新城疫病毒/鸽（通用9篇）
新城疫病毒/鸽 篇1
鸽新城疫是由鸽I型副黏病毒(PPMV-I)引起的一种以下痢和神经症状为主的急性、败血性、高度接触性传染病，成为当前养鸽业的主要疫病之一[1]。该病起源于1977年的中东，而后随着竞赛、观赏和肉用鸽量的急剧增加，该病迅速在世界范围内广泛传播，现亦广泛流行于我国各地[2,3,4,5]。另外，鸽还可作为病毒携带者将新城疫传染给大范围的易感动物，特别是鸡[6]。不同的禽类甚至是同一品种感染不同的新城疫毒株或分离株所引起的疾病类型和严重程度都存在很大的差异，因此，新城疫比较复杂[1]。为了保护地方养鸽业的健康稳定发展，采用本地流行毒株制备的疫苗对该病的流行起到了显著的预防和控制作用[7]。
2009年笔者收到浙江温州某肉鸽场的5羽肉鸽，患鸽表现为严重的呼吸道症状，出现斜颈、翅膀麻痹和角弓反张现象，肛门周围污染有绿色稀粪，问诊有70%鸽发病。剖检死亡鸽喉头黏液较多，喉头、气管、肺出血严重，心、肝、脾正常;肠道有点状出血。根据流行病学特点、临床症状和剖检变化初步诊断为鸽新城疫，并在实验室进行病毒分离工作，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
试验用SPF鸡胚由山东济南中美合资斯帕法斯家禽有限公司提供;试验用血清：新城疫(ND)及禽流感(AI)标准阳性血清，购自哈尔滨兽医研究所;1%鸡红血球和生理盐水：按常规方法自制。1.2病料处理无菌采取病死肉鸽的肝、肺、脾及脑组织，研磨后按1:5的比例加入无菌生理盐水和终浓度为2 000 IU/m L的双抗，经4℃作用2 h，然后置-20℃冰箱，反复冻融2次，5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。
1.3 鸡胚接种与培养
将上述处理后上清，接种于10枚11日龄的SPF鸡胚，0.1 mL/枚。另设l0枚鸡胚接种无菌生理盐水作对照。37℃温箱孵育，弃去24 h内死亡的鸡胚，以后每6 h观察1次，收集24～96 h死亡的鸡胚，观察鸡胚病变，收获有明显病变的鸡胚尿囊液。
1.4 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验
按常规微量法进行尿囊液血凝效价(HA)，并以抗NDV、抗禽流感阳性血清进行HI反应。
1.5 攻毒试验
用分离的病毒尿囊液0.2 mL，分别对10羽30日龄未进行新城疫疫苗免疫的肉鸽进行攻毒。每天记录死亡和发病情况。
2 结果
2.1 病毒分离结果
经尿囊腔接种的SPF鸡胚在24～72 h内全部死亡，可见死亡胚全身出血，尿囊膜上也有较多的出血点，头端和四肢出血更为严重。
2.2 HA及HI试验结果
尿囊液HA效价为8 log2。用分离毒与新城疫阳性血清做HI试验，其血凝作用可被抑制，而不能被禽流感标准阳性血清抑制。2.3攻毒试验攻毒的10羽肉鸽，在攻毒后第2 d有4羽发病，第4 d全部发病，至第10 d全部死亡。剖检死亡鸽，发现气管内有黏液，咽部黏膜充血并有少量出血点。肺脏坏死，腺胃乳头出血，肌胃与腺胃交接处形成出血带，十二指肠、小肠和直肠黏膜有点状出血点及出血斑。
3 讨论
1)通过临床检查、病理变化、血凝与血凝抑制试验等诊断为鸽新城疫。试验采用SPF鸡胚从发患鸽的肝、肺、脾及脑组织中分离得到一株病毒，该病毒可使鸡胚体出现全身出血性变化，死亡鸡胚的尿囊液具有血凝作用，HA效价达到8log2，这种血凝作用可被鸡新城疫标准阳性血清所抑制，但不能被禽流感标准阳性血清抑制，说明该分离毒株与鸡新城疫病毒含有相同的抗原成分。
2)用该分离毒株做攻毒试验，鸽第2 d即出现临床症状，第5 d全部死亡，鸽的发病率和致死率都比较高，证明该毒株为强毒株。试验也验证了使用SPF鸡胚较容易从患鸽的脑、脾组织分离到病毒，而且分离的病毒HA滴度比较高，也间接证明病原是鸽新城疫病毒，当然也很有必要做分离病毒对雏鸡的致病力试验和相关的病毒分子生物学方面的基础工作，从分子水平揭示分离病毒的相关特征。
3)NDV是引起禽类一种急性、高度传染性疾病，发病率和死亡率均很高。近几年各地常有鸽新城疫的报道，给养鸽业带来巨大的经济损失，因此必须重视该病的发生，严格加强卫生条件和生物防护，重视对肉鸽的免疫，防止新城疫在肉鸽中的流行。鸽新城疫病毒与鸡新城疫病毒虽含有相同的抗原成分[8]，鸽源新城疫病毒与La Sota、V4等传统疫苗株无论是在基因型还是氨基酸同源性比较、系统进化分析方面都存在较大差异，这就说明疫苗株与目前流行的鸽NDV的遗传距离较远[6,9,10,11]，而我国多数地方仍然使用鸡La Sota、V4等传统疫苗株对鸽群进行免疫，因此免疫效果并不理想，最有效的防治措施是采用地方分离株研制的具有高免疫原性的灭活油苗进行免疫接种。另外，做好鸽舍的消毒，及时隔离患鸽，对控制鸽新城疫的发生与流行也具有一定的作用。
摘要：用SPF鸡胚从疑为鸽新城疫的浙江温州某肉鸽场分离到一株毒株。该毒株能凝集鸡红细胞,初代分离毒HA效价高达8 log2;且其凝集作用能被鸡新城疫标准阳性血清抑制;将分离毒回归鸽,复制出与自然病例相似的临床症状和病变,且感染后10d内全部死亡,说明为强毒株。试验结果表明该毒株为鸽新城疫病毒。
关键词：鸽新城疫,分离鉴定,强毒
参考文献
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新城疫病毒/鸽 篇2
鹅源新城疫病毒F和HN基因的表达及功能鉴定
鹅源新城疫病毒的F和HN基因经RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pCR2.1载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了F基因的表达载体(pCI-F)和HN基因的表达载体(pCI-HN).间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明:F和HN基因均能在细胞中得到较好的表达;将pCI-F和pCI-HN共转染CEF和COS细胞,转染的细胞中能形成明显的合胞体.而用pCI-F单独进行转染时,不能产生合胞体,说明F蛋白要发挥其融合作用必须要有HN蛋白的`参与,同时也进一步证明F和HN蛋白与病毒的融合特性密切相关.
作 者：胡顺林 张艳梅 孙庆 吴艳涛 刘玉良 刘秀梵 HU Shun-lin ZHANG Hai-mei SHUN Qing WU Yan-tao LIU Yu-liang LIU Xiu-fan 作者单位：扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009 刊 名：扬州大学学报（农业与生命科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF YANGZHOU UNIVERSITY(AGRICULTURAL AND LIFE SCIENCE EDITION) 年，卷(期)： 27(4) 分类号：Q786 S852.65+9.5 关键词：鹅 新城疫病毒 F蛋白 表达 合胞体新城疫病毒/鸽 篇3
关键词：中心原子；钨铋酸；杂多酸；毒性；新城疫病毒
中图分类号：Q939.4 文献标识码：A文章编号：1674-0432（2012）-10-0046-2
课题项目： 黑龙江省自然科学基金面上项目（B200917）；黑龙江省教育厅课题（11551484，11551502）；黑龙江省卫生厅课题（2012-267）；佳木斯市社科联项目（11056）；佳木斯大学科学技术面上项目（S2011-052）。
新城疫（ND）又叫伪鸡瘟、亚洲鸡瘟，其病原是鸡新城疫病毒，该病在世界各国广泛分布，是鸡常见和多发的一种急性、热性、高度接触性传染病，是一种危害养鸡业比较严重的传染病 [1]。世界各国都在寻找最佳的防治方案，防疫和治疗相结合可收到很好的效果。疫苗防疫是当前较为流行的方法，但由于疫苗在使用前后出现问题，如疫苗失效，免疫程序不合理等问题，常常导致疫苗不能有效地发挥作用[2]，再者，由于病毒发生突变和重组，形成新的病毒，并找到合适的宿主，突破种间屏障[3]。对症治疗方面主要采取血清、干扰素等，治疗效果虽然好，但由于价格高，不能被广泛应用[4]。中药由于其毒副作用小，并有增强免疫作用，并有消除耐药性的功效，但是，其发挥作用时间较慢，为此，主要用于预防应用[5]，最近，一些中药对新城疫有良好的治疗效果被广泛报道[6，7]，抗生素作为治疗药物曾经取得巨大的经济效益，但由于宿主耐受性增强和新的病原体的出现，导致抗生素的疗效降低；在抗病毒方面，西药常为病毒灵、病毒唑，很难对病毒有好的疗效，大多数通过抗生素抑制细菌激发感染，抑制并发症。为此，市场上继续对细菌和病毒有好的疗效药物出现。
杂多酸化合物（POMs）已被报道具有抗细菌、抗肿瘤和抗病毒活性，在抗毒方面，主要研究集中在抗艾滋病（HIV）、疱疹病毒（HSV）等方面，而抗新城疫病毒方面没有报道，为此，为研发出对新城疫病毒高效、价廉、实用的杂多酸化合物，并深入研究其抗病毒机制，本课题通过小鼠急性毒性试验及血凝和血凝抑制试验，对三种中心原子不同的钨铋酸杂多酸的毒性及抗新城疫病毒作用研究，初步探索这三种杂多酸化合物的毒性及抗新城疫病毒作用，为杂多酸化合物的研究向临床方向发展提供基础性实验数据。为临床应用探索理论依据。
1 实验部分
1.1 供试化合物
供试化合物为佳木斯大学药学院刘红副教授合成，并且通过元素分析、红外光谱和单晶X-射线衍射确定其晶体结构。
结构式及缩写：
结构通式：
Na4（OH）[（Cu2EDTA）PW12O40]·17H2O （缩写为PWCu，药物编号为A）
Na4[（Cu2EDTA）SiW12O40]·19H2O （缩写为SiWCu，药物编号为B）
Na2[（Cu2EDTA）H2W12O40]·19H2O （缩写为WCu，药物编号为C）
三种化合物为异质同构体，以PWCu为例，结构图如图1。
1.2 实验动物及分组
在佳木斯大学实验动物中心购进（22±1）克小鼠15只，随机分成3组，每组5只，分别记为对照组，PW12CuEDTA、SiW12CuEDTA、H2W12CuEDTA组，海蓝褐成鸡5只用来采血来制备血凝和血凝抑制试验所需红细胞和阴性血清。
1.3 仪器
F–A2004型电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司），PHSJ–4A型雷磁pH计（上海精科雷磁仪器厂），SZ–97型自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂），VS–1300U型超净工作台 （上海嘉鹏科技有限公司），DA60369型P1000N微量移液器（GILSON），LDZM–40KCS型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），96 孔血凝板：国产， 用前紫外线照射12 h。奥林帕斯倒置显微镜（重庆光学仪器厂）。
1.4 试剂
鸡新城疫低毒力活疫苗（Lasota株）由吉林正业生物制品有限责任公司提供，使前用PBS缓冲液稀释，备用。用加EDTA抗凝管采取鸡心脏血液，参照《禽传染病实验室诊断技术》红细胞悬液的制备方法，配成体积分数为1%的红血球，现配现用[8]。其他试剂均为国产分析纯。
1.5 试验方法
1.5.1 化合物急性毒性试验 将3种化学物用PBS缓冲液稀释后，按稀释最大浓度对小鼠进行灌胃，以确定小鼠的半数致死量，并得出4种化学物的毒性。
1.5.2 化合物药效试验 将上述3种化合物配成不同浓度后，进行血凝抑制试验，得出化合物的血凝效价。化合物配制浓度见表1。通过血凝和血凝抑制試验，测定3种化学物的血凝抑制效价，通过血凝效价体现化合物的药效，反映出化合物对新城疫病毒的抑制作用。
1.6 数据处理
结果以平均值±标准差表示，实验数据采用SPSS 16.0 进行统计分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行差异显著性检验，其中P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 化合物毒性中毒症状
整个实验期过程中，对照组小鼠食欲、行为、精神状态均正常。各染毒组小鼠表现为食欲下降，饮水减少，精神沉郁、目光呆滞、反应迟钝、有避光表现、有的出现先跳跃后抑制状态、走路摇晃或倾斜、排尿，严重时腹式呼吸剧烈，头及后肢抽搐，直至死亡。
2.2 化合物毒性死亡结果
表1 小鼠灌胃染毒后的死亡结果
同竖行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。
由表1看出，按化学药品按WHO急性毒性分级标准，PW12CuEDTA处于5000-15000mg/kg，为微毒化合物；SiW12CuEDTA和H2W12CuEDTA处于500-5000mg/kg，为低毒化合物。
2.3 化合物药效试验结果
表2 化合物抗鸡新城疫病毒效价测定结果
同竖行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。
由表2看出，3种化合物的抗新城疫病毒效价都为1/32时，化合物的浓度使用量H2W12CuEDTA < SiW12CuEDTA < PW12CuEDTA，由此看出3種化合物抗新城疫病毒药效H2W12CuEDTA> SiW12CuEDTA > PW12CuEDTA。
3 讨论
本实验研究了新合成的三种中心原子不同的钨铋酸杂多酸的毒性及抗新城疫病毒作用，含铜化合物具有消毒抗菌功效，如硫酸铜常被用于药浴，进行环境消毒，添加EDTA-Cu显著减轻了粗毒素对香蕉幼苗的伤害[9]。而本实验研究表明H2W12CuEDTA、SiW12CuEDTA、PW12CuEDTA均为含铜化合物，其发挥抗病毒功效，可能与其抗菌消毒功能有关，有机磷农药是我国目前使用最广、使用量最大的杀虫剂之一[10]，其主要通过产生神经系统症状而杀菌，而本实验中PW12CuEDTA为低毒化合物，其可能机制与其化和物有关，磷元素不能有效发挥作用，此外，钨硅类药物在抗病毒方面研究较少，通过本实验研究发现SiW12CuEDTA有很好的抗病毒效果，此外，H2W12CuEDTA的抗新城疫效果最显著，可能由于其核心氢元素引起的，但其深入机制还有待研究。新型杂多酸化合物作为新型的抗病毒活性药物将有广阔的研究前景。
参考文献
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作者简介：程广东（1978-），男，黑龙江佳木斯人，在读博士， 讲师。
一例鸽新城疫病的诊治报告 篇4
关键词：鸽,新城疫病,诊治
1 流行特点
新城疫病主要感染鸡、火鸡、珍珠鸡、野鸡、鹌鹑和鸽, 而鸭、鹅及麻雀等禽类可成为本病的带毒者而不发病。本病各种日龄的禽类均能感染, 雏禽常带有母源抗体, 在1~2周龄内有一定的抵抗力, 以后母源抗体逐渐减弱, 若此时感染了新城疫强毒, 即可爆发本病。
2 发病情况
山西省太原市阳曲县种鸽场, 于2014年10月14日饲养360日龄成年白羽王种鸽、银王种鸽共3000对, 于2016年3月14日鸽群发病, 病鸽表现为拉稀, 食欲不振, 产蛋率突然下降10%, 蛋壳质量下降, 种蛋的孵化率下降50%, 每天死亡22~24对左右, 发病率可达80%, 病死率可达1%。
3 临床症状
鸽群精神萎靡, 闭眼无神, 食欲减退, 饮水量增加, 羽毛蓬乱, 拉绿色、白色或黄色稀便, 病鸽咳嗽、打呼噜, 个别鸽头颈扭向外侧或向背后弯曲, 也有的张口呼吸, 产蛋率由原来的90%下降到80%, 蛋壳质量下降, 但死亡率很低。
4 病理剖检
剖检5对病鸽发现:腺胃黏膜乳头和乳头间有出血点, 在腺胃与肌胃交界处有出血点, 肠黏膜淋巴集结充血肿胀和肠黏膜堤状肿胀, 小肠和盲肠扁桃体肿大、出血和坏死, 十二指肠远端有枣核状肿大及肠管黏膜上有枣核状纤维素性坏死灶。喉、气管内有卡他性渗出物, 有时有出血灶。卵泡和输卵管严重充血和出血。卵黄破裂, 卵黄流入腹腔。
5 实验室诊断
鸽群中随机采集30份血液进行抗体监测, 无菌分离血清后进行血凝与血凝抑制试验。结果表明:抗体滴度的均匀度较差, 24份血清的抗体滴度在log216以下 (即4以下) , 6份血清的滴度在log21024以上 (即12以上) 。根据本病流行特点、结合临床症状、剖检变化, 实验室诊断确诊本病为新城疫病。
6 防治措施
6.1 鸽场发生本病的紧急措施
(1) 鸽场发生新城疫病时, 应立即封锁, 禁止转场或出售, 首先是严格隔离病鸽, 无害化处理死鸽, 对污染的环境进行彻底消毒, 待最后一个病例处理两周后, 不再有新病例发生, 并通过彻底消毒, 方可解除封锁。
(2) 本场对发病的鸽群先肌肉注射新城疫多联高免蛋黄液0.75ml, 且在其中加入头孢, 按每只0.01g的剂量加入注射, 连注3天, 每天1次, 同时用板蓝根或黄芪提取物饮水或拌料, 150kg水兑250ml壹清, 病情严重可加大剂量。等病情稳定, 不出现死鸽时, 又使用新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗 (Lasota+H120株) 2倍剂量点眼或滴嘴, 也可用克隆30疫苗2倍剂量点眼或滴嘴。
(3) 经过以上的治疗, 病鸽经过20多天的时间完全恢复了正常。
6.2 预防工作
(1) 做好平时卫生防疫工作, 鸽场要坚持全进全出饲养制度和定期消毒制度。不从疫区购进种鸽和种蛋, 新购进的应作好检疫工作, 并隔离观察2周以上。防止一切带毒动物 (特别是鸟类) 和污染物进入鸽场, 饲养人员吃、住在场, 谢绝外来人参观, 饲养人员、饲养用具等进出鸽场必须严格消毒, 饲料来源要安全。
(2) 建立免疫监测制度, 对有条件的鸡场, 应定期检测鸽群的新城疫抗体水平, 全面了解鸽群的免疫状态、免疫程序的合理性以及疫苗接种的效果。
连翘抗鸡新城疫病毒的研究 篇5
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验鸡胚10日龄非免鸡胚, 购自教学实习基地种鸡场。
1.1.2新城疫毒株由中国农业大学微生物实验室提供, 鸡胚尿囊液HA效价为9log2。
1.1.3药品:中药连翘等制成含生药1克/毫升的浓度, 用水提醇沉方法配制成注射液。
1.1.4鸡红细胞悬液参照《禽传染病实验室诊断技术》红细胞悬液的制备方法, 配成体积分数为0.5%的红血球, 现配现用。
1.2试验分组10日龄鸡胚45枚, 随机分成3组, 具体分组情况见表1。
1.3试验方法
1.3.1半数致死量测定将病毒尿囊液稀释不同倍数, 接种非免鸡胚, 得出胚胎半数致死量。经过测定, 鸡胚病毒尿囊液半数致死量的稀释度为1︰106, 正式试验接种稀释度用1︰5×105的尿囊液。
1.3.2药物毒性试验, 将中药原药液用生理盐水作倍比稀释, 将原药液及不同浓度的药液分别接种5枚10日龄鸡胚的尿囊腔, 每只0.2毫升, 置37℃恒温箱孵育72小时, 每天观察存活情况, 鸡胚全部存活的最高药物浓度为正式试验的起始浓度。同时设生理盐水对照组。
1.3.3中药连翘注射液对鸡新城疫病毒增殖的抑制作用测定按1.3.1尿囊液的稀释度和表2的药物浓度做为接种的依据。具体方法如下。
1.3.3.1Ⅰ组每个鸡胚尿囊腔同时接种中药0.2毫升, 病毒稀释液0.1毫升。
1.3.3.2Ⅱ组每个鸡胚尿囊腔同时接种生理盐水0.2毫升, 病毒稀释液0.1毫升。
上述鸡胚在37℃恒温箱中孵育, 每天照蛋2～3次, 弃去24小时内死胚。收取72小时内活胚和24～72小时死胚尿囊液, 低温保存备用。以血凝 (HA) 试验检测每组鸡胚尿囊液的病毒滴度。
2结果
2.1药物毒性实验经过3次重复试验, 中药连翘的原药液及其不同稀释度均对鸡胚无明显致死作用。试验胚存活情况见表2。故用原药液为正式试验的起始浓度。
注:分母为接种胚数, 分子为存活胚数
2.2中药连翘注射液对鸡新城疫病毒增殖的抑制作第Ⅰ组鸡胚在24小时内死1枚, 弃去, 24～72小时死亡4枚, 72小时存活10枚, 收集3枚死亡胚与10枚存活胚尿囊液, HA滴度为0;第Ⅱ组鸡胚在24小时内死亡3枚, 弃去, 24～72小时死亡12枚, 收集12枚尿囊液, HA滴度为7log2;对照组在72小时内无鸡胚死亡, 收集所有活胚尿囊液, HA滴度为0, 详细结果见表3。
3讨论
3.1鸡新城疫是由新城疫病毒感染引起的传染病, 由于疫苗的广泛应用, 使该病多以慢性或散发为特点。鸡新城疫发病后, 目前还无有效疗法。用中药治疗畜禽病毒性传染病, 已有很多成功经验, 但用连翘治疗鸡新城疫只有很少报道。本试验为临床治疗鸡新城疫提供理论依据。
一株新城疫病毒的分离和鉴定 篇6
关键词：新城疫病毒,分离,鉴定
鸡新城疫毒 (Newcastle disease, ND) 是由鸡新城疫病毒 (Newcastle disease virus, ND) 引起, 是危害养禽业最重要的传染病之一, 发病率和死亡率都很高, 给全世界的养禽业造成严重的经济损失[1.2]。新城疫病毒感染的主要特征是呼吸困难、下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血, 近年来随着养禽业规模的扩大, 非典型新城疫不断发生, 免疫失败的增加, 新城疫病毒感染的宿主范围也在不断扩大[3]。根据新城疫病毒感染毒力的强弱将其分为3种类型, 即速发型 (强毒株) 、中发型 (中毒力株) 和缓发型 (弱毒株) [4]。因此, 本研究对临床送检的病料进行了病毒分离, 通过一系列的鉴定, 最后证明该毒株为新城疫强毒株。
1 材料和方法
1.1 材料
SPF鸡及SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司, 新城疫病毒、禽流感病毒 (H5亚型) 、禽流感病毒 (H9亚型) 标准阳性血清购自中国兽医药品监察所。
1.2 病料样品的处理
取湖南省永州市某发病鸡场送检的组织病料加入约5倍体积的灭菌生理盐水充分捣碎、研磨, 反复冻融3次, 12000r/min离心5min, 取上清液加入青、链霉素、卡那霉素, 4℃作用6h后, 12000r/min离心5min, 吸取上清液经0.22μm滤膜过滤, 即得到分离病毒样品, -20℃保存备用。
1.3 病毒SPF鸡胚传代
将上述待分离病毒样品接种10日龄SPF鸡胚, 每胚接0.1ml, 24h内死亡鸡胚弃去, 继续观察至120h, 死亡的鸡胚放4℃保存, 鸡胚全部死亡后收取死胚尿囊液。继续接种10日龄SPF鸡胚, 连续传3代。
1.4 血凝试验 (HA) 和血凝抑制试验 (HI) 的测定
取收获的第3代鸡胚尿囊液, 按常规血凝试验 (HA) 的操作方法测定其对于鸡红细胞的凝集价。按常规血凝抑制试验 (HI) 的操作方法分别测定新城疫病毒、禽流感病毒 (H5亚型) 、禽流感病毒 (H9亚型) 阳性血清对分离病毒血凝抑制性。
1.5 RT-PCR鉴定
根据文献[5]方法, 设计合成引物, 按照其RT-PCR扩增方法对待分离病毒样品与第3代分离病毒进行RT-PCR鉴定。
1.6 鸡胚最小致死量 (MLD) 及平均死亡时间 (MDT) 的测定
取含毒鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水10倍系列稀释 (10-7~10-9) , 取每个稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个, 每胚0.1ml, 观察7d, 每日早晚照胚一次, 记录每组鸡胚中各胚死亡的时间。使所有鸡胚死亡的最高稀释度就是最小致死量 (MLD) , MLD致死鸡胚的平均时间就是鸡胚最小致死量平均死亡时间 (MDT) 。
1.7 脑内致病指数 (ICPI) 的测定
用灭菌生理盐水将尿囊液1:10稀释, 接种10只1日龄SPF鸡, 每只脑内接种0.05ml, 接种鸡连续观察8d, 每天观察时正常鸡得0分, 患病鸡得1分, 死亡鸡得2分, 根据公式ICPI=8d累计发病数×1+8d累计死亡数×2/8d×试验鸡数, 计算该毒株的ICPI。
1.8 病毒含量-鸡胚半数致死量 (ELD50) 的测定
取含毒鸡胚尿囊液用灭菌生理盐水10倍系列稀释, 取10-7、10-8、10-93个稀释度各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个, 每胚0.1ml, 记录接种后24~72h死亡且胎儿病痕明显的鸡胚, 按Reed-Muench法计算分离病毒的ELD50。
1.9 特异性试验
用灭菌生理盐水将尿囊液稀释到105ELD50/0.1ml, 与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清混合, 室温中和1h后, 接种SPF鸡胚10只, 观察120h, 取鸡胚液做血凝试验。
1.1 0 动物回归试验
取收获的第3代鸡胚尿囊液经滴鼻途径接种45日龄SPF鸡10只, 每只0.1ml, 同时取10只45日龄SPF鸡接种灭菌生理盐水作为对照, 隔离饲养, 观察14d。
2 结果
2.1 病毒分离结果
将病料样品接种10日龄SPF鸡胚, 至第2代开始, 接种的鸡胚出现规律性死亡, 鸡胚集中死亡时间在接种后36~60h。收获第3代含毒鸡胚尿囊液, 将其命名为HX株, -70℃冷冻保存。
2.2 病毒血凝性的测定结果
按常规血凝试验方法测定第3代HX株病毒对鸡红细胞的血凝效价为1:512。该病毒的血凝效价可以被新城疫病毒阳性血清所抑制, 而不能被禽流感病毒 (H5亚型) 、禽流感病毒 (H9亚型) 阳性血清所抑制。
2.3 RT-PCR鉴定结果
RT-PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳, 在位于约320bp处可见特异性DNA扩增条带 (附图) , 与文献[5]的报道一致。
2.4 MLD及MDT的测定结果
观察记录结果如表1所示, 得出该毒株的MLD为10-7;如表2所示, 得出该毒株的MDT为42.4h。
2.5 脑内致病指数 (ICPI) 测定结果
观察记录结果如表3所示, 计算得出该毒株的ICPI为1.74 (139/80) 。
2.6 ELD50的测定结果
按Reed-Muench法计算分离病毒的ELD50为10-8.53/0.1m L。
2.7 特异性试验结果
120h内10枚鸡胚全部存活, 血凝试验阴性。
2.8 动物回归试验结果
10只SPF鸡在攻毒后2d开始表现精神沉郁, 采食量明显减少, 瞌睡, 不愿张眼, 第3d开始出现严重的呼吸道症状, 并开始出现死亡, 至第4d全部死亡。解剖病死鸡鸭可见气管内有粘液、岀血, 腺胃乳头点状出血, 盲肠扁桃体、泄殖腔粘膜、十二指肠等均出血。对照组10只SPF鸡没有表现任何症状, 全部健康。
3讨论
新城疫病毒有7个基因型[6], 包括基因I、II、III、IV、V、VI及新的基因VII型, 我国目前使用的疫苗大多属于基因I、II, 新城疫病毒属于RNA病毒, 抗原变异快, 一些新流行毒株常常发生基因型的变异, 所以用常规疫苗进行鸡群的疫苗免疫有时不能获得有效的保护。新城疫疫情发生后所带来的经济损失严重, 该病引起了世界范围内各国学者的广泛关注[7]。近些年来, 新城疫病毒的宿主范围呈扩大趋势, 因此对新城疫的防控提出了严峻的考验, 国内很多研究报道表明新城疫病毒不仅在鸡、鸭中流行, 而且在部分飞禽、鸟类及鸽中流行[8,9,10]。因此很有必要加强对新城疫病毒的广泛监测。强制免疫对我国新城疫的控制起到了很好的作用, 但由于野生飞禽的存在, 非典型新城疫时有发生, 给该病的免疫防控带来很大困难。由于疫苗的不合理不规范使用、消毒及免疫程序不当等原因, 均可能导致免疫失败。一些免疫抑制性疾病也可以导致免疫失败[11]。
本次试验成功的从湖南省永州临床发病送检的病料中分离到一株病毒, 命名为YZ株, 经HA、HI、RT-PCR鉴定、特异性试验证实HX株病毒为新城疫病毒。由于我国广泛使用新城疫弱毒活疫苗, 因此分离到HX株新城疫病毒还不能确诊该鸡场的鸡发病由新城疫病毒感染所至, 故本研究又进行了病毒毒力 (ELD50、MDT、ICPI) 测定和动物回归试验, MDT测定结果为42.4h (强毒株标准为40~60h) , ICPI测定结果为1.74 (强毒株标准为≥1.6) , 动物回归试验显示攻毒鸡能复制出新城疫的典型临床症状, 经过以上试验可以确定分离的HX株病毒为新城疫病毒强毒株。该病毒的成功分离与鉴定, 为发病鸡场找到了发病原因, 为鸡场制定合理的预防与治疗措施提供了依据, 该鸡场虽然已经进行了新城疫疫苗的免疫, 但很可能由于人为的免疫不当或饲养密度大, 卫生条件差等一系列原因引起免疫失败, 该分离毒株具体属于哪个基因型的新城疫病毒有待进一步的分子生物学深入研究。
参考文献
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一株鸡新城疫病毒的分离与鉴定 篇7
1 材料与方法
1.1 病毒分离
取发病鸡的肝、脾等组织剪碎,按1∶3加入灭菌生理盐水匀浆,3 000rpm离心15min,取上清用0.22μm的过滤器过滤,接种10日龄SPF鸡胚,37℃孵育。弃去24h死亡鸡胚,每天照蛋2次,收集死亡鸡胚,放置于4℃冰箱保存12h后收取尿囊液,盲传3代。
1.2 主要试剂
Trizol Reagent为Takala公司产品;载体系统p GEM-T-easy载体、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自Promega公司;氨苄青霉素、X-gal、IPTG等均购自上海英俊生物技术有限公司;DNA回收纯化试剂盒和质粒提取纯化试剂盒购自Omega公司。
1.3 总RNA的制备
取F3代200μL尿囊液加800μL Trizol试剂,混匀后按Trizol说明书要求提取病毒RNA。
1.4 引物设计与合成
根据Gen Bank已发表的F基因序列设计PCR引物,引物序列如下:上游引物P1序列:5’GCAAGATGGGCTCCA GAC 3’,下游引物P2序列:5’CGGAGGATGTTGGCAGC3’,扩增长度约为463bp,包含F基因裂解位点,引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
cDNA第1条链合成:在20μL反应体积中,含有RNA10μL,5×Buffer 4μL,10 mmol/L d NTP混合液2μL,逆转录酶1μL,RNase抑制剂1μL,随机引物2μL,于42℃水浴反应1h,95℃5min后冰浴2min,置-20℃备用。
PCR扩增cDNA片段以反转录产物为模板进行PCR扩增,反应在25μL体系中进行:10×PCR buffer 2.5μL、25mmol/L Mg Cl22μL、10mmol/L d NTP 1μL、P1 0.5μL、P2 0.5μL、c DNA 4μL、Taq酶0.5μL、灭菌dd H2O 14μL;循环参数:95℃5min;94℃30S;55℃30S;72℃1min,30个循环;72℃7min,4℃保存。
1.6 RT-PCR产物的克隆、筛选和鉴定
参照pGEM-T-easy Vector说明书,将扩增的RT-PCR产物纯化回收产物与pGEM-T-easy Vector连接,转化感受态大肠杆菌DH5α(感受态细胞的制备参照J.萨姆布鲁主编的《分子克隆实验指南》的方法[2]),在LB平板(含Amp+、IPTG、X-gal)上过夜培养。挑选白色菌落,进行PCR鉴定,阳性菌落进行测序。
1.7 序列分析
应用DANStar软件中的Clustal W方法对所分离株与我国常用疫苗毒株Lasota株和我国标准强毒株F48E9进行序列比对。
2 结果与分析
2.1 分离毒株的RT-PCR扩增结果
应用RT-PCR进行扩增,得到与预计大小相符的目的片段,如图1所示。
2.2 重组质粒的鉴定
通过蓝白斑筛选,利用PCR反应,对阳性重组和对照菌做进一步的鉴定。PCR扩增反应体系(25μL):10×Taq Buffer 2.5μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,d NTP(2.5mmol/L)1μL,P1 0.5μL、P2 0.5μL,菌液4μL,dd H2O 12μL;循环参数为:95℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃60s,33个循环;72℃10min。反应结束后取5μL PCR扩增产物,用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析(图2)。
2.3 序列测定与分析
序列分析表明,所扩增的分离株F基因片段的长度为463bp,与设计引物预期扩增的片段长度相符。应用Blast推导出相应的氨基酸序列,在裂解位点的氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,在101位和121位的氨基酸为K和V(图3),与NDV的强毒株特征相符,表明分离株属于基因Ⅶ型,序列比对表明分离株与Lasota株有81.2%同源性,与国内标准强毒F48E9只有82.4%的同源性。
3 讨论
本试验在发病鸡群分离到一株新城疫病毒,具有HA特性,可被ND标准阳性血清所抑制和中和,不能被禽流感(H5亚型与H9亚型)标准阳性血清及EDS-76阳性血清抑制。PCR鉴定进一步确定该致病毒株为新城疫病毒。
研究表明,NDV F蛋白F1/F2多肽裂解位点氨基酸的基序和NDV的毒力密切相关[3,4],F蛋白能否被裂解取决于病毒毒力的强弱和宿主细胞的特性。F蛋白通常以无活性的F0前体形式存在,必须裂解成以二硫键连接的F1和F2亚单位后,才能使病毒具有感染性。强毒株和弱毒株的氨基酸基序分别为112R/K-R-Q-K/R-R-F117和112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117,2种情况都是在117位前裂解开[5,6]。强毒株F0分子能被宿主体内多种细胞蛋白酶裂解,对多种细胞具有感染力,并可导致全身感染,这是F基因致病性的基础[2]。通过对分离株F基因氨基酸序列的分析,发现其裂解位点的序列为112R-R-Q-K-R-F117,与新城疫病毒强毒株的特征相符,从而进一步在分子水平上证明分离株为强毒株。
本次分离株F基因序列和其他具有代表性的NDV毒株进行比较,与我国标准强毒F48E9株在核苷酸的同源性仅为82.4%,与传统的疫苗毒La Sota株仅为81.2%,表明分离的新城疫病毒F基因已经发生了一定变化,这可能是现有新城疫疫苗La Sota免疫后不能形成有效保护,鸡群仍发生新城疫的一个重要原因。
摘要：从广东某发病鸡场分离鉴定出1株鸡新城疫病毒,采用RT-PCR法扩增出包括裂解位点在内的部分F基因,对其进行序列测定后与GenBank中的毒株进行比较。结果表明:所克隆片断长度为463bp;F基因的裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,并且第101位为K(赖氨酸),121位为V(缬氨酸),具有基因Ⅶ型副粘病毒强毒株的特征序列;分离株与Lasota株同源性为81.2%,与我国标准强毒F48E9的同源性只有82.4%,表明该基因已经发生了变化。
关键词：鸡新城疫病毒,F基因,基因Ⅶ型
参考文献
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新城疫病毒/鸽 篇8
1材料
1.1病毒
NDV La Sota毒株,购自哈尔滨维科生物技术开发公司。
1.2载体与菌株
p Bluscript ⅡKS( + / - ) 和p ET - 28a载体,由温州科技职业学院动物科学系动物病毒研究室保存; E. coli DH5α 和BL21 ( DE3 ) 感受态细胞,购自宝生物工程( 大连) 有限公司。
1.3工具酶和主要试剂
RNA酶抑制剂、PCR反应试剂、DNA Marker ( DL - 2 000、DL - 15 000) 、Prime STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、鼠源反转 录酶 ( M - MLV) 、 IPTG、限制性内切酶( Nde Ⅰ、Sal Ⅰ、EcoR Ⅴ) ,购自宝生物工程( 大连) 有限公司; DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒,购自生工生物工程( 上海) 股份有限公司; Ni - NTA纯化树脂,购自QIAGEN公司。
1.4引物的设计与合成
参照Gen Bank中的NDV La Sota毒株基因组序列 ( 登录号为AF077761) ,利用Primer Premier 5. 0软件设计引物,引物序列: 上游引物P1 5' - GGGAATTCCATATGATGGGGGCTAGCACACCTAG - 3' ( 下画线部分 为Nde Ⅰ 酶切位点 ) ,下游引物P2 5' -ACGCGTCGACCTAGCCAGACCTGGCTTCTC - 3' ( 下画线部分为Sal Ⅰ酶切位点) 。为了扩增出去信号肽和跨膜区的HN基因( 1 593 bp) 及便于构建重组表达载体,在上、下游引物的5'端分别加入酶切位点及多个保护性碱基。引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。
2方法
2.1NDVRNA的提取与反转录
取NDV La Sota毒株疫苗液150 μL,参照相应试剂盒说明书提取病毒RNA,然后反转录合成c DNA。 反转录体系和反应条件: RNA 22 μL,下游引物1 μL, d NTP( 2. 5 mmol / L) 3 μL,DTT 3 μL,65 ℃ 5 min; 冰水浴5 min; 然后加入5 × FS Buffer 8 μL,RNase Inhibitor 1 μL,M - MLV 1 μL,37 ℃ 水浴2 h; - 20 ℃ 保存,备用。
2.2目的基因的PCR扩增与克隆
以反转录得到的c DNA为模板,利用特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系: 5 × Primestar Buffer 10 μL,Primestar 0. 5 μL,d NTP ( 2. 5 mmol / L) 4 μL, 上、下游引物各1. 5 μL,Template( c DNA) 4 μL,d H2O 28. 5 μL。PCR反应条件: 95 ℃ 预变性5 min; 98 ℃ 变性10 s,56 ℃退火15 s,72 ℃ 延伸1. 5 min,共30个循环; 72 ℃终延伸10 min; 电泳鉴定PCR产物。PCR产物胶回收后与p Bluscript Ⅱ KS ( + / - ) 载体于16 ℃ 连接2 h,构建重组质粒,命名为p Blue - NDV HN; 将p Blue - NDV - HN转入E. coli DH5α 感受态细胞中,并均匀涂在含氨苄西林抗性的LB平板上; IPTG诱导17 h后挑取白色阳性菌落,37 ℃ 培养16 h; 参照相应试剂盒说明书提取质粒,将阳性质粒送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序。
2.3NDVHN基因表达栽体的构建与鉴定
用Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切p Blue - NDV - HN,以胶回收试剂盒回收获得HN基因。
用Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切p ET - 28a载体,与HN基因连接,转入E. coli DH5α 感受态细胞中,并均匀涂在含卡那霉素抗性的LB平板上。用Nde Ⅰ和Sal Ⅰ酶切鉴定重组表达载体p ET28a - NDV - HN,鉴定正确后转入E. coli BL21 ( DE3) 感受态细胞中进行表达。
2.4重组表达载体的诱导表达和重组蛋白的可溶性分析
设空载体p ET - 28a作为对照。用含卡那霉素的新鲜LB液体培养基按照1∶100比例分别稀释含p ET - 28a - NDV - HN和空载体p ET - 28a的菌液, 于37 ℃振荡培养至菌液OD600值达0. 6时,用终浓度为1. 0 mmol/L IPTG诱导5 h; 取15 m L菌液, 6 000 × g离心10 min; 弃上清液,加入结合缓冲液重悬沉淀,超声处理后6 000 × g离心分离上清液与沉淀样品; SDS - PAGE检测,确定重组蛋白是否为可溶性表达。
2.5表达产物的SDS-PAGE分析
收集菌液,4 ℃、12 000 r/min离心10 min; 收集沉淀,PBS重悬,加入等体积的2 × SDS凝胶上样缓冲液,煮沸5 min,作为SDS - PAGE电泳上样样品。按照《分子克隆实验指南》[5]中的方法进行SDS -PAGE电泳,同时以含空载体菌体和含重组阳性载体诱导前菌体作为对照。电泳完毕后取凝胶,用考马斯亮兰R250染色,脱色液脱色数次后分析蛋白的表达情况。
2.6重组蛋白的纯化
取诱导后的菌液100 m L,4 ℃、10 000 × g离心10 min; 弃上清液,向细菌沉淀中加入结合缓冲液重悬,超声破碎细胞,10 000 × g离心20 min; 收集上清液,通过Ni - NTA纯化树脂对目的蛋白进行纯化,应用SDS - PAGE对纯化蛋白进行检测。
2. 7重组蛋白的Western - blot检测
将SDS - PAGE凝胶电泳蛋白条带转印到NC膜上,用PBST ( 含0. 05% 吐温 - 20) 洗膜3次,每次3 min; 然后加入抗His - tag单克隆抗体( 一抗,按照1∶2 000比例稀释) ,室温振荡1 h; 再用PBST洗膜3次,每次3 min; 加入1 ∶5 000比例稀释的辣根过氧化酶( HRP) 标记的羊抗鼠 - 抗体( 二抗) ,室温振荡1. 5 ~ 2. 0 h; 再用PBST漂洗3次,每次3 min; 最后置DAB显色液中显色,待条带清晰后迅速用去离子水终止显色。
3结果与分析
3.1NDVLaSota毒株HN基因的克隆和pBlue-NDV-HN的构建与酶切鉴定(结果见图1~2)
1. PCR 产物; M. DL - 2 000 Marker。
由图1可知,经1% 琼脂糖凝胶电泳获得大小约为1 600 bp的目的片段,与预期结果相符。
M1. DL - 2 000 Marker; 1. 双酶切产物; M2. DL - 15 000 Marker。
由图2可知,重组质粒p Blue - NDV - HN构建成功,酶切鉴定正确的重组质粒测序验证正确。
3.2重组表达载体pET28a-NDV-HN的构建与鉴定(结果见图3)
由图3可知,酶切鉴定结果与预期大小一致,说明重组表达载体p ET28a - NDV - HN构建成功。
3.3重组表达载体的诱导表达、可溶性分析与目的蛋白纯化
SDS - PAGE检测结果表明: p ET28a - NDV - HN上清液与沉淀都在约59 ku处表达条带,与预计大小相符。诱导菌液超声离心处理后取上清液和沉淀进行可溶性分析,结果重组蛋白在沉淀和上清液中同时存在,见图4第1,3泳道。通过Ni - NTA纯化树脂对目的蛋白进行纯化,取少量纯化产物进行SDS -PAGE分析,得到较纯的1条蛋白条带,见图4第4泳道。
M1. DL - 15 000 Marker; 1. p ET28a - NDV - HN 双酶切产物; M2. DL - 2 000 Marker。
1. 细菌裂解液沉淀; M. 蛋白分子质量标准; 2. 细菌裂解液上清液; 3. 纯化重组蛋白。
3.4重组蛋白的Western-blot检测(结果见图5)
M. 蛋白分子质量标准; 1. 重组 HN 纯化蛋白。
由图5可知,在59 ku处出现1条清晰的反应条带,说明重组蛋白在大肠杆菌中得到正确表达,并且具有免疫反应原性。
4讨论
ND被世界动物卫生组织( OIE) 列为法定报告的传染病之一。NDV导致鸡群死亡率极高,强毒力毒株引起的死亡率常达100% ,并且广泛分布于世界许多国家。幸免存活的禽类出现生长障碍、产蛋量减少及软皮蛋的现象,这给全球养禽业造成了严重的经济影响[6,7]。疫苗预防接种是控制ND的重要措施,研制新型的基因工程疫苗是ND疫苗研究的重要方向。 HN蛋白作为重要的保护性免疫原之一,其诱导的单克隆抗体具有中和病毒感染的作用[8]。
新城疫病毒/鸽 篇9
关键词：疑似新城疫病毒,分离,鉴定
新城疫 (Newcastle Disease, ND) 也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟, 是由新城疫病毒 (Newcastle Disease Viurs, NDV) 引起的禽类急性、高度接触性传染病。主要症状是呼吸困难、下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。常造成雏鸡的大量死亡和产蛋鸡的产蛋率下降, 严重损害了养殖户的根本利益。
1 材料与方法
1.1 病料与毒株
采集河北省邢台南和地区某发病种鸡场死亡鸡只的脑、脾、输卵管、肺等组织, 对病毒进行分离鉴定并命名为NH1025株。F48E9标准毒株购自中国兽药监察所。
1.2 试验动物
1日龄公雏鸡, 购自邯郸华裕种鸡场, 隔离饲养至21日龄备用。SPF鸡胚购自北京梅堆亚维通实验动物技术有限公司。
1.3 引物
根据GenBank中收录的NDV F基因序列, 用Premier 5.0设计合成1对引物 (Ps:5'-AT-GGGCTCCAAACCTTCTAC-3'和Pa:5'-CTTG TAGTGGCTCTCATCTG-3') , 引物由上海生物工程有限公司合成。
1.4 主要试剂
新城疫阳性血清、EDS-76阳性血清购自中国兽药监察所;禽流感H5和H9型阳性血清购自哈尔滨兽医研究所;Trizol、pGEM-Teasy载体、M-MLV反转录酶、dNTPs、rTaq酶、2000 DNA Marker购自TIANGEN公司。
1.5 病料处理
无菌采集病死鸡的气管、肺、脑、肝、脾和输卵管等病料剪碎研磨, 用灭菌PBS按照1∶4制备悬液, 反复冻融3次, 8 000 r/min离心10 min, 弃去沉淀, 取上清加入终浓度为4 000 IU/mL的青、链霉素, 37℃作用1.5 h除菌, -20℃保存备用。
1.6 病毒分离鉴定
取处理好的病毒尿囊液0.2 mL接种于5枚9～11日龄的SPF鸡胚尿囊腔中, 将24 h内死亡的鸡胚弃去, 将24 h以后死亡的鸡胚或96 h未死鸡胚置4℃冰箱, 收集尿囊液, 分装, 保存于-20℃冰箱备用。
采用OIE标准规定的β-微量法进行血凝试验 (HA) 和血凝抑制试验 (HI) , 如果标准新城疫阳性血清能够抑制病毒尿囊液的血凝性, 而标准EDS-76阳性血清、禽流感H5和H9型阳性血清不能抑制病毒液血凝性, 则可以判断病毒尿囊液为NDV。
取10只30日龄左右的雏鸡, 将分离毒经滴鼻点眼途径攻毒, 0.l mL/只, 另设接种生理盐水对照组。攻毒后连续观察2周, 记录发病情况, 并采集发病鸡只病料, 进行病毒分离。
1.7 致病力试验
1) 鸡胚半数致死量 (ELD50) 的测定。将分离毒株F3代分别作10-5、10-6、10-7、10-8、10-9几个稀释度, 每个稀释度接种5枚SPF鸡胚, 0.1 mL/胚, 弃掉24 h之内死亡的鸡胚, 之后每隔8 h照胚1次, 记录每个稀释度鸡胚死亡数。
2) 最小致死量致死鸡胚的平均死亡时间 (MDT) 测定。按OIE标准提供的方法操作, 主要步骤:将新鲜的病毒尿囊液作连续10倍系列稀释, 将10-5～10-9的5个稀释度病毒尿囊液接种10日龄SPF鸡胚, 每个稀释度5枚, 0.2 mL/枚, 并设5枚接种PBS液的鸡胚作为对照。37℃孵化器中孵育, 将24 h内死亡的弃去, 之后每隔6 h观察一次, 直至120 h。能够使所有鸡胚致死的病毒的最大稀释倍数即为病毒的最小致死量 (MLD) , MDT是最小致死量 (MLD) 引起鸡胚死亡的平均时间。
1.8 新城疫NH1025株PCR检测
RT:按照TIANGEN公司TIANScript M-MLV反转录酶说明书的步骤进行。
PCR扩增:在0.2 mL的Eppendorff管中依次加入10×buffer 5μL, dNTP Mixture (各2.5 mM) 4μL, 上游引物P上3μL, 下游引物P下3μL, cD-NA 5μL、rTaq酶0.5μL, 加ddH2O使反应总体积为50μL。低速离心10 s, 混匀后置PCR反应仪上进行循环扩增。
反应参数如下:
最后72℃延伸10 min, 4℃保存。
在1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物, 同时设立阴性对照。
2 结果与分析
2.1 病毒的分离
将采集的疑似病料经处理后接种鸡胚, 之后分别在10日龄鸡胚上连续盲传3代, 观察鸡胚情况。大多数鸡胚在接种后40～76 h死亡, 对照组于接种96 h后冻死。与对照组胚体相比较, 死亡胚体呈现全身出血, 特别是胚体的头部、颈部和脚爪出血严重。
2.2 病毒的鉴定
收获NH1025株分离与传代过程中的所有24 h后死亡鸡胚和96 h存活鸡胚的尿囊液, 按β-微量法进行血凝试验。所有死亡胚和存活胚尿囊液经检测均具有血凝性, 血凝价在7log2～9log2之间。分离株的这种血凝性可被NDV标准阳性血清所抑制, 而不能被禽流感H5、H9亚型、EDS-76标准阳性血清等所抑制, 说明此株具有血凝性的分离物为新城疫病毒。
2.3 动物回归试验
动物回归试验结果表明, 接种强毒株的SPF鸡, 大多在48 h左右开始出现呼吸道症状。发病鸡只闭目站立、缩颈不食、颈羽逆立, 接种后第3天开始死亡, 并且于4 d内全部死亡。对照鸡未见异常剖检病死鸡, 与自然发病鸡症状相同, 表现为:气管出血、腺胃乳头、十二指肠、泄殖腔粘膜、盲肠扁桃体等出血。从病死鸡的脑、肝脏、脾脏、气管和肺脏等病料中分离到了有血凝性的病毒, 经血凝抑制试验鉴定为新城疫病毒。
2.4 病毒的毒力测定
1) 鸡胚半数致死量 (ELD50) 。按Kaber法计算新城疫病毒分离NH1025株的ELD50, 结果为:10-8.4/0.1mL。
2) 分离毒株及F48E9株的MDT。NH1025株新城疫病毒及F48E9株MDT的测定结果见表1。
2.5 RT-PCR扩增结果
尿囊液提取RNA, RT-PCR扩增到约1.7 kp的特异性片段, 大小与预期结果相符 (图1) 。
3 讨论
在邢台南和地区分离的NH1025株经HA和HI试验、病毒回归试验、RT-PCR检测, 证明该分离毒株为NDV;并经病毒毒力测定 (ELD50、MDT) 证明分离株NH1025株为新城疫强毒株。
相关研究证明, 当免疫鸡群中新城疫抗体滴度平均达到6Log2以上, 就能够使鸡群抵御新城疫强毒的攻击;然而在目前的生产中, 即使鸡群抗体滴度平均达到8log2～9log2, 同样可能受到NDV的攻击, 甚至造成很高的死亡率。
造成免疫鸡群中新城疫强毒感染的可能原因有:不规范的大剂量使用疫苗、消毒不合理、免疫程序不合理等;一些免疫抑制性疾病, 如鸡马立克氏病、禽淋巴细胞白血病、鸡传染性法氏囊病等, 都能造成疫苗免疫效果的缺失, 容易使鸡群受到野毒的攻击;另外, 环境中大量强毒的存在, 也容易导致鸡群早期感染。