P-21蛋白

P-21蛋白（精选4篇）

P-21蛋白 篇1

摘要：目的:探讨结直肠癌虑者肿瘤组织p21WAF1、p21H-ras表达与中医虚实辨证的相关性。方法:将45例结直肠癌患者按照中医辨证标准分为虚证组,实证组,虚实夹杂证3组,应用免疫组化方法检测结直肠癌组织蛋白p21WAF1、p21H-ras表达、比较组之间的差异。结果:结直肠癌虚证组p21WAF1阳性表达承平显著低于实证及虚实夹杂证组(P=0.025),差别有统计学意义;p21H-ras阳性表达水平在虚证,实证及虚实夹杂证组三组内差异无显著性(P=0.800)。结论:p21WAF1阳性表达与结直肠癌中医病证虚实有关,p21WAF1表达低可能是结直肠癌虚证辨证分型的客观物质基础之一。

关键词：结直肠癌,p21WAF1,p21H-ras,实证,虚证

任何复杂中医证型都是由病位、病性等辨证要素排列组合而成,因此,先从认识、分析复杂证型的各构成因素入手,首先研究基础证的特征并进行规范,然后再对各证间的逻辑组合及病位之间联系进行研究,最终阐明“证”的内涵是可能的。沿着这一思路我们对结直肠癌虚实证型进行考察,并引入现代医学指标,以气血状态论虚实,在气血辨证基础上将结直肠癌患者分为虚证,实证,虚实夹杂证3组,就p21WAF1 (wide-type p53-activated factor1,WAF1)、p21 H-ras (Oncogene protein H-ras)蛋白表达与中医虚实辨证间是否存在联系进行探讨,现报告如下:

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集酒泉市人民医院行外科手术治疗的结直肠癌患者45例,其中男性23例,女性22例,男女比例约为1:1;年龄28～74岁,中位年龄57.0岁。其中腺癌分化程度:高分化5例,中分化19例,低分化21例,当肿瘤组织表现为混合分化时,以较低分化程度统计。按照Dukes分期标准进行划分:Duke's分期A期1例,B期28例,C期15例,D期1例。根据患者术前症状进行辨证,分为实证,虚证,虚实夹杂证3组,其中虚证17例,实证12例,虚实夹杂证16例。大体组织蜡块由病理科保存,均经10%福尔马林固定按常规制作,石蜡切片切片厚度4μm。

1.2 试剂

p21 WAF1为鼠抗人单克隆抗体,即用型,p21H-ras为鼠抗人单克隆抗体,即用型,以及EliVision免疫组化试剂盒,均购自福州迈新生物技术公司。

1.3 实验方法

采用免疫组织化学EliVision二步法,操作步骤严格按照说明书进行,根据抗体说明书p21WAF1采用高温高压组织抗原修复,p21H-ras无需修复。DAB显色,苏木素复染。用已知阳性切片作阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定及辨证方法

p21WAF1以细胞核或胞核伴有少量胞浆出现棕黄色颗粒作为阳性细胞。p21H-ras以细胞胞浆出现棕黄色颗粒作为阳性细胞。先按染色强度打分:0分为无色,1分为浅黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色,染色强度与背景着色相对比;再按阳性细胞所占百分比打分:阳性细胞率≤4%为0分,5%-29%为1分,30%-59%为2分,≥60%为3分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥2分为免疫反应阳性(+)。根据患者术前症状进行分型,参考全国高等中医药院校材料《中医诊断学》虚实辨证标准,将患者分为虚证,实证,虚实夹杂证三组。

1.5 统计学方法

采用χ[2]检验和四格表的精确概率法判断p21WAF1、p21H-ras蛋白表达与虚实证的相互关系,检验水准α=0.05。所有数据均在SPSS 13.0软件上进行统计。

2 结果

2.1 p21WAF1蛋白表达与病证虚实的关系

p21WAF1蛋白表达在虚证组中明显低于实证和虚实夹杂证组,组间差别有显著性(P=0.025,χ[2]=7.385)(见表1)。

2.2 p21 H-ras蛋白表达与病证虚实的关系

p21H-ras蛋白表达在虚证,实证,虚实夹杂组间差别无统计学意义(P=0.800,χ[2]=0.445)(见表1)。

3 讨论

研究普遍认为肿瘤是一种基因病,基因异常是肿瘤发生过程中的主导因素,其中癌基因与抑癌基因功能的协调平衡在维持机体细胞处于正常状态方面发挥重要作用,当癌基因过表达,抑癌基因功能减退或消失,两者间失去协调平衡就会导致肿瘤发生,正如《素问.六微旨大论》所谓:“亢则害,承乃制,制则生化.害则败乱,生化大病。”,这些内容上的趋近,为中西医结合提供了理论支点。随着现代诊疗手段的进步,中医在新的时期有新的内涵,中医虚实辨证与基因相关因素研究日益增多并不断深入。

李晓峰[1]等选择101例恶性肿瘤患者为肿瘤组,按虚实证辨证标准分为偏虚型、偏实型、虚实并重型;另选择同期健康体检排除肿瘤者100例为对照组,发现肿瘤组偏虚型的ApoB100及偏虚型、虚实并重型的ApoA1、CD3、CD4明显低于偏实型,差异有显著性意义(P<0.05);偏实型、虚实并重型的ApoB100高于偏虚型,差异有显著性意义(P<0.05);虚实并重型的NK、A1/B100低于偏虚型、偏实型,差异有显著性(P<0.05),认为血清载脂蛋白A1、B100为恶性肿瘤中医虚实辨证的客观指标。杨建新[2]等将256例腹腹部手术后疲劳综合(postoperation fatigue-k,POF)患者按中医辨证标准分为虚证组、实证组、虚实兼证组,测定血清转铁蛋白(TRf)和血清铁(SI),发现虚证组TRf、SI值较实证组明显减低,差异有显著性(P<0.001),认为POF虚证患者TRf和SI较实证患者明显减低,可作为POF中医临床虚实辨证的客观指标。王融冰[3]等提取血液中白细胞DNA并用PCR方法对其相关片断进行扩增,用HLA基因分型芯片对HLA-DRB1位点进行分型检测,发现慢性乙型肝炎辨证以实证居多,同时虚、实不同证型间HLA-DR基因位点表达可能存在不同。华何与等[4]报道正气亏虚是肿瘤转移的根本原因,血瘀是促进肿瘤转移的条件和基础,气虚血瘀状态下会出现免疫功能低下、血液高凝状态、组织水肿等。贾小强[5]报道大肠癌中医辨证分型与其肿瘤浸润转移之间有着显著相关性,辨证分型在判断大肠癌病理改变程度,分析预后以及指导临床治疗上具有重要意义。

众多学者的有益探索,给我们以启迪。《内经》认为“百病之生,皆有虚实”,虚实普遍存在各疾病之中,是辨邪正盛衰的纲领,虚实病机影响着病情的轻重、病变的发展趋势及转归。一般认为“邪气盛则实,精气夺则虚”是辨别虚实的总纲,统领性强,但所指过于宽泛,而以气血论虚实,跟据气血辩证判定虚实,更具体,可操作性也更强。本研究结合结直肠癌湿热较多见的具体情况,亦将湿热证纳入实证,将结直肠癌辨证归纳为实证、虚证和虚实夹杂证,选择癌基因H-ras,抑癌基因WAF1为研究对象[6,7],考察p21WAF1、p21H-ras表达与虚实证的关系。结果显示,结直肠癌虚证组p21WAF1阳性表达水平显著低于实证及虚实夹杂证组(P=0.025),差别有统计学意义,表明结直肠癌病证虚实与p21WAF1表达减低明显相关,p21WAFI低表达有可能是结直肠癌虚证的特征之一,另有研究显示[8,9],p21WAF1表达在结直肠癌组织中明显减低,其表达多见于分化好、浸润浅、未发生淋巴结转移、临床分期较早的大肠癌组织中,有可能为反映大肠癌恶性生物学行为的指标,结合我们研究结果,提示结直肠癌虚证患者可能有较为不好的预后。p21H-ras阳性表达水平在虚证,实证及虚实夹杂证三组内差异无显著性(P=0.800),结直肠癌患者病证虚实可能与p21H-ras无关。结合研究结果,我们认为抑癌基因P21WAF1表达可以划到中医正气范畴,表达低可以认为是正气虚衰的表现,虚的形成有基因表达改变的背景,但这可能并不由单基因决定,并且“证”的最终形成可能还受到其他因素的影响。而癌基因p21H-ras与病证无关的实验结果,提示在名目众多的基因中可能仅有一部分参与了“证”的形成,而“证”相关基因的进一步筛选,将有助于我们揭示其成因了解其本质。探讨“证”与肿瘤相关基因的关联,可能能够更深刻揭示中医“证”的科学本质,对于中医临床科学辨证,提高辨证论治水平,发挥中医药治疗结直肠癌等疾病的优势有一定意义。

参考文献

[1] 李晓峰,叶德富,陈强.恶性肿瘤患者载脂蛋白代谢及免疫功能与中医虚实辨证关系的临床研究[J].新中医,2005;37(12) :21～23

[2] 杨建新,张茂威,陈志强.转铁蛋白和血清铁作为腹部手术后疲劳综合征虚实辨证指标的研究[J].新中医,2003;35(5) :18～19

[3] 王融冰,周桂琴,江宇泳.慢性乙型肝炎中医证型与HLA-DRB1位点表达探讨[J].中国中西医结合杂志,2007;27(10) :898～900

[4] 华何与,杨运高,张红栓.论气虚血瘀与肿瘤转移[J].中国中医基础医学杂志,2005;11(8) :564～565

[5] 贾小强,邱辉忠,黄乃健,等.大肠癌辨证分型肿瘤浸润转移相关性的前瞻性研究.中华中医药杂.2005;20:344～346

[6] Gartel AL,Radhakrishnan SK. Lost in transcription:p21 repression mechanisms, and consequences[J]. Cancer Bes,2005; 65 (10) : 3980～3955

[7] Kobayashi Y, Kawaoi A, Katon R. Mutation of Ras oncogene indiisopropano-lnitrosamine induced rat thyroid carcinogenesis[J]. Virchows Arch,2002; 441: 289～295

[8] 梁素美,文欣轩,方细堂.结直肠蛋白表癌中survivin、caspase-3、 p21WAF1的达及其意义[J].肿瘤防治研究,2007;34(8) :596～644

[9] 陈进才,雷联会,许延发,等.大肠癌p21(WAF1/CIP1) 和cyclinDI基因的表达及临床意义.医师进修杂志(外科版),2004;27(8) :19

P-21蛋白 篇2

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

1.1.1 细胞株和菌株

(1) GES-1细胞:为猴病毒40 (SV40) 转化的人类胎儿正常胃黏膜上皮细胞系, 由北京肿瘤防治研究所赠送。 (2) H.pylori国际标准菌株NCTC11637:为Cag A+和Vac A+菌株, 由中国疾病控制中心传染病研究所提供。 (3) H.pylori国际标准菌株NCTC11639:为Cag A+和Vac A-菌株, 由中国疾病控制中心传染病研究所提供。

1.1.2 主要试剂

高糖型DMEM购至美国Sigma公司、美国Gibico公司;胎牛血清购自杭州四季清生物工程材料有限公司;布氏肉汤粉、空肠弯曲菌选择性琼脂基础购自上海市疾病预防控制中心;MarkerⅠ、Oligo (d T) 15、RNase inhibitor、PCRmix购自北京d根生化科技有限公司;d NTPs购至美国BMI公司;PCR引物购至上海生工生物技术服务有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 GES-1细胞培养

GES-1细胞培养, 培养条件:37℃、5%CO2。按复苏;传代;冻存步骤依次进行。

1.2.2 H.pylori培养及H.pylori培养上清液的制备

(1) H.pylori培养, 培养条件:37℃, 5%O2, 10%CO2, 85%N2。 (2) H.pylori培养上清液的制备, H.pylori于固体培养基培养3d后, 挑选琼脂平板上的透明针尖样单个菌落, 接种至新的H.pylori固体培养基, 继续培养;2~3d后, 在H.pylori固体培养基上选择典型的H.pylori菌落, 用接种环将H.pylori接种盛有液体培养基的三角烧瓶中, 微需氧环境下, 120rpm震荡培养;2~3d后, 液体培养基混浊, 用紫外分光光度计检测600nm处OD值达0.6~0.7时结束培养;以10000 rpm, 4℃离心20min后小心收集培养上清液, 并过滤分装;采用Brad Ford法测定H.pylori培养滤液中蛋白浓度, 分装于-80℃冻存。

1.3 研究分组

1.3.1 实验组

NCTC11637 H.pylori A组:5.55mg/ml的H.pylori培养上清液作用GES-1细胞;B组:2.775mg/ml的H.pylori培养上清液作用GES-1细胞;C组:1.3875mg/ml的H.pylori培养上清液作用GES-1细胞。NCTC11639 H.pylori A组:7.5mg/ml的H.pylori培养上清液作用GES-1细胞;B组:3.75mg/ml的H.pylori培养上清液作用GES-1细胞;C组:1.875mg/ml的H.pylori培养上清液作用GES-1细胞。

1.3.2 对照组

分别设阴性和空白两个对照组, 以去除H.pylori培养液和DMEM培养液对实验的影响。D组 (阴性对照组) :H.pylori培养液作用GES-1细胞;E组 (空白对照组) :DMEM液作用GES-1细胞。以上不同浓度H.pylori上清液作用GES-1细胞分别取24h、48h、72h不同时点, 以探讨同一浓度不同时间段之间的差异及同一时间段不同浓度之间的差异。

1.4 RT-PCR检测P21WAF1m RNA (1) 聚合酶链式反应 (PCR) (1) 引物序列:

β-actin:上游:5’-AAG GAA GGC TGG AAG AGTGC-3’下游:5’-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GG-3’扩增长度:528bp P21WAF1:上游:5’-TTG ATT AGC AGC GGA A-CA-3’下游:5’-TAC AGT CTA GGT GGA GAA ACG-3'扩增长度:270bp; (2) PCR反应条件:见表1。 (3) PCR扩增产物相对定量琼脂糖凝胶电泳:0.3g琼脂糖加15ml 0.5×TBE, 混匀后微波炉内加热溶解;以水平仪校正电泳槽, 离模边约0.5cm处垂直插入梳子, 当琼脂糖温度降至60℃左右时, 加入1μl核酸染料, 混匀后倒入电泳胶板内, 注意去除梳子周围的气泡, 凝胶冷却后拔出梳子;取5μl扩增产物加样, 以MarkerⅠ为分子量标准;接通电源, 恒压电泳 (120V) 约20min, 待溴酚蓝迁移至凝胶的中部时, 结束电泳。紫外观察照相。结果分析:通过凝胶图像分析软件 (珠海黑马凝胶系统) 读取目的电泳条带的综合光密度扫描值, 以各组β-actin条带的扫描值标化其P21WAF1m RNA表达量。观察细胞染色强度及阳性细胞百分数。结果判定标准根据采用定量积分法[19]:每张切片至少观察5个高倍视野, 每个视野至少计数100个细胞, 并根据每张切片阳性细胞。

1.5 统计学处理

实验数据用SPSS 16.0统计软件进行分析, 计量资料:以±s表示, 各组实验数据进行正态性和方差齐性检验, 多组间比较行单因素方差分析 (one-way ANOVA) , 二组间比较 (用t检验) ;P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.775mg/ml NCTC11637毒力上清和3.75mg/ml NCTC11639毒力上清作用GES-1细胞48h后P21WAF1m RNA显著上调 (P<0.001~0.01) 。见表2, 附图。

3 讨论

P21WAF1蛋白是一种CIP/KIP家族的细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂, 是细胞周期的负性调节因子, 在正常细胞中, 能与Cyclin A/CDK2复合物结合, 并抑制其磷酸化活性, 而且还可以和PCNA结合形成P21WAF1-Cyclin A-CDK2-PCNA四联复合体, 抑制DNA复制而使细胞周期终止。P21WAF1基因上游信号可通过依赖p53和非依赖p53两种方式对其进行转录调控[4,5]。P21WAF1具有高度保守性, 在细胞周期调节、细胞分化和细胞凋亡中发挥重要作用。

本实验不同基因型H.pylori上清液作用细胞GES-148h后P21WAF1的表达均显著上调并高于阴性对照组, 表明H.pylori可以激活P21WAF1表达, 使细胞周期阻滞, 并发挥促凋亡作用。本实验发现不同基因型的H.pylori培养上清液是抑制胃黏膜上皮细胞GES-1的生长, 表明P21WAF1在H.pylori诱导细胞凋亡的进程中发挥作用。而P21WAF1表达的转录调控机制尚不十分清楚, 目前认为有许多细胞核因子参与此过程, 包括P53、SP家族蛋白、AP2、E2Fs、信号转导物与转录激活剂 (STATs) 、Gax、Runx2、Skp2和AML1b等[6]。在H.pylori致病作用中, H.pylori可能直接或间接引起上游调节基因的表达而激活P21WAF1, 而P21WAF1诱导GES-1细胞凋亡的机制有待进一步研究。

参考文献

[1]Ashktorab H, Daremipouran M, Wilson M, et al.Transactivation of the EGFR by AP-1 is induced by Helicobacter pylori in Gastric Cancer.Am J Gastroenterol, 2007, 102 (10) :2135-2146.

[2]Zhan N, Xiong YY, Lan J, et al.Relationship between Helicobacter pylori infection and expression of c-myc, Bcl-2, and Bax protein in different gastric mucosa lesions.Ai Zheng, 2003, 22 (10) :1034-1037.

[3]Liu Y, Cheney MD, Gaudet JJ, et a1.The tetramer structure of the Nervy homology two domain, NHR2, is critical for AMLI/ETO&apos;s activity.Cancer Cell, 2006, 9 (16) :249-260.

[4]Lutterbach B, Westendorf JJ, Linggi B, et a1.A mechanism of repression by acute myeloid leukemia-1, the target of multiple chro mosomal translocations in acute leukemia.J Biol Chem, 2000, 275 (3) :65l-656.

[5]Westendorf JJ, Zaidi SK, Cascino JE, et a1.Runx2 (cb·fal, AML-3) interacts with histone deacetylase 6 and represses the P21 (CIP1/WAF1) promoter[J].Mol Cell Biol, 2002, 22 (22) :7982-7992.

P-21蛋白 篇3

1 材料与方法

1.1 药品和主要试剂

白藜芦醇,甲氮甲唑篮(MTT)购自Sigma公司,RPMI-1640培养基为GIBCO公司产品,优质胎牛血清购自天津灏洋。RNA提取试剂盒、MMLV逆转录试剂盒、PCR试剂盒购自上海生工生物公司。P21小鼠单克隆抗体、SP试剂盒及DAB试剂均购自长沙力康生物有限公司。甲胎蛋白(AFP)放免试剂盒购自中国原子能科学院。

1.2 细胞培养

人肝癌HepG2细胞株由南华大学肿瘤研究所提供,培养基为含10%胎牛血清的RPMI-1640,置37℃、5%二氧化碳的孵箱内培养。48 h传代,取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 细胞的处理

将人肝癌Hep G2细胞株置37℃、5%二氧化碳及饱和湿度条件下,待24h细胞贴壁生长后,吸除培养液,分别加入终浓度为25、50及100μmol/L白藜芦醇的RPMI-1640培养液,对照组(A组)细胞不加药继续培养24 h后去掉培养液,倒置相差显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.4 AFP的检测

将人肝癌HepG2细胞株置37℃、饱和湿度及5%二氧化碳条件下,待24 h细胞贴壁生长后,吸除培养液,分别加入终浓度为25、50及100μmol/L白藜芦醇的RPMI-1640培养液,对照组(A组)细胞不加药,每一实验组培养5瓶细胞,取均数,常规培养24 h,收集一次培养液,透析浓缩,用放射免疫法进行检测,AFP检测操作按放免试剂盒说明进行,结果换算成ng/107细胞。

1.5 MTT比色实验

将Hep G2细胞悬液浓度调整为5×106个/m L,每孔200μL接种于96孔板,分别以终浓度为25、50和100μmol/L白藜芦醇的RPMI-1640培养液100μL作用细胞,对照组加100μL完全培养基,另设空白对照组(只加培养基,无细胞)。每组设6个平行孔,继续培养,分别在48、72 h加入MTT(5mg/m L)20μL,放置孵箱内4 h后弃上清,加入10%的十二烷基磺酸钠200μL过夜,震荡15 min,用酶联免疫检测各孔570 nm处的吸光度值(A值)。取6孔A值的均数按公式:抑制率(%)=(A对照-A实验)/(A对照)×100%

1.6 半定量RT-PCR检测P21WAF1/CIP1 m RNA的表达

采用RNA提取试剂盒提取总RNA,获得的RNA按MMLA第一链c DNA合成试剂盒说明书合成c DNA。P21WAF1/CIP1上游引物5'-CAGGGGACAGC AGAGGAAGA-3',下游引物5'-GGGCGGCCAGGG TATGTAC-3',反应产物大小335 bp,反应条件94℃5 min(94℃1 min、58℃1 min、72℃1 min)30个循环,72℃5 min;内参照β-actin:上游引物5'-GAGA CCTTCAACACCCCAGCCA-3',下游引物5'-GGCG-TACAGGTCTTGCGGATG-3',反应产物大小513 bp,PCR引物由上海博亚生物技术公司合成,扩增产物进行1.7%琼脂糖凝胶电泳,采用凝胶成像系统测定各组P21WAF1/CIP1与β-actin的光密度比值,表示P21WAF1/CIP1m RNA的相对表达,作为半定量指标。

1.7 用免疫细胞化学法检测P21WAF1/CIP1蛋白的表达

将Hep G2细胞株用0.25%胰酶消化后稀释为1×105个/m L,每孔5 m L接种于6孔培养板,每培养孔放置直径18 mm的无菌盖玻片,置37℃饱和湿度及5%二氧化碳条件下,待24 h细胞贴壁生长后,吸除培养液,分别加入终浓度为25、50和100μmol/L白藜芦醇的RPMI-1640培养液,继续培养48h后去掉培养液,按照SP试剂盒说明操作,依次用一抗、二抗孵育,DAB显色。对照:PBS替代一抗作空白对照。免疫细胞化学检测以细胞膜呈棕染或者胞浆有棕色颗粒者视为免疫阳性细胞,其结果判断:以16D目镜测微网在400倍放大下计数网格中的阳性细胞数,每例计数10个网格,计算阳性细胞的百分率,并根据每张盖玻片阳性细胞着色深浅计分,无着色为0分(阴性),浅黄色为1分(弱阳性),棕黄色为2分(阳性),棕褐色为3分(强阳性)。然后,根据两者积分的乘积进行统计分析。

1.8 统计学处理

采用SPSS统计软件进行单因素方差分析,P<0.05为差异有显著性,定量数据以均数±标准差表示。

2 结果

2.1 白藜芦醇对Hep G2细胞形态的影响

Hep G2细胞经白藜芦醇作用后,24 h可见细胞多角形转变为成纤维细胞样,细胞胞质伸出树枝样突起,核浆比例明显降低,叠堆状明显减少,图1。

2.2 AFP分泌的影响

将人肝癌Hep G2细胞株常规培养24 h,用放射免疫法进行AFP检测,AFP分泌在对照组(A组)中最高,为(225±22)ng/m L,加药组随白藜芦醇剂量增加而分泌下降。B、C及D组分别为(202±23)、(168±18)和(158±19)ng/m L,组间差异有显著性(P<0.01),(图2)。

A:对照组;B:25μmol/L白藜芦醇;C:50μmol/L白藜芦醇;D:100μmol/L白藜芦醇

2.3 白藜芦醇对Hep G2细胞株生长的抑制作用

表1表明,不同浓度的白藜芦醇作用于Hep G2细胞48 h、72 h后对细胞AFP分泌的影响。时间组比较之间P<0.05,差异有显著性;各浓度组与对照组比较,P<0.01,差异有显著性。表明白藜芦醇呈时间剂量依赖性抑制Hep G2细胞的增殖。

注:1)与对照组比较,P<0.01;2)50,100μmol/L组与25μmol/L组比较,P<0.01;3)100μmol/L组与50μmol/L组比较,P<0.01;4)72 h处理组与48 h处理组比较,P<0.05

2.4 肝癌Hep G2细胞株P21WAF1/CIP1 m RNA表达

M:标准参照物;1:对照组;2:25μmol/L白藜芦醇;3:50μmol/L白藜芦醇;4:100μmol/L白藜芦醇

结合图4、表2,对照组低水平表达P21WAF1/CIP1m RNA,经25、50及100μmol/L白藜芦醇处理48 h后,25μmol/L药物处理组P21WAF1/CIP1 m RNA的电泳条带比对照组亮(P<0.01),且随着浓度的增加,条带亮度越亮(P<0.01),表明细胞经白藜芦醇处理后,其P21WAF1/CIP1 m RNA表达量随着药物浓度的增加逐步上升。

2.5 Hep G2细胞株P21蛋白的表达

图4免疫组化图片结果显示,对照组Hep G2细胞株经P21抗体染色后,细胞膜和胞浆棕染较浅,其阳性积分为(9.63±2.80);而经25、50及100μmol/L白藜芦醇处理Hep G2细胞株48h后,细胞棕染较深,其阳性积分分别为(15.82±2.63)、(20.64±3.56)及(26.72±9.41)。各组与对照组比较,P<0.01;各组两两比较,P<0.01,表明细胞经白藜芦醇处理后,其P21蛋白表达量随着药物浓度的增加逐步上升。

A:对照组;B:25μmol/L白藜芦醇;C:50μmol/L白藜芦醇;D:100μmol/L白藜芦醇

3 讨论

肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一。大量实验表明,肿瘤起源于一些未分化或微分化的干细胞,是源于组织更新时所产生的分化异常[2]。最近国内外研究表明,不仅是非实体瘤,即使像肝癌这种实体瘤,其癌细胞亦可在分化诱导剂的作用下“改邪归正”,向正常细胞逆转。因此,寻找类似于白藜芦醇这样的高效低毒分化诱导剂,已成为肿瘤基础和临床学者研究的重点之一。

笔者在实验中观察到,白藜芦醇能明显抑制Hep G2细胞的生长,而且抑制率在一定范围内与时间剂量成正相关。

肝癌细胞分化不良在形态学上主要表现为细胞明显增大,染色深,核大、圆呈多型,核、浆比例失常[3]。本文在体外培养的Hep G2细胞中加入白藜芦醇后,发现Hep G2细胞多角形转变为成纤维细胞样,细胞胞质中伸出树枝样突起,核浆比例明显降低,叠堆状明显减少,呈趋向分化的改变。

AFP是一种胚胎性蛋白,主要由胚肝产生,在肝癌中分泌量增高,是肝癌细胞的特异性标志物。AFP与肝癌的恶性程度密切相关,许多诱导分化剂可下调它的表达。因此,AFP是肝癌细胞诱导分化的重要鉴定指标。本实验中,白藜芦醇降低Hep G2细胞恶性程度指标AFP分泌量,且在一定范围内呈显著量效关系,说明白藜芦醇能诱导恶性细胞重新分化,使基因表达的表型向正常方向逆转[4]。

抑癌基因P21WAF1/CIP1为细胞周期负调节因子,其基因启动子区富含胞嘧啶-鸟嘌呤-二磷酸核苷,启动子区的组蛋白去乙酰化可能是其抑癌、促分化的重要调节机制。

本实验通过免疫细胞化学和半定量RT-PCR发现,经白藜芦醇作用后,实验组P21WAF1/CIP1的基因和蛋白水平较对照组明显升高(P<0.01),提示白藜芦醇能激活抑癌基因P21WAF1/CIP的转录,增加P21WAF1/CIP蛋白的表达[5]。

因此,白藜芦醇诱导抑癌基因P21WAF1/CIP的表达,进而引起Hep G2细胞分化,可能是其明显抑制Hep G2细胞生长的原因之一,其机制可能是白藜芦醇有效地动员肿瘤细胞周期从G1~G0期进入S期。因为细胞DNA在S期解旋复制,若大量细胞堆积于S期,使DNA复制、重排和碱基配对发生错误的概率增加,有可能引起基因表型改变,导致整个细胞分化[6],但对其作用及作用机理仍需进行深入研究探讨。

参考文献

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P-21蛋白 篇4

1 材料与方法

1.1 实验材料

p IRES-p21waf1真核表达载体、人胃癌细胞系BGC-823(由青岛大学医学院附属医院中心实验室构建并惠赠),基因转染试剂盒(QIAGEN公司),Trizol试剂、DMEM-高糖培养基(Invitrogen公司),RT-PCR试剂盒(Takara公司),p21waf1及3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物及各自Taqman探针(由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供),鼠抗人p21waf1单克隆抗体(Santa Cruz公司),兔抗鼠二抗、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(QIAGEN公司)。

1.2 细胞培养方法

人胃癌细胞系BGC-823培养条件为含10%胎牛血清的DMEM-高糖完全培养液,37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中孵育。倒置相差显微镜观察细胞形态,取对数生长期细胞进行相关实验。

1.3 基因转染条件和方法

参照QIAGEN转染试剂盒说明书进行。采用24孔板转染细胞,分三个组,分别为p IRES-p21waf1转染组、p IRES-neo空载体组、未转染组。

1.4 p21waf1 m RNA表达的检测

依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,按照Trizol试剂盒说明提取总RNA。p21waf1基因引物设计:上游:5’-GGACAGCAGAGCACC ATGT-3’,引物:5’-GGCGTTTGGAGTGTA GAAATCT-3’,探针5’-AGACTCTCAGGGTCGAAAACGGCGG-3’,扩增片断为156 bp。三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物(内参照)设计:上游:5’-CTTAGCAC CCCTGGCAA G-3’,下游:5’-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3’,探针序列5’-CATGCC ATCACTGCCA CCCAGAAGA-3’,扩增片断为155bp。按照Takara试剂盒说明将提取的RNA进行反转录成c DNA。条件如下:42℃水浴10~15 min,95℃水浴扩增2 min。再以之为模板,以上下游引物、探针为引导,用ABI7500 RT-PCR仪进行扩增,扩增条件如下:95℃10 s,95℃7 s,60℃45 s,扩增40个循环。再采用“比较ct值法”即△△ct法,分析比较扩增后得到数据。

1.5 p21waf1蛋白表达的检测

依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,提取细胞总蛋白,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,进行一抗(鼠抗人p21单克隆抗体)、二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗)孵育和显色,曝光并照相。使用HPIAS-1000型全自动图像分析仪分析蛋白条带灰度值。

1.6 细胞增殖能力的检测

各组均取对数生长期的细胞,采用经典的MTT法检测后,绘制细胞生长曲线,分析各组细胞的增殖能力。

1.7 细胞周期分布的检测

依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞,各约1×106个细胞,加入终浓度70%冷乙醇,4℃固定24 h,PBS洗涤离心三遍,加入Rnase酶(2 mg/ml)于37℃水浴30 min,再加碘化丙啶(25 mg/ml)染色,4℃避光20 min,经尼龙网滤过后,上流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。

1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件包进行处理,计量资料以表示,两组间比较采用t检验,计数资料采用字2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p21waf1基因转染实时荧光定量PCR结果

转染组p21waf1基因表达量较空载体组、未转染组明显增多,转染48 h后p21waf1表达量最多,24 h、12 h时次之,3 d、5 d最低,差异有统计学意义(P<0.01)。而空载体组与未转染组p21waf1基因表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

注:A、B、C、D、E分别代表转染后48 h、24 h、12 h、3 d、5 d;F、G分别代表空载体组、未转染组;H代表内参照GAPDH

2.2 p21waf1蛋白表达Western blot结果

转染组p21蛋白表达量较空载体组、未转染组明显增多,且随转染后时间变化依次增多,差异有统计学意义(P<0.01)。而空载体组与未转染组p21蛋白表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

2.3 p21waf1基因转染对胃癌细胞BGC-823细胞增殖的影响

MTT证明,p21 waf1转染组胃癌细胞系BGC-823的增殖速度明显要低于空载体组、未转染组,p21waf1转染组在生长5 d后出现增殖速度减慢,而空载体组及未转染组则表现出持续增殖的态势,差异有统计学意义(P<0.01)。而空载体组及未转染组两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组p21waf1蛋白表达见图3。

2.4 p21waf1基因转染对胃癌细胞BGC-823细胞周期的影响

未转染组G1/G0期细胞所占百分数为(49.89±1.31)%;空载体组G1/G0期细胞所占百分数为(50.27±1.24)%;p21waf1转染组G1/G0期细胞所占百分数为(76.68±2.56)%。p21waf1转染组G1/G0期细胞明显多于空载体组及未转染组,差异有统计学意义(P<0.01),而空载体组及未转染组两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。S期细胞:空载体组为(39.59±1.19)%,未转染组为(41.56±1.17)%,p21waf1转染组为(12.48±1.08)%;G2M期细胞占细胞百分数:空载体组为(10.14±0.96)%,未转染组为(8.55±0.98)%,p21waf1转染组为(10.84±1.03)%,G2M和S期细胞数p21waf1转染组明显要低于空载体组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.01),而空载体组及未转染组两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

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3 讨论

据众多研究表明,细胞周期失去控制是肿瘤细胞恶性增殖重要原因之一[6]。Cyclin-CDKs-CKI共同构成了细胞增殖的内源性调控系统,其中Cyclin对CDKs有正性调控作用,CKI则起负性调控作用。Cyclins与其相对应CDKs结合成cyclins-CDKs复合物后可以起到激活CDKs作用,对特定底物磷酸化,从而促进细胞周期演变、启动DNA的合成、促进细胞分裂等重要功能[7]。p21waf1作为一种重要的CKI,可与多种cyclins-CDKs复合物结合(如Cyclin E-CDK2、Cyclin A-CDK2、Cyclin D-CDK4等)并抑制CDKs对特定底物的磷酸化作用。另一方面,p21waf1的C端还是DNA复制必需因子-增殖细胞核抗原(PCNA)结合域,其与PCNA结合后,阻碍其与DNA聚合酶结合成全酶复合物,从而在DNA复制过程中,阻止了全酶复合物在DNA单链上的滑动,使DNA得复制不能继续进行[8]。p21通过结合并起到对CDKs和PCNA的双重抑制,最终均导致细胞在增殖过程中,停滞在细胞周期G1/S关键点,并诱导细胞凋亡,进而抑制了细胞的继续无限增殖周期[8]。

本研究将外源性p21waf1基因转染人胃癌细胞系BGC-823中后,p21waf1转染细胞组,p21waf1m RNA和p21waf1蛋白均高表达;p21waf1转染组BGC-823细胞生长速度低于空载体组和未转染组;流式细胞仪观察到p21waf1蛋白高表达使BGC-823细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞数目明显要多于空载体组和未转染组,而S期细胞数则明显要低于空载体组和未转染组,并出现凋亡峰。笔者认为,外源性p21waf1基因转染且稳定表达后,可能通过p21waf1-cyclins-CDKs途径,起到对CDKs和PCNA的活性的双重抑制,进而使癌细胞DNA合成及细胞周期演进受阻,最终导致癌细胞增殖活性明显降低,大量停滞于G1期。根据本文结果,笔者认为,外源性p21waf1基因转染可以抑制人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖和促进细胞凋亡,将来可能为研究胃癌的治疗方法提供一条新的思路。

参考文献

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