RAPD技术

RAPD技术（精选9篇）

RAPD技术 篇1

DNA分子水平多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990年,Williams和Welsh等人运用随机引物扩增寻找的多态性DNA片段用作分子标记,并将此技术命名为RAPD(random amplifid polysnorphic DNA),即随机扩增多态性DNA。尽管RAPD技术诞生的时间不长,但由于其丰富的DNA多态性及快速、简便等特点,使它成为目前植物育种研究工作采用最多的手段。

1 RAPD技术原理

随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA),是以PCR为基础,以随机的短核苷酸序列为引物,以实验材料基因组DNA为模板,进行PCR反应,找出扩增片段的多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列,因此需单独对每一随机引物进行PCR,如果引物结合部位的核苷酸序列发生了变化,或者扩增范围内碱基出现插入或缺失,DNA重排,就会导致原来结合位点的消失或产生新的结合位点,或者使扩增片段的长度发生改变,经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色就检测出基因组所发生的变化。

2 RAPD技术的优缺点

与其他分子标记技术相比,RAPD具有以下优越性:RAPD所用引物为随机引物,一套引物可用于不同植物基因组分析,且不需预先知道待扩增基因的核苷酸顺序,试验费用较低。RAPD技术的多态性位点是无限的,灵敏度高,能够检测出品种间的微小差异。RAPD实验中所需DNA样品量少,纯度要求不高,实验过程中一般不需要进行Southern转移、分子杂交等一系列繁琐的程序,可一次检测大量样品。同时,RAPD不需要使用同位素,减少了对工作人员的危害。RAPD产物,经过克隆和序列分析后,可作为RFLP和原位杂交的探针,在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。

但RAPD分子标记技术也存在着一些缺点,一是标记大多是显性标记,二是实验稳定性一般。但许多研究表明,这些缺点是可以克服的。通过在实验中对RAPD技术体系进行优化,严格控制试验条件,并进行重复试验即可得到理想的结果。

3 RAPD分子标记技术在植物育种中的应用

3.1 种质资源遗传多样性的研究

植物种质资源的研究是植物品种改良、新品种培育及遗传育种工作的物质基础。利用RAPD技术能够检测植物物种的遗传多样性,研究物种间的亲缘关系,为植物种植资源的保存、鉴定提供了有力的工具,同时大大降低了种质资源收集和保存所需费用,可广泛应用于种质资源的研究工作中。李勇等利用该技术分析了24份不同产地的金莲花种质,结果显示,多态性位点为55.67%,金莲花总多样性指数为0.146 0,居群内遗传多样性为0.059 1[1]。依据结果推理,目前我国金莲花种质资源的遗传多样性指数偏低,因此需要采取相应的措施,对不同金莲花种质资源进行合理保护。

3.2 构建遗传图谱

遗传图谱是遗传学研究的一个重要领域,是功能基因克隆及基因组比较研究的技术平台,为植物分子育种提供了有力工具。通过构建遗传图谱,有助于对育种目的基因进行性状定位,有助于育种的早期选择和分子标记辅助选择,使育种进程加快,周期缩短。RAPD标记多态性丰富,结合原有传统标记构建的遗传图谱,能得到高饱和、高密度的遗传连锁图。Toshiharu Hashizume等利用69个RAPD引物研究外果皮颜色性状连锁图,构建了覆盖62个位点,共524 cm的西瓜连锁图谱,分析得出外果皮颜色性状与2个RAPD标记紧相连,间距为5 cm[2]。张鲁刚等利用RAPD连锁标记对白菜紫色性状进行了筛选与染色体定位,通过分析发现,标记S79-934和S123-750与紫色基因间的遗传距离分别为13.73 cm和18.65 cm,并且位于紫色基因的两边,初步推断出控制紫色性状的主基因位于大白菜1号染色体上[3]。

3.3 品种(杂种)纯度鉴定

RAPD技术可以在苗期对植物品种及杂种纯度进行快速、准确的鉴定,从而对推广优良品种、保护育种者和种植者的权益起到重要的作用。陈禅友等运用RAPD方法,分析长豇豆品种,根据RAPD条带反映的多态性对品种做聚类分析,将长豇豆品种分为5个品种[4]。

3.4 突变体的鉴定

突变体的筛选是植物育种工作的一项重要步骤,利用RAPD方法可以有效地对基因组进行差异分析,并快速地对植物突变体进行筛选。刘成明等通过对2个荔枝品种及其焦核突变体进行RAPD多态性分析,得到了焦核突变体上的多态性片段,初步得到了与突变基因有关的特异性片段[5]。沈法富等用RAPD技术对Na N3诱变的棉花早熟突变系进行了分析,检测到了突变系的特异性片段[6]。

RAPD在空间诱变突变体的鉴定分析研究中也有较多应用。中国科学院遗传与发育生物学研究所的研究人员于2003年对俄罗斯和平号空间站搭载6年的番茄种子进行了RAPD研究,所用的40个引物中有9个产生了29条多态性条带,多态性为10.8%。王斌等将获得的长荚形突变系和其原始对照品系进行了RAPD分析,在100个引物当中,有3个引物在突变系和原始品系之间扩增出了稳定的重复性好的多态性产物,而且在这3个引物的RAPD图谱中,突变系之间都是一致的,但它们与原始对照品系之间都有着共同的差异,从分子水平上说明了突变的获得以及突变趋于稳定。龚振平等在对高粱空间诱变进行RAPD研究时使用88对随机引物,有2个引物在选系与对照间扩增出了明显RAPD差异条带,其中D47引物能使3个试材相互区别。

RAPD技术由于其技术要求低,试验费用小,多态性丰富等特点,已经广泛应用于植物育种的各个技术领域。随着分子生物学技术的不断发展,RAPD与其他分子标记相结合,将在植物遗传多态性、品种鉴别、辅助育种、突变体鉴定等发面发挥更广泛的作用。

摘要：阐述了RAPD分子标记技术的原理和优缺点,着重介绍了RAPD分子标记技术在植物育种中的应用。

关键词：RAPD标记,分子标记技术,植物遗传育种,遗传多样性

参考文献

[1]李勇,丁万隆.我国部分金莲花种质资源遗传多样性的RAPD研究[J].植物遗传资源学报,2009,10(4):535-539.

[2]Toshiharu Hashizume,Ikuhiro Shimamoto,Yoshiaki Harushima,et a1.Construction of lanatus map for watermelon(Citrullus Matsum)using random amplified polymorph:cDNA(RAPD)[J].Euphytica,1996,90:265—273.

[3]张鲁刚,巩振辉,惠麦侠,等.白菜紫色性状RAPD连锁标记的筛选与染色体定位研究[J].西北植物学报,2008,28(5):901-906.

[4]陈禅友,潘磊.长豇豆品种资源的RAPD分析[J].汉江大学学报,2008,36(4):77-83.

[5]刘成明,梅曼彤.利用RAPD分析鉴别荔枝的焦核突变体[J].园艺学报,2002(1):57-59.

[6]沈法富,于元杰,尹承悄.棉花和子期化学诱变获得的早熟品系及其RAPD分析[J].遗传学报,1999,269(2):174-178.

RAPD技术 篇2

樟树RAPD反应体系的优化

以樟树叶片提取的基因组DNA为材料,对影响其RAPD-PCR各种反应条件的.因子进行研究.结果表明:PCR反应时,总反应液20μL中基因组DNA浓度为8 ng/μL,镁离子浓度为2.0 mmol/L,dNTP浓度为0.2 mmol/L,引物浓度为0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/(20μL)时,出现可辨认的鲜明谱带,为RAPD分析应用于樟树遗传多样性研究和良种选择打下良好的基础.

作 者：张国防 陈存及 邢建宏 ZHANG Guo-fang CHEN Cun-ji XING Jian-hong 作者单位：福建农林大学,林学院,福建,福州,350002刊 名：江西农业大学学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRICULTURAE UNIVERSITATIS JIANGXIENSIS年，卷(期)：28(3)分类号：Q813.4 S792.23关键词：樟树 RAPD反应 体系优化

RAPD技术 篇3

1 RAPD技术及其特点

随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, 简称RAPD) 是1990年美国杜邦公司科学家Willans[3]和加里福尼亚研究所Welsh[4]为首的两个研究小组几乎同时建立的检测随机扩增DNA的分子技术。它是建立在PCR技术基础上的一种遗传标记技术, 以所研究的总基因组DNA为模板, 用人工合成的随机的短脱氧核苷酸片段 (一般9-10bp) 作为引物进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳和染色来确定DNA中的核苷酸顺序, 检测DNA序列的多态性[5]。该技术具有快速、简便, 多态性检出率高、可自动分析的特点, 可用于所有生物体, 不需要探针和测序就能直接对基因组进行检测, 但不能提供完整的遗传信息, 而且其扩增产物的稳定性差, 不需用同位素跟踪, 操作安全, 简单易行, 对实验设备的要求低且周期短, 一般对人不构成危害。所需DNA样品少, 但对纯度要求很高。

2 RAPD技术在家蚕遗传育种中的应用

2.1 家蚕DNA指纹分析及品种鉴别

保持家蚕品种的真实性对家蚕品种的选育尤为重要, 进行纯度鉴定可以发挥家蚕品种优良的遗传特性, 确保蚕茧生产稳产、高产, 也是蚕种质量检验检疫的重要项目。

童晓玲[6]等利用RAPD技术对进展中的已经连续10代全同胞兄妹交配的代表品系IS-c108A个体基因组DNA进行扩增, 分析其遗传纯度, 结果表明家蚕近交系IS-c108A10同蛾区不同个体之间拥有相同条带的比率较高, 多态性带频率低, 平均为1.830%, 明显低于亲本c108个体间的多态性带频率 (7.207%) , 同时也低于实用品种871的多态性带频率 (7.08%) 。唐斌等[7]利用筛选出的RAPD随机引物S77稳定扩增出苏菊、明虎的DNA特异性片段RS和RM, 克隆和测序后大小分别为1 694 bp和1 303 bp, 能够准确, 快速地鉴别所标记的苏菊、明虎及其Fl蚕品种。唐斌等[8]利用筛选出的RAPD随机引物S42, 稳定扩增出家蚕品种苏5、苏6亲本品种的DNA特异性片段R5和R6, 克隆和测序确认其大小分别为255 bp和343 bp, 将2个亲本的RAPD标记转换成SCAR标记, 能够准确、快速地鉴别所标记的苏5、苏6及其F1蚕品种。徐世清等[9]利用筛选出的RAPD随机引物S60稳定扩增出黄海、苏春的DNA特异性片段RH-I440和Rs-Ⅱ1000, 克隆和测序后发现分别为463 bp和约938 bp。序列分析后发现RH-I440的nt2-462与一个家蚕whole genome shotgunsequence (WGS) (No:BAABO1096026.1) 的nt1644-2104有96%的一致性, 其中存在2个Caps。Rs-Ⅱ1000的nt3-935与另一个家蚕WGS (No:BAABO1031489.1) 的nt1046-1989有97%的一致性, 其中存在13个Gaps。RH-I440和Rs-Ⅱ1000可以作为两个品种RAPD特征DNA片段进行品种和纯度的鉴定。

2.2 家蚕不同地理品种间的亲缘关系研究

姜振等[10]采用RAPD和SSR 2种分子标记, 对12个实用家蚕品种的遗传多态性及其亲缘关系进行分析, 将供试的l2个实用家蚕品种聚为2大类, 与传统上的分类相符, 但又存在差异。利用RAPD标记分析的结果是芙蓉和871之间的遗传距离最小 (0.157 c M) , 利用SSR标记分析的结果是54 A和872之间的遗传距离最小 (0.214 c M) , 结合RAPD标记和SSR标记的12个品种间的遗传距离与聚类结果, 更能准确地从分子水平上反映品种间的亲缘关系及其来源, 是家蚕杂交育种亲本选择的依据。鲁成等[11]用RAPD分子标记技术研究了11个地区的野桑蚕和25个代表性家蚕品种的DNA多态性, 进一步证实了家蚕起源于中国野桑蚕。聂磊[12]采用RAPD标记技术分析山东省区保存的58个家蚕品种资源的DNA多态性。RAPD标记在家蚕品种间表现出丰富的多态性, 并根据58个家蚕品种的指纹图谱, 构建了供试家蚕品种资源的分子系统发育树, 为家蚕新品种选育提供基础信息。

2.3 基因定位

随着分子生物学的快速发展, 使家蚕基因组学的研究不断深入、遗传图谱的不断构建和完善, 为一些控制家蚕重要性状基因定位的研究提供了便利。

汪琳等[13]以家蚕龙角 (K) 近等基因系第11代龙角个体 (K/+) 和同蛾区正常个体 (+k/+K) 为材料, 用177个随机引物进行RAPD扩增, 筛选出长度为700bp的与龙角基因有关的特异性片段 (OPV-10700) 。陈克平等[14]在含有耐氟主效基因的家蚕品种T6和高敏感品种733新及其近等基因系NF733新中, 采用200个RAPD随机引物进行扩增, 获得了与家蚕耐氟性有关的两个分子标记OPB-08850和OPB-10900。林健荣等[15]用家蚕华l、S伴品种及其杂交后代F2分离群体为材料进行胚胎温敏性基目的RAPD分子标记筛选, 经287个随机引物的PCR扩增产物电泳分析, 筛选到2个特异性DNA多态片段。一个只出现在温敏性赤蚁蚕品种中。另一个出现在非温敏黑蚁蚕品种中。颜虹等[16]用家蚕显性赤蚁Ia品种 (09-041) 与非显性赤蚁品种 (08-101) 杂交, 经F1自交, 取F2代的显性赤蚁与非赤蚁个体为材料, 采取混合样品分析法进行RAPD多态性分析, 通过250个RAPD随机引物, 分别在显性赤蚁与非显性赤蚁中获得扩增带1 089条和1 083条, 共有220个引物在2个材料中有扩增片段, 其中有8个引物在显性赤蚁中扩增出多态性特异带, 有2个引物在非显性赤蚁中扩增出多态性特异带, 有30个引物在2个材料中无扩增产物。

2.4 家蚕分子连锁图谱的构建

分子连锁图谱是当今遗传学研究的热点之一。家蚕育种工作者可以借助分子连锁图谱提供的指导, 可以快速制定出富有成效的育种计划, 同时可进行目的基因的分析、定位, 进行基因克隆和外源基因导入等方面的研究。

何宁佳等[17]用40个选择性扩增多态性引物和137个RAPD引物对家蚕Bombox nwrt F2群体进行分子标记的筛选, 获得544个符合遗传分离比的多态性位点, 并用Mapmaker软件进行连锁分析。在最小LOD值为4, 最大重组值为0.2条件下拆分连锁群, 并对处于同一连锁群的位点进行合理排序, 计算出位点间的重组值后转换为图谱距离, 构建了一个家蚕的分子连锁图。

3 RAPD技术在家蚕遗传育种上的前景

分子标记技术在种质资源鉴定、遗传多样性分析, 目标性状基因的定位等方面, 已取得了突破性的发展, 利用分子标记辅助选择的方法可筛选有用基因, 进行杂交育种, 加快育种进程。目前RAPD技术在家蚕的遗传多样性、分子标记连锁图谱的构建、特定基因分子标记、系统学分析等方面有诸多应用。但是要成为家蚕遗传育种中普遍采用的技术, 仍有一些问题需要解决, 如试验结果的可靠性问题和不便于实验室间的互相交流等。但是随着生物技术的不断发展、研究的不断深入和技术的日益完善, RAPD技术在构建家蚕高密度的分子标记连锁图谱, 寻找和定位有重要经济价值的目的基因资源等研究中必将发挥重要作用。

摘要：介绍了RAPD技术, 概括了RAPD技术在家蚕遗传育种中的应用情况, 分析了RAPD技术在家蚕遗传育种上的应用前景。

RAPD技术 篇4

朱砂根群体遗传多样性RAPD分析

在对朱砂根形态变异系统观测的基础上,进一步采用RAPD标记技术在DNA水平上对其种内遗传多态性进行检测.结果表明,朱砂根5个群体平均等位基因数A为1.8052,有效等位基因数Ne为1.4600,Nei氏基因多样度H为0.2699,Shannon多样性指数I为0.4067.总的群体基因多样性达0.2706,其中群体间的基因多样性Dst为0.0894,群体内的基因多样性Hs达0.1812,群体内的.基因多样性高于群体间的基因多样性.说明朱砂根群体间和群体内均存在着丰富的遗传变异,并以后者为主要变异来源.检测结果还表明,15个样本并不足以代表一个群体的遗传多样性,30个样本所代表的群体,其遗传多样性参数则相对一致和稳定.

作 者：江香梅 温强 叶金山 江梅 JIANG Xiang-mei WEN Qiang YE Jin-shan JIANG Mei  作者单位：江香梅,JIANG Xiang-mei(江西省林业科学院,省植物生物技术重点实验室,江西,南昌,330032;宁波江南现代农业高新技术研究院,浙江,宁波,315806)

温强,叶金山,江梅,WEN Qiang,YE Jin-shan,JIANG Mei(江西省林业科学院,省植物生物技术重点实验室,江西,南昌,330032)

刊 名：江西农业大学学报  ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRICULTURAE UNIVERSITATIS JIANGXIENSIS 年，卷(期)：2006 28(5) 分类号：Q94 关键词：朱砂根   遗传多样性   RAPD分析  

RAPD技术 篇5

关键词：罗布麻,RAPD分析,DNA

罗布麻因罗布泊而得名, 是一类抗逆性 很强的多年生 宿根草本植 物 , 也是生长在我国北方盐碱、 沙荒地和河滩地的最具特色的一种纤维植物资源。 在我国淮河、秦岭、昆仑山以北各省( 自治区) 都有罗布麻 分布 ,但分布最多、最集中的地方是新疆。 罗布麻叶含有大量 黄酮 、三萜 、有机酸 、氨基酸等化学成 分 ,具有降血压 、降血脂 、增加冠状动脉流量等药理作用; 其茎皮是一种 比较理想 的新的天 然纺织原 料,故被誉为“ 野生纤维之王”; 此外, 罗布麻还具有耐贫瘠、 耐盐碱、 耐干旱、抗风蚀、抗寒冷、抗酷暑等特点,适应性强; 同时, 罗布麻还具有防风固沙、保持水土的 作用,被人们称为“ 绿洲前沿卫士”。 但近年来由于经济利益的驱动, 人们对野生罗布麻进行掠夺式采挖, 导致了罗布麻资源的大量流失以及整个生态环境日趋恶化, 对罗布麻植株生长产生了重大影响。 20世纪50年代 , 新疆野生 罗布麻面 积达53.3万hm2,目前仅剩约1 8万hm2。

有关罗布麻的地理分布、 生态学和形态学特性、生理抗性、种质保存等方面的研究报道较多[1,2,3],但在DNA分子方面的研究甚少[4,5]。 笔者以伊犁地区硅胶干燥的罗布麻幼嫩叶片为研究对象,使用Tiangen基因组提取试剂盒提取罗布麻基因组DNA,并以此为基础建立罗 布麻RAPD反应体系 , 为采用RAPD技术分析罗布麻不同居群遗传多样性差异研究提供技术保障。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1罗布麻居 群及供试 材料采集供试材料于2012年7—8月采自新疆精河 县艾比湖湿 地自然保 护区巩留县内、新源县高潮牧场、尉犁东河滩乡、阿勒泰市阿苇滩镇、阿勒泰市阿拉哈克乡6个居群。 其中艾比湖湿地自然保护 区内主要植 物有盐穗 木 、胡杨 、芦苇 、骆驼刺和沙拐 枣等 ;巩留县罗布麻居群多生长在农田附近, 主要植被有灰绿藜、芦苇、香蒲、甘草等;新源县罗布麻居群分布于高潮牧场的山脉中,主要植物有灰绿藜、芦苇、大蓟蒲公英等; 尉犁县罗布麻居群分布于东河滩乡民房,其主要植被有白麻、芦苇; 阿勒泰罗布麻居群分布在阿苇滩镇和阿拉哈克乡两地, 阿苇滩罗布麻居群位于撂荒地内, 附近主要植物有灰绿藜 、蓖麻 、芦苇等,阿拉哈克 乡罗布麻居群位于戈壁滩内, 罗布麻为该地区的主要植被。

由于罗布麻在自然条件下主要进行无性繁殖, 为避免对同一植株遗传组成完 全相同的 不同基株 的重复采 集,不同样本间的距离至少在1 km以上。 取罗布麻幼嫩叶片,叶片用硅胶干燥密封保存。

1.1.2试剂Taq DNA聚合酶 、d NTP、 Mg SO4、琼脂糖 、DNA Mar ker药品为大连宝生物工程有限公司产品, 引物为上海生工生物工程有限公司产品,DNA提取试剂盒为Tiangen植物组基因提取 试剂盒。

1.1.3仪器离心机: 上海安亭科学仪器厂生产的TGL-1 6GR型;紫外分光光度计:Biospec-mini型; PCR:Biomet r型 ; 电泳仪 :BAYGENE型 ; 水浴锅 : BLUEPARD生产的CU420型 ; 制冰机 : SANYO公司生产的SIM-F1 40AY65型 。

1.2方法

1.2.1罗布麻基因组DNA提取采用Tiangen植物组基因提取试剂盒,按说明书上方法进行。

1.2.2基因组DNA质量检测提取的DNA样品用Gene Quant TM pro D NA/RNA紫外分光光 度计测定波 长26和280 nm的光吸收值, 以A260值估算样品得 率 ,A260/A280值判断样 品的大致 纯度。

1.2.3电泳检测提取的DNA样品上样于0.8%琼脂糖凝 胶进行电 泳检测 , 染色,检测所得DNA大致分子量。

1.2.4 RAPD扩增检测将扩增产物在浓度为0.8%琼脂糖胶上进行电泳检测 , 于1 ×TAE缓冲液中 , 以DL2000 DNA l adder为分子量标准 ,1 00 V恒压电泳后,溴化乙锭染色,在凝胶成像仪上照相。

1.2.5数据分析方法用Popgene软件分析电泳结果, 得出罗布麻遗传多样性的各项指标。 RAPD随机引物扩增所得条带按琼脂糖凝胶电泳图谱同一位置上DNA条带的有无, 将电泳结果转化为二元数据矩阵,有带的( 包括弱带) 赋值为1 ,无带的赋值为0,计算出其遗传多样性。

2结果与分析

27个随机引物对6个罗布麻居群共90个个体的DNA样品进行 了PCR扩增。 每个引物检测到的位点在1 ~ 8之间,90个个体共检测到1 00个位点。 居群上的多态位点比率为1 00%。 阿勒泰市阿 苇滩镇( AWT) 、巩留县( GL) 、阿勒泰市阿拉哈克乡( HNH) 、艾比湖湿地自然保护区( TT) 、尉犁东河滩乡( YL) 和新源县高潮牧场( XY) 罗布麻居群分别共扩增出43、90、51 、80、77和70个多态性位 点 , 多态位点 百分率分 别为43%、90%、51 %、80%、77%、70%,GL居群>TT居群 >YL居群 >XY居群 >HNH居群 >AWT居群 。

3结论与讨论

三种蠕形螨RAPD研究 篇6

1990年, Willians J G等[2]和 Welsh J等[3]几乎同时创立随机扩增多态性DNA (RAPD) 技术, 利用一系列随机引物进行RAPD分析, 其结果可较全面地反映被测生物的DNA多态性, 可与形态学研究互相补充印证。笔者应用RAPD技术对毛囊蠕形螨、皮脂蠕形螨和山羊蠕形螨进行了方法学探讨, 现报道如下。

1 材料

1.1 样品的收集

1.1.1 毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨的收集

用刮片式取螨器刮取成年人的额部螨, 用镊式取螨器镊取成年人的鼻部螨[4]。供螨者为成年教师、学生, 男女比例为3∶1。

1.1.2 山羊蠕形螨的收集

取自山东省济南市桑梓镇老寨子村新屠宰的山羊, 将山羊剥皮后, 触摸羊皮找到皮下结节, 用手术刀片划破结节, 挤出结节中的淡黄色干酪样内容物, 置于显微镜下观察, 发现内含大量虫卵、各期虫体及其分泌物的样品取回, 于-80 ℃保存。

1.2 主要仪器和试剂

微型挑螨器, 自制;PCR扩增仪 (型号为2400) , 美国PE公司生产; 三羟甲基氨基甲烷 (Tris) , BBI公司生产;乙二胺四乙酸 (EDTA) 、Taq DNA聚合酶、脱氧核苷酸 (dNTPs) , 上海生工生物工程技术服务有限公司生产;十二烷基硫酸钠 (SDS) , 购自Sigma公司;Tris饱和酚, 购自北京鼎国生物技术发展中心;无水乙醇, 购自天津市北方化玻采购销售中心;琼脂糖, Oxoid公司生产;醋酸钠 (NaAc) , 上海化学试剂有限公司生产;RAPD随机引物, 北京赛百盛公司合成;6×PCR上样缓冲液, TaKaRa公司生产。

2 方法

2.1 基因组的提取

1) 取3种蠕形螨各1 000余条, 经餐洗净清洗后, 置于冰预冷的经高压灭菌的自制微型研钵中研磨约10 min, 待螨体完全破碎后, 收集研磨液至1.5 mL Eppendorf管中;2) 65 ℃水浴45 min (期间摇动2次) ;3) 加入3 mmol/L醋酸钠100 μL, 冰上放置1 h;4) 12 000 r/min 离心10 min, 小心吸取上清液, 转移至一新EP管;5) 加入等体积的Tris饱和酚, 轻轻混匀, 12 000 r/min离心10 min;6) 吸取下层有机相, 12 000 r/min离心10 min, 将上清液移至一新EP管;7) 加入2倍体积冰无水乙醇, -20 ℃沉淀2 h以上;8) 12 000 r/min离心15 min, 弃上清液;9) 沉淀加冰冷70%乙醇400 μL;10) 12 000 r/min离心15 min, 弃上清液, 再重复1次;11) 室温晾干约15 min;12) 加入TE缓冲液30 μL溶解, -80 ℃冻存, 备用。

2.2 PCR 扩增反应

2.2.1 引物的筛选

从上海生工生物工程技术服务有限公司设计的随机引物中挑选出8条引物, 根据GenBank上已发表的犬脂螨的一段序列, 自行设计4条随机引物。用12条引物对提取的DNA 模板液进行反复多次PCR 扩增, 根据多次PCR得到的条带的多少、稳定性、可重复性来选择最佳引物, 具体序列见表1。

2.2.2 RAPD反应体系

在0.5 mL Eppendorf管中建立25 μL RAPD反应体系:灭菌ddH2O 16.1 μL, 模板DNA 1.0 μL, 10×Buffer 2.5 μL, 10 mmol/L dNTPs1.0 μL, 25 mmol/L MgCl2 2.0 μL, 10 mmol/L 随机引物 2.0 μL, 5 U/μL Taq DNA聚合酶 0.4 μL。

2.2.3 RAPD反应程序

反应体系经瞬时离心后置PCR仪, 反应程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min, 36 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 共40个循环;72 ℃ 10 min。

2.2.4 电泳检测

取5 μL DNA样品加1 μL上样缓冲液, 于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳, 经 0.5 μg/mL EB染色, 用紫外透射仪观察结果并拍照。

2.3 数据处理

按照公式相似系数S=2Nxy/ (Nx+Ny) 获得各样品间的遗传相似度, 其中S为片段共享度, Nxy为 X 和 Y 2个个体共享的片段数, Nx和Ny为X与Y个体分别拥有的RAPD标记数, 再由D=1-S获得相应的遗传距离。

3 结果

3.1 引物筛选结果

以各样品的DNA为模板, 对12个引物进行筛选, 其中有5条引物在3种蠕形螨基因组中均扩增4条以上的电泳条带, 且其主带、次带、弱带的数目不尽相同, 提示用此随机引物对蠕形螨进行RAPD-PCR分析时可提供更多信息, 以供蠕形螨的分类和鉴别。用第10条引物对样品重复做3次, 均能得到相同的结果, 且扩增带清晰可辨, 扩增产物具有多态性, 片段为250～2 500 bp。

3.2 PCR条带分析

5条RAPD 引物对3种蠕形螨的扩增条带数见表2。

条

由于第1, 2引物条带不清, 无法两两做比较, 因此仅对第3条计数, 其中山羊蠕形螨与毛囊蠕形螨各有2条条带, 无共享条带 (见图1) 。

M.DL-2 000 Marker;1～3.第1条引物;4～6.第2条引物;7～9.第3条引物;1, 4, 7.毛囊蠕形螨;2, 5, 8.皮脂蠕形螨;3, 6, 9.山羊蠕形螨。

第10条引物在3种蠕形螨中均能扩增出条带, 其中山羊蠕形螨有7条带, 皮脂蠕形螨有5条带, 毛囊蠕形螨有9条带。山羊蠕形螨与皮脂蠕形螨共享2条带, 山羊蠕形螨与毛囊蠕形螨共享2条带, 皮脂蠕形螨与毛囊蠕形螨共享1条带 (见图2) 。

M.DL-2 000 Marker;1～3.山羊蠕形螨;4～6.皮脂蠕形螨;7～9.毛囊蠕形螨。

第9条引物扩增山羊蠕形螨、皮脂蠕形螨DNA各有4条带, 其中有2条共享条带;在毛囊蠕形螨中未扩增出条带。第11条引物扩增山羊蠕形螨有2条明显带, 有部分重叠带;扩增毛囊蠕形螨则有4条带, 并与山羊蠕形螨有1条共享条带;在皮脂蠕形螨中未扩增出条带。第12条引物能在山羊蠕形螨中扩增出较明显的2条带;在毛囊蠕形螨中仅有1条弱带;在皮脂蠕形螨中未扩增出条带 (见图3) 。

M.DL-2 000 Marker;1～3.第9条引物;4～6.第11条引物;7～9.第12条引物;1, 4, 7.山羊蠕形螨;2, 5, 8.毛囊蠕形螨;3, 6, 9.皮脂蠕形螨。

3.3 各样品间的遗传距离

以上述确定的引物对3个样品的模板DNA 进行深入的RAPD分析。按2.3数据处理中所述的方法得到各样品间遗传距离, 毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨两个种群间的平均遗传距离为0.937 5, 毛囊蠕形螨和山羊蠕形螨之间的平均遗传距离为0.850 0 , 皮脂蠕形螨和山羊蠕形螨之间的平均遗传距离为0.692 3 (见表3) 。

注:右上3个数据为3种蠕形螨的相似系数, 左下3个数据为遗传距离。

4 讨论

RAPD图谱上的每条带代表随机引物在基因组DNA上的一个结合位点, 由于物种的不同, 条带数目和片段的迁移率就会产生差异, 亲缘关系越近, 扩增的条带数目和片段的迁移率就会越相似。遗传距离可估测品种间遗传结构和分化关系, 遗传距离的信息可作为品种分化最基本的指标, 因为在群体的进化研究中, 可近似地认为标准遗传距离与分化时间成正比。Crawford A M等[5]也指出若要保存尽量多的遗传变异, 必须有可靠的方法对品种间的遗传分化进行测定, 遗传距离能很好地反映分化时间的长短, 能客观地反映群体间的遗传变异和分化。一般认为群体分化时间越短, 遗传距离越小, 当2个群体间的遗传距离小于0.05时则认为这两个群体没有产生分化, 或可以进行群体间的合并[6]。在本研究中, 3种蠕形螨两两间的遗传距离都比较远, 说明其分化时间较长。

参考文献

[1]孟阳春, 李朝品, 梁国光.蜱螨与人类疾病[M].合肥:中国科学技术大学出版社, 1995:261-280.

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[3]WELSH J, McCLELLAND M.Fingerprinting genomes using PCR wi-th arbitrary primers[J].Nucleic Acid Res, 1990, 18 (24) :7213-7218.

[4]袁方曙, 郭淑玲.人体蠕形螨取螨器检查方法介绍[J].中华皮肤科杂志, 2001, 34 (2) :144-145.

[5]CRAWFORD A M, LITTLEPOHN R P.The use of DNA marker indeciding conservation priorities in sheep and other livestock[J].Animal Genetic Resources Information, 1998, 23 (8) :21-26.

柳叶蜡梅RAPD反应体系的研究 篇7

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验材料取自浙江省林业科学研究院苗圃。随机采集柳叶蜡梅枝条上的幼嫩叶片,用塑料袋封装,用冰袋保鲜,带回实验室后保存于4℃冰箱中备用。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要仪器设备。

PCR扩增仪(Tpersonal Thermocycler,Biometra);全自动凝胶成像分析系统(上海培清科技);DYY-8C型双稳电泳仪;

1.2.2 主要试剂。

琼脂糖(Spain);引物((Sangon公司);Taq DNA聚合酶和Buffer(BIOER公司);dNTPs(BIOER公司);

1.3 基因组DNA提取方法

1.3.1 SDS-CTAB法,参考文献[3]。

1.3.2 CTAB提取法,参考文献[4]。

1.4 PCR扩增条件的初步优化

PCR扩增采用20μl体系:10×buffer(w/Mg)2.0μl,2.5mmol/L dNTPs,0.2μmol/L引物,1U TaqDNA聚合酶,20 ng左右的模板DNA。基本程序如下:94℃预变性2min;再32个循环:94℃变性1 min,36℃退火30S,72℃延伸2 min;最后72℃延伸10 min。取加入溴酚蓝的扩增产物13μl,用含有溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳分离检测,电泳结果通过凝胶成像分析系统打印和存盘保存。

因RAPD扩增容易受到诸多因素的影响,如DNA模板的浓度和纯度、引物与dNTPs的用量、Taq DNA聚合酶的浓度、扩增程序与循环周期等都会影响扩增式样,因此,需要优化固定RAPD-PCR反应的各种条件,以期实验得到很好的重复。筛选出多态性强,重复性好的引物是整个实验成功的关键。实验过程中使用的引物见表1。

1.5 dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和Mg2+的用量

采用L9(34)的正交表(见表2),寻找最佳组合。

1.6 扩增程序的优化

以36℃、39℃、42℃、45℃4种温度作为退火温度,比较确定最佳的温度。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取

对比两种方法提取柳叶蜡梅DNA的效果。从试验结果可以看出(见图1),两种方法均可以提取出柳叶蜡梅的基因组DNA,但SDS-CTAB法能有效地去除酚类化合物、多糖和蛋白质,使提取的DNA浓度更高,电泳前沿杂质少。因此,SDS-CTAB法提取的柳叶蜡梅基因组DNA能满足PCR扩增所需,可以作为优先选用的方法。

2.2 RAPD扩增反应的初步优化

2.2.1 dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和Mg2+的用量对RAPD分析的影响

反应体系中各成分的用量对反应结果的影响很大,从dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+和引物用量的组合实验中可以看到(见图2),第1和8的反应体系结果较好,第5和7的反应体系扩增条带不是很清晰,第2、3、4、6、9的反应体系完全没有扩增结果。考虑到节省引物用量,最后选定第8种反应体系。

2.2.2 退火温度对RAPD分析的影响。

初次筛选出的引物还存在着弱带,弥散背景较为严重的问题。这种现象可能是由于退火温度造成的。通过对RAPD反应的退火温度的调节,发现柳叶蜡梅的RAPD反应在36℃最好(见图3),最终使用温度为36℃。

3 讨论

DNA的质量是决定分子生物学实验成就的主要因素之一。自从Marmur[5]在1961年建立用SDS和氯仿从细胞中分离提取DNA样品的经典方法以来,研究者一直在探索能制备高纯度和高完整性DNA制品的最佳方案。Rogers和Bendich[6]用CTAB法从植物材料中提取DNA,但是产量较低。Collins和Symons[7]在1992年从新鲜的叶片中成功提取出核DNA,但步骤比较繁琐,产量也不高。目前,植物组织DNA的提取方法主要有SDS法[8]、高盐低pH法[9,10]、CTAB法[11,12]等。虽然植物DNA提取方法因材料不同而各异,但在材料的选择上,总的一个原则是尽量使用植物的幼嫩部位。由于不同植物及同一植物不同组织的结构及生化成分并不相同,对DNA的不同提取方法会造成不同程度的影响。SDS是一种离子型表面活性剂,溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而破坏细胞膜。CTAB作为一种去污剂,能裂解细胞,破坏细胞膜系统,使蛋白质变性,它能有效地防止组织破碎和沉淀大量材料时的电离化作用及酚类化合物的进一步氧化。本实验说明SDS-CTAB法对柳叶蜡梅的DNA提取是比较适用的。

一般RAPD-PCR的退火温度都在35℃～40℃[10,13]之间,高于40℃时会抑制PCR反应,本实验最终退火温度为36℃,符合一般RAPD-PCR的退火温度。通过实验获得优化的20μL反应体系和扩增程序能有效的进行柳叶蜡梅RAPD的扩增,为柳叶蜡梅的相关分子研究提供有益的参考。

摘要：以柳叶蜡梅(Chimonanthus Salicfiolius Hu)为材料,对其DNA提取方法和PCR扩增反应体系的建立和优化进行探讨。最适宜的PCR反应条件为:20μL PCR反应体积中含有1×缓冲液,20 ng模板DNA,2.75 mmol/LMgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,2.0 U Taq DNA聚合酶,0.4μmol/L引物。扩增程序为:94℃预变性2 min;再32个循环:94℃60 s,36℃30 s和72℃120 s;最后72℃延伸10 min。

RAPD技术 篇8

遗传丰富的种质资源是实现培育亚麻新品种育种目标的前提和基础。我国现已收集保存国内外亚麻资源4 000多份, 通过本实验筛选出的引物并利用本研究优化的适宜亚麻RAPD的PCR条件, 能快速准确地鉴定这些资源的亲缘关系, 可以为建立亚麻核心种质库提供准确的分子依据, 还可以为我们从国外引进亚麻种质资源的入库和分类提供技术平台。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

Diane (法国) 、FANY (荷兰) 、黑亚12 (中国) 均由黑龙江省农业科学院经济作物所提供。

1.1.2 酶与试剂

rTaq DNA聚合酶、dNTP、100 bp ladder、琼脂糖等购于天根生化科技 (北京) 有限公司;DL2000购于宝生物工程 (大连) 有限公司;常规试剂均购于天根生化科技 (北京) 有限公司。

1.1.3 PCR引物

70条RAPD引物购于上海生工。引物标号分别为:S1～S50, S61～S64, A1～A16, S字母开头的网上可以查到序列, A1～A16的序列见表1。

1.2 方法

1.2.1 亚麻总DNA提取与检测

亚麻总DNA提取参照王关林、方宏筠的方法[3]。分别取0.2 g 4个品种的叶片提取总DNA, 提取的DNA分装贮于-20℃;亚麻总DNA的浓度检测采用琼脂糖凝胶电泳法, 琼脂糖凝胶电泳方法参照萨姆布鲁克的方法[4], 取1 μL所提取的各Genome DNA在0.8%Agarose上进行电泳, 和标准分子量λDNA/HindⅢ比较, 进而检测所提取各Genome DNA的浓度和完整性。

1.2.2 RAPD反应条件

为确定最佳的PCR反应体系, 设置4个Taq酶浓度:0.5、1、1.5、2 U;4个dNTP浓度:0.2、0.25、0.3、0.35 mmol·L-1。选用A5引物, 其浓度设4个:0.5、1、1.5、2 μmol·L-1;退火温度设3个:35、36、37℃。根据扩增结果, 选择出最佳的PCR反应体系。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性40 s, 35、36、37℃退火1 min, 72℃延伸90 s, 40个循环;72℃再延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 PCR反应优化

2.1.1 不同Taq酶浓度对扩增结果的影响

试验Taq酶浓度选用0.5、1、1.5、2 U共4个梯度, 从图1中可以看出0.5 U时仅扩增出一条带, 当增加到1 U时扩增效果较好, 因此确定1 U是最佳浓度。

2.1.2 不同dNTP浓度对扩增结果的影响

本试验dNTP浓度设了4个梯度分别为0.2、0.25、0.3、0.35 mmol·L-1, 图2中dNTP浓度为0.2 mmol·L-1时扩增条带少, 当0.25 mmol·L-1时扩增的条带数目多而且清晰, 当dNTP浓度为0.3 mmol·L-1和0.35 mmol·L-1时条带数量又减少, 因此0.25 mmol·L-1是最佳浓度。

2.1.3 不同引物浓度对扩增结果的影响

本试验引物浓度设4个梯度:0.5、1、1.5、2 μmol·L-1, 图3中显示0.5和1 μmol·L-1扩增的条带不清晰, 1.5和2 μmol·L-1扩增的效果好, 但二者没有明显区别, 因此确定1.5 μmol·L-1是最佳浓度。

2.1.4 不同退火温度对扩增结果的影响

从所设的 35、36、37℃退火温度的三个梯度可看出 (见图4) , 37℃是最佳温度。

2.2 优化后亚麻最佳RAPD反应条件及PCR程序

通过Mg2+浓度优化、dNTP浓度优化、引物浓度优化、基因组DNA浓度优化、Taq酶浓度优化, 最终确定如下优化后的PCR体系。优化出适宜亚麻RAPD的PCR反应体系PCR体系 (25 μL) :10×Buffer, Mg2+ (1 mmol·L-1) , dNTP (0.25 mmol·L-1) , primer (1.5 μmol·L-1) , Genome DNA (50 ng) , Taq1 U。优化出适宜亚麻RAPD的PCR程序通过退火温度梯度试验, 确定优化后的PCR程序:94℃预变性4 min;94℃变性40 s, 37℃退火1 min, 72℃延伸90 s, 40个循环;72℃延伸10 min。

2.3 筛选出适宜亚麻RAPD的引物

筛选出适宜亚麻RAPD的引物12条, 其序列见表2。

从70条引物中选取扩增结果较好的引物如图5、图6和图7, 综合Diane、FANY、黑亚12三个品种为模板的结果, 70条引物中有12条引物 (序列见表2) 扩增出的条带清晰, 多态性好, 重复性好。

3 讨论

利用RAPD标记进行种质资源多样性分析的效果因不同作物、试验材料和所选引物而异。种质资源的遗传多样性研究不仅可以为新品种选育策略的制定提供依据, 还可以为亲本选配、后代遗传变异程度及杂种优势水平的预测提供预见性指导。

通过本研究优化的适宜亚麻RAPD的PCR体系和程序, 并利用本研究筛选出的适宜亚麻RAPD的引物可以对亚麻种质资源进行分子鉴定, 可以弥补传统方法的缺陷, 能更快速更准确地鉴定亚麻种质资源的亲缘关系, 更好地为亚麻育种和资源的保存提供依据。

摘要：对亚麻RAPD反应条件进行了优化:在25μL反应体系中, 含10×Buffer, Mg2+ (1 mmol.L-1) , Taq酶1 U, Ge-nome DNA50 ng, dNTP0.25 mmol.L-1, RAPDpri mer 1.5μmol.L-1。PCR反应程序为:94℃预变性4 min;94℃变性40s, 37℃退火1 min, 72℃延伸90 s, 40个循环;72℃延伸10 min。同时利用3个有代表性的亚麻品种从70条引物中筛选出12条多态性好、重复性高的引物, 为亚麻的分子鉴定奠定了基础。

关键词：亚麻,基因组DNA,RAPD反应,筛选

参考文献

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[2]Welsh J, McClelland M.Genome fingerprinting using PCR witharbitrary pri mers[J].Nucleic Acids Res, 1990, 8:7213-7218.

[3]王关林, 方宏筠.植物基因工程原理与技术[M].北京:科学出版社, 1998:598-599.

RAPD技术 篇9

虽然杂种优势很早以前就被人们发现并加以利用,也已组配了不少柞蚕杂交种,但有关柞蚕杂种优势的理论研究还不够深入,这在某种程度上影响了柞蚕杂种优势的充分利用。利用分子标记技术从基因的角度来探讨杂种优势产生的机理,为有效地利用杂种优势提供了可能,并且已在玉米[1]、水稻[2]等作物上加以应用。应用分子标记技术结合野外试验,可以用来指导杂交组合的选配、杂种优势的分析和预测,这样可以节省大量的人力和物力。

RAPD分子标记技术是最常用的分子标记技术之一。本文采用RAPD标记技术对柞蚕品种选大1号、沈黄1号及其杂交F1代、F2代、回交F1代共13个群体进行了分析,以探讨亲本及子代间的RAPD标记多态性,以期能更有效的对杂交后代进行研究分析鉴定,为杂种优势的利用提供分子生物学理论。

1 材料与方法

1.1 材料

黄蚕血统品种沈黄1号、青黄蚕血统品种选大1号及正反交F1、F2代和回交F1代。供试材料由沈阳农业大学柞蚕研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

基因组DNA的提取参考宋宪军[3]、赵巧玲[4]的方法,但略有改进,采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 RAPD—PCR扩增

引物序列参考聂磊[5]的报道(由大连宝生物公司合成),并筛选出8个扩增带丰富的引物(表1)。PCR反应体系为25μL:10.8μL ddH2O、2.5μL 10×buffer(含25 mmol·L-1 Mg Cl2)、1μL dNTP、7.5μL Primer、0.2μL Taq DNA酶(5U·μL-1,购自大连宝生物公司)、3μL模板DNA。反应程序为94℃预变性1 min,94℃变性0.5 min,40℃退火1 min,72℃延伸1.5 min;36个循环后,72℃延伸10 min。

1.2.3 电泳检测

PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,DNA Marker为DL2000(购自大连宝生物公司),采用凝胶成像系统观察拍照,记录电泳结果。

2 结果与分析

RAP D扩增产物的多态性

采用筛选出的8个不同RAPD引物对13个柞蚕群体分别进行扩增,结果见表1及图1。

注:1.选大1号;2.沈黄1号;3.选大1号×沈黄1号;4.沈黄1号×选大1号;5.选大1号×(选大1号×沈黄1号);6.(选大1号×沈黄1号)×选大1号;7.选大1号×(沈黄1号×选大1号);8.(沈黄1号×选大1号)×选大1号;9.沈黄1号×(选大1号×沈黄1号);10.(选大1号×沈黄1号)×沈黄1号;11.沈黄1号×(沈黄1号×选大1号);12.选大1号×沈黄1号自交F2;13.沈黄1号×选大1号自交F2。

RAPD-PCR扩增结果(表1):8个RAPD引物共扩增出74条重复性好、清晰的多态性条带,片段大小在250~2 300bp之间;每个引物扩增出的条带有6~12条,平均为9.25条;74个扩增位点中有65个位点具有多态性,多态性位点比率为87.84%。不同引物扩增出来的位点多态性有较大的差别,多态性位点比率在70%~100%之间。

8个RAPD引物对13个柞蚕群体的扩增谱带也存在着明显的差异(图1)。8个引物扩增出的片段数量和大小明显不同。所有的扩增位点也可分为以下几种类型:(1)正反交F1及F2代、回交F1代和双亲均有的扩增位点,共9个;(2)正反交F1及F2代、回交F1代与亲本一方共享的位点,在另一方不存在或出现频率很低,共1个;(3)正反交F1及F2代和回交F1代各自出现特异性的扩增位点(即非亲性扩增位点),共5个;(4)双亲中没有而在正反交F1及F2代、回交F1代中出现的位点,共29个。

以引物R1为例说明对选大1号、沈黄1号及其正反交F1代的鉴定。引物R1对13个柞蚕组合共扩增出12条带,其中第7条带为沈黄×选大所特有,第3、5两条带位置上在亲本沈黄1号没有带,其它三个都有;第9条带位置上就选大1号没有带,以此可以鉴定出选大1号、沈黄1号及其正反交F1代。同样可以鉴定的还有引物R2、R5、R7、R8。

3 讨论

本文采用RAPD标记技术对两个柞蚕品种选大1号和沈黄1号及F1、F2代、回交F1代作了初步研究。结果表明RAPD—PCR共扩增出特异性的扩增位点(即非亲性扩增位点)5个,占总数的6.76%。非亲性扩增位点的出现可能是在细胞分裂的过程中杂交种的染色体出现结构重排、断裂及丢失所致,因而在杂交后代中出现了非亲性扩增位点。Van Open[6](1994)认为这种情况是引物结合位点的竞争或是异质双链形成导致的。引物结合位点与基因组DNA的复杂程度和分子量大小有关,一般是复杂程度高的基因组被扩增。Jone[7](1983)和杨金水[8](1996)认为基因多态性的结构差异大多是存在于基因调控区,因为调控区与编码区相比能更灵活地适应自然选择的要求。在杂种子代中,双亲遗传物质结合后基因的调控区可能发生了改变,从而引起扩增位点多态性,出现了非孟德尔方式传递的扩增位点。这些调控区的变化会引起相应编码区等位基因显隐性关系的改变,从而使基因的表达模式发生改变,这可能是杂种优势形成的原因之一。

目前有关RAPD的分子标记研究的比较多,而本文采用RAPD分子标记对柞蚕亲本及其杂交种、回交种的分析,可以为柞蚕品种的选育特别是杂种优势的利用提供一些分子生物学理论。

摘要：本文采用RAPD分子标记技术对柞蚕品种选大1号和沈黄1号及其F1、F2代、回交F1代共13个群体的基因组DNA进行了分析,探讨了柞蚕品种的分子遗传机制。运用8个RAPD引物进行扩增,共扩增出74条清晰稳定的条带,其中有65条具有多态性,多态性位点比率为87.84%,其中也出现了特异性扩增位点。

关键词：柞蚕,RAPD,分子标记

参考文献

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[3]宋宪军,聂磊,张涛,等.柞蚕部分品种及杂交种的RAPD分析[J].蚕业科学,2004,30(4):428-431.

[4]赵巧玲,张志芳,何家禄.家蚕蛹体基因组DNA的快速制备方法[J].蚕业科学,2000,26(1):63-64.

[5]聂磊,钟鸣,李俊,等.柞蚕杂交F1代的RAPD分析[J].沈阳农业大学学报,2006,37(1):61-64.

[6]Van Open MJ H..Tracking dispersal rates phylogeography of the Antarctic disjust seaweed Acrosiphonia arcta.Jphycol,1994,30:67-80.

[7]Jone MA,Strommer J H.Exceptionally high levels of restriction site polymorphism in DNA near the maize ADHI gene.Genitics,1983,105:733-743.