新城疫病毒(NDV)（精选9篇）
新城疫病毒(NDV) 篇1
新城疫病毒 (Newcastle Disease Virus, NDV) 属于副粘病毒科 (Paramyxoviridae) , 副粘病毒亚科 (Paramyxovirinae) , 腮腺炎病毒属 (Rubulavirus) , 禽副粘病毒Ⅰ型 (Avian ParamyxovirusⅠ, APMV-Ⅰ) 。成熟的病毒粒子直径约为100~250 nm, 有囊膜, 呈现多形性, 囊膜上有纤突, 长约8 nm, 病毒囊膜上的纤突为2种糖蛋白, 一种为HN蛋白 (Hemagglutinin Neuraminidase) , 即血凝素-神经氨酸酶蛋白;另一种为F蛋白 (Fusion) , 也称融合蛋白。病毒粒子的内部为一核心, 也就是病毒粒子中卷曲的核衣壳, 核衣壳的直径约17nm。NDV可引起鸡、火鸡、鸽、鹌鹑、观赏鸟发生新城疫, 在过去的报道中认为水禽呈隐性感染, 但最近几年在我国发现NDV可使鹅发病, 且发病率和死亡率都很高[1]。
1 NDV的基因组结构
NDV有一个螺旋对称的核衣壳, 其中的基因组为单股负链RNA (-ss RNA) , 长约15 kb, 包含有6个基因, 其排列顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’[2]。NP为核衣壳结构蛋白基因, 其长度为14 67 bp;P为磷蛋白基因, 长度为1 185 bp;M为基质蛋白 (又称膜蛋白) 基因, 长度为1 241 bp;F为融合蛋白基因, 长度约1 790 bp;HN为血凝素-神经氨酸酶基因, 长度为2 000 bp, L为大蛋白基因, 长度在6 600~6 700之间。其中的NP、P、L与病毒基因组构成核衣壳, HN、F和M蛋白则存在于病毒的囊膜上。NDV基因组除了编码NP、P、M、F、HN、L这6种结构蛋白外, P基因还含有2个编码非结构蛋白的基因, 分别是V蛋白和W蛋白[3]。
2 NDV蛋白及其基因特点
2.1 F蛋白的结构与功能
F蛋白是NDV感染细胞所必需的[4]。病毒囊膜与靶细胞膜融合, 进而使病毒穿入细胞浆脱去核衣壳进行复制, 这一融合过程主要是靠F蛋白来完成的。F蛋白的基因约1 790 bp, 编码一个由553个氨基酸组成的多肽[5], 所有的NDV F蛋白首先以无活性的前体F0 (MW, 68103) 形式存在, 病毒感染细胞后, 在蛋白修饰酶的作用下, 裂解产生由二硫键连接的F1和F2后, 才使病毒具有感染力[6]。F1和F2的顺序为HN2-F2-F1-COOH, 其中F1的分子量为55.0103, F2为12.5103。F基因的转录起始信号是ACGGTAGAAG, 多聚腺苷酸信号是AAGAAAAAA, 这些信号保守[7]。终止序列核苷酸序列1 783~1 786位, 翻译终止信号位于706~1 708位核苷酸处[8]。
不同毒株F蛋白的糖基化位点有一定的差别, Toyoda (1987) 研究证明, Miyadera株有8个糖基化位点 (Asn-X-Ser/Thr) , 其中之一 (85-87aa) 位于F2亚单位, 其他7个位点 (191-193aa、192-194aa、366-368aa、447-449aa、471-473aa、497-499aa、541-543aa) 位于F1亚单位。此外, F蛋白中还有十几个半胱氨酸残基, 其中之一是位于F2亚单位上76位的半胱氨酸残基, 包含在F1和F2之间的二硫键中。多数半胱氨酸残基集中在338aa-424aa之间, 这一点类似其他副粘病毒的Fo蛋白, 这些半胱氨酸残基包含在F1亚单位内的二硫健中, 对维持F蛋白的高级结构有重要作用。另外两个半胱氨酸残基位于跨膜区, 不参与二硫键的构成, 而是一个脂肪酸的酰化位点。用单克隆抗体对F蛋白的抗原结构进行分析, 结果表明, F蛋白有3个抗原决定簇, 分别位于第72、161和343氨基酸残基位[10]。72位点 (Asp-天门冬氨酸) 位于F2亲水区, F1和F2之间的二硫键上的半胱氨酸残基有利于这一位点向F1N末端接近, 形成与抑制融合相关的抗原表位。161位点 (Thr-苏氨酸) 位于F1N末端, 所在的区域亲水性较低。343位点 (Leu-亮氨酸) 位于F1亚单位C末端高度保守的半胱氨酸富集区, 在病毒的抗原性及结构和功能上起着重要的作用, 是F蛋白主要抗原决定簇。
通过对NDV F蛋白氨基酸序列的分析表明, 不同毒株F蛋白氨基酸序列具有高度的同源性。Toyoda (1989) 对11株NDV进行了比较, F蛋白氨基酸序列同源性高达89.3%~99.6%[4]。Taylor (1990) 比较了3株NDV F蛋白的氨基酸序列, 同源性为94%, 除信号序列的25个氨基酸之外, 有32个氨基酸发生改变。F蛋白的半胱氨酸位点是完全保守的, 潜在的糖基化位点也是保守的[8]。F蛋白氨基酸只所以具有高度的同源性, 是由于在长期的进化过程中, 对F蛋白结构和功能高度强制的结果。大多数毒株F蛋白氨基酸的变异都集中在信号肽区 (1-25aa) 内。而各毒株之间最重要的差异存在于F蛋白的裂解区域 (112aa-117aa) 。除了信号肽区和裂解区内氨基酸易发生变异外, 在靠近半胱氨酸位点的氨基酸也易发生变异。Taylor (1990) 研究证明在靠半胱氨酸位点的340、396、402、403、421和422位氨基酸发生变异的机率较大[9]。
2.2 HN蛋白及其基因特点
2.2.1 HN基因特点:
HN基因长2.0 kb, 约占基因组的13.5%, 仅有1个大的开放阅读框, 不同毒力的毒株开放阅读框的长度不同。对已知的13株NDV HN基因序列进行对比, 发现各毒株开放阅读框长度和终止密码位置存在差异, 其翻译的多肽长度不同。根据开放阅读框的长度和编码氨基酸数目的不同可将HN基因分为3种类型:一类开放阅读长度为1 848 bp, 编码的HN0有616aa。HN0为无活性的前体, 需经水解才能转化为有生物活性的HN蛋白, 这种蛋白只存在于无致病性的NDV毒株中。其次是开放阅读长度为1 731 bp, 编码的HN为577aa, 为有生物活性的HN蛋白, 该蛋白既存在于无致病性的NDV毒株中也存在于致病性毒株中。第三类开放阅读长度为1 713 bp, 编码长度为571aa的HN蛋白。这一HN蛋白具有生物学活性且仅存在于致病性的NDV毒株中[11]。但是也有例外, NDV亲内脏强毒株AF2240HN基因的开放阅读框为1 746 bp, 编码581aa[12]。Gribanov OG (1999) NDV株BOR74和BOR82是属于无症状毒株, HN基因编码572aa[13]。这些NDV HN蛋白氨基酸序列差异主要集中在N端1~75位, 在该范围内包含HN蛋白的胞质区 (1-26aa) , 跨膜区 (27-48aa) 和细胞外区N端27个氨基酸残基。相对来说, 各毒株HN蛋白在76位至C末端整个细胞外区氨基酸差异较小。
2.2.2 HN蛋白的结构:
:HN蛋白位于病毒的包膜上, 呈纤突状突起, 因此也称为HN纤突蛋白。HN纤突蛋白是II型同型四聚物, 外功能域包括长的柄状结构, 支撑末端的球状头部, 球状头部上有HA、NA和抗原位点。HN四聚物是由成对的同型二聚物组成。二聚物是通过每一个单体柄状结构中的123位半胱氨酸形成的二硫键连接的。HN蛋白有26个氨基酸的胞质域, 有22个氨基酸的信号锚定功能域和523个氨基酸的外功能域[14]。不同NDV毒株的HN外功能域部分大小不同, 大约为525个氨基酸左右, 其中有12或13个半胱氨酸和5或6个N端连接的糖基化位点。Mc Ginnes LW (1995) NDV AV株中HN蛋白有6个潜在的N-连接糖基化位点 (G1、G2、G3、G4、G5、G6) 。G1、G2、G3、和G4糖基化位点分别在119、341、433、481位氨基酸, G5和G6分别位于508、538位氨基酸处, 经研究发现G1、G2、G3、和G4用于糖基化, 而G5和G6这两个潜在的糖基化位点则不用于糖基化[15]。
二硫键能够稳定HN蛋白的结构和功能。Mc Ginnes LW (1997) 通过对NDV Queensland株分析后发现其HN蛋白外功能域中包含13个 (C2-C14) 半胱氨酸残基, 其中最接近膜锚定区为C2, 位于123aa处, 参与分子间二硫键的形成, 其它12个二硫键参与分子内二硫键的形成。这13个半胱氨酸分别位于第123、172、186、196、238、247、251、344、455、461、465、531、542位氨基酸处。并且Cys (531) -Cys (542) 、Cys (172) -Cys (196) 、Cys (186) -Cys (247) 、Cys (238) -Cys (251) 、Cys (344) -Cys (461) 、Cys (455) -Cys (465) 之间形成二硫键, 两条HN肽链上的Cys (123) 之间形成二硫键, 使HN通过此二硫键形成外功能域二聚体。13或14半胱氨酸突变导致在蛋白肽链上添加其它的低聚糖, 使不发生糖基化作用G6糖基化位点糖基化。这说明这些半胱氨酸通常使G6糖基化位点不能被糖基化。不能形成二硫键则可使通常情况下不使用的糖基化位点发生糖基化, 蛋白肽链上的二硫键可以影响潜在糖基化位点的糖基化。天然肽链上的像二硫键这样的局域性折叠能阻止糖基化转移酶的接近, 是糖基化位点是否发生糖基化的决定因素[16]。
2.2.3 HN功能与蛋白结构的关系:
HN的生物学活性有:HA (血凝素) 活性, 即识别带有唾液酸的受体, 并与之结合;HN (神经氨酸酶) 活性, 即介导病毒粒子表面及细胞表面的唾液酸切除防止病毒粒子在细胞表面出芽时产生自我聚集;促进细胞融合作用;HN糖蛋白可以诱导人外周血单核细胞产生干扰素 (IFN-α) 、还可增量调节细胞膜表达肿瘤坏死因子。有实验证明是HN蛋白的HA活性诱导产生干扰素 (IFN-α) [17,41]。
Mc Ginnes LW (1995) 对NDV AV株HN蛋白上6个糖基化位点进行突变, 研究糖基化位点对蛋白功能的影响。结果显示G1, G2对分子的折叠、稳定、转运未起重要作用。而这两个序列的突变大大增加了病毒的细胞吸附和融合促进活性。G4位点无论是单独突变还是同其它点突变结合都能抑制成熟蛋白的形成, G3突变对蛋白的折叠有轻微的影响, 与G4突变结合时影响明显。G3、G4单独突变或与其它突变结合时, 可降低神经氨酸酶活性, 而不能降低融合促进活性。这说明G1、G2位点上的低聚糖不能影响蛋白的成熟而能调节蛋白的生物活性, G3、G4位点上的2种低聚糖影响蛋白的折叠和生物活性[15]。
NDV HN蛋白介导病毒同含有唾液酸的受体结合, 并通过神经氨酸酶活性将其切割成相同的两半, 用定点诱变的方法分析在球状头部二聚体交界处膜最近部分218-226氨基酸功能域。这一功能域中F220、S222、和L224aa被替换后蛋白有融合缺陷。这些融合缺陷不是由于突变对融合造成的直接影响, 不是因为NA活性的改变, 而是由于37℃下受体识别活性严重损伤。由于这些突变蛋白在低温下有效介导吸附, 所以也不是因为突变蛋白本身不能识别受体, 而是交界处突变减弱了HN和受体之间的相互作用[18]。
副粘病毒HN蛋白的保守氨基酸残基与流感病毒的NA蛋白保守的功能和结构激活位点具有同源性, 因此认为NDV HN蛋白上有7个保守氨基酸NA的活性位点。用定点诱变的方法分析这些保守氨基酸残基在NDV HN蛋白生物活性中的作用。R174、D198、R416、Y526和E547被替换导致HN蛋白缺少可检测的NA活性。如果R235和R498也被替换, 那么NA活性急剧下降。这7个氨基酸残基认为是NA活性位点, 全部被替换则在细胞表面表达的蛋白几乎完全没有NA和受体识别活性。如果通过外源的或同其它蛋白共同表达的方式提供NA活性, 那么受体识别活性可部分恢复。另外两个保守氨基酸I175和K236也能导致可检测NA活性的完全丧失。I175和D198的氨基酸突变也能改变NA的活性。NA活性缺失导致HA活性的丧失, 这说明NA活性位点对于吸附功能虽然不是决定性的, 但是吸附功能所必需的[19]。
Mc Ginnes LW (1994) 对13株不同毒株NDV的HN蛋白进行分析发现所有毒株有12个保守的半胱氨酸, 2个是可变的。一个位于第六位aa处, 在胞质区, 另一个在外功能区, 位于123aa处。为了研究非保守性半胱氨酸对蛋白质结构和功能的影响, 将AV株NDV的C6突变为S6和 (或) C123突变为W123。这3种突变体蛋白的吸附活性、NA活性和融合促进活性都有所降低。并且3种突变体HN蛋白低聚物的抗原位点特异性发生变化。这一结果表明非保守性半胱氨酸通过影响蛋白的低聚物结构调节蛋白的生物学活性[20]。
近期用共结晶方法研究发现:HN上存在第二个唾液酸结合位点, 第二个唾液酸结合位点对NA作用无影响, 但可影响HN的促进融合作用。如无第二唾液酸结合位点, NDV感染细胞的速度明显下降[21]。
Stone-Hulslander J (1999) 在对HN蛋白柄状结构分析时确定了两个七价重复序列, 对其进行二级结构分析, 表明这些区域有形成α螺旋的可能性。为了研究这一序列对融合促进作用的重要性, 对七价重复序列中疏水氨基酸突变成丙氨酸和甲硫氨酸, 突变蛋白保持了大于或等于野生型的吸附活性、同构象特异性单克隆抗体和多克隆抗血清反应的活性。但对神经氨酸酶活性有不同程度的影响。每一种突变蛋白的融合促进活性大大降低。HN蛋白柄状功能区七价重复序列中氨基酸对蛋白的融合促进活性是很重要的。HN蛋白与F蛋白通过两种蛋白的七价重复序列特异性结合[22]。
2.3 M蛋白及其基因特点
M蛋白即基质蛋白 (Matrix) , 基因长度为1 241 bp, 有一个开放阅读框, 编码一个346个氨基酸的多肽, 分子量约40 k D。M蛋白是NDV囊膜除F、HN蛋白之外的第三种蛋白。M蛋白既与膜结合又与病毒核衣壳结合, 它位于囊膜和核衣壳之间, 一部分镶嵌在囊膜内, 另一部分与核衣壳相互作用, 成为囊膜的基质蛋白层[22,23]。M蛋白在病毒粒子形成囊膜过程中起重要作用, 其功能是参与病毒子的组装和调节病毒RNA的合成[8]。研究表明, M蛋白与F蛋白有密切的关系, M蛋白突变株, 不能将F蛋白组装进入病毒粒子, 也就不能形成有感染性的病毒子。
2.4 L蛋白及其基因特点
L蛋白是由靠近基因组5’端的转录本编码合成的, 每个病毒约有50个考贝, L蛋白可能是一种病毒RNA聚合酶, 长度约2 200个氨基酸。L蛋白与P蛋白形成具有聚合酶活性的复合物, 但P/L蛋白复合物的聚合酶活性还需要NP/RNA模板的存在, 一些具有转录活性的核衣壳包含5~10个P/L蛋白, 并且这种复合物在体外能使m RNA5’端戴帽, 3’端加poly (A) 尾, 其3’端多聚腺苷酸化是在病毒聚合酶催化作用下, 通过与RNA 5’端之前的一段多聚U互补形成的, 而5’端的戴帽则需要鸟苷酸转移酶或甲基转移酶活性, 后者的酶活性是通过L蛋白提供的。有研究还发现, L蛋白能够使NP和P蛋白磷酸化, 因此认为L蛋白可能还是一种蛋白激活酶[24]。
2.5 NP蛋白及其基因特点
核衣壳蛋白NP又称为N蛋白, 它由489~553个氨基酸组成, 分子量53.167~57.896 k D, NP含有两个功能域, 其N端为RNA结合域, 约占整个NP蛋白长度的80%, 且是高度保守的。对大量分离的NDV NP蛋白氨基酸序列分析, 发现N末端区域 (1~401氨基酸残基) 高度保守, C末端区域可变性高。从NP蛋白全基因序列为基础的系统进化树分析表明:可将这些分离株分为两组:一组为致病性毒株, 另一组为非致病性毒株, 用限制性内切酶Pst I进行酶切分析, 结果表明:致病性毒株可被切开, 而非致病性毒株不能被切开[25,26]。
2.6 P蛋白及其基因特点
副粘病毒科的所有病毒P基因均为多顺反子, NDV的P基因有一个3, -UUUUUUCCC-5, 序列, NDV聚合酶在此序列复制时有时会插入1个或2个无模板的G, 无模板的核苷酸插入会造成上游4个碱基处1~2个不稳定配对 (U∶G) , 实际在NDV中, P基因的转录编辑多为插入两个G的V-P的编辑方式, 形成的W蛋白 (33KD非结构蛋白) 分子量在不同株系均不相同, P基因的少数编辑插入1个G, +1阅读框形成V蛋白, 即通常形成36KD非活性碱性蛋白。P、V、W具有共同的N端, 但在C端由于阅读框移位而不同[22]。V蛋白有一个半胱氨酸富集的C末端功能域, 可结合2个Zn原子。这一C末端功能域可起到干扰素 (IFN-α/β) 对抗物的作用, 能抑制IFN-α/β的抗病毒作用[27]。NDV的NP蛋白和P蛋白均参与病毒基因组的转录和复制。体外蛋白结合试验用于检测NP蛋白、P蛋白的相互作用区域。高度作用区域在NP蛋白N末端25个氨基酸处, 即使NP蛋白C末端去除114个氨基酸, 这2个蛋白仍能保持高度作用。这一作用模式同其他副粘病毒如仙台病毒、麻疹病毒不同, 这2种病毒NP蛋白的C末端在同P蛋白的结合中起重要作用[28]。
3 NDV基因工程疫苗
国内外许多研究室从上世纪80年代末开始利用重组DNA技术研制NDV基因工程疫苗, 在亚单位苗和活载体疫苗、DNA疫苗方面都进行了探索。F蛋白、HN糖蛋白是新城疫病毒的主要宿主免疫保护性抗原, 因此, F蛋白、HN糖蛋白成为研制NDV亚单位苗、活载体疫苗和DNA疫苗的热点, 并且已在多种系统中得到表达。
3.1 亚单位苗
亚单位苗是将NDV保护性抗原基因在原核或真核系统中表达所获得的产品制成的疫苗, 它具有安全性好, 稳定性好, 便于保存和运输, 易于批量生产的优点。杆状病毒载体系统是研制NDV亚单位苗的主要工具, 它是以昆虫杆状病毒为外源基因载体, 以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。与细菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统相比, 杆状病毒表达系统具有表达产量高、产物可进行翻译后加工的特点。该系统表达产物的抗原性、免疫原性等生物活性与天然蛋白相似, 并可通过感染昆虫幼虫从而大量提取基因工程产品。迄今为止, 已有NDV B1 Hitchner株、Miyadera株、D26株的HN和F基因在杆状病毒系统中表达。经检测表达的F和HN均经过糖基化加工, HN具有神经氨酸酶和血凝素两种活性。用感染重组杆状病毒的家蚕或组织细胞加工制备成油佐剂疫苗, 能使免疫接种的试验鸡产生对强毒攻击的抵抗力[30,31]。
3.2 活载体疫苗
虽然亚单位疫苗显示了良好的免疫和安全性能, 但是受禽用疫苗价格的限制, 往往难以推广和利用。因此, 近年NDV基因工程疫苗疫苗的研制热点转向以采用病毒或细菌为载体的活疫苗技术路线, 这方面的研究开始于用痘苗病毒构建重组病毒, 随后发展了包括其他种类痘病毒、疱疹病毒、反转录病毒和沙门氏菌减毒株等活载体重组体, 其中又以重组痘病毒和重组疱疹病毒研究最为深入。经过实验, 这些重组体作为疫苗是有效的, 兼有活疫苗和亚单位疫苗的特点, 所表达的抗原可成功地诱导各种形式的免疫应答。
3.2.1 疱疹病毒活载体疫苗:
由于疱疹病毒的复制利用细胞酶系统, 所以采用真核启动子构建重组病毒。1991年Morgan R.W等将NDV的HN、F基因分别克隆入火鸡疱疹病毒 (HVT) 的复制非必需区US2, 利用Rous肉瘤病毒LTR的强启动子构建了重组HVT。重组HVT在组织培养和鸡体内都十分稳定, 保持了充分的感染性[32]。实验证明, 接种该活载体疫苗的商品鸡对NDV强毒攻击有抵抗能力。
3.2.2 痘病毒活载体苗:
自本世纪80年代重组DNA技术应用于痘苗技术后, 痘苗病毒已被开发为各种类型的表达载体, 广泛应用于表达各种具有生物活性的蛋白质。痘病毒是最大的DNA病毒, 基因组长约180~300 kb。用其作为病毒活载体可容纳较多的外源基因, 并有大量的复制非必需片段可作为插入外源基因的位点。构建重组痘病毒分2步进行:第一步是构建转移载体质粒, 此质粒带有痘苗病毒启动子, 其下游连接外源基因, 在它们的两侧为痘病毒复制非必需DNA序列。第二是将转移载体质粒导入痘病毒感染的细胞中, 痘病毒DNA与质粒中的同源序列在细胞内发生同源重组, 由此将外源基因组装到痘病毒基因组的特定部位, 而构建出重组痘病毒。十多年来, 已有许多种表达NDV基因的重组痘病毒被构建。
但由于痘苗病毒感染包括人及多种动物在内的广泛宿主, 而且有个别种痘副反应, 尤其是免疫缺陷个体接种痘苗病毒后, 可能发生病毒血症, 并有散毒的危险, 因此以痘苗病毒为载体的重组痘苗的安全性引起了人们越来越多的担忧, 重组痘苗病毒的发展受到限制。基于以上考虑, 鸡痘病毒、鸽痘病毒等具有宿主限制性的禽痘病毒无疑是研制ND基因工程疫苗的理想载体, 不论是单独表达F或HN糖蛋白之一, 还是共表达F和HN糖蛋白重组禽痘病毒, 都能使SPF免疫鸡产生对强度攻击的保护作用。利用r FPV-HN重组病毒免疫4周龄SPF鸡, 发现其对鸡有良好的保护作用, 而非免疫鸡却不能抵抗NDV强毒的攻击。对接种后雏鸡产生的ELASA、HI抗体进行检测, 虽然抗体滴度明显低于活苗组, 仅为1∶16, 但对NDV强毒攻击保护可达80%, 表明重组病毒介导的体液免疫应答并不很强, 因此细胞免疫应答可能在重组r FPV-HN对雏鸡的保护中起着重要作用, 其免疫机理尚需深入研究。另外, 用不同计量对雏鸡进行免疫, 获得的保护力有明显差异, 实验结果可能与表达载体种类有关。我国鸡痘弱毒疫苗株是安全有效的预防鸡痘感染的活疫苗, 以其为载体制备基因工程活疫苗有着良好的开发前景[33]。
由于鸡痘病毒和鸽痘病毒疫苗对雏鸡增重有轻度的抑制, 所以一些研究者近年来探索了改进重组禽痘病毒疫苗的方法, 其中之一就是在疫苗中加入免疫调节因子。细胞因子被认为参与免疫调节和炎性反应过程, 有免疫佐剂的活性, 能增强疫苗的免疫保护作用。1990年表达F基因的重组鸡痘病毒在美国注册, 1995年美国农业部正式批准重组鸡痘病毒活载体苗Vector VAX FP-N的商品化, 该重组活疫苗免疫效果与常规NDV疫苗相当, 并且一次免疫即可保护鸡抵抗NDV强毒的攻击[30]。
FPV的基因组内具有较多的非必需区, 如将几种禽类的传染病病原的保护性抗原基因插入在这些区域内构建成多价重组鸡痘活疫苗, 以避免现今禽病免疫程序复杂的特点, 将会产生巨大的社会与经济效益, 由于大部分病毒的基因克隆已经完成, 现今急需的研究工作是在研究FPV的基因调节的基础上, 筛选出较强的启动子和更有效的插入位点, 以便构建有实际应用的多价重组鸡痘病毒疫苗。
3.2.3 减毒沙门氏菌载体活疫苗:
沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌, 通过基因工程方法减毒的沙门氏菌对宿主致病性显著降低, 但仍保留良好的侵袭力, 可直接将真核表达质粒携带进入动物细胞内表达相应的蛋白。通过对含重组质粒的减毒沙门氏菌的体外传代实验证实该重组质粒时非常稳定的, 免疫荧光实验和Western印迹等结果也客观地反映了表达的F蛋白具有免疫反应性[34]。
3.2 DNA疫苗
DNA是将外源基因克隆到表达质粒上, 直接注入到动物体内, 使外源基因在活体内表达, 产生抗原从而激活免疫力。在NDV疫苗的研究方面, 日本学者Sakaguchi等将NDV F基因插入质粒载体, 1周龄试验鸡肌肉内注射重组质粒后, 有2/5注射线性质粒的鸡和4/5注射线性质粒和脂质体转染剂混合物的鸡产生了高水平针对F蛋白的抗体, 而注射闭环状质粒的鸡不能产生抗体。免疫9个星期后, 体内有抗体的试验鸡都能抵抗致死剂量NDV强毒的攻击[30]。
含有编码IBDV和NDV抗原蛋白的核酸疫苗同DMSO以1:1的比例混合经皮肤免疫鸡, 这一二联DNA疫苗可诱导产生Ig A和Ig M。使用DMSO配合DNA疫苗免疫期可持续15周, IBDV、NDV攻毒后保护率均为86%[35]。
顾惠明等 (2004) 将新城疫热稳定性天然弱毒株B95株的F基因与真核表达载体pc DNA3.1连接构建了新城疫核酸疫苗, 并用所构建的新城疫核酸疫苗与阳离子脂质体结合进行了免疫试验, 通过ELISA、淋巴细胞转化试验检测了核酸疫苗在鸡体内的表达。结果显示, 表达产物作为抗原物质刺激机体产生了特异性应答反应, 引起了机体特异性的体液免疫和细胞免疫, 对新城疫强毒攻击的保护率为75%[36]。
3.4 新型疫苗
美国农业部的专家采用分子生物学技术获得了一种新型疫毒颗粒疫苗。该疫苗的特点是有关病毒复制的遗传物质被去掉, 因此病毒粒子在机体内不能复制, 也不会在家禽中传播能良好的诱发机体的保护性免疫应答, 并能有效区分疫苗株和野毒感染。在研究中, 采用1日龄雏鸡接种该疫苗, 鸡群可获得全部保护。该疫苗接种后不良反应较弱毒疫苗少[37,38]。
新城疫病毒作为病毒载体构建重组病毒疫苗也是目前研究的热点。Swayne DE (2003) 采用NDV弱毒株B1株作载体, 插入H7型AIV的HA基因, 构建了重组病毒。动物试验表明重组病毒对NDV强毒株和高致病力AIV的保护率为40%[39]。Huang Z (2004) 用NDV La Sota株为病毒载体, 表达鸡法氏囊病毒 (IBDV) 变异株GLS-5的保护性基因VP2。经实验证明, 该重组病毒遗传学上稳定, 能够表达VP2蛋白。将此重组病毒作为疫苗接种鸡后, 用NDV GB株和IBDV GLS-5株攻毒, 保护率可达90%[40]。
免疫接种是控制ND的主要手段。NDV有一系列不同毒力的毒株, 但血清学实验表明其抗原性差异很小, 不存在毒株特异性免疫问题, 即所有的NDV疫苗都可抵抗不同毒株的感染[29]。目前使用新城疫的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗两种, 这2种疫苗都有其局限性和缺点。灭活疫苗接种后不出现Ig A和Ig M, 仅有高水平的Ig G抗体, 然而Ig G不能转运到肺部;弱毒疫苗经滴鼻点眼, 气雾免疫后不仅能在呼吸道和消化道及哈德氏腺出现分泌型Ig A和Ig M, 还可产生高水平的Ig G抗体, 但是使用弱毒疫苗能向环境中排毒, 在高度的免疫和消毒压力下容易产生病毒基因突变。对鸡群在整个饲养期内多次进行免疫接种, 仍有可能感染新城疫病毒 (NDV) 强毒, 造成非典型ND流行, 且二者都不能区分自然感染与免疫感染, 这就给ND的诊断和清群带来了困难。然而, 就目前的研究结果来看, 基因工程疫苗具备了灭活疫苗安全性好和弱毒疫苗可产生粘膜免疫的优点, 并且可达到同常规疫苗相当的保护率, 是完全有可能取代常规疫苗的。
新城疫病毒(NDV) 篇2
鹅源新城疫病毒F和HN基因的表达及功能鉴定
鹅源新城疫病毒的F和HN基因经RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pCR2.1载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了F基因的表达载体(pCI-F)和HN基因的表达载体(pCI-HN).间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明:F和HN基因均能在细胞中得到较好的表达;将pCI-F和pCI-HN共转染CEF和COS细胞,转染的细胞中能形成明显的合胞体.而用pCI-F单独进行转染时,不能产生合胞体,说明F蛋白要发挥其融合作用必须要有HN蛋白的`参与,同时也进一步证明F和HN蛋白与病毒的融合特性密切相关.
作 者：胡顺林 张艳梅 孙庆 吴艳涛 刘玉良 刘秀梵 HU Shun-lin ZHANG Hai-mei SHUN Qing WU Yan-tao LIU Yu-liang LIU Xiu-fan 作者单位：扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009 刊 名：扬州大学学报（农业与生命科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF YANGZHOU UNIVERSITY(AGRICULTURAL AND LIFE SCIENCE EDITION) 年，卷(期)： 27(4) 分类号：Q786 S852.65+9.5 关键词：鹅 新城疫病毒 F蛋白 表达 合胞体鸡新城疫病毒的分离和鉴定 篇3
1 材料和方法
1.1 鸡胚、鸡、血清
10日龄SPF鸡胚、2月龄SPF鸡均购自济南斯帕法斯家禽有限公司;新城疫病毒阳性血清购自中国兽医药品监察所。
1.2 病料样品的采集与处理
无菌采取病死鸡的气管、淋巴结等组织病料按1:3加入生理盐水, 用研磨器反复研磨, 12 000 r/min离心10 min, 取上清液依次加入终浓度分别为2 000 I-U/m L的青霉素、链霉素和卡那霉素, 置于4℃放置6h, 即得处理后的病料样品。
1.3 病毒分离传代
将处理后的病料样品接种10日龄SPF鸡胚10枚, 0.2 m L/胚, 弃去24 h死亡的鸡胚, 收集24 h之后死亡的鸡胚尿囊液, 传3代, 收集每一代的死亡鸡胚尿囊液, 取第3代病毒尿囊液做下面的毒株鉴定。
1.4 分离毒株血凝性测定
按照常规血凝实验方法测定第3代分离毒对1%鸡红细胞的凝集性。
1.5 分离毒株鸡胚半数致死量 (ELD50) 的测定
将第3代病毒尿囊液做10倍系列稀释, 取10-6, 10-7, 10-8三个稀释度分别接10日龄SPF鸡胚5枚, 弃去24 h死亡的鸡胚, 记录接种后24 h死亡且胎儿病痕明显的鸡胚, 按Reed-Muench法计算ELD50。
1.6 中和试验
将第3代病毒尿囊液与等量新城疫病毒阳性血清混合, 室温中和1 h后, 接种10日龄SPF鸡胚10枚, 0.2 m L/胚, 弃去24 h死亡的鸡胚, 观察鸡胚死亡情况, 至120 h, 取所有活胚尿囊液做凝集实验。
1.7 动物回归试验
将分离的第3代病毒接种健康2月龄SPF鸡10只, 每只鸡气管内注射0.1m L, 观察接种后鸡的发病情况。
1.8 RT-PCR鉴定
将分离的第3代病毒按照参考文献[3]的方法提取病毒基因组RNA, 并按照文献[2]中的RT-PCR反应程序进行PCR扩增, RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果。
2 结果与分析
2.1 病毒分离与胚体病变观察结果
鸡胚接种病料样品后48 h开始出现死亡, 一般在72~96 h死亡较多, 取死亡鸡胚剖检可见全身有出血点, 鸡胚缩小, 发育不良。
2.2 血凝性的测定结果
通过血凝实验, 测定第3代分离毒的血凝价为28。
2.3 ELD50的测定结果
第3代分离毒的ELD50为107.83/0.1 m L。
2.4 中和试验结果
第3代分离毒与新城疫阳性血清中和后, 接种10日龄SPF鸡胚10枚全部健活, 活胚尿囊液对1%鸡红细胞无凝集性, 说明分离毒株可以被新城疫病毒阳性血清特异性中和。
2.5 动物回归试验结果
第3代分离毒接种健康SPF鸡后, 接种第3 d开始发病, 发病鸡食欲下降, 精神萎靡, 翅下垂, 眼半闭半睁, 后期出现咳嗽和呼吸困难, 5 d后全部死亡。剖检死亡鸡可见全身出血, 消化道和呼吸道出血明显。
2.6 RT-PCR鉴定结果
PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳, 在511 bp处出现特异性扩增条带, 与预期大小一致, 说明扩增产物为新城疫病毒的特异性序列, 分离毒株为新城疫病毒。
3 讨论
本研究通过对现地感染的病鸡病变组织处理后接种10日龄SPF鸡胚, 通过对分离毒进行血凝性, 中和试验, ELD50测定和动物回归试验及RT-PCR检测, 最终确定鸡场感染新城疫病毒, 为发病鸡场找到致病原及综合防制奠定了基础。新城疫病毒是家禽最常见的病毒性传染病, 各种家禽普遍易感, 各种年龄鸡都可感染, 幼鸡和雏鸡更易感。本病春秋两季高发, 鸡群一旦发生强毒感染, 一般很难净化。新城疫的防治主要通过疫苗免疫接种, 制定科学合理的免疫程序对新城疫的防控至关重要。免疫鸡群也可以发生新城疫病毒感染, 往往由于母源抗体干扰免疫效果导致免疫失败[3], 因此, 新城疫疫苗免疫要掌握好免疫时机, 避开母源抗体高峰期, 一般可以对鸡群的母源抗体效价进行监测, 如果抗体效价高于25则不产生免疫应答, 在23的时候免疫接种可以产生良好的免疫效果。平时需要做好养殖场的环境卫生, 保持鸡舍的温度, 通风良好, 一旦发生患病鸡要及时隔离。此外, 防治新城疫要采取严格的生物安全措施, 加强引种方面的监管, 防止新城疫强毒进入家禽群, 做好定期的免疫接种工作, 提高禽群特异性免疫效果。
摘要：旨在为发病鸡场找到致病原, 本研究利用SPF鸡胚从发病鸡组织中分离到1株病毒, 病毒对1%鸡红细胞的血凝价为28, 病毒的ELD50为107.83/0.1 m L, 病毒可以被新城疫病毒阳性血清特异性中和, 攻击该病毒的SPF鸡表现出典型的新城疫病毒感染症状, RT-PCR鉴定显示该病毒为新城疫病毒。
关键词：鸡新城疫病毒,分离,鉴定
参考文献
[1]肖华平, 黄忍, 魏培, 等.新城疫病毒的最新研究进展[J].中国畜牧兽医文摘, 2016, 32 (4) :43, 87.
[2]梁瑾, 程福亮, 陈甜甜, 等.新城疫病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国生物制品学杂志, 2013, 26 (2) :265-267.
新城疫病毒(NDV) 篇4
采用流式细胞检测技术对表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒(rFPV-gB-F)、新城疫弱毒疫苗以及传染性喉气管炎弱毒疫苗免疫和传染性喉气管炎以及新城疫强毒攻击后外周血T细胞表型亚类(CD4+、CD8+、TCRγδ+)的.变化动态进行监测.重组疫苗和禽痘疫苗免疫之后,CD8+和TCRγδ+的细胞数先升高后回落;在NDV强毒攻击之后,ND疫苗免疫组的TCRγδ+数量升高,rFPV-gB-F免疫组的三种细胞数量在第1周都下降,随后升高;ILT疫苗在免疫后的第1周,CD4+细胞数量下降.结果提示rFPV-gB-F可以诱发相应的细胞免疫应答,但是有关传染性喉气管炎病毒导致的细胞免疫需要进一步的研究.
作 者：智海东 王云峰 孙永科 张晶 王玫 彭金美 刘永刚 童光志 ZHI Hai-dong WANG Yun-feng SUN Yong-ke ZHANG Jing WANG Mei PENG Jin-mei LIU Yong-gang TONG Guang-zhi 作者单位：智海东,王云峰,张晶,王玫,彭金美,刘永刚,童光志,ZHI Hai-dong,WANG Yun-feng,ZHANG Jing,WANG Mei,PENG Jin-mei,LIU Yong-gang,TONG Guang-zhi(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001)
孙永科,SUN Yong-ke(西北农林科技大学,动物医学系,陕西,杨凌,712100)
连翘抗鸡新城疫病毒的研究 篇5
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验鸡胚10日龄非免鸡胚, 购自教学实习基地种鸡场。
1.1.2新城疫毒株由中国农业大学微生物实验室提供, 鸡胚尿囊液HA效价为9log2。
1.1.3药品:中药连翘等制成含生药1克/毫升的浓度, 用水提醇沉方法配制成注射液。
1.1.4鸡红细胞悬液参照《禽传染病实验室诊断技术》红细胞悬液的制备方法, 配成体积分数为0.5%的红血球, 现配现用。
1.2试验分组10日龄鸡胚45枚, 随机分成3组, 具体分组情况见表1。
1.3试验方法
1.3.1半数致死量测定将病毒尿囊液稀释不同倍数, 接种非免鸡胚, 得出胚胎半数致死量。经过测定, 鸡胚病毒尿囊液半数致死量的稀释度为1︰106, 正式试验接种稀释度用1︰5×105的尿囊液。
1.3.2药物毒性试验, 将中药原药液用生理盐水作倍比稀释, 将原药液及不同浓度的药液分别接种5枚10日龄鸡胚的尿囊腔, 每只0.2毫升, 置37℃恒温箱孵育72小时, 每天观察存活情况, 鸡胚全部存活的最高药物浓度为正式试验的起始浓度。同时设生理盐水对照组。
1.3.3中药连翘注射液对鸡新城疫病毒增殖的抑制作用测定按1.3.1尿囊液的稀释度和表2的药物浓度做为接种的依据。具体方法如下。
1.3.3.1Ⅰ组每个鸡胚尿囊腔同时接种中药0.2毫升, 病毒稀释液0.1毫升。
1.3.3.2Ⅱ组每个鸡胚尿囊腔同时接种生理盐水0.2毫升, 病毒稀释液0.1毫升。
上述鸡胚在37℃恒温箱中孵育, 每天照蛋2～3次, 弃去24小时内死胚。收取72小时内活胚和24～72小时死胚尿囊液, 低温保存备用。以血凝 (HA) 试验检测每组鸡胚尿囊液的病毒滴度。
2结果
2.1药物毒性实验经过3次重复试验, 中药连翘的原药液及其不同稀释度均对鸡胚无明显致死作用。试验胚存活情况见表2。故用原药液为正式试验的起始浓度。
注:分母为接种胚数, 分子为存活胚数
2.2中药连翘注射液对鸡新城疫病毒增殖的抑制作第Ⅰ组鸡胚在24小时内死1枚, 弃去, 24～72小时死亡4枚, 72小时存活10枚, 收集3枚死亡胚与10枚存活胚尿囊液, HA滴度为0;第Ⅱ组鸡胚在24小时内死亡3枚, 弃去, 24～72小时死亡12枚, 收集12枚尿囊液, HA滴度为7log2;对照组在72小时内无鸡胚死亡, 收集所有活胚尿囊液, HA滴度为0, 详细结果见表3。
3讨论
3.1鸡新城疫是由新城疫病毒感染引起的传染病, 由于疫苗的广泛应用, 使该病多以慢性或散发为特点。鸡新城疫发病后, 目前还无有效疗法。用中药治疗畜禽病毒性传染病, 已有很多成功经验, 但用连翘治疗鸡新城疫只有很少报道。本试验为临床治疗鸡新城疫提供理论依据。
一株新城疫病毒的分离和鉴定 篇6
关键词：新城疫病毒,分离,鉴定
鸡新城疫毒 (Newcastle disease, ND) 是由鸡新城疫病毒 (Newcastle disease virus, ND) 引起, 是危害养禽业最重要的传染病之一, 发病率和死亡率都很高, 给全世界的养禽业造成严重的经济损失[1.2]。新城疫病毒感染的主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血, 近年来随着养禽业规模的扩大, 非典型新城疫不断发生, 免疫失败的增加, 新城疫病毒感染的宿主范围也在不断扩大[3]。根据新城疫病毒感染毒力的强弱将其分为3种类型, 即速发型 (强毒株) 、中发型 (中毒力株) 和缓发型 (弱毒株) [4]。因此, 本研究对临床送检的病料进行了病毒分离, 通过一系列的鉴定, 最后证明该毒株为新城疫强毒株。
1 材料和方法
1.1 材料
SPF鸡及SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司, 新城疫病毒、禽流感病毒 (H5亚型) 、禽流感病毒 (H9亚型) 标准阳性血清购自中国兽医药品监察所。
1.2 病料样品的处理
取湖南省永州市某发病鸡场送检的组织病料加入约5倍体积的灭菌生理盐水充分捣碎、研磨, 反复冻融3次, 12000r/min离心5min, 取上清液加入青、链霉素、卡那霉素, 4℃作用6h后, 12000r/min离心5min, 吸取上清液经0.22μm滤膜过滤, 即得到分离病毒样品, -20℃保存备用。
1.3 病毒SPF鸡胚传代
将上述待分离病毒样品接种10日龄SPF鸡胚, 每胚接0.1ml, 24h内死亡鸡胚弃去, 继续观察至120h, 死亡的鸡胚放4℃保存, 鸡胚全部死亡后收取死胚尿囊液。继续接种10日龄SPF鸡胚, 连续传3代。
1.4 血凝试验 (HA) 和血凝抑制试验 (HI) 的测定
取收获的第3代鸡胚尿囊液, 按常规血凝试验 (HA) 的操作方法测定其对于鸡红细胞的凝集价。按常规血凝抑制试验 (HI) 的操作方法分别测定新城疫病毒、禽流感病毒 (H5亚型) 、禽流感病毒 (H9亚型) 阳性血清对分离病毒血凝抑制性。
1.5 RT-PCR鉴定
根据文献[5]方法, 设计合成引物, 按照其RT-PCR扩增方法对待分离病毒样品与第3代分离病毒进行RT-PCR鉴定。
1.6 鸡胚最小致死量 (MLD) 及平均死亡时间 (MDT) 的测定
取含毒鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水10倍系列稀释 (10-7~10-9) , 取每个稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个, 每胚0.1ml, 观察7d, 每日早晚照胚一次, 记录每组鸡胚中各胚死亡的时间。使所有鸡胚死亡的最高稀释度就是最小致死量 (MLD) , MLD致死鸡胚的平均时间就是鸡胚最小致死量平均死亡时间 (MDT) 。
1.7 脑内致病指数 (ICPI) 的测定
用灭菌生理盐水将尿囊液1:10稀释, 接种10只1日龄SPF鸡, 每只脑内接种0.05ml, 接种鸡连续观察8d, 每天观察时正常鸡得0分, 患病鸡得1分, 死亡鸡得2分, 根据公式ICPI=8d累计发病数×1+8d累计死亡数×2/8d×试验鸡数, 计算该毒株的ICPI。
1.8 病毒含量-鸡胚半数致死量 (ELD50) 的测定
取含毒鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水10倍系列稀释, 取10-7、10-8、10-93个稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个, 每胚0.1ml, 记录接种后24~72h死亡且胎儿病痕明显的鸡胚, 按Reed-Muench法计算分离病毒的ELD50。
1.9 特异性试验
用灭菌生理盐水将尿囊液稀释到105ELD50/0.1ml, 与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清混合, 室温中和1h后, 接种SPF鸡胚10只, 观察120h, 取鸡胚液做血凝试验。
1.1 0 动物回归试验
取收获的第3代鸡胚尿囊液经滴鼻途径接种45日龄SPF鸡10只, 每只0.1ml, 同时取10只45日龄SPF鸡接种灭菌生理盐水作为对照, 隔离饲养, 观察14d。
2 结果
2.1 病毒分离结果
将病料样品接种10日龄SPF鸡胚, 至第2代开始, 接种的鸡胚出现规律性死亡, 鸡胚集中死亡时间在接种后36~60h。收获第3代含毒鸡胚尿囊液, 将其命名为HX株, -70℃冷冻保存。
2.2 病毒血凝性的测定结果
按常规血凝试验方法测定第3代HX株病毒对鸡红细胞的血凝效价为1:512。该病毒的血凝效价可以被新城疫病毒阳性血清所抑制, 而不能被禽流感病毒 (H5亚型) 、禽流感病毒 (H9亚型) 阳性血清所抑制。
2.3 RT-PCR鉴定结果
RT-PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳, 在位于约320bp处可见特异性DNA扩增条带 (附图) , 与文献[5]的报道一致。
2.4 MLD及MDT的测定结果
观察记录结果如表1所示, 得出该毒株的MLD为10-7;如表2所示, 得出该毒株的MDT为42.4h。
2.5 脑内致病指数 (ICPI) 测定结果
观察记录结果如表3所示, 计算得出该毒株的ICPI为1.74 (139/80) 。
2.6 ELD50的测定结果
按Reed-Muench法计算分离病毒的ELD50为10-8.53/0.1m L。
2.7 特异性试验结果
120h内10枚鸡胚全部存活, 血凝试验阴性。
2.8 动物回归试验结果
10只SPF鸡在攻毒后2d开始表现精神沉郁, 采食量明显减少, 瞌睡, 不愿张眼, 第3d开始出现严重的呼吸道症状, 并开始出现死亡, 至第4d全部死亡。解剖病死鸡鸭可见气管内有粘液、岀血, 腺胃乳头点状出血, 盲肠扁桃体、泄殖腔粘膜、十二指肠等均出血。对照组10只SPF鸡没有表现任何症状, 全部健康。
3讨论
新城疫病毒有7个基因型[6], 包括基因I、II、III、IV、V、VI及新的基因VII型, 我国目前使用的疫苗大多属于基因I、II, 新城疫病毒属于RNA病毒, 抗原变异快, 一些新流行毒株常常发生基因型的变异, 所以用常规疫苗进行鸡群的疫苗免疫有时不能获得有效的保护。新城疫疫情发生后所带来的经济损失严重, 该病引起了世界范围内各国学者的广泛关注[7]。近些年来, 新城疫病毒的宿主范围呈扩大趋势, 因此对新城疫的防控提出了严峻的考验, 国内很多研究报道表明新城疫病毒不仅在鸡、鸭中流行, 而且在部分飞禽、鸟类及鸽中流行[8,9,10]。因此很有必要加强对新城疫病毒的广泛监测。强制免疫对我国新城疫的控制起到了很好的作用, 但由于野生飞禽的存在, 非典型新城疫时有发生, 给该病的免疫防控带来很大困难。由于疫苗的不合理不规范使用、消毒及免疫程序不当等原因, 均可能导致免疫失败。一些免疫抑制性疾病也可以导致免疫失败[11]。
本次试验成功的从湖南省永州临床发病送检的病料中分离到一株病毒, 命名为YZ株, 经HA、HI、RT-PCR鉴定、特异性试验证实HX株病毒为新城疫病毒。由于我国广泛使用新城疫弱毒活疫苗, 因此分离到HX株新城疫病毒还不能确诊该鸡场的鸡发病由新城疫病毒感染所至, 故本研究又进行了病毒毒力 (ELD50、MDT、ICPI) 测定和动物回归试验, MDT测定结果为42.4h (强毒株标准为40~60h) , ICPI测定结果为1.74 (强毒株标准为≥1.6) , 动物回归试验显示攻毒鸡能复制出新城疫的典型临床症状, 经过以上试验可以确定分离的HX株病毒为新城疫病毒强毒株。该病毒的成功分离与鉴定, 为发病鸡场找到了发病原因, 为鸡场制定合理的预防与治疗措施提供了依据, 该鸡场虽然已经进行了新城疫疫苗的免疫, 但很可能由于人为的免疫不当或饲养密度大, 卫生条件差等一系列原因引起免疫失败, 该分离毒株具体属于哪个基因型的新城疫病毒有待进一步的分子生物学深入研究。
参考文献
[1]Jindal N, Chander Y, Primus A, et al.Isolation and molecular characterization of Newcastle disease viruses from raptors[J].Avian Pathol, 2010, 39 (6) :441-445.
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[3]秦卓明, 杨英阁, 于可响, 等.影响新城疫病毒分子变异的因素分析[J].中国家禽, 2010, 15 (32) :1-4.
[4]Xiao S, Paldurai A, NayakB, et al.Complete genome sequences of Newcastle disease virus strains circulating in chicken populations of Indonesia[J].J Virol, 2012, 86 (10) :5969-5970.
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一株鸡新城疫病毒的分离与鉴定 篇7
1 材料与方法
1.1 病毒分离
取发病鸡的肝、脾等组织剪碎,按1∶3加入灭菌生理盐水匀浆,3 000rpm离心15min,取上清用0.22μm的过滤器过滤,接种10日龄SPF鸡胚,37℃孵育。弃去24h死亡鸡胚,每天照蛋2次,收集死亡鸡胚,放置于4℃冰箱保存12h后收取尿囊液,盲传3代。
1.2 主要试剂
Trizol Reagent为Takala公司产品;载体系统p GEM-T-easy载体、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自Promega公司;氨苄青霉素、X-gal、IPTG等均购自上海英俊生物技术有限公司;DNA回收纯化试剂盒和质粒提取纯化试剂盒购自Omega公司。
1.3 总RNA的制备
取F3代200μL尿囊液加800μL Trizol试剂,混匀后按Trizol说明书要求提取病毒RNA。
1.4 引物设计与合成
根据Gen Bank已发表的F基因序列设计PCR引物,引物序列如下:上游引物P1序列:5’GCAAGATGGGCTCCA GAC 3’,下游引物P2序列:5’CGGAGGATGTTGGCAGC3’,扩增长度约为463bp,包含F基因裂解位点,引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
cDNA第1条链合成:在20μL反应体积中,含有RNA10μL,5×Buffer 4μL,10 mmol/L d NTP混合液2μL,逆转录酶1μL,RNase抑制剂1μL,随机引物2μL,于42℃水浴反应1h,95℃5min后冰浴2min,置-20℃备用。
PCR扩增cDNA片段以反转录产物为模板进行PCR扩增,反应在25μL体系中进行:10×PCR buffer 2.5μL、25mmol/L Mg Cl22μL、10mmol/L d NTP 1μL、P1 0.5μL、P2 0.5μL、c DNA 4μL、Taq酶0.5μL、灭菌dd H2O 14μL;循环参数:95℃5min;94℃30S;55℃30S;72℃1min,30个循环;72℃7min,4℃保存。
1.6 RT-PCR产物的克隆、筛选和鉴定
参照pGEM-T-easy Vector说明书,将扩增的RT-PCR产物纯化回收产物与pGEM-T-easy Vector连接,转化感受态大肠杆菌DH5α(感受态细胞的制备参照J.萨姆布鲁主编的《分子克隆实验指南》的方法[2]),在LB平板(含Amp+、IPTG、X-gal)上过夜培养。挑选白色菌落,进行PCR鉴定,阳性菌落进行测序。
1.7 序列分析
应用DANStar软件中的Clustal W方法对所分离株与我国常用疫苗毒株Lasota株和我国标准强毒株F48E9进行序列比对。
2 结果与分析
2.1 分离毒株的RT-PCR扩增结果
应用RT-PCR进行扩增,得到与预计大小相符的目的片段,如图1所示。
2.2 重组质粒的鉴定
通过蓝白斑筛选,利用PCR反应,对阳性重组和对照菌做进一步的鉴定。PCR扩增反应体系(25μL):10×Taq Buffer 2.5μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,d NTP(2.5mmol/L)1μL,P1 0.5μL、P2 0.5μL,菌液4μL,dd H2O 12μL;循环参数为:95℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃60s,33个循环;72℃10min。反应结束后取5μL PCR扩增产物,用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析(图2)。
2.3 序列测定与分析
序列分析表明,所扩增的分离株F基因片段的长度为463bp,与设计引物预期扩增的片段长度相符。应用Blast推导出相应的氨基酸序列,在裂解位点的氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,在101位和121位的氨基酸为K和V(图3),与NDV的强毒株特征相符,表明分离株属于基因Ⅶ型,序列比对表明分离株与Lasota株有81.2%同源性,与国内标准强毒F48E9只有82.4%的同源性。
3 讨论
本试验在发病鸡群分离到一株新城疫病毒,具有HA特性,可被ND标准阳性血清所抑制和中和,不能被禽流感(H5亚型与H9亚型)标准阳性血清及EDS-76阳性血清抑制。PCR鉴定进一步确定该致病毒株为新城疫病毒。
研究表明,NDV F蛋白F1/F2多肽裂解位点氨基酸的基序和NDV的毒力密切相关[3,4],F蛋白能否被裂解取决于病毒毒力的强弱和宿主细胞的特性。F蛋白通常以无活性的F0前体形式存在,必须裂解成以二硫键连接的F1和F2亚单位后,才能使病毒具有感染性。强毒株和弱毒株的氨基酸基序分别为112R/K-R-Q-K/R-R-F117和112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117,2种情况都是在117位前裂解开[5,6]。强毒株F0分子能被宿主体内多种细胞蛋白酶裂解,对多种细胞具有感染力,并可导致全身感染,这是F基因致病性的基础[2]。通过对分离株F基因氨基酸序列的分析,发现其裂解位点的序列为112R-R-Q-K-R-F117,与新城疫病毒强毒株的特征相符,从而进一步在分子水平上证明分离株为强毒株。
本次分离株F基因序列和其他具有代表性的NDV毒株进行比较,与我国标准强毒F48E9株在核苷酸的同源性仅为82.4%,与传统的疫苗毒La Sota株仅为81.2%,表明分离的新城疫病毒F基因已经发生了一定变化,这可能是现有新城疫疫苗La Sota免疫后不能形成有效保护,鸡群仍发生新城疫的一个重要原因。
摘要：从广东某发病鸡场分离鉴定出1株鸡新城疫病毒,采用RT-PCR法扩增出包括裂解位点在内的部分F基因,对其进行序列测定后与GenBank中的毒株进行比较。结果表明:所克隆片断长度为463bp;F基因的裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,并且第101位为K(赖氨酸),121位为V(缬氨酸),具有基因Ⅶ型副粘病毒强毒株的特征序列;分离株与Lasota株同源性为81.2%,与我国标准强毒F48E9的同源性只有82.4%,表明该基因已经发生了变化。
关键词：鸡新城疫病毒,F基因,基因Ⅶ型
参考文献
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新城疫病毒(NDV) 篇8
1材料
1.1病毒
NDV La Sota毒株,购自哈尔滨维科生物技术开发公司。
1.2载体与菌株
p Bluscript ⅡKS( + / - ) 和p ET - 28a载体,由温州科技职业学院动物科学系动物病毒研究室保存; E. coli DH5α 和BL21 ( DE3 ) 感受态细胞,购自宝生物工程( 大连) 有限公司。
1.3工具酶和主要试剂
RNA酶抑制剂、PCR反应试剂、DNA Marker ( DL - 2 000、DL - 15 000) 、Prime STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、鼠源反转 录酶 ( M - MLV) 、 IPTG、限制性内切酶( Nde Ⅰ、Sal Ⅰ、EcoR Ⅴ) ,购自宝生物工程( 大连) 有限公司; DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒,购自生工生物工程( 上海) 股份有限公司; Ni - NTA纯化树脂,购自QIAGEN公司。
1.4引物的设计与合成
参照Gen Bank中的NDV La Sota毒株基因组序列 ( 登录号为AF077761) ,利用Primer Premier 5. 0软件设计引物,引物序列: 上游引物P1 5' - GGGAATTCCATATGATGGGGGCTAGCACACCTAG - 3' ( 下画线部分 为Nde Ⅰ 酶切位点 ) ,下游引物P2 5' -ACGCGTCGACCTAGCCAGACCTGGCTTCTC - 3' ( 下画线部分为Sal Ⅰ酶切位点) 。为了扩增出去信号肽和跨膜区的HN基因( 1 593 bp) 及便于构建重组表达载体,在上、下游引物的5'端分别加入酶切位点及多个保护性碱基。引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。
2方法
2.1NDVRNA的提取与反转录
取NDV La Sota毒株疫苗液150 μL,参照相应试剂盒说明书提取病毒RNA,然后反转录合成c DNA。 反转录体系和反应条件: RNA 22 μL,下游引物1 μL, d NTP( 2. 5 mmol / L) 3 μL,DTT 3 μL,65 ℃ 5 min; 冰水浴5 min; 然后加入5 × FS Buffer 8 μL,RNase Inhibitor 1 μL,M - MLV 1 μL,37 ℃ 水浴2 h; - 20 ℃ 保存,备用。
2.2目的基因的PCR扩增与克隆
以反转录得到的c DNA为模板,利用特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系: 5 × Primestar Buffer 10 μL,Primestar 0. 5 μL,d NTP ( 2. 5 mmol / L) 4 μL, 上、下游引物各1. 5 μL,Template( c DNA) 4 μL,d H2O 28. 5 μL。PCR反应条件: 95 ℃ 预变性5 min; 98 ℃ 变性10 s,56 ℃退火15 s,72 ℃ 延伸1. 5 min,共30个循环; 72 ℃终延伸10 min; 电泳鉴定PCR产物。PCR产物胶回收后与p Bluscript Ⅱ KS ( + / - ) 载体于16 ℃ 连接2 h,构建重组质粒,命名为p Blue - NDV HN; 将p Blue - NDV - HN转入E. coli DH5α 感受态细胞中,并均匀涂在含氨苄西林抗性的LB平板上; IPTG诱导17 h后挑取白色阳性菌落,37 ℃ 培养16 h; 参照相应试剂盒说明书提取质粒,将阳性质粒送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序。
2.3NDVHN基因表达栽体的构建与鉴定
用Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切p Blue - NDV - HN,以胶回收试剂盒回收获得HN基因。
用Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切p ET - 28a载体,与HN基因连接,转入E. coli DH5α 感受态细胞中,并均匀涂在含卡那霉素抗性的LB平板上。用Nde Ⅰ和Sal Ⅰ酶切鉴定重组表达载体p ET28a - NDV - HN,鉴定正确后转入E. coli BL21 ( DE3) 感受态细胞中进行表达。
2.4重组表达载体的诱导表达和重组蛋白的可溶性分析
设空载体p ET - 28a作为对照。用含卡那霉素的新鲜LB液体培养基按照1∶100比例分别稀释含p ET - 28a - NDV - HN和空载体p ET - 28a的菌液, 于37 ℃振荡培养至菌液OD600值达0. 6时,用终浓度为1. 0 mmol/L IPTG诱导5 h; 取15 m L菌液, 6 000 × g离心10 min; 弃上清液,加入结合缓冲液重悬沉淀,超声处理后6 000 × g离心分离上清液与沉淀样品; SDS - PAGE检测,确定重组蛋白是否为可溶性表达。
2.5表达产物的SDS-PAGE分析
收集菌液,4 ℃、12 000 r/min离心10 min; 收集沉淀,PBS重悬,加入等体积的2 × SDS凝胶上样缓冲液,煮沸5 min,作为SDS - PAGE电泳上样样品。按照《分子克隆实验指南》[5]中的方法进行SDS -PAGE电泳,同时以含空载体菌体和含重组阳性载体诱导前菌体作为对照。电泳完毕后取凝胶,用考马斯亮兰R250染色,脱色液脱色数次后分析蛋白的表达情况。
2.6重组蛋白的纯化
取诱导后的菌液100 m L,4 ℃、10 000 × g离心10 min; 弃上清液,向细菌沉淀中加入结合缓冲液重悬,超声破碎细胞,10 000 × g离心20 min; 收集上清液,通过Ni - NTA纯化树脂对目的蛋白进行纯化,应用SDS - PAGE对纯化蛋白进行检测。
2. 7重组蛋白的Western - blot检测
将SDS - PAGE凝胶电泳蛋白条带转印到NC膜上,用PBST ( 含0. 05% 吐温 - 20) 洗膜3次,每次3 min; 然后加入抗His - tag单克隆抗体( 一抗,按照1∶2 000比例稀释) ,室温振荡1 h; 再用PBST洗膜3次,每次3 min; 加入1 ∶5 000比例稀释的辣根过氧化酶( HRP) 标记的羊抗鼠 - 抗体( 二抗) ,室温振荡1. 5 ~ 2. 0 h; 再用PBST漂洗3次,每次3 min; 最后置DAB显色液中显色,待条带清晰后迅速用去离子水终止显色。
3结果与分析
3.1NDVLaSota毒株HN基因的克隆和pBlue-NDV-HN的构建与酶切鉴定(结果见图1~2)
1. PCR 产物; M. DL - 2 000 Marker。
由图1可知,经1% 琼脂糖凝胶电泳获得大小约为1 600 bp的目的片段,与预期结果相符。
M1. DL - 2 000 Marker; 1. 双酶切产物; M2. DL - 15 000 Marker。
由图2可知,重组质粒p Blue - NDV - HN构建成功,酶切鉴定正确的重组质粒测序验证正确。
3.2重组表达载体pET28a-NDV-HN的构建与鉴定(结果见图3)
由图3可知,酶切鉴定结果与预期大小一致,说明重组表达载体p ET28a - NDV - HN构建成功。
3.3重组表达载体的诱导表达、可溶性分析与目的蛋白纯化
SDS - PAGE检测结果表明: p ET28a - NDV - HN上清液与沉淀都在约59 ku处表达条带,与预计大小相符。诱导菌液超声离心处理后取上清液和沉淀进行可溶性分析,结果重组蛋白在沉淀和上清液中同时存在,见图4第1,3泳道。通过Ni - NTA纯化树脂对目的蛋白进行纯化,取少量纯化产物进行SDS -PAGE分析,得到较纯的1条蛋白条带,见图4第4泳道。
M1. DL - 15 000 Marker; 1. p ET28a - NDV - HN 双酶切产物; M2. DL - 2 000 Marker。
1. 细菌裂解液沉淀; M. 蛋白分子质量标准; 2. 细菌裂解液上清液; 3. 纯化重组蛋白。
3.4重组蛋白的Western-blot检测(结果见图5)
M. 蛋白分子质量标准; 1. 重组 HN 纯化蛋白。
由图5可知,在59 ku处出现1条清晰的反应条带,说明重组蛋白在大肠杆菌中得到正确表达,并且具有免疫反应原性。
4讨论
ND被世界动物卫生组织( OIE) 列为法定报告的传染病之一。NDV导致鸡群死亡率极高,强毒力毒株引起的死亡率常达100% ,并且广泛分布于世界许多国家。幸免存活的禽类出现生长障碍、产蛋量减少及软皮蛋的现象,这给全球养禽业造成了严重的经济影响[6,7]。疫苗预防接种是控制ND的重要措施,研制新型的基因工程疫苗是ND疫苗研究的重要方向。 HN蛋白作为重要的保护性免疫原之一,其诱导的单克隆抗体具有中和病毒感染的作用[8]。
新城疫病毒(NDV) 篇9
关键词：疑似新城疫病毒,分离,鉴定
新城疫 (Newcastle Disease, ND) 也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟, 是由新城疫病毒 (Newcastle Disease Viurs, NDV) 引起的禽类急性、高度接触性传染病。主要症状是呼吸困难、下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。常造成雏鸡的大量死亡和产蛋鸡的产蛋率下降, 严重损害了养殖户的根本利益。
1 材料与方法
1.1 病料与毒株
采集河北省邢台南和地区某发病种鸡场死亡鸡只的脑、脾、输卵管、肺等组织, 对病毒进行分离鉴定并命名为NH1025株。F48E9标准毒株购自中国兽药监察所。
1.2 试验动物
1日龄公雏鸡, 购自邯郸华裕种鸡场, 隔离饲养至21日龄备用。SPF鸡胚购自北京梅堆亚维通实验动物技术有限公司。
1.3 引物
根据GenBank中收录的NDV F基因序列, 用Premier 5.0设计合成1对引物 (Ps:5'-AT-GGGCTCCAAACCTTCTAC-3'和Pa:5'-CTTG TAGTGGCTCTCATCTG-3') , 引物由上海生物工程有限公司合成。
1.4 主要试剂
新城疫阳性血清、EDS-76阳性血清购自中国兽药监察所;禽流感H5和H9型阳性血清购自哈尔滨兽医研究所;Trizol、pGEM-Teasy载体、M-MLV反转录酶、dNTPs、rTaq酶、2000 DNA Marker购自TIANGEN公司。
1.5 病料处理
无菌采集病死鸡的气管、肺、脑、肝、脾和输卵管等病料剪碎研磨, 用灭菌PBS按照1∶4制备悬液, 反复冻融3次, 8 000 r/min离心10 min, 弃去沉淀, 取上清加入终浓度为4 000 IU/mL的青、链霉素, 37℃作用1.5 h除菌, -20℃保存备用。
1.6 病毒分离鉴定
取处理好的病毒尿囊液0.2 mL接种于5枚9～11日龄的SPF鸡胚尿囊腔中, 将24 h内死亡的鸡胚弃去, 将24 h以后死亡的鸡胚或96 h未死鸡胚置4℃冰箱, 收集尿囊液, 分装, 保存于-20℃冰箱备用。
采用OIE标准规定的β-微量法进行血凝试验 (HA) 和血凝抑制试验 (HI) , 如果标准新城疫阳性血清能够抑制病毒尿囊液的血凝性, 而标准EDS-76阳性血清、禽流感H5和H9型阳性血清不能抑制病毒液血凝性, 则可以判断病毒尿囊液为NDV。
取10只30日龄左右的雏鸡, 将分离毒经滴鼻点眼途径攻毒, 0.l mL/只, 另设接种生理盐水对照组。攻毒后连续观察2周, 记录发病情况, 并采集发病鸡只病料, 进行病毒分离。
1.7 致病力试验
1) 鸡胚半数致死量 (ELD50) 的测定。将分离毒株F3代分别作10-5、10-6、10-7、10-8、10-9几个稀释度, 每个稀释度接种5枚SPF鸡胚, 0.1 mL/胚, 弃掉24 h之内死亡的鸡胚, 之后每隔8 h照胚1次, 记录每个稀释度鸡胚死亡数。
2) 最小致死量致死鸡胚的平均死亡时间 (MDT) 测定。按OIE标准提供的方法操作, 主要步骤:将新鲜的病毒尿囊液作连续10倍系列稀释, 将10-5～10-9的5个稀释度病毒尿囊液接种10日龄SPF鸡胚, 每个稀释度5枚, 0.2 mL/枚, 并设5枚接种PBS液的鸡胚作为对照。37℃孵化器中孵育, 将24 h内死亡的弃去, 之后每隔6 h观察一次, 直至120 h。能够使所有鸡胚致死的病毒的最大稀释倍数即为病毒的最小致死量 (MLD) , MDT是最小致死量 (MLD) 引起鸡胚死亡的平均时间。
1.8 新城疫NH1025株PCR检测
RT:按照TIANGEN公司TIANScript M-MLV反转录酶说明书的步骤进行。
PCR扩增:在0.2 mL的Eppendorff管中依次加入10×buffer 5μL, dNTP Mixture (各2.5 mM) 4μL, 上游引物P上3μL, 下游引物P下3μL, cD-NA 5μL、rTaq酶0.5μL, 加ddH2O使反应总体积为50μL。低速离心10 s, 混匀后置PCR反应仪上进行循环扩增。
反应参数如下:
最后72℃延伸10 min, 4℃保存。
在1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物, 同时设立阴性对照。
2 结果与分析
2.1 病毒的分离
将采集的疑似病料经处理后接种鸡胚, 之后分别在10日龄鸡胚上连续盲传3代, 观察鸡胚情况。大多数鸡胚在接种后40～76 h死亡, 对照组于接种96 h后冻死。与对照组胚体相比较, 死亡胚体呈现全身出血, 特别是胚体的头部、颈部和脚爪出血严重。
2.2 病毒的鉴定
收获NH1025株分离与传代过程中的所有24 h后死亡鸡胚和96 h存活鸡胚的尿囊液, 按β-微量法进行血凝试验。所有死亡胚和存活胚尿囊液经检测均具有血凝性, 血凝价在7log2～9log2之间。分离株的这种血凝性可被NDV标准阳性血清所抑制, 而不能被禽流感H5、H9亚型、EDS-76标准阳性血清等所抑制, 说明此株具有血凝性的分离物为新城疫病毒。
2.3 动物回归试验
动物回归试验结果表明, 接种强毒株的SPF鸡, 大多在48 h左右开始出现呼吸道症状。发病鸡只闭目站立、缩颈不食、颈羽逆立, 接种后第3天开始死亡, 并且于4 d内全部死亡。对照鸡未见异常剖检病死鸡, 与自然发病鸡症状相同, 表现为:气管出血、腺胃乳头、十二指肠、泄殖腔粘膜、盲肠扁桃体等出血。从病死鸡的脑、肝脏、脾脏、气管和肺脏等病料中分离到了有血凝性的病毒, 经血凝抑制试验鉴定为新城疫病毒。
2.4 病毒的毒力测定
1) 鸡胚半数致死量 (ELD50) 。按Kaber法计算新城疫病毒分离NH1025株的ELD50, 结果为:10-8.4/0.1mL。
2) 分离毒株及F48E9株的MDT。NH1025株新城疫病毒及F48E9株MDT的测定结果见表1。
2.5 RT-PCR扩增结果
尿囊液提取RNA, RT-PCR扩增到约1.7 kp的特异性片段, 大小与预期结果相符 (图1) 。
3 讨论
在邢台南和地区分离的NH1025株经HA和HI试验、病毒回归试验、RT-PCR检测, 证明该分离毒株为NDV;并经病毒毒力测定 (ELD50、MDT) 证明分离株NH1025株为新城疫强毒株。
相关研究证明, 当免疫鸡群中新城疫抗体滴度平均达到6Log2以上, 就能够使鸡群抵御新城疫强毒的攻击;然而在目前的生产中, 即使鸡群抗体滴度平均达到8log2～9log2, 同样可能受到NDV的攻击, 甚至造成很高的死亡率。
造成免疫鸡群中新城疫强毒感染的可能原因有:不规范的大剂量使用疫苗、消毒不合理、免疫程序不合理等;一些免疫抑制性疾病, 如鸡马立克氏病、禽淋巴细胞白血病、鸡传染性法氏囊病等, 都能造成疫苗免疫效果的缺失, 容易使鸡群受到野毒的攻击;另外, 环境中大量强毒的存在, 也容易导致鸡群早期感染。