人工真皮支架

人工真皮支架（精选4篇）

人工真皮支架 篇1

指甲及甲床处于手指远端,易受重物、机器、锐器等损伤,其中在以Elsahy—B C平面[1]以远的损伤较为常见(如图1),指甲除具有美化手指外,还有有保护指端、增加指腹感觉强度、防止指腹软组织向背侧旋转完成捏、持、剥、搔、掐等精细动作[2],如未予以完整修复,手指外形和功能可遗留有缺陷。故如何利用残存甲近侧皱襞下甲床根再生指甲,获取最大的功能恢复及遗留最小损伤是临床中努力的方向。2014年12月至2016年6月,我们对57例62指的甲床缺损,采用人工真皮支架修复,手术操作简便,疗效满意。

1资料和方法

1.1一般资料

本组共57例62指,男38例43指,女19例19指,年龄14-56岁。致伤原因:压伤、割伤、电锯伤等,甲床缺损最大面积为1.5cm×1.2cm,最小为0.5cm×0.4cm。

1.2手术方法

病例采取神经根阻滞麻醉或臂丛麻醉,常规处理手中骨折、神经、血管损伤,甲床创面彻底止血,用生理盐水反复冲洗,清除血凝块。根据创面大小选择适宜尺寸的人工真皮支架(Pelnac,日本Gunze Limited),剧创面外形裁剪,覆盖于甲床缺损处,海绵层紧贴创面,沿刨面皮缘间断缝合固定,硅胶面切小口,便于引流渗血渗液。术后定期换药,2~3周见表层硅胶膜与胶原海绵层分离,缺损甲床处见粉红色肉芽组织,表明创面类真上皮组织已经形成。

1.3结果

参考吕桂欣等[3]的评定标准,甲床缺损修复的疗效评定依据如下标准:1)外形光滑、无纵嵴及横沟;2)无裂甲、嵌甲、钩甲;3)新生甲附着力达3/5或以上;4)甲上皮无粘连和切迹;5)无感觉过敏及疼痛症状。评价标准:优:达其中4条或以上者;良:有2条或3条达标者;差:只有一条或无达标者。通过临床观察,本组病例获2~12个月随访,手外形及功能优51例,良6例,优良率为100%。患指指甲生长光滑、平坦,外形美观,指端无疼痛及感觉过敏等症状。

1.4经典病例

女,29岁,被刀割伤致右示指甲床大部分缺损(图2),术中使用人工真皮支架(皮耐克)覆盖修复(图3),术后3周予以拆除硅胶膜(图4),见创面生长好,术后10月复查,见指甲正常生长,手指功能好(图5)。

2讨论

指甲的解剖结构包括生发基质、甲床、甲板、甲皱襞等,目前较受大家接受的是一元学说[4]指甲生长仅来源于甲基质,甲床及甲皱襞只是指甲良好生长的条件。指甲甲床的血供[5]主要来自指掌侧固有动脉的尺侧支和桡侧支共同发出的指背动脉弓分支、指腹动脉弓分支及甲皱支,甲床内纵行小动脉在上中1/3及中下l/3交界处相吻合,分别形成甲床第二、第三级动脉弓。由此,拥有再生基质及独立血供系统的甲床,为甲床的损伤及缺损的修复奠定了基础。

顾玉东[6]曾提出甲床缺损可分为三型,其中伴或不伴有甲周、指腹软组织损伤,甲床缺损超过4mm以上时,需甲床断层移植或全层移植或皮肤真皮移植。早期常使用残端修整的方法处理甲床缺损,使病患仅因为甲床的单纯缺损导致手指短缩,最终遗留功能残损,留下一生遗憾。目前常用的甲床缺损治疗方法及优劣对比如下(表1)。

人工真皮支架为再生模板和基材,在人体中具良好生物相容性、可降解性及抗菌性,支持细胞和组织,影响细胞的发展形态,调控和诱导细胞与组织的分化,以此形成新的组织或器官[12]。目前临床常用的人工真皮支架是Pelnac(商品名:皮耐克),由美国科学家Yannas[13]、Burke[14]研制成功,由硅胶薄膜和胶原海绵组成的双层结构,使创面修复时的毛细血管和纤维母细胞等借助胶原海绵的网状支架结构向里面侵入生长,3周左右生长出血运良好的类似真皮的组织,替代人体的真皮结构,覆盖外露的骨面[15]。术中使用人工真皮支架的经验上,主要有三点:1)书中注意保护甲根部,创面雪彻底止血,尽量保证无菌。2)在使用人工真皮支架上,本研究中的绝大多数病例均采用真皮覆盖后间断缝合,和曾林如等[16]报到的需要置长线打包,术后同样可以取得满意的疗效,同时更加简化了手术操作;另外,人工真皮支架全覆盖甲床或仅覆盖缺损处甲床,术后疗效一致。3)在甲根部损伤或缺损的病例不适用,因生发基质受损致新生甲可能不平整或无指甲生长。

综上所述,证实在不伴甲根缺损的不同程度甲床缺损病例中使用人工真皮支架手术操作简单,无需二期手术,不牺牲供区,术后外观及功能几近正常,术后疗效好,病人满意度高,是修复甲床缺损的理想选择。

人工真皮支架 篇2

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

1.1.1 实验动物:健康普通级雌性广西巴马小香猪 (许可证号:SYXK<沪>2004-0004) 12只, 体重 (10±2) kg/只。

1.1.2 主要材料:胶原-磺化羧甲基壳聚糖/硅橡胶双层人工皮肤[3,4] (具有三维多孔结构, 其孔隙率>90%, 平均孔径80～500 μm, 厚度为2 mm, 直径3.1 cm) 。VEGF DNA质粒 (由第四军医大学提供。在大肠杆菌中扩增, 分层沉淀法纯化, 质粒DNA浓度用紫外光谱仪检测260 nm处吸收峰, 在260 nm和280 nm的吸收率为1.7～1.8) 。

1.1.3 其他材料:医用级硅橡胶薄膜;1∶100的I型胶原单克隆抗体;1∶100的TGF-β1单克隆抗体 (细胞表达转化生长因子β1, transforming growth factorβ1) , SP免疫组化检测试剂盒。

1.2 实验方法

1.2.1 载有VEGF DNA质粒的胶原-磺化羧甲基壳聚糖/硅橡胶双层人工皮肤制备:将质量为2 mg的胶原壳聚糖支架 (直径3 cm, 厚度2 mm) 4 ℃下浸泡于DNA微粒溶液中4 h。PBS洗涤2次后置于0.5 ml 25 g/L的木瓜蛋白酶/PBS溶液中 (含4 g/L乙二胺四乙酸 (EDTA) ) , 60 ℃降解过夜。取100 ul待测液和1mg/L Hoechst 33258溶液2 ml混匀后, 立刻在荧光光谱仪上测定吸收强度 (激发波长360 nm, 发射波长460 nm) 。通过标准曲线计算支架中负载的DNA量。每片支架含VEGF DNA质粒0.5 mg。用丙烯酸类胶粘剂将医用级硅橡胶薄膜与载有VEGF DNA质粒的胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架轻轻粘合, 即制备成了双层人工皮肤支架[4]。

1.2.2 实验分组:12只猪分为两组, 6只为胶原-磺化羧甲基壳聚糖人工真皮支架组 (A组) , 6只为负载VEGF DNA质粒的胶原-磺化羧甲基壳聚糖人工真皮支架组 (B组) , 每只猪背部包含的创面分别为同一支架植入后1、2、3周及支架植入1、2周加植表皮2周。两组各取3只猪, 在背部不同支架植入创面旁另造同上2组创面但不植入支架, 作为无支架对照组 (C组) 。

1.2.3 Ⅲ度烧伤创面模型制作:采用3%戊巴比妥腹腔注射和速眠新Ⅱ肌肉注射复合麻醉。将直径2.5 cm的圆柱形铜块在100 ℃水浴箱中升温至 (99.0±0.5) ℃以上, 在猪背部两侧距离后正中线3～4 cm 处恒温恒压持续70 s造成Ⅲ度烧伤[4]。每次制备2～4个创面, 常规清创后聚维酮碘包扎。每日换药一次。

1.2.4 Ⅲ度烧伤创面切痂后两种双层人工真皮支架植入:烧伤48小时后, 同上麻醉后行Ⅲ度烧伤创面切痂, 创面切痂至有出血的正常组织 (脂肪或肌肉) , 切痂直径3.1±0.05cm。A、B两组将直径3.1 cm的两种不同无菌双层人工皮肤支架 (硅橡胶膜面朝上) 植入;C组直接在创面上覆盖硅橡胶膜;受床贴合[3]。

1.2.5 各组创面的取材:A、B组在不同支架移植术后1、2及3周打开内层敷料, 揭下硅橡胶膜, 观察创面, 在创面中间切取1.0 cm ×0.5 cm深至肌层的组织块, 不同时间点对6只猪分别进行取材 (每时间点每组6孔) 。同样对不同时间点的C组创面进行观察和取材。

1.2.6 血管化创面的表皮移植:取厚约1 mm猪刃厚皮, 剪成 (0.5～0.7) cm× (0.5～0.7) cm大小组织块, 置0.2%胰酶磷酸缓冲液中37 ℃消化100 min, 将表皮从真皮上分离。打开同只猪植入支架后2周创面, 揭下硅橡胶膜, 植入分离的表皮 (0.4%台盼蓝染色表明表皮细胞成活率在80%以上) , 环创面留长线常规打包加压固定。植表皮后2周观察表皮成活情况, 并在创面中间切取1.0 cm×0.5 cm深至肌层的组织块进行组织学观察。

1.2.7 免疫组织化学检测:按免疫组化检测试剂盒说明进行检测, I型胶原和TGF-β1-抗浓度为1∶200, 二甲氨偶氮苯 (DAB) 显色, 标本在光镜下观察, 阳性信号为棕黄色, 主要在血管和成纤维细胞胞浆表达。阴性对照用PBS代替一抗。三组在上述每一个时间点 (各6例) 每例组织切片于400×光镜下肉眼随机观察10个视野, 对表达阳性信号进行计数, 取平均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件, 数据用表示, 对各组相同时间点以及不同时间点数据行单因素方差分析 (Oneway Anova) 检验, 组间两两比较用LSD法, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创面血管化情况[2]

支架植入后1、2、3周, B组创面表层可见黄白色未血管化支架均比A组少, B组创面比A组更显红润, 且A、B组与C组有较多分泌物且肉芽粗糙的创面有着明显的区别。A、B两组支架植入后2周创面植表皮, 植皮后2周, 支架上表皮均成活。通过免疫组化实验检测, 发现1～3周的创面无论是成熟血管还是新生血管B组最多, C组最少。A、B组植表皮后, 创面的新生血管数和成熟血管数与3周相比均明显减少。

2.2 三组创面I型胶原免疫组织化学检测结果

I型胶原阳性信号主要表达在血管和成纤维细胞胞浆中。免疫组化实验的阴性对照未见阳性信号。本实验的阳性信号只统计成纤维细胞表达, 未将血管统计在内。

a:A、B、C组2周与1周相比:P值<0.05;b:A、B、C组3周与2周相比:P值<0.05;c:A、B、C组4周与3周相比:P值<0.05;d:A组与B组不同时间点相比:P值<0.05;e:C组与A组不同时间点相比:P值<0.05;f:C组与B组不同时间点相比:P值<0.05。

从表1可得出, A、B两组I型胶原合成1-3周逐渐增多, 2周创面加植表皮后2周, I型胶原合成比3周少。C组I型胶原合成1-4周逐渐增多。1-2周, I型胶原合成以B组为最多, C组为最少;3周时, A与B组无显著性差异, 但比C组多;4周时, I型胶原合成以C组为最多, B组为最少。

2.3 三组创面TGF-β1免疫组织化学检测结果

TGF-β1阳性信号主要表达在血管和成纤维细胞胞浆中。免疫组化实验的阴性对照未见阳性信号。本实验的阳性信号只统计成纤维细胞表达, 未将血管统计在内。

a:A、B、C组2周与1周相比:P值<0.05;b:A、B、C组3周与2周相比:P值<0.05;c:A、B、C组4周与3周相比:P值<0.05;d:A组与B组不同时间点相比:P值<0.05;e:C组与A组不同时间点相比:P值<0.05;f:C组与B组不同时间点相比:P值<0.05。

从表2可得出, A、B两组TGF-β1表达1-2周逐渐增多, 至3周时下降, 2周创面加植表皮后2周, 表达比3周进一步下降;C组TGF-β1表达1-3周持续上升, 植表皮可使TGF-β1表达减少。1-2周, TGF-β1表达以B组为最多, C组为最少;3周和4周时, C组表达最多, B组最少。

3 讨论

人工皮肤替代物修复创面主要面临人工皮肤的血管化和创面修复的瘢痕化问题[5]。多数人工皮肤替代物本身没有血管组织, 移植早期, 营养成分单纯依靠创面扩散作用提供给皮肤替代物, 距离血管0.2mm以上, 细胞往往因得不到足够的营养而凋亡[6], 因此人工皮肤替代物快速、充分的血管化对于提高皮肤替代物的存活率具有十分重要的作用。虽然直接应用生长因子可加快植入物的血管生长, 但因生长因子在体内的半衰期非常短, 大多在数秒至数分钟内便失去活性, 限制了其使用。因此, 较理想的模型是在保证生长因子的活性的同时, 实现局部、持续的释放。VEGF是血管内皮细胞特异的有丝分裂原, 其可促进血管内皮细胞增殖和新生血管的形成[7], 之前的实验证实了负载pDNA-VEGF质粒可加速胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架的血管化[2]。而过度瘢痕化是人工皮肤修复创面实现功能正常化的主要障碍。瘢痕增生是细胞外基质的合成代谢与降解代谢的失衡, 导致细胞外基质尤其是I型胶原的堆积, 而TGF-β是调控胶原、蛋白多糖等细胞外基质沉积, 从而调节瘢痕生成的关键因子[8]。TGF-β1是已知的与创面修复与瘢痕增生关系最为密切、最具代表性的细胞因子[9], 其可促进成纤维细胞合成胶原, 有利于创面的修复, 但其也可促进创面收缩和瘢痕形成[10]。因此, 创面中早期TGF-β1高表达有利于创面尽快修复, 但TGF-β1在创面中持续长时间高表达则会促进瘢痕增生。

因此, 本实验从I型胶原和TGF-β1入手, 研究了负载pDNA-VEGF质粒胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架对III度烧伤创面修复中瘢痕的影响。实验结果表明, 负载pDNA-VEGF质粒在增加真皮支架血管化的同时, 在1-2周创面可明显增加胶原的合成, 较迅速地修复创面, 至3周创面胶原的合成的速度减慢, 与B组无显著性差异, 2周创面加值表皮使创面较好修复同时, 胶原合成明显下降。说明创面支架较好的血管化早期可诱导胶原的大量合成, 创面较好的修复又可负反馈抑制胶原的过度合成, 从而阻止创面的过度瘢痕增生。而无支架对照创面的结果表明, 胶原合成在1周创面较少, 此后合成持续上升, 说明瘢痕增生较植入支架组严重。TGF-β1结果表明, 在1-2周的早期创面, B组表达最多, C组最少, 说明支架及其良好的血管化可诱导创面较多的TGF-β1表达, 有利于创面的修复, 3周创面, 则A、B组表达比2周明显减少, 且B组减少更明显, 而C组则比2周表达增加, 2周创面加值表皮使TGF-β1减少。而无支架对照创面的结果表明, TGF-β1表达1-3周持续上升, 加植表皮虽可使TGF-β1表达下降, 但表达较A、B组明显多, 说明创面瘢痕增生较重, 说明创面支架较好的血管化既利于早期创面的修复, 又利于抑制瘢痕的增生。

综上所述, 负载pDNA-VEGF质粒可使胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架在烧伤创面愈合过程中, 因更易诱导血管化, 而其较快的血管化则更利于创面的早期修复和抑制瘢痕增生, 在皮肤移植中显示了良好的应用前景。这种血管化良好、可快速较好地修复创面、同时抑制瘢痕增生的真皮支架, 不但可以修复基层医院中常见的因创伤或烧伤引起的不同面积的皮肤缺损, 也因其操作简单快捷, 非常适宜在基层医院开展。

参考文献

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人工真皮支架 篇3

1 资料与方法

1.1 临床资料及分组

选择2010年1月-2011年1月在笔者单位住院的慢性难愈性创面患者20例, 其中男15例、女5例, 年龄 (36±16) 岁。入选标准:创面均持续存在8周以上, 经多种方法保守治疗不能愈合, 或经植皮、皮瓣手术治疗失败的病例。

根据创面性质、修复难度以及修复机制, 将入选病例分为2组。 (1) 慢性溃疡组:9例, 其中男7例、女2例, 年龄22~75 (38±15) 岁。共11处创面, 面积12.5~18.0 (11±5) cm2, 为创伤、烧伤后继发瘢痕溃疡, 创面基底及周围组织呈瘢痕状, 组织循环差或有肌腱组织外露, 无正常皮肤作为供皮区。 (2) 骨外露组:11例, 其中男8例、女3例, 年龄6~72 (37±16) 岁。共14处创面, 骨外露面积0.8~77.0 (17±25) cm2 (最大为22.0cm×3.5cm) , 伴有骨膜缺损和创面感染。创伤后开放骨折或严重撕脱伤合并骨外露7例, 化学烧伤2例, 高压电烧伤1例, 慢性贴骨瘢痕溃疡1例。

1.2 手术方法

手术分2期进行。Ⅰ期先进行扩创术, 切除溃疡及炎性肉芽组织时应超过创面边缘1cm;切除瘢痕至正常组织, 如外露坏死肌腱应予切除;用骨凿凿除外露骨表层坏死组织至骨面有细微渗血, 扩大切除骨外露创面周围的软组织, 为创面营造良好血运。比照创面裁剪人工真皮 (皮能快愈敷料, 日本GUNZE株式会社) , 使其超过骨外露区域并紧贴创面不留间隙, 用缝线或缝合器固定。早期由于创面渗血渗液, 人工真皮呈深红色;随着细胞成分和微血管的长入以及胶原成分的沉积, 术后2~6周人工真皮逐渐呈现橘红色或粉红色, 表层硅胶模与胶原海绵层分离, 表明人工真皮已经“成熟”, 类真皮组织逐渐形成。Ⅱ期手术时, 先揭去表层硅胶模, 应用聚维酮碘或碘伏溶液清洗创面, 适当湿敷。然后移植自体薄断层皮片, 按常规方法包扎固定, 术后5~7d换药并拆线。

1.3 判定标准

Ⅱ期手术后2周, 观察患者自体皮片成活情况。皮片95%~100%成活者为优;皮片成活率大于或等于90%但小于95%, 经换药创面完全愈合且无残留创面者为良;皮片成活率大于或等于80%且小于90%, 经换药创面大部分愈合但仍残留创面者为中;皮片成活率小于80%需再次手术者为差。术后1个月开始进行不定期随访, 观察皮片成活、挛缩、瘢痕生长情况并照相记录。

2 结果

2.1 总体情况

20例患者的25处创面中, 有21处愈合达优良。 (1) 慢性溃疡组:9例患者共移植人工真皮12.5~260.0 (68±70) cm2;供皮区2例为中厚皮, 4例为刃厚皮, , 3例为瘢痕皮。11处创面皮片成活情况:6处优、3处良、2处中, 其中2处腋窝瘢痕溃疡切除松解的创面有轻度挛缩;2次手术间隔时间为 (17±3) d。 (2) 骨外露组:11例患者的14处创面皮片成活良好, 其中12处为优, 外露骨质得到有效覆盖。另外2处创面感染, 所移植的人工真皮未成活:其中1例发生于外踝关节腔开放的骨外露创面, 因关节内感染导致人工真皮移植失败;另1例为跟骨外露感染, 由于松质骨肉的感染未得到有效控制导致人工真皮移植失败。上述2处创面均采用局部皮瓣修复。2次手术间隔时间依骨外露面积和创面基底情况而不同, 一般 (21±8) d。在骨外露组中1例骨外露面积较大者, Ⅰ期手术植入人工真皮。4周后, 外周创面移植自体皮行Ⅱ期手术;中心部位因类真皮组织形成不足, 重新移植人工真皮。2周后类真皮组织基本成形, 再次移植自体表皮修复创面。随访5~24个月, 患者创面无复发, 未见明显瘢痕增生。供皮区愈合良好, 无瘢痕形成。

2.2 典型病例

例1:男, 39岁。双足化学烧伤, 左腿腱外露2个月, 面积4.0×3.5cm (图1a) 。Ⅰ期手术时切除表层近1/2坏死跟腱组织, 创面仔细止血后移植人工真皮5.0cm×4.5cm (图1b) 。术后3周行Ⅱ期手术, 人工真皮血管化良好, 跟腱表面被类真皮组织覆盖 (图1c) 移植自体薄皮断层皮片, 厚度为0.25mm术后10d创面愈合。

3 讨论

3.1 关于慢性难愈性创面

体表慢性溃疡, 其形成大多与局部伤口及周围组织条件有关, 例如坏死组织清除不彻底或异物残留, 骨、肌键组织外露, 创面基底及周围组织血运不良。目前, 应用各种皮瓣的手术方法, 仍是修复此类难愈性创面的常用外科手段。皮瓣手术修复的质量较高, 创面复发率底, 但供瓣区外观和功能会受影响;有时受局部和全身条件的限制, 选择适合的皮瓣也有一定困难。常规的植皮手术方法操作简单, 供皮区损失小, 但在血运不良的瘢痕、慢性溃疡、外露肌腱和骨等创面基地上, 移植皮片往往成活不良, 创面容易再次裸露。

人工真皮具有硅胶膜和胶原海绵双层结构, 本世纪初研制成功并用于临床皮肤软组织缺损的修复。构建血运良好的类真皮组织。随后在其表面移植极薄的自体断层皮片, 以高质量修复皮肤缺损创面。

我们观察到, 将人工真皮移植于基底血运欠佳的创面时, 局部血管化的时间为2~3周, 较基底血运良好的创面延缓, 提示创面基底血运对人工真皮的“成熟”起关键作用。这一方法为慢性难愈创面的修复提供了新的、有效的治疗手段。

3.2 关于骨外露创面

近年来已有报道将人工真皮或脱细胞真皮应用于部分肌踺外露和小面积骨外露创面的修复, 但用于修复伴骨膜缺损的大面积管状骨外露创面的报道并不多见。我们将人工真皮修复组织缺损的设计理念用于骨外露创面的修复, 结果证明除方法较新颖外, 也扩展了人工真皮的适用范围。动物实验证实, 缺乏骨膜的骨外露创面愈合过程明显延长, 其上移植的人工真皮血管化过程亦明显延迟。本组骨外露创面均有骨膜缺损并伴有不同程度的感染, 临床上属于难愈性创面, 特别是骨外露面积大者, 用常规方法治疗愈合非常困难。我们观察到:人工真皮修复骨外露的机制有别于软组织缺损创面的修复, 其血管化过程更多地始于创面周边组织, 随后逐渐向中心部位侵入, 可见外周类真皮组织丰满、中心部位薄弱的现象。在骨外露创面移植人工真皮, 其生长相对缓慢, 在这一过程中人工真皮的支架和诱导作用显得更为重要。

3.3 待改进之处及注意事项

人工真皮修复难愈性创面的方法也存在不足, 完成修复需进行2次手术, 较之皮瓣修复需要更长的治疗时间。有文献报道, 在移植人工真皮时加用纤维蛋白胶, 并在固定时应用创面负压引流装置, 可加速人工真皮血管化过程。我们前期的动物实验也证实, 联合应用Fb、血管内皮细胞以及血小板源性生长因子可以加速人工真皮血管化过程, 但应用于临床尚有一定距离。另外, 应用于颈部、腋窝等屈曲部位关节时, 移植皮片挛缩程度较伸直部位的关节明显。影响关节活动范围的改善, 如果存在关节腔开放感染, 要慎重选用人工真皮, 笔者建议尽量采用皮瓣修复法, 以保全患者关节功能。

摘要：目的:了解人工真皮联合自体皮移植修复难愈性创面的可行性并评价其治疗效果。方法:选择20例住院患者共25处持续8周以上的难愈性创面, 分为慢性溃疡组9例11处创面, 为创伤、烧伤后瘢痕溃疡创面;骨外露组11例14处创面, 骨外露面积为0.877.0cm2 (最大面积为22.0cm×3.5cm) 。手术方法为Ⅰ期扩创移植人工真皮, 26周后局部血管化良好, 外露肌腱和骨质被类真皮组织覆盖, Ⅱ期移植自体薄断层皮片。结果:慢性溃疡组9例患者的11例创面中, 9处愈合优良, 2处经换药后愈合。骨外露组11例患者的14处创面中, 12处愈合优, 外露骨质得到有效覆盖;2处创面因感染人工真皮未成活, 随后行皮瓣修复手术。随访524个月, 未见创面复发, 外观满意, 无明显增生性瘢痕, 供皮区亦无明显瘢痕形成。结论:人工真皮联合自体皮移植修复难愈性创面, 方法简便、创面愈合质量高、供皮区损失轻微, 为难愈性创面的修复提供了新的选择。

关键词：皮肤溃疡,真皮,难愈性创面,骨外露

参考文献

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人工真皮支架 篇4

关键词：高糖,骨髓间充质干细胞,脱细胞真皮基质,成骨细胞

糖尿病是一种以高血糖为典型表现的复杂性全身疾病,高血糖状态常导致血管、神经发生严重的病理改变[1]。Palmer BF认为:糖尿病及其并发症已经成为影响我国等国家发展的重要影响因素[2],人口老龄化和糖尿病患病人数的增多常导致糖尿病患者骨质疏松,骨折不易愈合等严重问题[3],加重患者家庭及社会经济负担[4]。如何改善糖尿病骨质状况,加速糖尿病性骨损伤的修复是迫切需要解决的问题。

脱细胞皮肤基质间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)由于具有来源广泛、低免疫性、多分化等优势,为逆转糖尿病性组织缺氧和促进组织修复带来了希望,是细胞治疗和骨组织工程技术首选的种子细胞[5]。皮肤组织的再生能力非常强,脱细胞真皮细胞外基质具有复杂的三维结构[6],是具有广泛应用前景的生物组织支架材料,对支持移植细胞生长、促进组织修复具有关键效果[6]。但是高糖状态下,MSC在脱细胞真皮基质的成骨分化尚鲜见报道。本研究拟揭示高糖环境下,MSC在脱细胞真皮基质的生长和成骨分化情况,为MSC组织工程技术促进骨组织新生,治疗高糖缺氧性骨组织损伤奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 细胞来源

GFP标记的人骨髓间充质干细胞(h BMSC)购于广州赛业生物公司。

1.2 主要试剂和实验仪器

体重2~3 kg雄性新西兰白兔购自齐齐哈尔医学院动物实验中心[动物合格证号:SYXK(黑)20140022],胎牛血清(FBS)、α-MEM培养基、青链霉素和L-谷氨酰胺均购于广州赛业生物公司,地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、VEGF、噻唑蓝(MTT)和葡萄糖等均购于美国Sigma公司,兔抗人BMP-1抗体和TRITC标记羊抗兔Ig G购自美国Santa cruz公司,人骨形成蛋白-1(BMP-1)、碱性磷酸酶(ALP)的ELISA试剂盒购于美国R&D公司。Emax酶标仪为美国Molecular Devices公司产品,F-7000荧光分光光度计为日立公司产品,BX50型显微镜和SU1510型扫描电子显微镜分别为日本OLYMPUS、日立公司的产品。

1.3 实验方法

1.3.1 脱细胞真皮的制备

8只体重2~3 kg雄性新西兰白兔,按照30 mg/kg耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠,常规备皮、消毒,切取背部6 cm×6 cm全层皮肤,清理周围组织后,首先加入0.9%氯化钠溶液,在37℃摇床孵育12 h,去除表皮层[6];然后置于0.125%胰蛋白酶溶液中,37℃,消化24 h,依次经过0.1%、0.5%十二烷基磺酸钠(SDS)震荡洗涤12 h,60Co消毒处理密封,-80℃保存。扫描电镜观察样品结构[7,8]。

1.3.2 细胞培养和实验分组

含10%FBS的α-MEM培养基培养h BMSC,37℃、5%CO2培养者为正常对照组;若α-MEM培养基中含300 mmol/L葡萄糖,则为高糖培养基。在细胞高糖模型下,未进行任何刺激的h BMSC为高糖对照组;将h BMSC种植在脱细胞真皮基质上进行培养则为基质实验组;每组细胞均进行成骨诱导分化。成骨分化培养基为:α-MEM培养基中若含10%FBS、1×10-7mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖情况

按实验分组,或在96孔板底放置脱细胞真皮基质,每组均添加1×104h BMSC后,在正常条件下培养24 h。每孔加入150μL含0.1%FBS的正常或高糖α-MEM培养基,37℃、5%CO2条件下培养12 h;每孔加入20μL的5%MTT孵育4 h,然后添加100μL二甲基亚砜,492 nm波长测定每个样品吸光度(OD值)。

1.3.4 免疫荧光染色

各组分化诱导的h BMSC,DAPI进行细胞核标记,4%多聚甲醛固定,4℃条件下,用兔抗人BMP-1抗体(1∶200)孵育12 h后,添加山羊抗兔Ig G(1∶150),DAKO水溶性封片液进行封片。

1.3.5 人BMP-1、ALP蛋白的检测

按照人BMP-1、ALP蛋白的ELISA试剂盒说明,裂解各组细胞,提取各组细胞裂解液,ELISA实验检测人BMP-1、ALP蛋白的表达。

1.4 统计学方法

所有实验均重复3次,实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计,结果以均数±标准差(±s)表示,并进行方差分析或t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 h BMSC的增殖情况

正常对照组、高糖对照组和基质实验组h BMSC增殖的OD值进行方差分析,发现各组h BMSC增殖的OD值并不相等(F=247.35,P=0.0001)。与正常对照组OD值(1.453±0.164)比较,高糖对照组h BMSC的OD值(0.618±0.110)明显降低,二者比较差异有统计学意义(P<0.01);与高糖对照组比较,基质实验组h BMSC的细胞增殖OD值(1.294±0.135)升高比较明显,二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 脱细胞真皮基质结构

扫描电镜观察发现,未脱细胞的皮肤比较致密,见图1A;脱细胞真皮基质几乎不含细胞,纤维组织比较丰富,空隙较大,见图1B。

A:正常皮肤扫描电镜图像,标尺=100μm;B:脱细胞真皮基质的扫描电镜图像,标尺=100μm

2.3 各组h BMSC的BMP-1染色和扫描电镜观察

与高糖对照组比较,基质实验组BMP-1染色阳性的细胞明显增多,差异有统计学意义(Q=9.535,P<0.01),见图2A、2B。扫描电镜观察发现,h BMSC突起较多,与脱细胞真皮基质黏附在一起,生长状态良好,见图2C。

A:各组MSC分化为成骨细胞的BMP-1染色(蓝色为DAPI标记),标尺=25μm;B:各组MSC的BMP-1阳性细胞比较,*P<0.01(n=18);C:基质实验组MSC在脱细胞真皮基质的生长(扫描电镜,标尺=50μm)

2.4 ALP、BMP-1蛋白的检测

与未脱细胞皮肤比较,脱细胞真皮基质的ALP蛋白含量降低(P<0.05);相对于未脱细胞皮肤,脱细胞真皮基质组的BMP-1蛋白含量降低(P<0.05),见表1。与高糖对照组比较,基质实验组的ALP蛋白含量明显增高(P<0.01);相对于高糖对照组,基质实验组的BMP-1蛋白含量明显增高(P<0.01),见表2。

注:ALP:碱性磷酸酶;BMP-12:骨形成蛋白-1

注:ALP:碱性磷酸酶;BMP-12:骨形成蛋白-1

3 讨论

随着世界经济、交通高速发展,全球骨损伤的发病率逐年增加;外伤、感染或肿瘤切除导致的骨组织损伤、骨延迟愈合或不连接问题是世界性骨科难题。糖尿病及其并发症已经成为困扰人们的重要疾病,由于糖尿病的高血糖状态常常导致多种离子、多糖成分代谢紊乱,进而发生糖尿病性骨质疏松等骨疾病[9],严重影响着患病人群的健康和生命质量。

骨组织除了含有较多血管、神经纤维外,还含有大量骨细胞,对骨的再生修复具有重要意义。虽然利用MSC分化为骨细胞对促进骨组织损伤具有重要意义[10],但是,如果能够在三维环境下激发间充质干细胞的成骨分化活性,将对利用组织工程技术促进糖尿病性骨损伤修复具有重要意义。皮肤是人体最大的器官,再生能力非常强,如果利用宿主皮肤构建组织工程材料将降低患者排斥反应,皮肤中含有的3D结构和有效的活性因子将有效促进种子细胞分化和生长,对治疗糖尿病骨病等具有重要意义。研究发现,存在于骨髓、脂肪等多种组织的MSC,具有多分化性能、易适应局部微环境生存等特点[11]。在缺血性心脏病、糖尿病足皮肤溃疡等许多由于缺氧引起的疾病治疗中,利用MSC细胞治疗技术或MSC组织工程技术具有喜人的治疗效果和广泛的应用[12],并认为MSC的多分化特性更适用于糖尿病等多种组织损伤的病例[12]。也有研究发现,高糖缺氧环境会导致组织产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)[13],ROS粒子比较微小,由于存在未配对的自由电子,因此ROS十分活跃,呈现一种不稳定自由基状态,往往导致细胞膜脂质、蛋白质等发生变性,造成MSC、血管内皮细胞等细胞器损伤,细胞生物活性降低,造成组织损伤等[14]。因此,抗高糖损伤一直是移植MSC技术确保移植细胞正常生长和分化的关键问题。如果利用自体生物组织材料既可以避免生物排斥反应,又可以促进MSC生长,达到修复骨组织损伤的目的,将较好地解决高糖环境下,移植的MSC活性降低等问题。相对于肠黏膜等部位组织,皮肤是人体最大的浅表器官,取材方便,再生能力强,符合自体生物组织材料的筛选条件[15]。

皮肤的细胞外基质主要由胶原蛋白、纤维蛋白、整合素等多糖或蛋白质构成复杂的三维结构,并具有良好的孔隙率和丰富的细胞活性因子等条件,可以更好地利于体内细胞的生长[16],如果良好模拟细胞的体内生长基质,将对细胞的生长具有积极作用。近年来发现,MSC、内皮祖细胞(EPC)在静电纺丝制作的三维纳米生物材料上尚能正常生长,并对糖尿病足具有促进愈合的作用[17,18],这些成果提示,构建脱细胞的皮肤细胞外基质会具有较好的三维立体结构,皮肤基质中的VEGF、EGF等多种细胞活性因子能够促进种植的MSC生长,对维持MSC功能、促进MSC分化具有重要影响。在本实验中,扫描电镜下也可以观察到脱细胞真皮基质的纤维组织间隙较大,纤维纵横交错,细胞结构分成非常少,说明皮肤脱细胞比较彻底,排除了皮肤细胞对实验的干扰。说明利用梯度SDS法脱细胞简单可行。相对于高糖对照组,基质实验组MSC增殖的OD值明显升高,MSC在脱细胞真皮基质的生长状态良好,说明脱细胞真皮基质的三维结构更好地模拟了体内细胞生长环境[19],适合MSC在高糖环境的生长,此外,还可能是由于皮肤基质含有一定量的VEGF、EGF等细胞因子,这些因子对促进细胞生长和黏附于三维介质具有积极作用[20],研究也发现,基质实验组的MSC分化为成果细胞能力明显强于高糖对照组,这进一步说明脱细胞真皮基质的确含有成骨诱导因子,可以促进MSC分化为成骨细胞。本研究利用BMP-1染色的手段,也发现基质实验组BMP-1染色的阳性细胞数明显高于高糖对照组,说明脱细胞真皮机制包含的VEGF等因子[15]积极促进了MSC在脱细胞真皮基质向成骨细胞分化。