瓶中加入适量培养基继续培养,于38.5 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.4 细胞生长曲线的测定

将传至第3代的牛胎儿成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化,调整细胞浓度为5×104个/mL,接种于24孔细胞培养板中,每孔接种0.5 mL,置38.5 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养,每隔24 h消化收集细胞,用血细胞计数板计数3个孔的细胞数,每孔计数2次,取平均值,最后绘制生长曲线。在细胞接种及计数过程中用台盼蓝染色法去除死细胞干扰。

1.5 血液和细胞基因组的提取

选取雌雄各5头成年草原红牛,颈静脉采集血液样品,加ACD抗凝。草原红牛胚胎成纤维细胞及血液基因组的提取采用酚氯仿法提取(方法详见《分子克隆》第3版),用0.8%琼脂糖电泳检测基因完整性及纯度,-20 ℃冷冻保存。

1.6 牛性别特异性引物的设计与合成

选取牛性别特异性基因SRY(登录号为EU581861)及内参基因GAPDH(登录号为NC_007303),采用引物设计软件Oligo 6.0设计基因特异性引物。SRY基因引物序列为SRY U 5′-AAGTTTGCCTTATGGATT-3′,SRY D 5′-GAAGTAATATGCGGTGTA-3′;GAPDH基因引物序列为GAPDH U 5′-ATTCTGGCAAAGTGGACATCG-3′,GAPDH D 5′-ACATACTCAGCACCAGCATCAC-3′。 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.7 性别鉴定引物的特异性检验

以已知性别成年草原红牛外周血基因组为模板,采用基因组PCR方法对试验中设计的性别鉴定引物进行特异性检验。PCR 反应体系(25 μL):10×PCR Buffer 1.5 μL,上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL,Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1 μL,DNA 模板(50～100 ng/L)1 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,加ddH2O 至25 μL。反应条件:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性40 s,62 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共35个循环;72 ℃延伸10 min ;4 ℃保存。取产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测性别鉴定引物的特异性。试验中设置水空白对照以排除体系污染。

1.8 草原红牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定

在完成性别鉴定引物特异性的前提下,对本研究中分离培养的草原红牛胚胎成纤维细胞进行基因组PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测以确定其性别。具体基因组PCR反应程序参见1.7。

2 结果

2.1 草原红牛胎儿成纤维细胞的分离培养及生长特征

胎儿组织块经贴壁培养48 h后可见单细胞游离出来,呈辐射状向外贴壁生长。培养1周后贴壁细胞逐渐增多,多数围绕组织块周围生长。随着培养时间的推移,组织块周围可见大量成纤维细胞包绕,其间有上皮样细胞共生(见图1A)。9～10 d后成纤维细胞生长旺盛,成纤维细胞呈梭形或不规则三角形、放射状或漩涡状走行(见图1B)。培养2周左右,组织块移出的单层细胞汇合,细胞铺满瓶底,可进行消化传代。

2.2 草原红牛胎儿成纤维细胞的生长规律

胎儿成纤维细胞传至第3代时,以5.0×104个/mL的浓度接种24孔细胞培养板,细胞于7～8 d长满。于不同时间点测定细胞数并绘制生长曲线,见图2。

从图2可以看出,胎儿成纤维细胞生长曲线基本呈现S型,分别代表潜伏期、指数增生期和停滞期,0～4 d为潜伏期,5～9 d为指数增生期,培养至第10天进入生长停滞期。

2.3 性别鉴定引物的特异性检验结果

提取已知性别草原红牛血液基因组(雌雄各5头),利用所设计的牛性别鉴定SRY基因引物,以GAPDH基因特异性引物为对照,采用基因组PCR方法对性别鉴定SRY引物进行特异性检验,结果(见图3)发现:在完全没有进行PCR条件摸索的情况下,性别特异性SRY引物能够特异性地扩增出雄性草原红牛SRY基因片段(见图3 第1～5泳道),而以雌性草原红牛为模板则完全不能扩增出任何片段(见图3 第6～10泳道);内参基因GAPDH引物无论在雌性还是雄性草原红牛中均能很好地扩增出特异性片段。说明基因组质量良好,不影响引物的扩增。同时以水作为空白对照不存在任何扩增产物,说明扩增体系不存在污染现象。

1～5.雄性草原红牛血液基因组扩增产物; 6～10.雌性 草原红牛血液基因组扩增产物;11.水空白对照组。

2.4 草原红牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定结果

本研究在验证SRY性别鉴定引物特异性的基础上,对已分离的草原红牛胚胎成纤维细胞利用SRY引物采用基因组PCR方法进行性别鉴定,结果见图4。表明已分离培养的胚胎成纤维细胞为雄性。

3 讨论

1.100 bp DNA Ladder;2.草原红牛胚胎 成纤维细胞SRY基因PCR结果;3.雌性草原红牛SRY 基因PCR对照; 4.雄性草原红牛SRY基因PCR对照。

动物成纤维细胞分离培养主要采用两种方法,一种是组织块贴壁培养法;另一种是胰酶消化分离单细胞接种培养法。通常情况下,组织块贴壁培养法长出细胞比分离单细胞培养法需要较长的时间,但操作相对简单方便,目前多用此法培养动物成纤维细胞[9,10]。本研究同样采用此方法成功分离出草原红牛胚胎成纤维细胞。

在转基因克隆动物的研究过程中,成纤维细胞活力及纯度严重影响转基因细胞的制备及体细胞核移植操作,与转基因克隆动物的获得息息相关。尽管胚胎早期细胞的分化程度不高,但早期分离培养的胚胎成纤维细胞依然多为上皮细胞和成纤维细胞的混合物。上皮细胞由表皮生发层细胞分裂、增殖而来,是源于外胚层的细胞;成纤维样细胞是由真皮层细胞分裂、增殖而来,源于中胚层。两者具有完全不同的细胞特征及生长特性。在体外培养过程中,可以利用这些生长特性进行成纤维细胞的分离、纯化,常规方法是利用上皮细胞与成纤维细胞的贴壁能力及对胰酶消化反应时间差不同进行初步分离纯化[11],也可以针对上皮细胞及成纤维细胞的不同生长区域进行人为刮除。本研究采用细胞时间差酶消化法分离纯化胚胎成纤维细胞,经过反复几轮的分离纯化达到比较理想的效果。

SRY 基因位于Y 染色体上靠近常染色体区的35 kb的区域,为Y染色体所特有,具有高度的保守性和同源性[12],分子生物学性别鉴定方法多以检测SRY 基因为目标,尤其是胚胎性别鉴定的实质就是检测Y 染色体上的SRY 基因。目前,常用于性别鉴定的PCR方法有单重PCR法、常规多重PCR法、巢式PCR法、连续复合PCR法等[13,14]。事实上,由于胚胎处于发育早期,在不影响胚胎继续发育的情况下,胚胎可提供用于性别鉴定试验所需基因组的细胞少之又少;因此众多研究人员把研究重心放在如何优化和建立更高精确度、更特异性的PCR反应体系及全新检测手段上来[15,16],甚至在人医中已经建立以单细胞为模板进行诸如疫病筛选、HLA配型等方面的研究,并取得非常好的试验结果[17,18]。对于本试验来说,由于鉴定性别的并非为胚胎,而是相对细胞数量多得多的体外培养细胞,可随时提供用于提取基因组的细胞;因此不需要进行PCR条件的优化就可以得到很好的试验结果。本试验中,基因组PCR方法鉴定出所分离的胚胎成纤维细胞为雄性,由此可以进行重组转基因细胞的构建工作。本研究中所设计的性别鉴定SRY引物是否可以用于早期胚胎的性别鉴定还需要进行试验条件的摸索,以建立最佳的反应体系。

培养及鉴定 篇2

该同志思想成熟,入党动机纯洁,平时能起好模范带头作用；遵纪守法,认真学习党的理论,主动帮助他人,自律严格,有一定的群众基础,模范带头作用发挥明显,经考核培养,基本具备党员发展条件,提交党支部大会讨论通过。

XXXX同志能够努力学习党的章程，并努力按照党员的标准要求自己。认真学习党的理论，积极拥护党的路线、方针、政策。自觉树立共产主义世界观，在学习和工作实践中不断经受考验。在学习和工作中充分发挥自己的能力，在学习工作中充分发挥党员的先进模范积极作用。经考核培养,基本具备党员发展条件,提交党支部大会讨论通过。

经过长期的考察，XXXX同志有更大的进步。对党忠诚老实，言行一致，在工作和学习等各个方面均取得了很大的提高，用一名共产党员的标准严格要求自己，充分发挥先锋模范作用。经考核培养,基本具备党员发展条件,提交党支部大会讨论通过。

XXX同志在政治上积极要求进步，积极申请加入党组织，自愿接受党组织的教育。认真学习马克思列宁主义、毛泽东思想、邓小平理论和“三个代表”重要思想，拥护党的路线、方针、政策。经考核培养,基本具备党员发展条件,提交党支部大会讨论通过。

培养及鉴定 篇3

关键词：副猪嗜血杆菌,分离,鉴定,血清型

副猪嗜血杆菌病的病原菌为副猪嗜血杆菌 (Haemophilus parasuis, HPS) 。HPS可影响2～4月龄的青年猪, 主要感染4～8周龄的猪, 发病率一般为10%～15%, 病死率可高达50%。感染猪主要表现为浆液性-纤维蛋白性多发性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎[1,2]。研究从疑似副猪嗜血杆菌病病猪中分离到14株革兰阴性细小杆菌, 同时进行了血清型鉴定, 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病料

病猪的心脏、肺脏、心包液、关节液, 采自重庆市荣昌、永川、垫江和四川省宜宾、隆昌等地区10个猪场的疑似患有副猪嗜血杆菌病而死亡的猪。

1.2 菌种、主要培养基及试剂

金黄色葡萄球菌, 购自中国兽医药品监督所。普通营养琼脂培养基、纯化琼脂、伊红美蓝培养基、生化微量鉴定管, 购自杭州微生物试剂有限公司;营养肉汤、胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) , 购自北京奥博星生物技术有限公司;麦康凯琼脂培养基, 购自上海市医学化验所试剂厂;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) , 购自AMRESCO公司;琼脂粉, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 细菌的分离培养、纯化、染色及镜检

无菌取疑似副猪嗜血杆菌病猪的心血、肺脏、心包液、关节液接种于含0.025%NAD的鲜血平板, 在37 ℃条件下培养24～48 h, 观察菌落形态。挑取针尖大小、无色、透明、露珠样菌落继续分离培养, 取疑似副猪嗜血杆菌进行革兰染色, 在显微镜下观察菌体大小、形态特征及染色结果。

1.4 细菌的培养特性观察

挑取纯培养后的疑似菌株分别接种于普通营养琼脂平板、巧克力琼脂平板、鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板中, 37 ℃培养24～48 h, 观察细菌生长情况。

1.5 卫星试验及V因子依赖性试验

将纯培养疑似菌株接种普通营养琼脂平板, 垂直划线接种金黄色葡萄球菌, 同时以不接种金黄色葡萄球菌的平板作为对照, 37 ℃培养24～48 h后观察细菌生长情况。将纯培养疑似菌株分别接种于含0.025% NAD 的鲜血平板和不含NAD的鲜血平板, 置于37 ℃培养24～48 h, 观察细菌生长情况。

1.6 分离菌分型抗原的制备及血清型鉴定

用PBS (pH值为7.2) 洗下在TSA平皿中培养24 h的菌苔, 再用PBS洗涤2次, 7 000 r/min 离心2 min;弃上清液, 调整OD600值约等于1, 121 ℃高压蒸气处理2 h;10 000 r/min离心5 min;取上清液作为用于琼脂扩散试验的分型血清 (又称热稳定抗原) , 备用。

参考P.Keilstein和V.J.Rapp-Gabrielson[3]建立的方法, 用华中农业大学动物科学院惠赠的15种标准分型血清对分离到的菌株进行血清型鉴定:用含8.5% NaCl的PBS (pH值为7.2) 配制1%琼脂培养基, 加0.1%NaN3, 厚度为3～5 mm;用打孔器打孔, 孔径为3 mm、孔间距为4 mm, 热熔封底;中间孔加各菌株热稳定抗原, 周边孔加各分型血清, 加满为止;同时设健康兔血为阴性对照;放湿盒中置于37 ℃作用24 h后观察结果, 连续观察3 d。抗原抗体之间出现清晰白色沉淀线为阳性反应, 反之为阴性反应。

2 结果

2.1 菌落及镜检形态

分离菌接种含NAD的鲜血平板36 h后, 可观察到露珠状、无色、透明小菌落, 菌落直径为0.5～1 mm。经革兰染色后, 疑似菌株为革兰阴性短小杆菌, 偶见球杆状和长丝状, 呈散在分布。

2.2 培养特性观察结果

疑似菌株在普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板上均不生长, 在巧克力琼脂平板和鲜血琼脂平板上生长的菌落呈针尖大小、露珠状、无色透明、不溶血的细小菌落, 在含NAD鲜血平板上生长较好。

2.3 卫星试验及V因子依赖试验结果

越靠近金黄色葡萄球菌的菌落生长越好, 菌落大、数量多, 离得越远的菌落越小且数量少, 直至不生长。在含NAD的鲜血平板上疑似副猪嗜血杆菌生长良好, 而不含NAD的鲜血平板无菌落出现, 表明该疑似菌株生长依赖NAD。

2.4 生化鉴定结果

分离到的14株疑似菌株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖;蛋白胨、吲哚、山梨醇、氧化酶、尿素酶、甘露醇反应均为阴性;对乳糖、棉籽糖、硝酸盐、触酶、H2S生化反应表现不稳定。

2.5 血清型鉴定结果

结果表明:血清4型5株, 占35.71%;血清5型3株, 占21.43%;血清12型2株, 占14.28%;血清13型4株, 占28.57%。

3 讨论

试验从重庆市荣昌、永川、垫江和四川省宜宾、隆昌地区10个猪场分离到了14株革兰阴性小杆菌, 经鉴定均为副猪嗜血杆菌, 表明副猪嗜血杆菌在采样的10个猪场呈一定的流行性。副猪嗜血杆菌血清型复杂多样, 基于热稳定性可溶性抗原琼脂扩散血清分型方法 (Kieletein-Rapp-Gabriedson, KRG) 至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型[3], 但仍有15%～41%的分离株无法确定血清型[4]。通过对从野外病例中分离到的流行株的血清型鉴定, 发现在日本、美国、西班牙、德国、丹麦和澳大利亚以4, 5, 13型最为常见, 在中国流行的菌株血清型同为4, 5, 13型[5]。本研究对分离到的副猪嗜血杆菌进行了血清型鉴定, 结果显示14株分离菌中血清4型5株, 血清5型3株, 血清12型2株, 血清13型4株, 与国内外的流行规律相似。

参考文献

[1]AMANO H, SHIBATA, KAJIO N, et al.Pathologic observations ofpigs intranasally inoculated with serovar 4 and 5 of Haemophilus pa-rasuis using immmunoperoxidase method[J].J Vet Med Sci, 1994, 56 (4) :639-644.

[2] WIEGAND M, KIELSTIN P, POHIE D, et al.Examinationof primary SPF swine after experimental infeetion with Haemophilus parameters and in the paraeters of cerebrospinal fluid[J].Tierarztl Prax, 1997, 25 (3) :226-232.

[3]KEILSTEIN P, RAPP-GABRIELSON V J.Designation of 15 sero-vars of Haemophilus parasuis on the basisi of immunodiffusion usingheat-stable antigen extracts[J].J Clin Microbiol, 1992, 30 (4) :862-865.

[4]OLIVEIRA S, PIJOAN C.Haemophilus parasuis:new trends on diag-nosis, epidemiology and control[J].Vet Microbiol, 2004, 99:1-12.

培养及鉴定 篇4

新生猪骨骼肌卫星细胞的培养鉴定及生物学特性

采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法获取新生猪骨骼肌卫星细胞,并进行体外原代和传代培养.观察细胞各个阶段的形态,通过生长曲线等手段研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用RT-PCR以及免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定.结果显示两步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取.在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基下,细胞分化良好,可融合成肌管.本研究探讨了猪骨骼肌卫星细胞体外培养、鉴定的`方法及其生物学特性,为建立猪骨骼肌卫星细胞系打下了一定的基础.

作 者：何波 郑嵘 熊远著 胡春艳 HE Bo ZHENG Rong XIONG Yuan-zhu HU Chun-yan 作者单位：华中农业大学,农业部猪遗传育种重点实验室,武汉,430070刊 名：畜牧兽医学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA VETERINARIA ET ZOOTECHNICA SINICA年，卷(期)：37(6)分类号：S828.2关键词：猪 骨骼肌卫星细胞 培养 鉴定 两步消化

培养及鉴定 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

成年Wistar大鼠, 雄性, 体重 (200±50) g, 购于兰州大学实验动物中心, 动物合格证号:SCXK (甘) 2013-0002。

1.1.2 主要试剂

DMEM/F12培养基及0.25%胰蛋白酶 (购自Gibco公司) 。胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 购自Hyclone公司。B27添加剂购自Invitrogen公司。表皮生长因子 (EGF) 、碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF) 购自Peprotech公司, 小鼠抗Nestin抗体、兔抗GFAP抗体、小鼠抗Galc抗体购自Chemicon公司, 小鼠抗MAP2抗体、兔抗β-tubulinⅢ抗体购自Abcam公司, 兔抗CD133抗体购自Santa Cruz公司。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠Ig G、Alexa Fluor 594标记羊抗兔Ig G和Alexa Fluor 488山羊抗兔Ig G购自Molecular Probes公司。DAPI封片剂购自Vector Laboratories公司。

1.2 方法

1.2.1 Wistar大鼠骨髓基质细胞的分离、培养和鉴定

将所选大鼠无菌条件下取双侧股骨和肱骨, 取5 m L无菌注射器, 用10 m L DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔, 用吸管将骨髓组织悬液反复吹打均匀, 1000 r/min, 离心5 min后, 以含10%FBS的DMEM/F12含血清培养基重悬, 接种于25 cm2培养瓶, 37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。骨髓细胞通过直接贴壁法培养, 根据大鼠骨髓基质细胞贴壁生长的特征, 采用差异贴壁法, 定期更换掉不贴壁的细胞, 得到贴壁生长的骨髓基质干细胞, 48 h后更换培养基, 培养条件同前, 去除未贴壁细胞, 并以PBS缓冲液轻轻冲洗2遍。以后每隔72小时换液1次, 待原代细胞达到90%融合后, 用0.25%胰酶消化进行传代, 通过传代培养进行纯化及扩增。。

1.2.2 Wistar大鼠骨髓源性神经球的诱导培养及鉴定

大鼠骨髓源性神经干细胞的培养方法采用无血清悬浮培养法, 选择第四代在含血清培养基中培养呈对数生长期的贴壁骨髓基质细胞, 用0.25%胰酶消化, 吸管反复吹打制成单细胞悬液, 以含20 ng/m L b FGF、20 ng/m L EGF及使用浓度为1∶50的B27添加剂的DMEM/F12培养基重悬, 调整活细胞密度为2×105/m L, 接种于25 cm2培养瓶中, 置37℃, 5%CO2、饱和湿度培养箱中培养, 约2~3 d换半液1次, 并添加半量b FGF、EGF、B27等生长因子。

1.2.3 Wistar大鼠骨髓源性神经球的CD133和Nestin检测

(1) 选取在无血清培养基中呈悬浮生长的状态良好的大鼠骨髓源神经球, 去除培养基, 0.01 mol/L PBS冲洗3次, 用4%多聚甲醛固定30 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次; (2) 0.3%Triton X-100破膜, 室温10 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次; (3) 10%正常山羊血清封闭60 min; (4) 滴加一抗:兔抗CD133 (1∶200) 和小鼠抗Nestin (1∶100) 置湿盒中4℃孵育过夜, 去除一抗, 0.01 mol/L PBS冲洗3次; (5) 滴加二抗:Alexa Fluor 594标记羊抗兔Ig G (1∶200) 和Alexa Fluor 488标记羊抗小鼠Ig G (1∶200) , 37℃孵育1 h, 去除二抗后, 0.01 mol/L PBS冲洗3次; (6) 用含DAPI的封片剂 (H-1200, Vector Laboratories) 对细胞核进行复染, 并封片, 荧光显微镜下观察。 (7) 同时设阴性对照实验, 以抗体稀释液代替一抗, 结果镜下不显色, 为阴性结果。

1.2.4 Wistar大鼠骨髓源性神经球的分化

Wistar大鼠骨髓基质细胞在无血清培养条件下, 呈球状聚集生长, 选择生长状态良好的大鼠骨髓源神经球, 经0.01%胰酶消化制成单细胞悬液或直接将神经球用PBS液清洗, 按2×105个活细胞/m L的密度, 接种于含血清培养基 (DMEM/F12+10%FBS) , 置37℃, 5%CO2、饱和湿度恒温培养箱培养。分化7 d后, 行免疫细胞荧光检测, 具体操作步骤如下: (1) 去除培养基, 0.01 mol/L PBS冲洗2次, 用4%多聚甲醛固定30 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次, 5 min/次; (2) 10%正常山羊血清封闭60 min; (3) 滴加一抗:小鼠抗GFAP (1∶500) , 小鼠抗MAP-2 (1∶100) , 小鼠抗β-tubulinⅢ (1∶100) , 小鼠抗Galc (1∶100) 置湿盒中4℃孵育过夜, 去除一抗, 0.01 mol/L PBS冲洗3次; (4) 滴加二抗:Alexa Fluor 488标记羊抗小鼠Ig G (1∶200) 、Alexa Fluor 488山羊抗兔Ig G (1∶200) , 37℃孵育1 h, 去除二抗后, 0.01 mol/L PBS冲洗3次; (5) 用含DAPI的封片剂 (H-1200, Vector Laboratories) 对细胞核进行复染, 并封片, 荧光显微镜下观察。 (6) 同时设阴性对照实验, 以抗体稀释液代替一抗, 结果镜下不显色, 为阴性结果。

2 结果

2.1 Wistar大鼠骨髓基质细胞的形态学观察

通过倒置相差光学显微镜观察发现, 至第三代时骨髓基质细胞形态较为均一, 已经得到纯化, 细胞形态以长梭形为主, 体积较小、大小基本一致, 增殖速度较快, 经多次传代其细胞形态、大小及增殖方式不会发生改变 (图1) 。

注:细胞呈贴壁生长, 梭形, 交织成网, 放大倍数:×200

2.2 大鼠骨髓源性神经球的诱导培养、鉴定及CD133和Nestin检测结果

DMEM/F12培养基中, 大部分细胞呈悬浮生长, 形成细胞球, 细胞球由几个到几十个细胞组成, 大部分细胞球呈圆形, 随着培养时间的延长, 球体内细胞数量增多, 球体增大, 但球体内细胞增殖速度较慢, 约7~9 d传代1次。经免疫组织化学检测, 所形成的细胞球呈CD133和Nesitn阳性 (图2) 。

注:大鼠骨髓源神经干细胞呈Nestin (绿色、图2A) 、CD133 (红色、图2B) 阳性, 细胞核以DAPI复染 (蓝色、图2C) , 荧光显微镜, 标尺为50μm

2.3 大鼠骨髓源神经干细胞的分化

将大鼠骨髓源神经干细胞去除生长因子, 并转入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养后, 其生长方式再次发生改变, 不再呈悬浮生长, 而是再次转为贴壁生长, 单细胞及神经球很快发生贴壁, 贴壁后细胞不再呈圆形, 而是伸出突起, 呈梭形、多角形及不规则形等, 且其增殖速度较在无血清培养基中为快。分化7 d后, 行免疫荧光细胞化学检测, 可表达星形胶质细胞表面标志物GFAP、神经元标志物MAP-2和β-tubulinⅢ, 少突胶质细胞表面标志物Galc。其中大部分细胞均呈GFAP阳性, 少部分细胞呈MAP-2、β-tubulinⅢ及Galc阳性 (图3) 。

注:大部分细胞均呈GFAP阳性 (图3A) , 少部分细胞呈MAP-2 (图3B) 、Galc (图3C) 及β-tubulinⅢ阳性 (图3D) , 荧光显微镜放大倍数:×200

3 讨论

神经干细胞 (neural stem cells, NSCs) 是指分布于神经系统的, 具有无限增殖、自我更新及多向分化潜能的细胞[1], 最早由Reynolds等[4]分离得到并提出这一概念, 以后的研究发现在中枢神经系统的多个部位存在神经干细胞, 如脑室、脑室下区、中脑导水管周围等[1,5], 它具备无限增殖、自我更新及多向分化潜能, 其增殖方式包括对称分裂和不对称分裂两种分裂方式, 通过对称分裂进行自我更新与增殖, 产生两个子代神经干细胞;而通过不对称分裂产生一个神经干细胞, 另一个为相对成熟的已分化细胞, 通过不对称的分裂方式产生神经组织的各类细胞, 如神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。神经干细胞不仅存在于动物胚胎时期发育的脑组织中, 在成年动物脑中也存在。神经干细胞的主要功能是作为一种后备储备, 它在一定条件下可以进行增殖、迁移和分化并参与神经系统损伤修复或细胞正常死亡的更新[6,7]。但是成体中枢神经损伤后其自我再生能力有限, 远远不能完成神经功能的再生修复的功能, 特别是大面积受损的中枢神经组织, 仅靠自身的神经干细胞修复是无法实现的。因此, 采用外源性干细胞移植治疗中枢神经系统损伤成为目前治疗的主要策略之一[8,9,10,11]。

目前干细胞移植修复中枢神经系统损伤的细胞包括胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓基质细胞、脂肪源神经干细胞、骨髓源神经干细胞等[12,13]。其中, 胚胎干细胞及中枢来源的神经干细胞虽在理论上有较高的评价, 但用于异体移植时有较大的免疫排斥反应, 并且存在伦理上的限制, 故其不适宜用于临床。脑源性神经干细胞直接从中枢神经组织取材, 其来源受限, 扩增培养困难;胚胎干细胞来源于发育早期阶段的胚胎, 能分化成全身的所有组织细胞, 是全能干细胞, 但是由于伦理的限制和具有诱发同种异体免疫以及有致瘤性的可能性, 目前尚无法临床推广应用。相比而言, 骨髓基质细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 作为移植修复治疗用细胞则具显著优势[12]。

骨髓基质细胞是一种增殖能力较强的、存在于骨髓非造血组织中的多能干细胞, 它来源丰富, 取材简单, 培养增殖容易, 并且自体移植没有伦理争议和免疫排斥的问题。在中枢神经系统损伤的细胞移植治疗研究中, 骨髓基质细胞已成为较理想的种子细胞来源之一[14]。目前分离纯化骨髓基质细胞的方法主要有以下四种:全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、荧光激活细胞分选 (fluorescence-activated cell sorting, FACS) 和磁珠分离法 (magnetic-activated cell sorting, MACS) [15]。由于目前尚无BMSCs的特异性表面标志物, FACS及MACS方法的应用十分局限。袁斌等[16]研究发现, 采用密度梯度离心法分离出的BMSCs增殖速度显著慢于全骨髓贴壁培养法。在本实验的预实验中, 采用梯度离心法进行细胞, 亦发现骨髓细胞的增殖显著慢于全骨髓贴壁法, 且采用梯度离心法分离出的骨髓细胞在培养过程中其形态不规则, 细胞内易出现空泡, 分析原因, 可能系梯度离心分离液对骨髓细胞的生物学活性有一定的抑制作用, 故在本实验中, 采用了全骨髓贴壁培养法。实验发现, 若接种后24 h进行换液, 部分骨髓基质细胞贴壁不牢, 经换液时细胞量损失较大;若延期至72 h进行换液, 培养基内营养成分减少, 细胞培养基的酸度增大, 细胞的活性会受到一定程度的抑制, 因此, 本实验采用首次接种后48 h换液, 换液时轻轻晃动培养瓶, 并采用PBS缓冲液将未贴壁的杂细胞去除, 然后多次传代处理, 骨髓基质细胞形态逐渐变得均一, 细胞形态以长梭形为主, 体积较小、大小一致、增殖速度较快, 经多次传代其细胞形态及增殖方式不会发生改变。

近年来研究表明, 骨髓基质细胞于体外通过诱导分化可获得骨髓源性神经干细胞[2]。无限增殖和自我更新能力是神经干细胞的主要特征之一。本实验发现, 将Wistar大鼠骨髓基质细胞转入含b FGF、EGF的无血清培养基中后, 其生长方式发生改变, 呈悬浮或半悬浮状态, 呈球状聚集生长, 从生长速度来看, 其增殖速度相对较慢, 呈现未分化的幼稚状态。CD133和Nestin为目前公认的神经干细胞特异性标志物, 通过免疫荧光检测, 发现呈球状聚集生长的细胞球呈CD133和Nestin阳性。多向分化潜能是神经干细胞的另一主要特征, 其可分化为中枢神经系统内神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等细胞。在本实验中, 将Wistar大鼠骨髓源细胞球转入含血清培养基中后, 其生长方式再次发生改变, 不再呈悬浮生长, 而是再次转为贴壁生长, 单细胞及神经球很快发生贴壁, 贴壁后细胞不再呈圆形, 而是伸出突起, 呈梭形、多角形及不规则形等。分化7 d后, 行免疫荧光细胞化学检测, 大部分细胞表达星形胶质细胞表面标志物GFAP, 表达星形质细胞表面标志物GFAP、神经元标志物MAP-2和β-tubulinⅢ, 少突胶质细胞表面标志物Galc。由此可见, 成年Wistar大鼠骨髓源神经细胞球具多向分化能力, 具备类似神经干细胞的多向分化能力, 可分化为星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞样细胞。

综上所述, 采用含b FGF和EGF的无血清培养法, 可成功将成年Wistar大鼠骨髓基质细胞诱导为骨髓源神经干细胞, 这为大鼠骨髓源神经干细胞的进一步研究提供了实验基础。

摘要：目的:对Wistar大鼠骨髓源神经干细胞进行分离、培养和鉴定, 观察其生长方式和分化特征。方法:运用无血清培养基对Wistar大鼠骨髓基质细胞进行培养, 对分离获得的悬浮生长的神经球采用免疫组织化学法检测CD133和Nestin表达情况。用血清诱导其分化, 分化7 d后, 采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulinⅢ、Galc的表达情况。结果:大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中, 呈悬浮状态生长, 形成细胞球, 经免疫荧光检测, 细胞球呈CD133和Nestin阳性。将细胞球转入含血清培养基后, 转为贴壁生长, 经免疫荧光检测大部分已分化细胞呈GFAP阳性, 少部分细胞呈MAP-2、β-tubulinⅢ及Galc阳性。结论:采用含bFGF、EGF的无血清培养基可培养出呈球状聚集生长、具多向分化潜能的大鼠骨髓源神经干细胞。

培养及鉴定 篇6

关键词：小鼠,成骨细胞,分化,ALP,钙化结节

成骨细胞(osteoblast,OB)主要由骨髓基质内的间充质干细胞在体内各种调控因素的调节下分化而来[1]。原代小鼠前体成骨细胞的体外分离培养是建立稳定细胞系的基础,是在细胞水平研究骨代谢和各种骨胳疾病分子机理的前题。自1964年PECK首次在体外分离培养小鼠前体成骨细胞以来,该项技术在不断发展和完善,目前人们已经成功地从禽类、啮齿类、哺乳类及人类等多种物种中分离培养了前体成骨细胞[2,3]。原代细胞分离方法主要有酶消化法和组织块法。由于组织块法分离的细胞数量有限,目前多用酶消化法。本研究优化消化酶,改进操作步骤,使原代前体成骨细胞的分离更简单,分离获得的细胞纯度更高、活性更强,为原代成骨细胞的体外分离培养提供更高效的方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

出生72 h以内的小鼠,来自西北农林科技大学实验动物中心。无血清alpha-MEM、胶原酶A(Collagense A)和分散酶(Dispase)购自Gibco公司。β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、茜素红购自Sigma公司,其它常用化学试剂购自天根生化科技有限公司。

1.2 原代前体成骨细胞的分离培养

在无血清的alpha-MEM中加0.1%w/w胶原酶A(Collagense A)和0.2%w/w的分散酶(Dispase)作为消化液,配好的消化液用0.22μm的滤膜过滤待用。

将出生72 h以内的小鼠,先放入70%的乙醇中2 s消毒,再放入PBS中清洗身体表面,然后用手术剪断颈,取出颅骨放于过滤后的消化液(1 m L/只),37℃120 rpm震荡15～20 min消化,将第一次消化的液体弃掉,重新加入消化液(1 m L/只),37℃120rpm震荡15～20 min,收集第二次到第五次的消化液,1000 rpm离心5 min,弃上清,然后将消化后的细胞用加有双抗(0.1 units/mL and 0.1μg/m L)和10%FBS的α-MEM培养基,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,2～3 d换培养液一次。细胞汇合后,弃去培养基,PBS轻轻洗一次,加1mL 0.25%Trypsin-EDTA,37℃温育3～5 min消化细胞,加适量培养基终止消化,1000 rpm离心3 min,弃上清培养基,加新培养基吹打混匀,分于新培养皿传代继续培养。

1.3 诱导分化前体成骨细胞

在全培养液中加入5 mmol/Lβ甘油磷酸钠、50μg/m L抗坏血酸和10 nmol/L地塞米松配成诱导培养基,将分离的原代前成骨细胞按1×104/m L的浓度分到培养皿中,当细胞培养至90%汇合时,换诱导培养基诱导其分化,2～3 d换诱导培养液一次,直到检测。

1.4 碱性磷酸酶活性测定

细胞开始加诱导培养基时即测定细胞中碱性磷酸酶活性,每隔2～3 d测定一次,每次测三个重复,计算其平均值和标准差。测定时参考M.J.COELHO等人的实验方法[4,7]。

1.5 碱性磷酸酶染色

当细胞诱导培养10 d以后,参考杨景山等人所述方法进行碱性磷酸酶染色[5,7]。

1.6 Von Kos s a染色

在细胞诱导培养15 d以后,参考Mc Gee-Russell SM所述方法对细胞进行Von Kossa染色[6,7]。

1.7 茜素红染色

当细胞诱导分化21 d后,进行茜素红染色。先去掉培养液,用无Ca Cl2和Mg Cl2的PBS将细胞洗两次,3.7%福尔马林固定10 min,用去离子水洗细胞一次,在培养皿中加pH值为4.1～4.3的2%茜素红染色液,10 min后在显微镜下观察,当有橙色出现时,去掉染色液,用去离子水洗30 min,然后照像。

2 结果

2.1 原代前体成骨细胞的生物学特征

用胶原酶A和分散酶消化下来的细胞在光学显微镜下关察,未贴壁的细胞呈圆形,接种后很快开始贴壁,培养12 h后,相差倒置显微镜下可见贴壁生长的细胞呈不规则梭形、三角形或多角形,活力旺盛的细胞呈半透明状,轮廓清晰,见图1.1,当细胞活力不好时细胞拉长,轮廓变得模糊。细胞核呈圆形或椭圆形,居中或偏于一侧,轮廓清晰,可见1～3个核仁,见图1.2。培养2～3 d细胞基本汇合,再继续培养,细胞可重叠生长。

注:1.消化后12 h:贴壁生长的OB,100×;2.汇合后重叠生长的OB,200×;3.ALP染色,200×;4.ALP染色,1×;5.Von Kossa染色钙化结节,4×;6.Von Kossa染色钙化结节,1×;7.茜素红染色钙化结节,4×;8茜素红染色钙化结节,1×

2.2 ALP活性测定和ALP染色的光镜观察

ALP的大量表达是前体成骨细胞分化为成骨细胞的重要标志之一。本试验加入诱导培养基后,开始测定ALP活性,由图2结果可知诱导10 d以后ALP表达增加较多,诱导13～16 d时ALP活性最高,16d以后ALP活性开始下降。诱导培养12 d时ALP染色结果显示细胞呈灰黑色,见图1.3、图1.4。细胞染色后颜色越深,表明ALP表达量越多。

2.3 钙化结节的光镜观察

在成骨细胞发育后期,细胞外基质矿化,细胞表面产生大量磷酸钙沉淀,形成钙化结节。这是成骨细胞成熟的重要标志。Von Kossa染色通过对磷酸钙沉淀中的磷酸根离子染色来验证钙化结节的存在。本实验在前体成骨细胞诱导培养21 d进行Von Kossa染色,看到了大量钙化结节形成,见图1.5、图1.6。茜素红染色是验证钙化结节存在的另一种方法。为了排除由于某些因素干扰所造成的Von Kossa染色实验的假阳性结果,本实验用茜素红染色的方法对磷酸钙沉淀中的钙离子染色,再次验证了细胞中大量钙化结节的存在,见图1.7、图1.8。

3 讨论

成骨细胞的离体培养已进行了40多年,方法不断改进。目前多采用胰蛋白酶和胶原酶消化剪碎的颅盖骨,分离得到前体成骨细胞的方法。该方法使用的胰蛋白酶作用于细胞会使细胞膜表面的蛋白受损,剪刀剪碎颅盖骨的过程也很容易使细胞被污染。因此本研究优化消化酶,采用胶原酶A和分散酶直接消化手术取下的颅盖骨,避免了胰蛋白酶对细胞的伤害,手术取下的颅盖骨也不需要剪碎,直接消化即可,这样减少了细胞污染环节,缩短了细胞应激时间。实验中将细胞消化液置于37℃水浴待用,其酶活性最好,消化得到的细胞数量最多,细胞没有团块,分散均匀。收集消化液和细胞的离心管预先放置于冰上,每次消化完成后将消化液和细胞收集于冰上预冷的离心管,5次消化完成后,将收集的所有消化液和细胞一次离心,这样缩短了操作过程需要的时间,使细胞应激减少,得到的细胞活力好。优化酶消化方法获得的细胞量大、均匀、活力好,成活率高。一般消化4只小鼠的颅盖骨可获得3×105个以上的细胞,足够培养于1个175 cm2的培养瓶,2～3 d后即可传代至3个175 cm2的培养瓶。光镜下形态观察、诱导培养后ALP活性测定、ALP染色和钙化结节染色,均表明细胞活性高且具有典型成骨特性。研究证明该方法获得的细胞可以作为研究骨代谢和骨疾病分子机理的原代前体成骨细胞实验材料[8]。因此本研究提供了一种更简便、高效的分离小鼠原代前体成骨细胞的方法。

参考文献

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培养及鉴定 篇7

本研究参照Ross和Campbell贴壁法, 获得了大量纯度较高、生长状态良好的VSMC从而为细胞水平上研究高血压的发病机制提供理想的细胞模型。培养均是在标准的、可控的条件下进行观察、研究其生物学行为。

1 材料和方法

1.1 实验材料和试剂

实验于2013年5-12月在山西医科大学国家重点实验室完成。选择自发性高血压大鼠5只, 雌雄不限, 体重质量190~210g由北京维通利华实验动物中心提供, 鼠尾血压监测收缩压 (170±12) mmHg, 舒张压 (98±7) mmHg。胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素 (GIBCO公司) , 3- (4, 5-二甲基-2-噻唑) -2, 5二苯基溴化四氮唑蓝[3- (4, 5-dimethy-2-thiahiazo) -2, 5-diphenylterazoliumbromide, MTT]、二甲基亚砜 (dimethysulfoxide, DMSO) 均为Sigma公司产品, 羊抗鼠a-平滑肌肌动蛋白 (a-smoothmuscleaction, a-SMActiion) 、异硫氰酸罗丹明 (tetraethyrhodamineisothiocyanate, TRITC) 标志兔抗羊二抗均为SantaCruz公司, 六孔板 (Nikon公司) 。

1.2 仪器和设备

数显鼓风干燥箱 (GZX-9246MBE山海博讯实业有限公司医疗设备厂) 、高压蒸汽灭菌锅 (SANYOLABOAUTOCLAVE MLS-3780) 、数显恒温水浴锅 (HH-2国华电器有限公司) 、DL-CJ-1N医用型洁净工作台 (北京东联哈尔仪器制造有限公司) 、LDZ5-2医用离心机 (北京医用离新机厂) 、酶标检测仪 (德国Beckman) 、CKX31倒置显微镜 (OLYMPUS) 、细胞培养箱 (Thermoelectroncorporation3111 FormaSeriesⅡWater JacketedCO2Incubator) 。组织剪、止血钳、眼科剪、眼科镊 (上海医疗器械集团有限公司手术器械厂) 。

1.3 动物取材

1.3.1 无菌获取鼠主动脉:

取清洁SHR一只, 用8%的水合氯醛以浓度0.5ml/100g下腹部倾斜进针腹腔麻醉后, 浸入到75%的乙醇2~3min, 为避免过度刺激使大鼠清醒应保持头部暴露在乙醇外面。移入缓冲间, 无菌条件下仰卧固定四肢, 使用无菌手术剪和止血钳钝性分离皮肤、皮下组织, 依据解剖结构依次剥离心脏、双肺组织, 暴露脊柱可在脊柱旁边见胸主动脉, 更换手术器械, 沿主动脉弓之膈面下剪下主动脉, 用无菌PBS缓冲液反复冲洗, 洗净血凝块等杂质后, 置于盛有青霉素和链霉素的DMEM培养皿的冰袋上减慢代谢速度, 迅速移入到超净工作台进行进一步操作[3]。

1.3.2 中膜制备:

更换手术器材, 袖套样剥离血管外膜及粘连的组织, 清除血管外脂肪、结缔组织, 使用无菌眼科剪纵向切开血管, 使内膜向上平铺于无菌培养皿中, 用一次性无菌医用棉签擦拭内膜, 由上到下擦拭3~4遍清除内膜, 移入0.5mlEP管中, 滴入少量DMEM培养液, 防止组织块干燥, 用眼科剪在EP管中血管剪切成1mm×1mm的边缘整齐的肉糜组织块, 使用玻璃弯头吸管将切好的组织块均匀分装置于无菌一次性培养瓶中, 内膜面向上, 使组织块间距0.5cm, 于37℃、5%CO2孵箱内放置3~4h左右使组织块干涸并粘附后, 缓慢加入DMEM培养液, 使组织块完全浸入培养液, 置于CO2孵箱中继续静置3~5d, 避免振动和移动, 待有细胞从组织块周围游出后换液, 除去漂浮组织块并更换新鲜培养液[4]。

1.3.3 传代培养:

7d左右大部分细胞周围出现细胞晕, 待与相邻细胞晕相接触后, 然后迅速加入2%预热的胰蛋白酶消化1~2min, 待倒置显微镜下观察到多数细胞收缩变圆且漂浮后, 向培养瓶中加入20%的胰蛋白酶中止消化, 再用吸管吸取瓶中培养液轻轻捶打培养瓶壁, 使细胞尽可能多的脱落下来, 然后将培养瓶中的液体移入离心管, 以1000r/min离心, 5min后, 弃去上清液, 加入含有10%的胎牛血清制成的均匀细胞悬液, 按1∶2的比例将细胞悬液移入培养瓶, 每3d换液1次, 每次换2/3量, 保留1/3原培养, 放回培养箱中继续培养, 待细胞长至融合状态后, 可再传代。

2 主要观察指标

(1) 倒置相差显微镜观察VSMC形态; (2) 细胞成活率检测及生长曲线; (3) MTT法测VSMC增殖; (4) 免疫组织化学法观察VSMC形态。

2.1 VSMC形态

贴壁细胞光镜特征:×100镜下观察, A组摄于第5天, B组摄于第7天, C组摄于第11天。见图1。

注:A组摄于第5天, B组摄于第7天, C组摄于第11天。

2.2 成活率及生长曲线

取消化后重新混悬的原代细胞18ul, 加入浓度为0.4%台盼蓝溶液2μl, 使用一次性吸管反复抽吸混悬均匀后吸取10μl于计数板上, 镜下观察, 存活的细胞为不着色细胞, 蓝色细胞为异常或者死亡细胞, 存活细胞均在96%以上。绘制传代细胞生长曲线:将对数生长期的细胞采用传代培养方法制成单细胞悬液, 调解细胞密度1×106/L接种于六孔板上贴壁24h后第1天收集1孔计数, 第2天收集第2孔细胞, 第3天同上, 培养第4天给未记细胞换液, 每次重复3孔, 使细胞生长曲线的测定更准确。

2.3 MTT法测血管平滑肌细胞增殖

调整细胞数1×105接种于96孔板, 孵育24h后避光条件下, 加入浓度为5mg/ml的MTT溶液, 每孔加入20μl, 培养箱中继续培养4h, 形成蓝色结晶, 每孔加入150ulDMSO溶液, 待结晶充分溶液后即可上机检测。采用酶标仪在490nm处测定各孔观察值密度。连续9d测定VSMC增殖能力, 光密度 (D490nm) 分别为:1d0.073±0.012, 2d0.071±0.010, 3d0.110±0.016, 4d0.133±0.010, 5d0.209±0.011, 6d0.215±0.015, 7d0.226±0.014, 8d0.232±0.012, 9d0.221±0.014。

2.4 培养细胞鉴定

第2、4代VSMC悬液接种于24孔板中分别进行爬片的制备, 待细胞生长亚融合时, 取出细胞爬片进行细胞免疫化学染色。分为实验组 (滴加一抗) 与空白对照组 (不加一抗) 。吸出培养基, PBS清洗1遍, 4%多聚甲醛室温固定20min, PBS清洗3遍, 0.2%Tritonx-100室温透膜10~15min。PBS清洗3遍, 0.1%山羊血清室温封闭30min, PBS清洗3遍, a-SMA (vsmc) , 一抗稀释为1∶250, 吸除一抗, PBS清洗3遍, 每遍3min, 加辣根过氧化物酶标记的抗兔/鼠通用型二抗, 室温孵育1h。PBS清洗3遍后, DAB显色3~5min。PBS清洗3遍, 去除DAB。选染色均匀的区域, 在100倍视野下计数着色细胞占视野细胞总数的百分数, 共计数5个视野, 取平均值, 按着色细胞占视野细胞总数的百分比分别计1~4分, 1分为小于30%, 2分为30%~69%, 3分为70%~89%, 4分为90%~100%, 按细胞着色强弱 (Staininginrensity, SI) 记0~3分, 0分为不着色, 1分为着色弱, 2分为中等着色, 3分为强着色, 观察者为单盲计分, 每张切片的积分为PP×SI值, 每组取5张切片, 取均数做统计学处理。

3 结果

3.1 VSMC形态

光镜观察原代第5天左右即可见数个组织块周围出现细胞晕, 单个细胞以垂直的方向从组织块边缘游出, 以三角形、梭形多见, 每日在相差显微镜下观察细胞的贴壁、生长形态变化并拍摄照片。继续培养7~8d后, 细胞分裂增殖迅速, 进入对数生长期, 细胞呈多层、极性排列, 第11天后, 在组织块附近首次出现血管平滑肌细胞特征性的“谷-峰”结构, 峰:即多层细胞丘呈多层重叠、高低起伏状, 谷:即稀疏、单层排列的细胞如图1。

3.2 VSMC生长曲线

生长前2d无明显增殖 (P>0.05) , 提示此段时间细胞增殖能力较弱, 3~4d时较前2d变化显著 (P<0.05) , 提示此段时间细胞出现增殖, 5~8d变化与3~4d变化比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示此段时间细胞增殖旺盛, 与VSMC生长曲线结果一致, 所以于第5天传代为最佳时机, 7~8d为细胞分裂增殖高峰, 9d增殖速度减慢, 如图2。

3.3 免疫组化结果

第2代VSMC的a肌动蛋白免疫组织化学染色显著且广泛, 呈强阳性表现, 其PP与SI乘积均值为8.68±2.33, 培养至第4代时a肌动蛋白染色显著变浅, 稀疏。其PP与SI乘积均值为7.04±1.13, 与2代细胞免疫组化结果差异显著 (P<0.05) 。

注:*P<0.05。

4 讨论

已经证实VSMC是构成血管壁组织结构、功能的物质基础, 自身的改变是导致高血压的病理学基础[5,6]。随着分子生物学, 细胞生物学的研究进展, VSMC细胞表型的可塑性、增殖、迁移、分化、凋亡和细胞外基质的合成和分泌等方面的认识不断的深化[7]。

原代培养的细胞大小不一, 细胞周期为7~10d, 呈典型的“峰-谷”, 少量的为扁平的多角细胞, 细胞间紧密相靠, 呈“铺石路”样外观[8]。从细胞生长曲线观察, 可见细胞在第5天换液后呈显著增殖, 考虑与自身分泌的多种生长因子促进细胞增殖, 所以在第5天换液时建议保留1/3原液。MTT法进一步证实VSMC增殖高峰在7~8d左右, 建议可以在此期进行实验干预最佳。a-SMActiion在所有真核细胞中表达均高度保守, 公认是VSMC表型转化标志[9]。免疫组化差异提示细胞在体外培养时可能发生了生理、生化、免疫、形态学及表型间转化, 尤其后者会导致细胞表面特异性的标志蛋白表达的差异, 导致第2代与第4代免疫组化的差异, 但这些改变具体有哪些?是否对实验结论产生质的影响?在传代过程中能否保持平滑肌细胞的一般特性?这些问题有待以后探讨解决。

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培养及鉴定 篇8

1 产酶菌株形态学鉴定

1.1 材料与方法

1.1.1 菌株。

新鲜采集的自然环境中生长在植物叶片害虫上的子座。本实验中所用到菌种是由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室所保藏的菌株WYSD-16。

1.1.2 试剂及工具。

乳酸棉兰染料:乳酸25ml, 甘油50ml, 蒸馏水25ml, 加0.1g苯胺蓝。

工具:刀片、小木块、解剖针、载玻片、盖玻片。

1.1.3 切片。

将子座连同叶片一起用刀片修成约2mm宽的细长条, 子座位于长条的顶端, 利用刀片进行徒手切片, 把子座切成薄片, 以能在光学显微镜下看清楚其内部结构为准。

1.1.4 制片。

用解剖针将徒手切片的薄片挑到干净的载玻片上, 滴加乳酸棉兰染料染色。用镊子将盖玻片沿染料的一侧小心地盖上, 放到显微镜下观察并拍照。

1.2 结果

菌株WYSD-16的形态特征如下:子座初期为白色, 成熟时为淡黄色到金黄色, 圆形半球形, 周围有白色薄膜状囊基膜, 子座生长初期表面被绒毛, 成熟时由于粘孢团溢出表面较湿润, 子座约2.03 (2.83~1.15) mm×1.89 (2.73~0.90) mm, 高0.67 (1.40~0.18) mm, 分生孢子器口葵花籽状成环状排列, 有桔红色或红色粘孢团溢出;分生孢子器埋生于子座内部, 不规则形, 多腔室, 敞口, 内有侧丝, 64.58 (87.0~50.5) μm×0.95 (1.0~0.8) μm, 孢子器的大小为139 (230~60) μm×224 (340~130) μm;孢子呈细长新月形, 里面有3~7个油滴, 13.25 (18.5~7.5) μm×1.45 (1.5~1.1) μm。

此种在形态上与粉虱座壳孢菌 (Aschersonia aleyrodis) 很相似, 但前者的侧丝较短, 一般为40~80μm, 综上所述, 该样品鉴定为扁座壳孢。

A子座;B新月形和窄纺锤形的孢子;C长的丝状侧丝;D镶嵌于子座内部的不规则的孢子器;E孢子器孔口堆积大量的孢子。A、C和D的标尺分别为500μm、20μm和200μm, B和E的标尺为20μm。

2 产酶培养基和培养条件的筛选

2.1 材料与方法

2.1.1 菌株和培养基。

菌株:扁座壳孢WYSD-16。

培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA) 用于本实验真菌的活化培养。马铃薯葡萄糖培养基 (PD) 用于座壳孢菌的菌丝培养。基础液体培养基用于座壳孢菌产蛋白酶。

组成成分如下:马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA, w/v) 培养基:20%土豆汁、2%葡萄糖、2%琼脂。

马铃薯葡萄糖 (PD, w/v) 培养基:20%土豆汁、2%葡萄糖。基础液体培养基 (w/v) :0.5%明胶、1.1%Na2Hp O4·12H2O、1.2%Na H2PO4·2H2O、p H值6.5。

2.1.2 蛋白酶活力的测定方法。

(1) 待测酶液的制备。参考张寒俊[8]的方法加以修改, 取适量基础液体培养基的培养液于7m L离心管中, 8000r/min离心5min, 取上清液, 稀释到适当的浓度。

(2) 蛋白酶活力的测定方法。先将L-酪蛋白溶液放入40±0.2℃恒温水浴中, 预热5min。取1m L酶液于7m L离心管中, 加入2m L 0.4mol/L三氯乙酸摇匀后恒温水浴10min, 再加入1ml L-酪蛋白溶液, 静置10min, 10000r/min离心10min, 取上清液定容至10m L, 作为对照。再取1m L酶液加L-酪蛋白溶液1m L恒温水浴10min, 加入2m L 0.4mol/L三氯乙酸摇匀, 静置10min, 10000r/min离心10min, 定容至10m L, 在275.0nm波长下测吸光度。

(3) 蛋白酶活力的计算公式:酶活力 (U/g或U/m L) =A·K·V·n·t-1·m-1式中, A为样品的紫外吸光值;K为吸光常数;V为反应试剂的总体积, 10m L;N为酶液的稀释倍数;t为反应的时间;m为酶的质量或者酶的体积, g或m L。

2.1.3 蛋白质的定量测定-考马斯亮蓝染色法。

(1) 标准方法。取含蛋白质的溶液于小试管中, 用dd H2O或缓冲溶液定容至至10m L, 加5m L蛋白试剂, 充分混匀, 2分钟后于595nm处测吸光度[9]。以0.1m L dd H2O或缓冲溶液加5m L蛋白试剂为空白对照。

(2) 微量蛋白分析法。取含蛋白质1~10μg的溶液, 用dd H2O定容至0.8m L, 加0.2m L蛋白试剂, 充分混匀, 2分钟后于595nm处测吸光度。以0.8m L dd H2O加0.2m L蛋白试剂作为空白对照。

2.1.4 蛋白酶产酶条件研究。

(1) 适宜扁座壳孢WYSD-16产酶的碳源、氮源、维生素及金属离子筛选。在基础液体培养基中按1%比例分别添加麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、麦麸、果糖、海藻糖、D-山梨醇、可溶性淀粉配制成8种不同碳源培养基, 按1%比例分别添加蛋白胨、酵母粉、NH4HCO3、KNO3、NH4C1、Ca (NO3) 2配制成6种不同氮源培养基, 按0.01%比例分别添加维生素B2、维生素B2、维生素B6、维生素E和维生素C配制成5种含有不同维生素的培养基, 按0.01%比例分别添加4×10-4mol/l的Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+配制成6种不同金属离子的培养基, 在以上不同碳源、氮源、维生素、金属离子的培养基中接入相同的蜡蚧菌液, 26℃、160r/min震荡培养, 每天测定发酵滤液中蛋白酶活力, 比较不同因素对扁座壳孢WYSD-16产酶活力的影响。以上试验均以基础液体培养基发酵滤液中蛋白酶活力作为对照, 根据试验数据选择对产酶最有利的碳源、氮源、维生素及金属离子。

(2) 初始p H对产酶活力的影响。用0.1mol/L Na OH和HCl溶液将基础液体培养基分别调至p H值=5、6、7、8、9, 10, 将各处理培养基接种后于26℃、160r/min条件下震荡培养10d后, 测定发酵滤液中蛋白酶活力, 以基础液体培养基发酵滤液的蛋白酶活力作为对照, 根据试验数据选择对产酶最有利的初始p H值。

(3) 培养时间对产酶的影响。将扁座壳孢WYSD-16菌丝接到基础液体培养基中震荡培养, 每天测1次发酵滤液中蛋白酶活力, 直至蛋白酶活力连续2天出现下降为止, 以确定最佳的发酵培养时间。

(4) 培养基的优化。对前期单因素试验中筛选出的最佳碳源和氮源设定不同浓度, 分别为0.5%、1%、2%、4%, 设定最佳金属离子浓度分别为2×10-4mol/l、4×10-4mol/l、8×10-4mol/L、16×10-4mol/L, 设定最佳维生素浓度分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L, 设定p H值分别为6.0、7.0、8.0、9.0, 进行5因素4水平的正交试验设计, 以筛选出最佳产酶培养基。不同组合的培养基接种后置于26℃、160r/min条件下震荡培养10d后测定发酵滤液其酶活力。

(5) 培养条件的优化。选取3种接种量 (2ml、4ml、8ml) 、培养基装液量 (50ml、100ml、150ml) 、菌龄 (3d、5d、7d) 、培养时间 (9d、10d、11d) 进行4因素3水平的正交试验设计, 26℃、160r/min震荡培养, 从第9d天后检测发酵滤液蛋白酶活力。

2.2 结果

2.2.1 酪氨酸标准曲线。

如图2所示, 用100μg/m L的酪氨酸标准溶液配制标准系列溶液, 在275.0nm波长下测定吸光值, 并绘制标准曲线, 以dd H2O为空白。其回归方程为A (吸光度) =0.0071×C (浓度) +0.003, 相关系数R2=0.9996, 测定的线性范围为0~120μg/m L。

2.2.2 蛋白含量标准曲线。

如图3所示, 以不同浓度的牛血清蛋白反应液在595nm处的吸光度为纵坐标, 牛血清蛋白的浓度为横坐标制定出标准曲线。曲线方程为y=0.0178x+0.0102, 并且R2为0.9966。

2.2.3 蛋白酶产酶培养基和条件研究。

(1) 碳源对产酶的影响。研究发现所添加的8种不同碳源均可提高酶活力。其中添加麦芽糖使扁座壳孢菌WYSD-16在接种后第10d出现蛋白质酶高峰, 活力达到47.92U/m L;其次是添加葡萄糖的处理, 活力达到30.78 U/m L, 其余处理相对前两者其产酶活性略低。由此可见, 麦芽糖是促进扁座壳孢菌WYSD-16产蛋白酶的最佳碳源。

(2) 氮源对产酶的影响。研究发现, 不同的氮源对该菌产蛋白酶影响差别较大。有机氮都可以促进产酶, 其中蛋白胨的作用最强, 酶活力达到16.44U/m L;其次是酵母粉, 酶活力可达10.62U/m L。但无机氮对该菌产酶作用不明显或有不同程度的抑制作用, 其中硝酸钙的抑制作用最明显, 由此可见, 麦芽糖是促进扁座壳孢菌WYSD-16产蛋白酶的最佳氮源。

(3) 维生素对产酶的影响。研究发现加入维生素B6的培养基最有利于扁座壳孢WYSD-16产生蛋白酶, 其酶活可达到55.70U/m L, 其次是添加维生素B2的培养基, 酶活力达到46 U/m L但维生素C对该菌产酶呈现出较强的抑制作用, 酶活力为22 U/m L, 明显低于对照的酶活力33 U/m L。由此可见维生素B6是该菌产蛋白酶的最佳维生素。

(4) 金属离子对产酶的影响。研究发现, 添加Mg2+的培养基最有利于提高该菌产蛋白酶的活力, 酶活力为61 U/m L, 但其余金属离子均在不同程度上抑制该菌产生蛋白酶, 其中Zn2+的抑制作用最大。由此可见Mg2+是该菌产蛋白酶的最佳离子。

(5) 初始p H值对产酶的影响。研究发现, 当培养基的初始p H值为6.0时, 该菌所产的蛋白酶活性最高, 酶活力达到52.01U/m L, p H值为5.0和9.0时酶活急剧下降, 由此可见该菌产蛋白酶的最佳初始p H值为6.0。

(6) 培养时间对产酶的影响。结果表明扁座壳孢WYSD-16震荡培养5d后开始具有一定的酶活力, 在5~9d内酶活力缓慢升高, 而在9~10d呈现迅速升高趋势, 在第10d时酶活力最高;此后随着培养时间的延长, 酶的活力开始缓慢下降。由此可见, 培养10d是该菌产酶的最佳时间。

(7) 培养基的优化。由正交试验分析结果表明:最有利于该菌产酶的培养基组合为A4B3C2D4E1, 即麦芽糖40g/L、蛋白胨20g/L、Mg2+浓度4×10-4mol/L、VB6 400mg/L、p H值为6.0。变化因素的极差值R分别为碳源 (291.78) 、氮源 (169.08) 、金属离子 (175.77) 、维生素 (168.27) 和p H值 (203.40) , 表明碳源、氮源、金属离子、维生素和p H值的变化与该菌蛋白酶培养基相关 (表2) , 其中碳源浓度的变化对该菌产蛋白酶的影响最大, 相对而言, 维生素浓度的改变对产酶的影响较小。

(8) 培养条件的优化.。由表3和表4可知, 4个培养条件 (接种量、装液量、菌龄和培养时间) 对该菌蛋白酶的产生具有不同程度的影响。表3.4中的R值表明接种量 (335.22) 是一个比其他培养条件更重要的因素, 其次是培养时间 (138.33) , 然后是装液量 (109.62) , 对产酶影响最小的因素是菌龄 (58.59) 。正交分析表明最适合该酶产生的条件为A3B3C2D2 (接种量8m L, 装液量150m L, 菌龄5d, 培养时间10d) 。

3 结论与讨论

本试验通过形态学观察, 确定菌株WYSD-16为扁座壳孢。侧丝的有无一般都作为座壳孢属的分类依据, 但本实验发现某些样品在子座成熟的初期, 分生孢子器内有侧丝的存在, 子座成熟的后期出现侧丝消减的现象, 这就有可能造成将该种鉴定为无侧丝的种, 因此我们认为在进行座壳孢的形态分类研究时, 应选择已经发展成熟的子座作为研究材料, 但尽量不要选择那种已经进入衰亡期的样品, 否则会造成分类的偏差。

注:Ij为各因素水平1的所有酶活力之和, Ⅱj为各因素水平2的所有酶活力之和, Ⅲj为各因素水平3的所有酶活力之和, Ⅳj为各因素水平4的所有酶活力之和, R为极差, 酶活力的数字代表3次重复的平均值 (mean) ±标准差 (S.D) 。

侧丝的长短也是作为分种的重要依据, 如Petch将粉虱座壳孢 (A.aleyrodis) 和扁座壳孢分成2个不同的种, 主要依据是它们侧丝的长度不同, 而在试验中, 由于机械力或是制片过程中的机械损伤往往造成侧丝的断裂, 使得测量的长度比实际的偏小, 这就要求我们, 选择顶端尖细的侧丝进行测量。不同的产蛋白酶微生物的培养基和培养条件也各不相同, 细菌类微生物通常在以葡萄糖作碳源, 蛋白胨作氮源条件酶活较高。真菌则不尽相同。本文通过一系列单因素实验和正交实验, 结果表明碳源为麦芽糖40g/L, 氮源为蛋白胨20g/L, 金属离子为4×10-4mol/L Mg2+、400mg/L维生素B6、初始p H值为6.0、接种量8m L, 装液量150m L, 菌龄5d, 培养时间10d的培养条件最有利于该菌产蛋白酶, 酶活最高达到73.18 U/m L。

注:Ij为各因素水平1的所有酶活力之和, Ⅱj为各因素水平2的所有酶活力之和, Ⅲj为各因素水平3的所有酶活力之和, R为极差, 酶活力的数字代表3次重复的平均值 (mean) ±标准差 (S.D) 。

不同培养基能为真菌的产酶提供不同营养成分。不同液体培养基是否为座壳孢菌提供的营养存在差异呢?需要进一步实验研究。培养基的碳源、氮源、金属离子和维生素等营养成分均可能影响其产酶能力的发挥, 培养条件如温度、菌龄、通气量和培养时间等也能影响产酶量的多少。本研究目的在于优化该菌株的培养基和培养条件, 使其大量产酶, 为酶的分离纯化和酶学性质的研究奠定基础。

参考文献

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浅析珠宝鉴定师的培养 篇9

一、高效优质的教学大纲和人才培养计划

公司和学校的培养应紧密结合市场需求, 制订教学大纲和人才培养计划。珠宝专业自1999年以来3次修订教学大纲, 每年都深入到企事业单位座谈、探讨如何更合理地制订教学大纲, 调整人才培养计划, 更新专业课程的设置, 将教学大纲和人才培养计划修订得更加合理, 更加有利于学生的发展, 更加有利于企业和科研研究的实际需要。

强化技能操作和动手能力。在教学计划的制订、人才培养规划的实施、专业课程的设置等方面, 加强培养同学们的动手能力。珠宝专业在成立时应建设了实验、实训室、首饰镶嵌与制作实验实训室、宝石鉴定实验室, 学校每年下拨固定经费用于实验实训设备的添置和维护, 使得珠宝专业的实验室建设达到了全世界一流的水平。同学们通过在这些实验、实训室的长期培训和强化训练, 进入企业工作后基本都能马上上手, 使企业缩短了新进人员的培训时间和磨合期。

贯彻落实“1张文凭+3张职业资格证书”的办学模式。珠宝专业是具有专业性、特殊性的行业, 没有相应的职业资格证书, 就无法跨入行业门槛。因此要求每位同学在拿到毕业证书以前都应该考出相应的专业职业资格证书, 此举深受广大用人单位的欢迎, 使学校教育、教学和企业实际需要更紧密地联系起来。

把职业道德、职业操守的教育渗透到每门专业课中。珠宝专业除了在常规教学中开设职业道德教育课程以外, 还将职业道德教育和专业课程教学紧密结合起来, 使同学们在学习中了解到珠宝专业的特殊性并且始终牢记职业道德、职业操守的重要性。用人单位在对毕业生的评价中就这样评价:××学校毕业生显示出良好的职业道德操守, 无论是在实习期间, 还是上岗工作, 都能够遵守劳动纪律, 讲究诚信, 责任心比较强, 具有良好的团队协作精神。

二、专业知识与英语相结合的培养理念

随着人们对珠宝需求的增多, 珠宝鉴定师逐渐变得火热起来。中国的珠宝鉴定业由于种种历史原因曾一度萧条, 断层几十年, 专业人才严重匮乏。要想与世界先进的珠宝鉴定相接轨, 需要我们的学生掌握熟练的英语, 这样才有机会和能力翻译英语著作和与国际学校交流。通过几年的教学实践, 综合各大企事业单位对毕业生的评价, 我国培养的珠宝鉴定专业学生, 其职业能力、社会综合竞争力都是数一数二的, 结合学校教学、科研、产业开发, 广开渠道, 本着多国家、多层次、多学科、多形式交流合作的外事宗旨, 学校和企业积极开展国际间的学术交流, 以合作办学、合作科学研究等多种方式增强整体实力, 取得了长足进步, 为学校和企业逐步发展成为现代型、开放型、国际型大学作出了应有的贡献。例如, 中国地质大学先后承办各种规模、各种学科的国际会议达17次。多个国家的百余名专家及国内众多地质学家、学者对会议的成功也给予了肯定和好评。

大部分珠宝鉴定师不能对证书的英文进行翻译, 有的连证书的出具机构也不能准确表达。珠宝首饰检测鉴定证书是珠宝价值的惟一凭证, 珠宝鉴定师要看懂英语鉴定证书。“国外检测证书是国外实验室根据自己的标准出具相关的报告和证书, 而有关实验室的标准甚至要略低于我国的国家标准。”省珠宝玉石首饰行业协会副秘书长米粮川表示, 由于这些国际认证是否权威机构出具很难辨别, 同时国外检测鉴定证书难查真伪, 此外, 珠宝商家大部分用国外检测鉴定证书, 珠宝鉴定师应将英文翻译成中文, 以告知消费者相关珠宝的真实情况。珠宝鉴定专业之所以具有较强的职业竞争力和社会适应力, 当鉴别者手中拿到一块未知珠宝时, 只要细心按以下鉴定步骤去观察, 便可将一些矿物的范围缩小, 最后得出一个正确的矿物名称.对其他品牌具有国际认证的珠宝产品进行了了解。

三、“师徒模式”的珠宝鉴定师培养方式

我国是一个历史悠久的文明古国, 其文物及艺术品资源雄厚, 更能成为世界文物及艺术品市场的主导。对此感到我国文物及艺术品市场的专业人才奇缺已是燃眉之急了。如何尽快地培养新型高级珠宝鉴定师专业人才是当前值得考虑的大事。任何一门经济领域的发展都是由市场促使人才的培养, 再由人才促使市场的发展, 没有人才市场难以成熟更难以前进, 所以抓人才是至关重要的。

想让每一个读书人大学一毕业就能担任鉴定师这是不现实的。可以说再好的优秀生经过三五年书本上的学习, 绝不能成才。主要是课堂里学的知识太有限, 学校里的设备、实物、标本都远远跟不上需要, 只是光从书本上学还不能建立起明确的概念。不曾见过实物的人, 虽然理论上一套一套能说的很多, 针对某一具体问题则表现得茫然了。珠宝的鉴定, 确实需要知识面的广度和深度都非常高, 与一般学科不可同日而语。就是从事文物艺术品活动几十年的老一辈也感到知识远远不够, 真是只有“活到老, 学到老”, 永做小学生。

学校里最大的缺陷就是没有实物, 就算有实物的地方, 也不让动手去摸去闻去看……也就无法辨认真假。从事珠宝鉴定必须是实践性特别强的, 对真的要细摸细看, 对假的也要细摸细看。不见真的识不破假的, 没有假的也比不出真的来。学校里这点是不可能满足学生要求的, 只有在真正的大收藏家家里才有可能学到、看到、摸到……。鉴定文物及艺术品有许多真知是来自个人的经验总结, 这些东西尤其是一些秘诀, 很难在书上出现。就算是课堂里请来大专家, 在当众之下也不一定会吐真言, 想学到专家行家们积蓄一生的精髓谈何容易。也只有在心诚求教的感昭下, 师父才会教给你一招一术。师父教弟子不仅看你的心诚不诚, 还要看你的求学精神、为人道义、知识基础等等, 才能决定此人可教不可教。否则就难了, 因为在这里能真正体会到知识就是财富。文物及艺术品投资这一行是非常特殊的一行, 同时能真正涉入到这一行且又有相当水平的鉴定人才确实太少太少。老一辈鉴定师相对当前形势而言也永远跟不上形势, 尤其是针对现代高仿手段之精良, 还用完全传统的鉴定手段, 仅凭经验去鉴别恐怕也感到束手无策、难保不会“走眼”。

四、专业宝石鉴定实验室的建设

高级珠宝要鉴定其历史价值, 除了从设计款式而论, 就是看镶嵌于高级珠宝上宝石的稀有性及保用价值。随着大自然的变化, 人类的开采, 天然矿绝无仅有, 发掘纯天然、高质素及卡数的宝石的机会愈来愈少, 有些宝石产地甚至已绝迹。故此, 一颗高品质稀有的宝石, 如克什米尔的蓝宝石及缅甸红宝等, 其历史保用价值都是非常高的。要断定一件高级珠宝的历史价值, 就要先断定其宝石的天然性及品质的真确性, 故此宝石证书可说是一件高级珠宝作品的价值证明书。以确定真假古董珠宝, 鉴赏者的经验、仪器的协助及证书的明证实是必需。

在当今珠宝首饰市场上, 无论是优化处理的还是合成的宝石材料。其种类和数量都在增加。在某些情况下, 它们呈现出与贵重天然宝石极其相似的外观特征, 尽管某些经处理的或合成的宝石材料常显示出其独特的宝石学性质。但对于珠宝商, 尤其是对那些缺乏宝石学专业培训或刚刚入门使用常规宝石鉴定方法或设备的珠宝商, 鉴定起来十分困难。因此, 到专业宝石鉴定实验室去鉴定宝石样品就显得非常必要。在专业实验室中, 先进的科学仪器必须由受过培训的专业人员操作, 宝石的准确鉴定对维护天然宝石的商业价值及消费者的信心都至关重要介绍了几种优化处理及合成宝石材料的鉴定实例。这些材料对当今的宝石鉴定提出了挑战。专业人士说:“真正要做到理论和实践操作相结合, 一个完备的工作室体制首先是意识上的开放, 其次是制作上的开放。学生所想的东西在导师的指导下, 由技师来指导制作, 制作的过程中遇到什么问题, 由学生和技师共同来解决问题。这样可以有效地达到阶段性研究目标。”“珠宝鉴定师是一个风险很大的职业。”从事这一行有心理压力, 一旦某件珠宝的鉴定结果出了问题, 鉴定师就要负责。

展望未来, 任重而道远, 为了使我国珠宝鉴定工作上一个新台阶, 进一步推动学校和企业对外交流与国际合作工作的发展, 扩大学校和企业在国际上的知名度和影响力, 应继续拓展对外交流渠道, 聘请高层次人才。

摘要：随着人们生活水平的不断提高, 对珠宝饰品的需求与日俱增, 珠宝首饰正成为继住房、汽车之后的又一消费热点。国内外珠宝供应商不断增多, 市场竞争日益激烈, 从先期鉴别、设计制作, 到后期的销售、评估等环节的珠宝人才全面紧缺, 有丰富行业经验和较高技术水平的从业人士非常抢手。所以, 对于珠宝鉴定师的培养工作迫在眉睫。

关键词：珠宝鉴定师,人才,培养

参考文献

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