酶解技术

酶解技术（精选10篇）

酶解技术 篇1

中药研究的水平及中药质量的保障在很大程度上依赖于中药有效成分提取分离的结果,而中药所含的化学成分大都非常复杂,为了提高中药的治疗效果,就要尽最大限度提取有效成分,去除无效成分及有毒成分。但常用的提取方法(如煎煮法、浸渍法、渗渡法等)在提取有效成分方面,存在着有效成分损失大、周期长、工序多、提取率不高等缺点。近年来,在中药提取方面出现了许多新的提取分离技术(如超临界流体萃取法、超声提取法、酶法提取、微波提取法、半仿生提取法等),与传统中药有效成分提取分离方法相比,新型的提取分离技术具有明显的优越性,能显著提高有效成分的收率和纯度。

我国的酶制剂工业起步于1965年,广泛应用于食品工业、饲料工业、纺织和洗涤行业等行业,但直到90年代初,我国才出现将酶解技术用于中药有效成分提取的相关研究报道[1],近年来,酶解技术应用于中药有效成分的提取分离取得了不少新的成果,尤其应用纤维素酶可破坏细胞壁的致密结构,加速药用有效成分的溶出,提高药用有效成分的提取率。因此本文综述了国内应用酶解技术提取中药有效成分的研究进展,希望有助于这方面的研究工作。

1 酶解技术简介

酶是由活细胞产生,并可在细胞内或细胞外起催化作用的一类蛋白质。具有催化效率高,作用专一性强和催化条件温和等特点,用于工业可提高生产率,降低能耗,改善劳动条件,减少污染,简化工艺程序,还可以生产出其他方法难以得到的产品。因此,酶不仅用于食品和化工行业,还可用于基因工程、细胞工程等新技术领域。将酶应用于医药方面可以快速、准确的诊断疾病,作为药物使用也可以达到良好的效果。但是酶在医药方面的应用还未达到预期水平,在中药中的应用研究才只有十几年的历史,但已取得了较好的效果,还有很大发展空间[2]。

中药中植物药大约占了90%,大部分植物药的有效成分都是包裹在细胞壁内,而植物的细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成的致密结构。在提取药用植物有效成分过程中,有效成分向提取介质扩散时,必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力。选用适当的酶作用于药用植物材料,如能水解纤维素的纤维素酶、水解果胶质的果胶酶等,可以通过酶反应温和地分解细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶质等成分,破坏细胞壁的致密构造,引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化,减小细胞壁及细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力,从而有利于有效成分的溶出[3,4]。在提高溶出效率的同时,还可选用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、葡萄糖苷酶等适当的酶作用于药用植物,将通常认为无效的杂质如淀粉、蛋白质、果胶等分解祛除,为后续的分离精制、改善提取澄清度创造有利条件[5,6,7]。选用适当的酶,还可以促进某些极性低的脂溶成分转化成糖苷类易溶于水的成分而有利于提取[8]。

2 酶解技术在中药提取中的应用

中药的品种不同,其细胞结构和有效成分有很大的差异,因此不同的中药需要按实际情况选择不同种类的酶来提取,以达到最佳的提取效果。已经有将纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶等单一酶及它们的复合酶用于中药有效成分的提取的报道,并取得了很好的效果,此外,近年还出现了超声波酶法相结合、酶膜法相结合等强化提取法。下面将结合文献对常用的这几种酶解提取法进行分类阐述。

2.1 纤维素酶的应用

目前,在中药提取时应用最广泛的是纤维素酶(Cellulase),它是能将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一组复杂酶系的总称,又称纤维素酶系,根据其中各酶功能的差异,主要分为3大类:内切葡聚糖酶;外切葡聚糖酶;β-葡萄糖苷酶。大部分的中药材的细胞壁都是由纤维素构成,其有效成分往往包裹在细胞壁内,纤维素则是由β-D-葡萄糖以1 ,4-β葡萄糖苷键连接,通过三种酶的协同作用可以切开β-D-葡萄糖键,生成短纤维、纤维二糖、葡萄糖等,从而破坏细胞壁,增加有效成分的溶出度,提高其得率[9,10]。

在将近20年的应用中,采用纤维素酶已成功提取分离出包括黄酮、多糖、皂苷、生物碱等多类有效成分,其使用范围也不断拓宽。吕卫明等[1]首先于1991年介绍了一种从黄芩中提取分离黄芩素的新方法-酶水解法,结果酶水解法所得粗品中黄芩素达75.67%,收率为2.46%,均明显高于直接提取法的50.60%和0.3%。王岩岩等[11]的研究表明,同传统化学法相比,纤维素酶法提取陈皮黄酮较好,黄酮提取率从2.78%提高到4.35%;对酶法提取工艺进行正交优化后,纤维素酶法所得黄酮提取率可达到6.96 %,为化学法黄酮提取率的2.5倍。梅林等[12] 研究表明,采用纤维素酶法提取金银花时可提高绿原酸得率,达到3.57%。陈学伟等[13]采用纤维素酶提取黄芪多糖,与传统水煮醇沉法相比,黄芪多糖的提取率有较大提高,提取多糖含量为9.78%,总糖含量为50.2%。杨军宣等[14]的实验表明,通过纤维素酶酶解作用破坏细胞壁,提取液固形物含量提高10%,三七总皂甙提取率提高23.5%,与未加酶提取方法相比有显著性差异(P < 0.001),薄层层析结果表明,两种方法所提出的成分一致,加入纤维素酶对提取的成分无影响。张福维等[15]采用纤维素酶浸法和氯仿法两种不同的工艺提取马钱子生物总碱,结果显示酶浸法提取士的宁和氯仿法提取士的宁的含量分别为1.83 %、1.32 %,酶浸法和氯仿法提取马钱子生物总碱的产率分别为:2.85 %、1.86 %,既提高了生物总碱的提取率,又缩短了提取时间。陈华等[16]采用纤维素酶提取法和水蒸气蒸馏提取法对没药挥发油成分进行比较研究。发现两种处理方法的没药挥发油成分存在着一定的差异,但纤维素酶提取所得的没药油收率比未处理所得的没药油收率提高近3倍,挥发油成分百分含量也较多,其主要原因可能是纤维素酶解过程破坏没药细胞壁,有利于有效成分的提取。此外,毕会敏等[17]报道采用中等浓度的乙醇溶液作为纤维素酶的反应体系可有效提高红景天总黄酮的浸出率,粗提物得率高,乙醇对纤维素酶的提取有协同作用。

2.2 果胶酶的应用

果胶酶是指能够分解果胶质的多种酶的总称,主要功能是通过裂解或β消去作用切断果胶质中的糖苷键,使果胶质裂解为多聚半乳糖醛酸。果胶酶大致分为果胶水解酶、果胶裂解酶、果胶酯酶和原果胶酶等。果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4 糖苷键聚合而成的多糖链,常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链,游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子,特别是与硼化合物结合在一起。它存在于所有的高等植物中,沉积于初生细胞壁和细胞间层,在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联,使各种细胞组织结构坚硬,表现出固有的形态。因此将果胶酶和纤维素酶、半纤维素酶结合使用,可破坏植物的细胞壁,便于有效成分的释放,从而提高提取率[18,19]。

李玲等[20]通过研究优选出了果胶酶提取川芎多糖的最佳工艺条件,其最佳工艺条件是果胶酶用量为1%,pH值3.5,反应时间150 min,反应温度60℃。理想条件下川芎多糖的提取平均得率为11.3%。邱斌等[21]探讨了栀子黄色素提取工艺中的浸提法及加果胶酶提取法,发现加果胶酶法提取栀子黄色素与传统浸提法相比,提取的色素产品提取率高、色价高。在此最佳酶解条件下色素的提取率为98%,产品色价85。陈晓娟等[22]优选了杜仲叶中绿原酸和黄酮提取最佳工艺,结果显示果胶酶提取效果最好,纤维素酶次之,β-葡聚糖酶和复合酶最差。果胶酶处理效果最好,可能是因为杜仲叶中含有大量胶质。在其条件下,绿原酸的得率达1.29%,黄酮得率达0.043%。王元凤等[23]对酶法提取茶多糖工艺进行了优化,发现热水提取后的茶渣采用果胶酶单独提取茶多糖的提取率为2.21%,是水提法的1.81倍。倪慧等[24]在优化出的新疆枸杞多糖粗粉的提取工艺中加入了果胶酶处理,发现对枸杞多糖粗粉的提取有一定的提高。

2.3 木瓜蛋白酶的应用

木瓜蛋白酶又称木瓜酶,是一类巯基蛋白酶,广泛地存在于番木瓜(Carica papaya)的根、茎、叶和果实内, 其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。其对动植物蛋白质、多肽等有较强的水解能力,能把大分子蛋白质水解成易消化吸收的小分子多肽或氨基酸,同时还能把蛋白质水解物再合成蛋白质类物质,因此广泛应用于医药、化工、食品等领域。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类:木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶Ω、木瓜凝乳蛋白酶M [25,26]。

曾惠芳等[27]利用木瓜蛋白酶预处理补骨脂粉后煎提,与普通煎煮法比较,煎液总氮量提高了2倍,磷脂提高了4倍;补骨脂素、异补骨脂素提高了近1倍。结果提示,蛋白酶水解蛋白质的同时,促进了磷脂的溶出,发挥增溶作用,最终导致各种有效成分煎出量增加。赵素霞[28]采用木瓜蛋白酶提取桑椹多糖时发现,酶法提取能够提高多糖的提取率及多糖含量,可能是因为酶对桑椹中游离蛋白质具有水解作用,提取液中只含少量蛋白质,同时降低了它们与原料的结合力,有利于多糖的浸出。所以酶法是一种理想的提取方法。钟耀广[29]利用木瓜蛋白酶进行水解制取螺旋藻蛋白水解液,确定了木瓜蛋白酶水解的最适工艺条件为:温度55℃、pH 值6.0、酶底比1.0%、水解时间2h,这时可获得最佳的蛋白回收率。

2.4 复合酶的使用

以上各种酶除单独应用外,还可与其它酶组合进行多酶水解。目前,已有研究将木瓜酶、果胶酶、纤维素酶按一定质量比配成复合酶,用于相关产品的制备,这不仅大大提高了酶的水解能力,而且反应条件更温和,水解率更高。

胡瑞君等[30]考察了利用果胶酶、纤维素酶辅助提取麦冬皂苷的研究,优选的提取工艺条件为:纤维素酶用量0.1%,果胶酶用量8%,酶解pH4.5,酶解温度50℃,提取时间2h,该条件下所得麦冬总皂苷含量为3.576 2‰。赵前程等[31]采用复合酶法(纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶, 比例为2:1:1)从海带中提取3种多糖,结果表明分步加酶法比同步加酶法3种海带多糖和总多糖的提取率及多糖含量都有显著地提高。张裕卿等[32]利用阶梯生物催化法,将纤维素酶和果胶酶复合酶制剂、淀粉酶以及糖化酶按顺序依次加入时,能够将植物中98%的薯蓣皂苷元提取出来,同直接酸水解法、自然发酵法和单纯酶解法相比,能耗降低,皂苷元收率和质量均提高。

2.5 酶解技术与其他技术的联用

为进一步提高中药提取的效率和质量,国内一些学者还把酶解技术法同其他的提取新技术(如超声提取技术、膜分离技术、微波技术等)相结合,取得了一定的进展。陈军辉等[33]研究西洋参多糖的提取时,通过对回流提取法、微波提取法、超声提取法、酶解-回流提取法4种方法进行对比,发现采用酶解-回流提取法提取西洋参多糖,可以明显提高多糖的提取率。徐艳[34]等考察不同因素对超声-酶法提取黄柏小檗碱的影响,发现水浴时间2.5 h,超声功率80%,加酶25mL,水浴温度60℃时提取率最高。超声-酶法应用于黄柏小檗碱的提取,具有提取率高、省时、高效、节能等优点。薛伟明[35]等提出了酶法提取与超滤膜法精制相结合的药用植物有效成分提取、分离新工艺,并且对提取过程进行了研究。赵功玲[36]研究了微波处理和外加果胶酶对提取番茄红素的技术,结果表明,微波酶法提取工艺相对于单纯的有机溶剂提取工艺、酶法提取工艺及微波法提取工艺有较好的提取率,并缩短了提取时间。王兴文[37]独创的水提三七总苷工艺整合了生物酶工程、絮凝技术、膜分离、大网格组合大孔吸附树脂技术在中药提取离上的应用,是创新性技术,目前应用该技术生产三七总甙已实现产业化。

3 回顾与展望

以上研究显示,酶解技术用于中药材的提取时,具有反应温和、提取效果较好、收率高、周期短、节约能耗等优点,所以应用前景广阔。但由于酶作用的专一性和选择性,所以应用时多采用复合酶,导致酶解技术在中药材的提取中具有复杂性。该技术同时也存在着一定的局限性,由于酶的种类、酶解温度、酸碱度等对酶的催化能力影响较大,因此,针对具体药物,研究酶反应的最佳条件非常重要。另外,酶提取对复方有效成分、疗效影响及酶残留问题等尚需进一步深入研究。

中药制剂的质量在很大程度上依赖于中药提取分离的效果,加快利用先进的提取分离技术对促进产品质量的提高将起到非常重要的作用。因此,借助现代高新技术,改革传统的制药工艺,解决好中药产品的“三小”( 服用剂量小、毒性小、副作用小) 、“三效”( 高效、速效、长效)等问题,同时获得高质量的有效活性的药效成分,使之符合现代医药的严格要求,已成为当务之急。酶解技术这种高新技术应用于中药领域,可以实现并提高中药有效成份的提取和分离,增加中药有效成份的含量,促进药用微量有效活性成份的转化,从而推动中药产业的技术跨越,提高中药市场竞争力,促进传统中药产业转化为现代中药产业。总之,随着对酶解技术的不断消化吸收、研究应用和不断完善,必将为中药的提取提供一种高效可行的方法。

响应曲面法优化板栗酶解工艺研究 篇2

关键词：板栗;酶解;还原糖;响应曲面法

中图分类号：S664.2     文献标识码：A    DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.012

Optimization of Enzymolysis Technology of Chestnut by Response Surface Methodology

ZHANG Le， WANG Zhao-gai， YANG Hui， WANG Xiao-min， SHI Guan-ying

（Institute of Agricultural Products Processing，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou， Henan 450008， China）

Abstract： The enzymolysis technology of chestnut was investigated. The influencing factors of enzymatic hydrolysis technology of chestnut including dosage of enzyme， ratio of solid， temperature， time， pH were studied. Based on the result of the single factor experiment， the quadratic polynomial model of the reducing sugar content by using Box-Behnken design and response surface methodology was designed. Factor contribution rate obtained from the F-test were as follows：dosage of enzyme > temperature > time > pH value. The optimum hydrolytic parameters obtained from response surface analysis were as follows： the dosage of the α-amylase 0.3%， solid-liquid 1∶4， temperature 65 ℃， pH value 6.5， enzymolysis time 60 min. Under the optimized conditions， the actual reducing sugar content（DE value） was 14.56%.

Key words： chestnut;enzymolysis;reducing sugar;response surface methodology

板栗[Castanea mollissima Blume]也称为栗子、中国板栗，是壳斗科、栗属、坚果类植物，在中国已有3 000余年栽培历史[1]。板栗淀粉含量高达到70%左右，与粮谷类相当，还含有蛋白质、脂肪、B族维生素等多种营养素，对冠心病、动脉硬化等疾病有较好药用价值，素有“铁杆庄稼”“干果之王”的美称[2-3]。我国是世界上最大的板栗生产国，在20多个省均有栽培，栽培面积111万hm2，年产量100万t，占全球产量的70%[4]。由于板栗在贮藏过程中容易出现霉烂、发芽、生虫等问题，不宜久藏。另外我国板栗多以生栗原料销售为主，加工量少，加工转化率仅为20%～30%，而发达国家为90%～95%[5]。板栗加工主要集中在初加工如糖炒栗子，深加工产品以板栗罐头为主，品种较少，科技含量不高，加工技术比较落后，生产效率低[6]。因此，迫切需要提高板栗产品的精深加工和综合利用能力，开发各种优质的深加工新产品。

板栗果仁中淀粉含量高，使板栗饮料类制品在加工过程中溶解性差，常易产生固液分离，造成饮料分层、沉淀现象，同时易发生褐变、香味流失等问题[7]。在板栗浆中加入α-淀粉酶进行酶解，可切断一些枝条使淀粉网囊松开，降低粘稠度;还可将淀粉水解成为低分子的糊精和可溶性糖类，提高其溶解性和甜度;另外由于酶的专一性，这样仅作用于淀粉类物质，可以完整保持板栗的原有风味物质和香气成分[8]，从而有效地解决上述问题，对板栗的深度加工和更高层次的开发利用有着重要的意义。已有研究报道采用生物酶解技术，制备了马铃薯等高淀粉含量的固体饮料[9]，这为板栗固体饮料加工提供了一定的借鉴方法。本研究针对速溶板栗粉生产过程中的酶解工艺这个难点进行重点研究，优化板栗浆的酶解工艺条件，以期为板栗制品的后续制作加工奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

鲜板栗原料品种为大板红，由河北美可多食品有限公司提供。α-淀粉酶（酶活3 700 U·g-1），购于北京奥博星生物技术有限责任公司;葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠等购于国药化学试剂有限公司，分析纯;重蒸酚购于北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HHS型数显式电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司;JYL-C022E型九阳料理机，九阳股份有限责任公司;NUⅡ-10T型实验室（超）纯水机，南京优普—实验室纯水处理系统;H1850R型台式高速冷冻离心机，湖南长沙湘仪实验室仪器有限公司;genesys10suv紫外分光分光度计，赛默飞世尔科技; ME204E型万分天平，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 板栗酶解工艺 将板栗脱壳、去衣、切片，称取板栗片按一定料液比打浆，在90 ℃恒温水浴糊化20 min，调pH值为酶的适宜值，加酶，一定温度下酶解一定时间后，沸水浴灭酶5 min，冷却后转移至离心管中，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液，测定还原糖含量，表示水解度。以未酶解为对照CK。

1.3.2 还原糖测定 采用 3、5-二硝基水杨酸比色法[10]。

（1）葡萄糖标准曲线绘制。分别吸取1 mg·mL-1的葡萄糖标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL刻度试管中，分别加水补至2 mL，再加入1.5 mL DNS试剂，摇匀，沸水浴中加热5 min取出，冷却至室温，用蒸馏水补至10 mL，混匀，540 nm 波长下比色测定。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，绘出标准曲线，得回归方程y=1.408 2x 0.096 8，相关系数R2=0.999 4。

（2）样液测定。吸取酶解离心后上清液0.2 mL和1.5 mL DNS显色剂，加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。依据标准曲线得出的浓度及稀释倍数，计算还原糖含量。

1.3.3 酶解工艺单因素试验设计 在其他条件一致时，改变一个因素，分别研究酶加量0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%;pH值 5.5，6.0，6.5，7.0， 7.5;酶反应时间20，40，60，80，100 min;酶反应温度50，55，60，65，70 ℃;料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7对酶解效果的影响。

1.3.4 响应曲面试验设计 在单因素试验基础上，确定料液比为1∶4，以酶加量、温度、时间、pH值为自变量，还原糖含量为响应（Y），依据Box-Behnken中心组合试验的设计原理[11]，采用4因素3水平的响应面分析法，建立数学模型。自变量因素水平及编码见表1。

1.3.5 数据分析 采用Origin 8.0 软件进行数据处理和绘图;通过Design-Expert.8.05b 软件进行响应曲面模型建立和分析。

2 结果与分析

2.1 酶解效果影响因素研究

2.1.1 反应时间对酶解程度的影响 不同反应时间对酶解程度的影响结果见图1。由图1可以看出，在反应初期，随着时间的延长，还原糖含量增加较快，有显著差异（P<0.05），到60 min时达最大，之后随时间的延长而还原糖含量趋于平稳并略有下降。这是因为随着时间的延长，酶活力得到充分利用，酶解反应进行的比较完全;而随着时间的延长，还原糖含量下降，可能是因为反应产物的积累抑制了酶的活力。故酶解时间控制在60 min左右为宜。

2.1.2 pH值对酶解程度的影响 不同pH值对酶解程度的影响结果见图 2。由图2以看出，当板栗浆pH值在5.0～6.0 时还原糖含量随pH值的增大而逐渐增大且差异显著（P<0.05），pH值为6时达最大，之后随pH值的增大还原糖含量呈下降趋势。酶活力受pH值影响较大，在最适pH值下催化反应的速率最高，这是因为pH 值会影响底物和酶的构象，从而影响酶的活力及其与底物的结合[12]。

2.1.3 酶加量对酶解程度的影响 不同酶加量对酶解程度的影响结果见图 3。由图3可以看出，还原糖含量随酶加量的增大而逐渐增大，当酶加量为0.3%时达最大。随着提取液中酶浓度升高，与底物的接触面积增大，酶解反应速率升高。酶加量低于0.3%时，底物中的酶未饱和，故还原糖含量在增加。当酶浓度达到过饱和时，底物浓度相对较低，酶与底物竞争，会对酶产生抑制作用，故其后增加酶加量时还原糖含量并未增加。

2.1.4 温度对酶解程度的影响 不同温度对酶解程度的影响结果见图 4。由图4可知，还原糖含量随温度的升高而逐渐增大，65 ℃时达最大，之后随温度的升高而还原糖含量略有下降。这是因为在一定温度范围内，温度升高，酶活性增强、反应速度加快，但当温度升高超过酶作用的适宜温度时，能使酶活性降低，还原糖含量下降。

2.1.5 料液比对酶解程度的影响 不同料液比对酶解程度的影响结果见图5。由图5可知，随着料液比的升高，还原糖含量逐渐增加，当料液比为1∶4时还原糖含量达最大，随后呈略微下降趋势。较低的物料浓度有助于质量扩散作用的增强，但液料比过大会造成溶剂和能源的浪费，且会给后续操作过程带来负担。

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 回归方程的建立与方差分析 根据单因素试验结果，以酶加量、pH值、温度和时间作为自变量，以板栗浆酶解后还原糖含量作为响应值（Y），响应曲面试验设计及结果见表2。

采用Design Expert 8.0.5软件对试验结果进行分析，得到板栗浆酶解后还原糖含量%（Y）与酶加量（A）、pH值（B）、温度（C）和时间（D）4个因素的数学回归模型如下：

Y=+14.56+0.37A+0.013B+0.22C-0.084D-1.06AB-0.066AC+0.48AD+0.17BC+0.52BD+0.52CD-2.35A2-1.64B2-2.14C2-1.25D2。

对该回归模型进行方差分析，结果如表3所示。

由表3可知，该模型的F=22.33，P<0.000 1，表明该模型有意义且达到极显著水平（P<0.01）。决定系数R2为0.957 1，说明该模型的拟合性较好，可以用此模型对板栗浆酶解还原糖含量进行分析和预测。由表3还可以看出，A、AB、CD、A2、B2、C2、D2对还原糖含量的影响显著。由F检验得到因子贡献率为：A>C>D>B，即酶加量>温度>时间>pH值。

2.2.2 单因素效应分析 进一步分析试验中各因素对还原糖含量的影响，对模型进行降维处理，即固定任意3个因素于0水平，得到各因素与还原糖含量的效应方程，单因素效应曲线如图6。由图6可知，各因素对还原糖含量的影响均呈现先升高后降低的趋势，并且A（酶加量）变化幅度最大，说明酶加量对还原糖含量的影响最大。各曲线的变化趋势与上文单因素试验结果吻合，故说明建立的数学模型是合适的。

2.2.3 交互作用分析 方差分析结果表明， AC、AD、BC、BD无明显交互作用，AB、CD交互作用显著，即酶加量与pH值间的交互作用对还原糖含量有显著影响;温度与时间的交互作用对还原糖含量有显著影响。响应曲面和等高线如图7、图8所示。

从图7可以看出，当酶加量一定，pH值在5.5至6.5范围内，还原糖含量先显著增大，达到最大值后又开始慢慢减小;当pH值一定时，酶加量在0.2至0.4之间，还原糖含量先明显增大，达到最大之后又开始慢慢减小。由等高线图形可以看出，椭圆形明显，二者的交互作用显著。

从图8可以看出，当温度一定，时间在40 min至80 min范围内，还原糖含量先缓慢增大，达到最大值后又开始慢慢减小;当时间一定时，温度在60 ℃至70 ℃之间，还原糖含量先明显增大，达到最大之后明显减小。由等高线图形可以看出，椭圆形明显，二者的交互作用显著。

2.2.4 回归模型验证 由 Design-Expert.8.0.5b软件对模型进行典型性分析结果表明，最佳酶解工艺条件为：酶加量0.31%、pH值 5.99、温度65.24 ℃、时间59.75 min，还原糖含量的理论值为14.58%。根据实际操作的容易程度，把条件修正为酶加量0.3%、pH 值6.00、温度65 ℃、时间60 min，实测值为14.56 %，相对偏差0.14%，可见该模型能较好地反映酶解的还原糖含量条件。

3 结  论

本文对板栗浆的酶解工艺进行研究，首先对影响酶解工艺的因素酶加量、料液比、温度、时间、pH值进行了研究，在单因素试验结果基础上，采用Box-Behnken试验设计和响应面分析建立了回归方程：

Y=+14.56+0.37A+0.013B+0.22C-0.084D-1.06AB-0.066AC+0.48AD+0.17BC+0.52BD+0.52CD-2.35A2-1.64B2-2.14C2-1.25D2。通过方差分析和失拟项分析，证明该模型拟合度较好。由F检验得到因子贡献率为酶加量>温度>时间>pH值。利用优化模型得到最佳提取条件为酶加量0.3%、pH值6、温度65 ℃、时间60 min，还原糖含量可达14.56%。为板栗的酶解工艺提供了理论依据，为板栗制品的加工奠定了理论基础。

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[7] 李琴，袁琳琳，朱科学，等. 速溶板栗粉的研制[J]. 食品与发酵工业，2007（33）：108-102.

[8] 陈奇.防止高淀粉质饮料沉淀的方法[J].食品与机械， 2000，76 （2）： 29-30.

[9] 陈朋引. 马铃薯固体饮料开发及工艺研究[J].食品科技， 2002（10）： 47-49.

[10] 齐香君，苟金霞. 3，5-二硝基水杨酸比色法测定溶液中还原糖的研究[J]. 纤维素科学与技术，2004，12（3）：17-19.

[11] 王成恩， 黄章俊. 基于高斯函数和信赖域更新策略的Kriging响应面法[J]. 计算机集成制造系统， 2011， 17（4）： 740-746.

酶解技术 篇3

关键词：羊肝,大肠杆菌,金黄葡萄球菌,酶解

羊肝具有补血、养肝、明目等功效, 可用于牙疳肿痛、雀目、青盲、翳膜羞明等症[1]。羊肝富含营养物质, 其中VA含量可高达每百克29 900国际单位, 蛋白质为17.9 g/100g[2,3,4]。

目前, 对羊肝的利用较少, 加工方式多为手工作坊, 国内许多肉类加工厂没有对其充分利用, 一部分羊肝被废弃, 如果对其进行加工利用, 经济效益将非常可观。

对于羊肝的研究国内少有报道, 其中李黎[5]等人, 优化羊肝口服液的工艺条件, 实验结果表明VA含量可高达58.33μg/100 m L。代启超等[6]以羊肝、赤豆等为原料, 研究了制作无膻味羊肝羹的最佳工艺条件。韩志慧等人以菊花、胡萝卜、决明子、红枣等为原料, 通过发酵制作出明目羊肝羹。本研究从羊肝中进行酶解多肽的抑菌活性筛选并对其影响因素进行研究, 为羊肝的综合加工利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊肝购自天津武清区泉州路市场;胰蛋白酶来自南京奥多尼生物有限公司;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌由天津天狮学院生物与食品工程学院提供。

1.2 主要仪器设备

斩拌机, 石家庄晓进机械制造科技有限公司;BPX-272培养箱, 博讯电热恒温有限公司;UV2550紫外分光光度计, 岛津中国有限公司;恒温水浴锅, 东莞市海达仪器有限公司;TG16KR高速冷冻台式离心机, 长沙东旺实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

羊肝→清洗→切块→煮沸→斩拌→分装→酶解 (p H8.0) →灭酶→离心 (3500 r/min, 15 min) →取上清液→接菌→抑菌实验

1.3.2 抑菌率的测定

经高压灭菌的5 m L液体置于培养基试管中, 无菌操作分别接入0.1 m L大肠杆菌、金黄葡萄球菌菌液, 再依次加入羊肝酶解液1 m L, 摇匀后37℃培养12 h。在600 nm处测定, 以蒸馏水作为空白组, 对照组不加酶解液, 同样条件下培养测定吸光度A0。

抑菌率%=[ (A0-An) /A0]×100%

1.3.3 单因素试验

以抑菌率为指标, 选取酶解温度、酶解时间、酶用量、底物浓度作为影响因素, 发酵条件见表1, 每个水平有5个, 重复3个平行。

1.3.4 正交试验

在单因素试验的基础上 (见表2) , 以抑菌率为评价指标, 设计四因素三水平, 得出最佳酶解条件。

2 结果分析

2.1 羊肝多肽酶解的单因素实验设计结果

2.1.1 酶解温度对羊肝多肽抑菌效果的影响

从图1可以看出, 当酶解温度为45℃时羊肝酶解液对金黄葡萄球菌的抑菌效果最好, 而羊肝酶解液只对金黄葡萄球菌具有抑菌效果, 随着温度的增加抑菌率逐渐增大, 综合考虑选

2.1.2 酶解时间对羊肝多肽抑菌效果的影响

由图2可知, 随着时间的延长, 羊肝酶解产物对金黄葡萄球菌的抑菌活性呈现先增加后降低的趋势, 6 h时酶解产物的抑菌率达到最大。原因可能是随着时间的延长, 酶解程度不断加深, 6h之前, 抑菌活性随着多肽含量的增加而增强;6h以后, 酶解继续进行, 可能将有抑菌活性的肽分解成为比之前更小的分子肽, 此时的肽不具有抑菌活性。因此, 选择最佳酶解时间5~7h。

2.1.3 酶用量对羊肝多肽抑菌效果的影响

如图3所示, 随着酶用量的增加, 羊肝酶解液对金黄葡萄球菌的抑菌率逐渐升高。综合考虑, 酶用量为3750U/g时对两种菌的抑菌效果最好。

2.1.4 底物浓度对羊肝多肽抑菌效果的影响

如图4所示, 随着底物浓度的增加, 羊肝酶解物对大肠杆菌的抑菌效果在逐渐增加, 而对金黄葡萄球菌的抑菌效果先逐渐增加后减少, 综合考虑, 当底物浓度为1:6时, 羊肝多肽酶解液对两种菌的抑菌效果最好。

2.2 正交实验结果

从表3方差分析表中可以得出, 以大肠杆菌为抑菌率指标时, 最佳的酶解条件为酶解温度45℃, 酶解时间7 h, 酶用量4 500 U/g, 底物浓度为1:7。当以金黄葡萄球菌为抑菌率指标时, 最佳的酶解条件是酶解温度50℃, 酶解时间7 h, 酶用量4 500 U/g, 底物浓度为1:6。经验证, 当酶解温度45℃, 酶解时间7 h, 酶用量4 500U/g, 底物浓度为1:7, 此时大肠杆菌抑菌率为36.77%, 金黄葡萄球菌抑菌率为17.32%;当酶解温度50℃, 酶解时间7 h, 酶用量4 500 U/g, 底物浓度为1:6, 此时大肠杆菌抑菌率为39.91%, 金黄葡萄球菌抑菌率为25.43%。综合所有因素, 最佳条件为酶解温度50℃, 酶解时间7 h, 酶用量4 500 U/g, 底物浓度为1:6。

3 结论

采用单因素和正交试验设计, 以抑菌率为指标得出胰蛋白酶的最佳酶解工艺条件为:当酶解温度50℃, 酶解时间7 h, 酶用量4 500 U/g, 底物浓度为1:6, 此时大肠杆菌抑菌率为39.91%, 金黄葡萄球菌抑菌率为25.43%, 抑菌效果均比较好。本研究结果对今后羊肝酶解生产抗菌肽的研究, 提供了一些理论数据, 同时对羊肝蛋白活性肽在食品和药品中的应用, 起到一定的推动作用, 具有比较大的实践性意义。

参考文献

[1]严英.动物肝的营养保健作用[J].药膳食疗, 2004 (5) :18.

[2]杨月欣, 王光亚, 潘兴昌.中国食物成分表2002[M].北京:北京大学医学出版社, 2002.

[3]姚碧霞, 曾琼萍, 肖富玉, 等.几种动物肝脏中V A的含量分析[J].应用化工, 2008, 37 (8) :953-954.

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 5009.82-2003食品中V A和V E的测定[S].北京:中国标准出版社, 2003.

[5]李黎, 马俪珍, 唐燕.明目羊肝口服液关键工艺优化参数研究[J].食品科技, 2012, 37 (5) :95-95.

蛋白质酶解实验教学中的实践探索 篇4

关键词：蛋白质酶解;实验教学;改革

蛋白质酶解属于传统的蛋白质化学技术，蛋白质在酶的作用下，水解特定的位点，用于一级结构分析肽谱。胰蛋白酶专一作用在赖氨酸和精氨酸的羧基端，但对Arg-Pro和Lys-Pro键没有作用。酶切后得到的肽段碎片需要进一步分析其一级结构，传统的一级结构鉴定需要N端序列仪，随着现代生物技术的发展，质谱作为蛋白质鉴定的主流技术得到广泛应用。因此，蛋白质酶解联用质谱技术测定蛋白质成为学习蛋白质化学的必备知识。在教学实验课中，让学生在掌握传统蛋白质酶解技术同时了解质谱技术在生物大分子中的应用，使学生对蛋白质一级结构鉴定的知识理解得更加深刻，拓展学生的知识面。

本课题小组在蛋白质酶解实验课程进行教学改革，主要做了以下几方面工作：

一、加强学生的实践能力

生物类学科要求培养学生的动手能力，但生物课程实践环节偏少。针对这些问题，在教学改革中，教师首先考虑的是如何加强学生的动手实践能力。由于需要引进现代分析技术，所以改革过程中首要任务是建立中、大型仪器公共服务平台。实验室由生命科学与技术学院实验教学中心与医学院生物实验室联合组成跨学院共享型实验室。通过规范的管理，实现实验室、仪器设备和实验技术人员的共享，并在此基础上建立跨学科的综合性实验教学体系，进行研究型实验教学模式的实践，探索具有同济特色的创新型人才培养模式。本实验室位于同济大学医学院蛋白质研究所，包含4个学生实验室、2个实验准备室、1个仪器室、1个细胞培养室。该所拥有国际一流的蛋白质/多肽研究的实验设备和一流的科研队伍，并承担国家科技部“973”的“SARS”防治基础研究课题、新活性多肽的优化设计与靶分子相互作用的理论模拟和人类肝脏结构蛋白质组学研究、上海市科委“多肽作为艾滋病药物的研制”、国家自然科学基金—— 广东省自然科学基金联合基金等多个项目。

在实验课程改革方面，我们首先采用了实验课程多媒体教学，生动形象地将理论知识直观化，其内容包括实验原理、实验步骤，实验注意事项和实验讨论部分，同时展示实验视频，让学生在动手实验之前具备直观的认识。整个实验过程中，教师指导，学生2～3人一组从最初的溶液配制开始独立完整地完成整个实验。在实验过程中，让小组中每个学生都积极主动地参与到实验中。实验结束后，学生组内讨论，查阅文献，撰写实验报告，分析和解决实验中出现的问题，逐渐培养学生的初步科研思维。

二、实施研究性教学

蛋白质化学课程具有系统性和连贯性，由于实验教学学时有限，如何让学生在短暂的实验课上系统地掌握该课程的理论知识和实验技能是教改过程中的一大难题。另外，我们发现孤立的蛋白质酶解实验并不能，很好地将理论知识和实验操作连接起来。本课题小组将学生的实验课程安排到教师的科学研究项目中进行学会学生实验教学。这种教学方式的改变目的性明确，针对性强。首先教师确定实验方案，这个实验方案是教师课题研究的一部分，由教师提前和学生介绍课题背景，向学生提供相关文献资料，学生通过提前的基本知识学习和文献查阅相关资料，然后教师安排课上疑点难点交流，明确实验可行性分析和实验方案的技术路线，最后在老师的指导下独立完成实验，整理统计实验数据，分析实验现象和实验结果，撰写实验分析报告。这种研究性教学让学生理解每个实验在整个研究项目的位置，让学生以主人翁的意识参与到实验项目中，发挥主动性，使得学生们的大脑与双手同时得到锻炼。

蛋白质酶解属于传统的蛋白质化学技术，单独的酶解实验只是机械地将知识传递给学生，无法达到知识、能力和素质的综合培养。在本小组开展的研究性实验教学中，选择教师课题项目的一部分作为学生教学实验，由教师将该研究课题介绍给学生，同时将现代分析技术质谱技术带入到蛋白质酶解实验中，主要让学生掌握蛋白质酶解技术，了解质谱技术在生物大分子中的应用，看懂质谱图谱和报告，能区别蛋白/多肽的质谱测定和N端蛋白/多肽测序的区别。

三、提高教师素质

蛋白质技术是一门技术性强的学科，发展日新月异，这对从事学科教学的教师提出了更高的要求，急需建立一支高素质、高水平的教师队伍。学校积极开展教师与国内外同行进行学术交流，参加学术会议，培养在职教师进修深造等。教师自身需要不断学习，关注专业最新动态发展，丰富和完善知识体系。教师在进行科研工作时，应不断总结研究经验，有利于在实验教学中对学生动手能力和创新意识的培养。

对蛋白质化学课程进行教学改革，提高学生的实践能力，实行研究性教学，提高教师素质，提高教学质量，不断探索新的教学方法，使教学改革适应时代发展的需要，使学生的综合素质得到进一步锻炼和提高，从而培养出复合型创新性人才。

参考文献：

[1]张艳贞，陈文，郭俊霞，文镜.基于核心能力培养的《蛋白质化学》课程教学改革[J].职业技术教育，2011（32）：28-30.

[2]王秧年，陆大东，叶涛，奚中华，李琳.色谱-质谱联用仪在1-溴丁烷教学实验中的应用[J].实验技术与管理，2011，（28）：

64-65.

玉米秸秆酶解条件的试验研究 篇5

纤维素是地球上最丰富和最廉价的可再生资源。目前,纤维素材料利用率极低,大部分被抛弃或焚烧,不仅造成巨大的资源浪费,而且污染环境,带来公害。由于酶解反应条件温和、设备简单、能耗低以及污染小,所以纤维素酶解条件的研究得到广泛重视。

本文用纤维素酶对玉米秸秆进行酶解,探讨了温度、pH值、固液比、酶浓度和酶解时间等对玉米秸秆酶解条件的影响,以便为玉米秸秆生产酒精提供一定的参考。

1 试验材料和方法

1.1 材料

玉米秸秆取自沈阳农业大学能源研究示范基地,其成分如表1所示。纤维素酶购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

在温度为50℃、pH值为5、酶浓度为1.5g/L、固液比为1:10、酶解时间为48h的基础上,分别设置不同的梯度条件,研究温度、pH值、酶浓度、固液比和时间对玉米秸秆酶解条件的影响。

1.3 玉米秸秆的酶解

称取一定量的玉米秸秆装入250mL三角瓶中,与装有100mL蒸馏水的三角瓶一同灭菌。冷却后加入一定量的纤维素酶,混匀。在给定的温度、pH值和时间下反应,待反应结束后过滤。

2 结果与分析

2.1 温度对得糖量的影响

取30,35,40,45,50℃等5个温度梯度,研究温度对玉米秸秆酶解条件的影响,结果如图1所示。

由图1可知,还原糖[1]和总糖含量随温度的升高而升高。当温度达到45℃时,如果温度再升高,还原糖和总糖含量反而下降,而蔗糖含量随温度的变化不大。在酶解反应中,温度是一个重要的因素,它不仅影响反应速度,而且影响纤维素酶的活性。当温度升高时,与一般的化学反应一样,反应速度加快,有利于纤维素酶解的进行;但随着温度的继续升高,酶蛋白逐渐变性,反应速度随之下降。因此,酶解反应存在一个最适温度。实验结果表明,纤维素酶解的最适温度是45℃。在此温度下, 还原糖含量为3.39g,总糖含量为3.66g,蔗糖含量为0.27g。温度升高到50℃时,得糖量反而下降,这主要是由于纤维素酶的酶活下降,导致纤维素酶解速度下降,得糖量降低。如果有更高的温度,纤维素酶蛋白分子可能会迅速变性[2],酶解速度反而会更慢。

2.2 pH值对得糖量的影响

取3,4,5,6,7等5个pH值梯度,研究pH值对玉米秸秆酶解条件的影响,结果如图2所示。

由图2可知,pH值为5时得糖量最高,还原糖含量为3.28g,总糖含量为3.54g,蔗糖含量为0.27g。由于纤维素酶的活性受其环境pH值的影响,在一定pH值的条件下,酶反应有最大反应速度,高于或低于此值,反应速度下降。pH值的改变可引起纤维素酶活的损失,还能影响酶活性中心催化基团和底物的解离状态,使底物不能与其结合或结合后不能生成产物[3]。因此,纤维素酶解时,要适当控制酶解体系的pH值,使纤维素酶呈现出最大活力。

2.3 固液比对得糖量的影响

取5:100,10:100,15:100,20:100,25:100等5个固液比梯度,研究温度对玉米秸秆酶解条件的影响,结果如图3所示。

由图3可知,固液比为1:10时得糖量最高,还原糖含量为3.14g,总糖含量为3.46g,蔗糖含量为0.32g。在其他条件一定时,当底物浓度较低时,反应没达到饱和,反应速度随底物浓度的增加而迅速增加;而后底物继续增加时,反应速度增加率就比较小;当底物浓度增加至某种程度时,反应饱和或趋于饱和,反应速度达到一个极限值;此后即使再增加底物浓度时,反应速度增加较小或不再增加。底物过量时,超出酶对应的底物上限的那部分就不会被酶解,同时底物过量会增加酶解反应的不均一性,因此影响了酶解的反应。

2.4 酶浓度对得糖量的影响

取0.5,1.0,1.5,2.0,2.5g/L等5个酶浓度梯度,研究酶浓度对玉米秸秆酶解条件的影响,结果如图4所示。

由图4可知,随着纤维素酶浓度的增加,糖量不断增高,在酶浓度为1.5 g/L时得糖量最高, 还原糖含量为3.38g,总糖含量为3.68g,蔗糖含量为0.30g;但是随着酶浓度的继续增高,得糖量反而下降。当酶量较少时,反应速度太慢,许多玉米秸秆没有机会与酶结合,产糖量较少;酶量较多时,由于反应已达到饱和,会造成不必要的浪费。因此,需要确定适当的酶添加量[4]。

2.5 酶解时间对得糖量的影响

分别在12,24,36,48,60,72h等6个时间段测定得糖量,研究酶解时间对玉米秸秆酶解条件的影响,结果如图5所示。

由图5可知,在反应的初始阶段,得糖量增加较快,反应时间到达48h后,得糖量反而下降。这主要因为:一方面随着反应进行,产物逐渐增多,抑制作用增强,即产物中含有的有毒和有害物质对酶解反应有抑制作用;另一方面,随着反应时间的延长部分糖被降解[5]。

3 结语

本文利用纤维素酶对玉米秸秆进行酶解试验,研究了温度、pH值、固液比、酶浓度以及酶解时间对玉米秸秆酶解的影响。根据实验结果玉米秸秆酶解的最佳条件:温度为45℃,pH值为5,固液比为1:10,酶浓度为1.5g/L,酶解时间为48h。在此条件下,玉米秸秆酶鲜得糖量最高, 还原糖含量为3.39g,总糖含量为3.66g,蔗糖含量为0.27g。

摘要：以玉米秸秆酶解的过程为研究对象,研究了各因素对酶解得糖量的影响。得出最优条件:温度为45℃,pH值为5,固液比为1:10,酶浓度为1.5g/L,酶解时间为48h。此时,还原糖含量为3.39g,总糖含量为3.66g,蔗糖含量为0.27g。

关键词：玉米秸秆,纤维素酶,酶解

参考文献

[1]稳宏,吴大雄,高新,等.麦秸纤维素酶解法产糖预处理工艺条件研究[J].西北大学学报(自然科学版),1997,27(3):227-230.

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[3]万年升,郭荣富.纤维素酶的作用因素和应用中应注意的问题[J].生物技术应用,2002,23(7):41.

[4]何勇,薛立新,李树俊.纤维素酶水解汽爆秸秆的研究[J].酿酒,2007,34(4):98-99.

[5]刘斌,蔡敬民,吴克,等.纤维素酶对稻草秸秆水解的研究[J].中国饲料,2007(5):33-34.

蟹肉风味蛋白酶酶解工艺研究 篇6

1 实验材料

煮熟的梭子蟹肉备用, 胰蛋白酶, 碱性蛋白酶, 风味蛋白酶, 木瓜蛋白酶和胃蛋白酶购买于北京索莱宝科技有限公司。

S-2C型PH计, 恒温水浴锅, CS501型水域锅。

2 试验方法

2.1 蛋白质含量的测定

本文参照半微量凯氏定氮法[3]。

2.2 梭子蟹的酶解方法

称取20 g梭子蟹用粉碎机打碎成粉, 加入100 m L蒸馏水。调节水浴锅至预定温度, 将底物先预热10min, 酸碱调制所需p H值, 再加入E/S为4%的蛋白酶进行酶解, 酶解达到预定时间后, 沸水浴灭酶活5min, 以终止酶解反应, 迅速冷却至室温, 以5000rpm离心10min, 倾倒出上清液定容至30m L备用, 并在同条件下做无底物对照组。

2.3 最佳用酶的选择及口感的评定方法

选用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶这5种蛋白酶在各自适宜酶解温度、p H、时间、酶与底物之比E/S为4%的条件下进行酶解反应, 对不同酶解后的水解液, 通过离心机用4000 r离心5min, 收集上清液并煮沸, 供评定小组进行评定。同时, 测定蟹肉的水解度。评定小组由10位组成, 其评定严格的按照规范进行, 评分表如下图所示。将评定结果进行打分, 并求出不同酶解液酶解后的感官分数[4]。

2.4 风味蛋白酶的单因素实验

根据口感实验筛选出木瓜蛋白酶为最佳对的酶解条件, 所以以DH%为指标, 对风味蛋白酶解p H、温度、E/S和时间进行单因素实验。对风味蛋白酶酶解时间进行单因素实验, 酶解温度为40℃, E/S为3%, p H为6.5, 酶解时间为2h, 4h, 6h, 8h, 10h。对温度进行单因素实验, 控制风味蛋白酶的水解时间为6h, E/S为3%, p H为6.5, 酶解温度为变量为25℃, 35℃, 45℃, 55℃, 65℃, 75℃。对风味蛋白酶酶解的p H进行单因素实验, 控制解时间为6h, 温度为55℃, E/S为3%, 酶解p H为变量为3, 4, 5, 6, 7和8。对风味蛋白酶的酶解E/S进行单因素实验, 控制酶解时间为6h, 温度为55℃, 酶解p H为7, E/S的变量为2%, 3%, 4%, 5%, 6%。

3 实验与结果

3.1 最佳用酶的选择

经测定水解度的测定发现风味蛋白酶的水解度最大, 达到30.34±0.31%, 且与弹性蛋白酶, 胃蛋白酶, 胰蛋白酶, 菠萝蛋白酶和风味蛋白酶之间存在着显著的差异。经过10位鉴定成员对酶解后的蟹肉进行得分评定, 风味蛋白酶的得分最高为78.0±5.0%, 比较水解度与得分之间的关系还发现水解度与蟹肉的得分有着相关性, 在某种程度上, 水解度越大, 得分越高。

3.2 风味蛋白酶单因素实验优化的结果

分别对风味蛋白酶进行时间, 温度, p H和E/S进行单因素实验, 可以看出在6h内, 随着酶解时间的延长, 水解度是不断增加的, 达到最大值为30.76±0.82%, 酶解10h的水解度与6小时的差异不显著。所以酶解时间为6小时, 较为合适。从图1 B可以看出当温度为55℃时, 酶解效果最大为30.56±0.87%, 且水解度与其它温度差异较为显著, 最适的酶解温度为55℃。从图1C可以看出p H为7时, 水解度最大为30.21±0.62%, 从图1 D中可以看出最佳E/S为4%。所以, 风味蛋白酶对蟹肉蛋白最佳的水解条件为时间6h, 温度为55℃, p H为7, E/S为4%。

4 结论

通过对五种不同的蛋白酶进行选择, 选择出风味蛋白酶的水解度和鉴定得分最好分别为30.34±0.31%和78.0±5.0。在对风味蛋白酶进行单因素条件的优化, 得出最佳的酶解条件为时间6h, 温度为55℃, p H为7, E/S为4%。并在此条件下测得水解度为32.24±0.34%, 鉴定得分为80.4±4.0。

用木瓜蛋白酶的酶解效果较好, 在最佳的酶解工艺条件下, 蟹肉下脚料的水解度可达到32.24%左右, 蟹鲜味微淡, 很香, 与天然的蟹香味较为接近。

参考文献

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[2]乐坚.酶法水解甲鱼蛋白的研究[J].食品工业科技, 1997 (06) :46.

[3]张华山.酶法水解猪血蛋白的研究[J].粮食与饲料工业, 1999 (08) :33-34.

紫薯浆制备及酶解工艺的研究 篇7

1.1 材料

紫薯:在福州永辉超市购买 (川山薯品种) , 品质要求:优质、无病虫害、无机械损伤、无变质、皮薄;

高温α-淀粉酶 (α-Amylase) :20000U/g, 由aladin试剂 (上海) 有限公司提供。

1.2 主要仪器

A88组织捣碎机:江苏省金坛市医疗仪器厂;

PHS-3C精密p H计:梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司;

AB204-N电子天平:梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司;

2002型水浴恒温振荡器:常州国华电器有限公司;

LD5-2B型离心机:北京众益中和生物技术有限公司;

UV2000紫外可见分光光度计:日本岛津仪器有限公司。

1.3 试验方法

可溶性固形物测定方法:GB/T12143-2008;

总糖的测定方法:GB/T5009.8-2008;

淀粉的测定方法:GB/T5009.9-2008;

还原糖的测定方法:还原糖含量能够间接反映酶解的程度, 以100g酶解液为基准, 按GB/T5009.7-2008方法测定。

1.4 紫薯蒸煮时间的确定

挑选新鲜紫薯, 洗净、去皮后切成2~3cm的薯块, 于100℃下蒸煮0min、5min、10min、15min、20min后, 再分别以1∶5料水比打浆, 观察紫薯浆液状态, 确定紫薯的最佳蒸煮时间。

1.5 紫薯浆酶解液最佳料水比的确定

挑选新鲜紫薯, 洗净、去皮后切成2~3cm的薯块, 于100℃蒸煮10min后, 再以一定的料水比 (1∶1, 1∶3, 1∶5, 1∶10, 1∶15, m/m) 打浆, 3000r/min离心10min, 测定滤液中的可溶性固形物、总糖以及淀粉的含量。

1.6 紫薯浆酶解工艺的研究

挑选新鲜紫薯, 洗净、去皮后切成2~3cm的薯块, 于100℃下蒸煮10min后, 再以1∶5 (m/m) 料水比打浆, 制成紫薯浆预酶解液。进行试验的每组紫薯浆质量100g, 酶解后3000r/min离心10min, 取上清液测定还原糖含量。

1.7 高温α-淀粉酶酶解条件的研究

将高温α-淀粉酶加入紫薯汁中, 分别进行加酶量、酶解时间、酶解温度和最适p H的研究, 确定高温α-淀粉酶酶解条件。

2 结果与分析

2.1 紫薯蒸煮时间的确定

紫薯的蒸煮是为了使淀粉充分糊化, 进而利于酶解, 蒸煮结果如表1所示。未蒸煮而直接打浆的紫薯汁粘度差, 色泽也较差, 不利于酶解;比较不同蒸煮时间后的打浆液后, 得出蒸煮10min的紫薯汁状态最好, 香味和粘度都比较适宜。

2.2 紫薯汁酶解浆液最佳料水比的研究

紫薯与水的打浆比例影响着调配过程中饮料的风味:过高的水分会使物料过稀, 易造成酶解后紫薯原浆浓度过低, 影响紫薯饮料的调配过程;而过少的水分不能完全把紫薯浸没, 导致浆液过于浓稠, 影响酶解效率。本文比较了不同料水比对紫薯滤液可溶性固形物、总糖和淀粉含量的影响, 结果见表2。

由表2可知, 随着料水比的变化, 紫薯汁中3个测定指标的都呈一定的变化规律。可溶性固形物, 先下降后增大, 并在料水比为1∶5处达到最大, 而后可溶性固形物又开始下降;而总糖和淀粉的含量则随着料水比的增大而增大, 在1∶5处达到稳定。综合考虑提取效率和饮料风味等因素, 选择1∶5作为紫薯打浆的最佳料水比。

2.3 高温α-淀粉酶酶解条件的研究

2.3.1 加酶量对酶解效果的影响

分别取紫薯汁6组, 按高温α-淀粉酶0 U/g、10 U/g、20U/g、30 U/g、40 U/g、50U/g, 在温度90℃, p H6.5条件下酶解1h, 测定还原糖的含量, 结果见图1。

由图1可知, 当高温α-淀粉酶用量为20U/g时, 紫薯汁的还原糖含量达到最高, 而后继续增大加酶量, 紫薯汁的还原糖含量也不再增加。说明紫薯汁中的淀粉已经基本被作用完全, 所以确定高温α-淀粉酶的适宜添加量为20U/g。

2.3.2 酶解温度对酶解效果的影响

分别取紫薯汁6组, 按高温α-淀粉酶20U/g, 在温度75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃, p H6.5条件下酶解1h, 测定还原糖的含量, 结果见图2。

酶是蛋白质类物质, 温度对酶活性的影响很大, 因此, 选择一个合适的酶解温度能提高产品的得率。由图2可知, 在一定条件下, 紫薯汁还原糖含量随着温度的升高而加大, 在90℃时, 还原糖含量达到最高水平。超过90℃时, 酶的活性减弱, 酶解率下降。因此, 确定90℃为高温α-淀粉酶的最佳水解温度。

2.3.3 酶解p H对酶解效果的影响

分别取紫薯汁9组, 按高温α-淀粉酶20U/g, 在温度90℃, p H为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0条件下酶解1h, 测定还原糖的含量, 结果见图3。

在不同p H环境下, 酶所表现的活力不一样, 酶解率也是不同的。由图3可知, 高温α-淀粉酶酶解时的p H环境是弱酸性的, 以p H3.0为起点, 随着p H值的升高, 紫薯汁中还原糖含量随之增大;在p H值为6.0时, 紫薯汁中还原糖含量达到最高。而后继续升高p H值, 还原糖含量之下降。因此, 选取p H6.0为高温α-淀粉酶的最佳酶解p H值。

2.3.4 酶解时间对酶解效果的影响

分别取紫薯汁6组, 按高温α-淀粉酶20U/g, 在温度90℃, p H为6.0条件下酶解15min、30min、45min、60min、90min、120min, 测定还原糖的含量, 结果见图4。

由图4可知, 随着水解时间的增加, 紫薯汁的还原糖含量也逐渐增加, 当酶解时间为60min时还原糖含量达到最高;当酶解时间超过60min后, 底物基本被酶解完全, 因此, 选取60min为高温α-淀粉酶的最佳酶解时间。

3 结语

通过比较确定紫薯的最佳蒸煮时间为10min, 紫薯打浆的料水比为1:5;高温α-淀粉酶酶解紫薯汁的工艺参数为:加酶量20U/g, 酶解温度90℃, 酶解时间60min, p H6.0。

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六种蛋白酶酶解效果的研究 篇8

蛋白质是动物生长的物质基础,主要来源于动植物性蛋白饲料。但由于动物自身往往不能分泌足够的蛋白酶来消化饲料中的蛋白质,不但降低了蛋白质利用率还容易引起动物腹泻、生长迟缓等营养性疾病[1]。在饲料中添加蛋白酶可以补充动物内源蛋白酶,提高内源蛋白酶活性,将一些难以消化的蛋白质水解成利于吸收的肽和氨基酸[2~4],并产生活性物质提高动物的激素代谢水平[5],从而提高饲料中蛋白质的利用率[6]和动物免疫力。据研究,在饲料中添加一种含木聚糖酶、β-葡聚糖酶和蛋白酶的复合酶可有效提高生长猪日增重和饲料报酬[7]。Ghazi等[8]研究表明,在肉鸡豆粕饲料中添加蛋白酶,可提高饲料真代谢和真氮消化率。Drew等[9]发现,在虹鳟鱼日粮中添加蛋白酶,可提高消化率改善生长性能。有研究证明,在幼龄动物饲料中添加蛋白酶有改善断奶后消化不良、降低腹泻率等特殊作用[10,11]。然而近年来,对饲用蛋白酶的研究多以常见的蛋白酶,如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等为主,对新型饲用蛋白酶的研究却鲜有报道。随着畜牧业的不断发展,开发更高效更适合饲料原料的新型蛋白酶制剂显得越来越重要。

我国蛋白饲料严重短缺,在饲料生产中多使用工业废料如豆粕、菜籽粕、花生粕等为主要蛋白原料,其开发及利用一直是学术界的焦点。本实验以肽含量为指标,研究六种酶对饲料中应用最多的豆粕、玉米芽粕、花生粕、菜籽粕、酒糟及新型饲料原料黄粉虫、地鳖的酶解效果,研究其酶解特性,为开发新型饲用蛋白酶提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆粕、玉米芽粕、花生粕、菜籽粕、酒糟、黄粉虫、地鳖虫由青岛农业大学食品科学与工程学院中韩食品生物技术研究所提供。

1号蛋白酶产自黑曲霉,最适温度50 ℃,最适pH值3.5;2号蛋白酶产自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),最适温度55℃,最适pH值7.0;3号蛋白酶产自地衣芽胞杆菌,最适温度50 ℃,最适pH值10;4号蛋白酶产自地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis),最适温度55 ℃,最适pH值8.5;5号蛋白酶产自黑曲霉(Asperqillus niger),最适温度50℃,最适pH值9.0;6号蛋白酶产自黑曲霉,最适温度55 ℃,最适pH值8.0。上述蛋白酶均由四川绵阳禾本生物工程有限公司提供。

二喹啉甲酸(BCA)蛋白质检测试剂盒,北京泰天河生物技术有限公司;牛血清白蛋白(BSA)标准品,原平皓生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

FD8-3a冷冻干燥机,美国SIM公司;RE-6000旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器公司;UV-2000紫外分光光度计,上海尤尼柯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解过程的表征

将六种不同的蛋白酶样品分别按其最佳酶解温度和最佳酶解pH值对豆粕、玉米芽粕、花生粕、菜籽粕、酒糟、黄粉虫及地鳖虫进行酶解。料液比为1∶15,调节最佳酶 解pH值,每克原料 加酶量为100μg,在最佳酶解温度下水浴振荡酶解,分别设定酶解时间为0、2、4、6、8、10、12h,每个时间点取样后,样品经80 ℃水浴灭酶处理15min,离心取上清液即为酶解液。

1.3.2 酶解样品肽含量的测定

取BCA母液A和B按体积50∶1比例混合,取20μL酶解样品,加入200μL BCA工作液,充分混匀,37℃水浴1h,在562nm下测定吸光度。以0.9%NaCl溶液做空 白对照,用BSA制作标准 曲线,得BSA标准曲线的回归方程为y=1.884 7x+0.003 3 (R2=0.999 1)。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶样品酶解豆粕肽含量

由图1可知,豆粕酶解液中肽含量总体呈先增后降的趋势。在最初的2h内,除1号蛋白酶外,其他蛋白酶的酶解效率都很高,其中3号蛋白酶效率最高,2h以后蛋白酶酶解效率逐渐降低。4号蛋白酶酶解豆粕肽含量在6h时达到最高值,为17.47mg·L-1,3号蛋白酶酶解豆粕肽含量较4号略低,为16.96mg·L-1。可见3、4号蛋白酶可以在短时间内高效分解豆粕中的蛋白质,相较于其他几种蛋白酶实用性更强。

2.2 不同蛋白酶样品酶解玉米芽粕肽含量

由图2可知,酶解液中肽的含量在最初2h内增加明显,之后有小幅增加。其中3号蛋白酶酶解效率最好,酶解玉米 芽粕肽含 量达到6.72 mg·L-1。六种蛋白酶酶解玉米芽粕所得最终肽含量并不高,说明六种蛋白酶对玉米芽粕酶解能力不高。

2.3 不同蛋白酶样品酶解花生粕肽含量

由图3可知,3、4、5、6号蛋白酶酶解花生粕能力很强,实验的最初2h内酶解液中肽含量迅速增加,之后肽含量逐渐下降,5号蛋白酶酶解花生粕肽含量在4h时达到21.88 mg·L-1,酶解能力远高于其他5种蛋白酶。1、2号蛋白酶酶解花生粕能力较低,利用价值不大。

2.4 不同蛋白酶样品酶解菜籽粕肽含量

由图4可知,酶解过程中肽的含量在快速上升后保持稳定,且几种蛋白酶酶解液之间肽含量差异并不大。反应最初2h肽含量迅速增加,此时蛋白酶活力最高。六种蛋白酶的肽含量曲线近乎重叠,可知六种蛋白酶的酶解过程有相似性。综上可知,六种蛋白酶酶解菜籽粕能力都很高且差异不大。

2.5 不同蛋白酶样品酶解酒糟肽含量

由图5可见,肽含量在反应最初的4h内有明显增加,可知六种蛋白酶对酒糟的酶解能力在最初的4h最好。由肽含量曲线可知,六种蛋白酶对酒糟的酶解过程很相似,反应12h时六种蛋白酶酶解酒糟肽含量并不高且相差不大,可知六种蛋白酶对酒糟的酶解效果并不理想,其中3号蛋白酶酶解能力强于其他5种蛋白酶。

2.6 不同蛋白酶样品酶解黄粉虫肽含量

由图6可知,在反应最初的2h内,六种蛋白酶酶解效率都很高,之后1、2、3、4号蛋白酶酶解液中肽含量继续增加,在12h内呈上升趋势。其中3号蛋白酶酶解效果最好,反应12h时肽含量达到最高,为17.66mg·L-1,5、6号蛋白酶酶解液中肽含量在反应2h之后不再增加,说明其对黄粉虫的酶解效果较差,利用价值不大。

2.7 不同蛋白酶样品酶解地鳖肽含量

由图7可知,酶解液肽含量先升后降,在最初2h内地鳖虫酶解液中肽含量迅速增加,可知在这期间酶活力最强,其中3号蛋白酶酶解能力最为突出,在2h时酶解地鳖肽含量高达36mg·L-1,在反应4h后酶解液肽含量开始明显下降。综上可知,六种蛋白酶中3号蛋白酶酶解地鳖虫能力最好,最佳酶解时间为2h。

3 结 论

酶解技术 篇9

摘 要：运用超声辅助酶解进行猪血血红素的制备，并对猪血血红素在不同环境下紫外-可见吸收光谱进行分析。结果表明：超声可以使酶活力提高25.5%，提高了酶解反应效率，缩短了酶解反应所需时间；对酶解产物pH值调节后进行离心分离血红素，并经纯水洗涤后再次离心，对血红素样品进行真空冷冻干燥；通过与血红素标准品比对，所得产品纯度达到83.2%。在碱性条件下，血红素溶液具有明显的特征吸收光谱；在酸性条件下，血红素溶液在300～400 nm和640 nm附近的特征吸收光谱发生了显著变化，吸收值明显降低。

关键词：酶解；猪血；血红素；吸收光谱

Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Porcine Heme and Characterization by UV-Vis Absorption Spectroscopy

LIU Wenying1， ZHANG Zhenqi2， CHENG Xiaoyu1，*， LI Yingnan1， JIA Xiaoyun1， LI Jiapeng1， CHEN Wenhua1， QU Chao1

（1. Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， China Meat Research Center， Beijing Academy of Food Sciences，

Beijing 100068， China； 2.Beijing Light Industry Polytechnic College， Beijing 100070， China）

Abstract： Porcine heme was prepared by ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis of porcine red blood cells with Protamex and its UV-Vis absorption characteristics under acidic and alkaline conditions were analyzed. Results revealed that ultrasonic treatment resulted in a 25.5% increase in the enzyme activity， augmenting the hydrolysis efficiency and shortening the hydrolysis time. After pH adjustment of the hydrolysate， centrifugal separation of heme was carried out， followed by washing with purified water， second centrifugation and vacuum freeze drying. The product purity was determined using heme standard to be 83.2%. Under alkaline condition， the heme exhibited the obvious characteristic absorption， whereas under acidic condition， its characteristic absorption in the region of 300–400 nm and near 640 nm changed noticeably， showing a pronounced decrease in absorbance values.

Key words： enzymatic hydrolysis； pig blood； heme； absorption spectrum

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.001

中图分类号：TS251.93 文献标志码：A文章编号：1001-8123（2016）03-0001-04

引文格式：

刘文营， 张振琪， 成晓瑜， 等. 超声辅助酶解制备猪血血红素及紫外-可见吸收光谱分析[J]. 肉类研究， 2016， 30（3）：

1-4. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

LIU Wenying， ZHANG Zhenqi， CHENG Xiaoyu， et al. Ultrasonic-assisted enzymatic extraction of porcine heme and characterization by UV-Vis absorption spectroscopy[J]. Meat Research， 2016， 30（3）： 1-4. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.001. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

血是畜禽屠宰加工过程产生的主要副产物之一，我国2014年全年猪肉总产量为5 671万 t，在满足人们消费需求的同时，产生了大量猪副产物，其中猪血占有重要部分[1]。血液中含有大量的蛋白质、维生素、矿物质和其他物质，被誉为“液体肉”，其中尤其以血细胞中蛋白质和铁含量最为丰富[1-2]。

目前人们对猪血的应用集中在食品、饲料、化工和医学等领域，食品上主要是进行血豆腐、血肠等的加工，或者利用血红素增加肉制品的着色效果；在饲料应用上主要是补充蛋白质和矿物质等，增加非反刍动物的免疫力；而医学上主要是生物制剂的开发。但是鉴于其在食品加工上附加值较低，饲料利用上又考虑到物种的同源性，使其利用受到限制；而在医学上进行生物制剂的加工，包括血红蛋白肽、血红素等的加工，基于其来源广、成本低廉和易于加工，将会产生良好的经济效益和社会效益，应用前景广阔[3-4]。

缺铁是当今世界上最为严重的营养缺乏症之一，缺铁会对生物体产生各种损害[5]。传统的补铁制剂主要是二价的非血红素铁，如硫酸亚铁和有机酸亚铁盐类等，这些补铁制剂易受其他因素干扰，吸收效率不高，同时，体内金属铁离子过多时，会诱发体内产生大量自由基，对身体健康产生危害。因此寻找一种安全、高效的补铁制剂迫在眉睫。血红素是一类铁卟啉化合物，结构如图1所示[6]，是红细胞的主要成分之一，血红素在小肠内直接被上皮细胞吸收，不受植酸盐等物质影响，吸收率可达15%～20%[7-8]，为其作为一种安全有效的铁制剂提供了方便。

血红素的传统制备方法，主要有冰醋酸法、酸性丙酮法、羧甲基纤维素法和蛋白酶水解法等。鉴于有机溶剂难以回收、产品纯度较低、生产成本高和生产周期长等缺点，目前普遍采用酶解法[9-10]。本研究旨在通过超声辅助酶解反应制备血红素，对其提取效果进行分析，并针对血红素在不同环境下的稳定性进行分析，以期对血红素更好地提取、利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪血采自北京资源亚太食品有限公司，采血后加入5‰柠檬酸三钠抗凝，充分混匀后冷藏备用。

二水合柠檬酸三钠、氢氧化钠、盐酸、硝酸、盐酸、硫酸、氯化钠均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司；ProtamexTM复合蛋白酶 诺维信（中国）生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

CR21GⅢ离心机 日本日立株式会社；LCH-18恒温水槽 日本三洋株式会社；BSA822-CW天平、PB-10

pH计 德国赛多利斯集团；F6/10-10G超细匀浆器

上海Fluko流体机械制造有限公司；Agilent 7700电感耦合等离子体质谱仪 美国安捷伦科技公司；Cary 50 spectrophotometer紫外-可见分光光度计 美国Varian公司；Cascada BIO纯水机 美国Pall公司；UP-400S手

提式超声波细胞破碎仪 宁波新芝公司；TANK微波消解仪 济南海能仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血红蛋白溶液的制备

将加入抗凝剂的血液，在3 000 r/min条件下离心10 min，将获得的沉淀加入0.9%的NaCl溶液搅匀后再次离心，重复3 次；将获得的沉淀在沸水下加热10 min，用均质机充分均质，置于4 ℃备用。

1.3.2 超声条件的选择

参考文献[11]方法测定酶活性大小。超声条件选择的依据是酶活力的大小，依据酶最适活性温度，将酶反应的条件设为40 ℃、pH 6.0。通过改变超声的功率大小，对比酶活性的大小，选择最为合适的超声条件。

1.3.3 水解度测定[12-13]

（1）

式中：AN为氨基态氮含量/（mol/L）；TN为总氮含

量/（mol/L）。

1.3.4 水解条件工艺参数的选择

将制备好的血红蛋白水溶液pH值调节至6.0，设定反应温度为40 ℃，待恒温后加入反应酶，开始反应。水解过程中，滴加0.1 mol/L的NaOH溶液，保持反应体系pH值的恒定，水解反应结束后，将酶反应液在沸水浴中加热10 min灭酶。

参考文献[12-14]方法，测定水解度和上清液在383 nm波长处吸光度A383 nm，确定所需的反应时间。

1.3.5 血红素的分离纯化

将水解液在30 ℃保温后，将水解液调节为pH 4.0，分别在3 000、3 500、4 000、4 500、5 000 r/min离心，通过在383 nm波长处测定吸光度A383 nm，确定最佳沉淀的转速；将水解液调节为pH 4.0，在4 000 r/min下离心，通过在383 nm波长处测定吸光度A383 nm，确定最佳离心时间。

1.3.6 铁离子含量的测定

参考文献[15-16]方法，采用微波消解和电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法测定样品中铁离子含量，并略有修改。

微波消解条件为：样品加入10 mL消解液（HNO3∶HCl=5∶2，V/V），分别在120 、180、150 ℃条件下1 500 W超声2 min，然后定容待用。

ICP-MS操作参数如下：功率1 270 W，冷却气流量（Ar）12 L/min，雾化气流量（Ar） 1 L/min，扫描次数200 次，停留时间10 ms，总采样时间18 s。

1.3.7 血红素的提取率和纯度的测定

（2）

式中：产品中血红素含量、原料中血红素含量（以铁含量换算为血红素含量/g）。

（3）

式中：产品中铁含量（以ICP-MS测定铁含量计/%）；纯品血红素铁含量（以血红素理论值计13.77%）。

1.3.8 吸收光谱学分析

参考文献[17-18]方法，并略有修改，样品制备后扫描190～1 100 nm紫外-可见吸收光谱，扫描波长为1 nm，扫描3 次，取平均值。

1.4 数据分析

实验均进行3 次重复，取平均值，使用Excel、Origin 8.0

进行数据整理和制图。

2 结果与分析

2.1 血红素制备条件的选择

2.1.1 超声对酶活力的影响

实验中选用的酶为复合蛋白酶，最适的反应条件为40 ℃、pH 6.0。由图1可知，随着超声频率的增加，酶活力的大小呈现先增加后减小的趋势，在21 kHz时酶活力最高，较之不超声酶活力增加25.5%。先前亦有研究[19]报道超声能够增强酶的活性，在一定程度上缩短酶解反应所需的时间。

2.1.2 酶解时间的选择

酶解反应能够将血红素与结合的珠蛋白等分离，酶解过程中的水解度和上清液吸光度如图3所示。随着反应的进行，水解度逐渐增加，同时上清液的吸光度也呈现先增加后稳定的趋势。水解度的增加是由于复合蛋白酶对红细胞蛋白的水解作用，将血红蛋白等分解为血红素、血红蛋白肽等，血红素的释放使得上清液的特征吸光度A383 nm增加。结合水解度和特征吸光度A383 nm，考虑到投入的成本和生产效率，在2.5 h时基本达到需要，认定为需要的反应时间。同时，考虑到酶解反应的酶种类的不同和反应处理条件的不同，酶解时间各不相同[9-10，12]。

2.1.3 血红素提取条件的选择

由图4a可知，在固定离心时间15 min条件下，随着离心转速的增加，上清液A383 nm呈现逐渐下降的趋势，在离心转速达到4 000 r/min以后，离心转速的增加对上清液吸光度的大小影响不大，考虑到提取时间和成本消耗，选择对血红素在4 000 r/min下分离；而同样，在离心处理的时间上，如图4b所示，随着离心时间的增加，上清液A383 nm也是呈现下降的趋势，从35 min时开始，随着离心时间的延长，上清液吸光度变化较为缓和，所以，亦选择处理35 min。血红素样品的分离条件选为4 000 r/min、35 min。依照以上方法制备的血红素的纯度为83.2%，提取率为30.2%，较文献方法有所提高[9-10，14]。

2.2 血红素的紫外-可见吸收光谱

2.2.1 碱性条件下血红素紫外-可见吸收光谱

文献报道显示，血红素在383、403、575、640 nm波长附近有特征吸收[3，14，20-21]。由图5可知，所得样品在383、403、640 nm波长处有明显的吸收峰，而575 nm波长处亦处于特征吸收光谱范围内，结果与文献报道一致。

2.2.2 血红素在酸性条件下的紫外-可见吸收光谱

由图6可知，血红素在碱性溶液中，其溶液在383、403、575、640 nm具有明显的特征吸收光谱，但是在酸性条件下，其300～400 nm和640 nm附近的特征光谱吸收发生了明显的下降，说明酸性条件对血红素的结构产生了影响；同时，在400 nm附近的最大吸光度在酸性条件下也产生了明显的降低，说明酸性条件对血红素及其衍生物的溶解性有显著影响，与文献报道结果一致[14，21]。

3 结 论

运用复合蛋白酶进行猪血血红素制备的条件为：3 000 r/min下离心10 min分离血红蛋白，并进行3 次洗涤；血细胞沸水条件下加热10 min使蛋白变性，然后匀浆均质；复合蛋白酶反应条件为40 ℃、pH 6.0，反应2.5 h；4 000 r/min条件下离心35 min，纯水洗涤3 次后收集沉淀，并对样品冷冻干燥；制备的血红素的纯度是83.2%，提取率为30.2%。

血红素在碱性条件下，在383、403、575、640 nm波长处具有明显的特征吸收光谱；血红素在酸性条件下，特征光谱吸收值下降明显，尤其是在300～400 nm和640 nm附近，说明酸性条件对血红素的稳定性有直接影响。

实验通过血红素溶液在不同条件下的特征吸收光谱的变化，对揭示血红素的稳定性有重要意义，为血红素作为色素应用于不同肉制品中提供参考，为血红素的妥善保存、有效利用和消除提供思路。针对血红素在不同条件下的变化机理尚需更进一步研究。

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酶解技术 篇10

芦荟属植物颇受大众喜爱, 主要因其易于栽种, 为花叶兼备的观赏植物。可食用的品种只有六种, 而当中具有药有价值的芦荟品种主要有:洋芦荟 (又名巴巴多斯芦荟或翠叶芦荟Aloe Barbadensis/Aloe Vera) 库拉索芦荟 (分布于非洲北部、西印度群岛) , 好望角芦荟 (分布于非洲南部) , 元江芦荟等。目前芦荟在食品中的应用越来越广泛, 主要用于饮品酒类等产品的添加[4,5,6,7]。

试将芦荟经过榨汁处理, 添加于大麦啤酒中, 生产新型芦荟啤酒, 开发一种新型保健生啤酒。将经发酵制得的啤酒清酒与芦荟酶解液按一定比例勾兑。该文对该生产过程中芦荟酶解工艺进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦荟, 果胶酶, 菲林试剂等。

酒度计、m321106过滤机、LG10-2.4A型高速离心机、北京瑞邦兴业科技有限公司。

1.2 芦荟汁生产工艺流程

芦荟鲜叶→清洗消毒→破碎→酶解→过滤→高温瞬时灭菌→贮存。

1.3 操作要点

1.3.1 芦荟鲜叶分选

选择2~3年以上叶龄、生长良好、整齐的芦荟叶, 在根茎处用刀划一个口, 用手掰下, 取鲜叶, 在4~7℃条件下保存。

1.3.2 清洗消毒

去除叶根、叶尖, 并去除腐烂、变黄部位后, 用清水漂洗干净, 去除泥尘。飘洗用水最好用深层井水或经处理后的酿造用水最好, 不能用含漂白剂的自来水, 漂白剂可导致芦荟变色、变质。用0.2%次氯酸钠水溶液将鲜芦荟叶浸泡2~3min后, 再用无菌水漂洗干净。

1.3.3 破碎

将带有叶外皮的芦荟叶用粉碎机搅碎, 得芦荟浆汁。

1.3.4 酶解榨汁

采用果胶酶, 设置三个因素, 每因素三水平, 对芦荟进行酶解正交试验, 以出汁率为标准, 确定影响因素。因素表见表1。

1.3.5 过滤

对酶解后的芦荟汁进行过滤, 滤汁备用。

1.3.6 杀菌、备用

采用120℃、3~10 s灭菌工艺, 然后立即冷却至0~4℃, 得芦荟提取液备用。

2 芦荟汁酶解结果与分析

由表2可以看出, 各因素对产品综合品质影响程度由强到弱依次为B>C>A, 即酶解温度对产品风味影响最大, 其次是酶解时间和加酶量, 通过分析显示最优水平组合为A2B2C2, 即:加酶量为0.04%, 酶解温度为45℃, 酶解时间为2.0h时, 芦荟啤酒的口感最好。

3 结语

对芦荟汁的酶解条件进行优化, 果胶酶添加量为0.04%, 温度为45℃, 时间为2h, 出汁率最佳。

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