PCR技术

PCR技术（精选12篇）

PCR技术 篇1

PCR (polymerase chain reaction) 的中文全称为聚合链反应。PCR技术随着自身的发展及其与已有分子生物学技术的结合衍生了多种技术, 如逆转录PCR (reverse transcription PCR, PT-PCR) 、原为PCR (in situ PCR) 、实时PCR (in situ PCR) 等[1]。单分子PCR (single molecular PCR, SM-PCR) 技术[2]是最近发展出的新的PCR技术。该文将着重介绍常规PCR技术与单分子PCR技术要点、特点及其优点。

1 常规PCR技术要点[1.3]

PCR反应体系的基本成分包括:模板DNA、特异性引物、耐热DNA聚合酶 (如Taq DNA聚合酶) 、d NTP以及含Mg2+的缓冲液。

模板DNA的变性模板DNA经加热至94℃, 使模板DNA双链完全变性或经PCR扩增形成的双链DNA解离, 使之成为单链, 同时引物自身以及引物之间的局部双链也得以打开。

模板DNA与引物的退火模板DNA经加热变性成单链后, 温度降至55℃, 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

引物的延伸将温度升至72℃, DNA模板一引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下发挥酶活性, 以d NTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤构成一个循环, 新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板, 经多次循环 (25-30次) 后即可达到扩增DNA片段的目的。

2 SM-PCR技术要点

SM-PCR是基于常规PCR技术发展而来的, 包括变性、退火、延伸3个基本环节, 但在模板数量、引物设计、DNA聚合酶选择以及反应条件上与常规PCR存在较大区别。

模板的准备:SM-PCR是在DNA模板稀释到极端条件下进行的扩增反应, 模板的质量直接决定实验的成败与扩增效率。实验中, 首先用限制性内切酶消化质粒DNA得到含有靶DNA的片段, 经常规PCR扩增, PCR产物再经酚/氯仿抽提, 酒精沉淀和HPLC等方式纯化。纯化的DNA用含0.1% (V/W) 的蓝色葡聚糖2000或1ng/L t RNA的TE溶液[4]稀释到1个 (或5个, 或10个) 分子/μl的终浓度。蓝色葡聚糖2000或1ng/L t RNA的作用是为了防止DNA吸附于管壁上, 以保证模板DNA的正常变性、引物的退火以及链的延伸。

引物的设计:SM-PCR反应混合物中模板数极低, 若引物之间存在少量配对序列, 循环扩增下极易形成二聚体。因此。在进行引物设计时应严格控制其GC含量和Tm值, 同时尽量避免引物间存在可配对序列。实验证明, 引物工作浓度在3μmol/L时, 可以得到理想的PCR产物;高于或低于3μmol/L, PCR产物的数量都不理想[5]。

DNA聚合酶的选择SM-PCR反应中模板数很少, 循环数多, d NTP损耗很大, 因此选择何种DNA聚合酶, 完全取决于实验是否需要产生突变。在体外定向进化中, 希望增加突变的频率以构建突变基因文库, 因此, 选择低保真度Tap DNA聚合酶, 其错误参入率为10-4/bp, 扩增效率为70%时, 将200bp长的片段扩增一百万倍, 产物错误率达33%[6]。在基因组测序及法医鉴定中, 为获得大量无突变, 高度一致的PCR产物, 通常选用高保真度pfu DNA聚合酶, 其错误参入率为7×10-7/bp, 在同样实验效率下将500bp长的片段扩增一百万倍, 产物错误率为0.7%[7]。

反应条件SM-PCR的变性温度 (96~98℃) 大多比常规PCR (94℃) 高, 其变性时间 (5~15s) 短于常规PCR (40s) , 同时退火时间及延伸时间也相应缩短;常规PCR循环为3~5h, 因此必须选择热稳定性好的DNA聚合酶。

预防污染SM-PCR中模板数量极少, 少量污染都会导致实验产生错误, 甚至整个实验失败。在处理样品的过程中, 微量移液器, 空气等极易造成样品间的交叉污染。此外, 试剂配制中也极易被污染而导致SM-PCR污染。因此, 实验中应注意设阴性对照。

3 PCR技术特点[3.4]

3.1 敏感性高

PCR产物的生成以指数方式增加, 能将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。这是PCR技术最主要的特点, 它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。

3.2 特异性强

自从提取出耐热Taq DNA聚合酶以来, 在热变性处理时不被消化, 不必在每次循环扩增中再加入新酶, 以及在较高温度下连续反应, 显著提高了PCR反应产物的特异性。PCR扩增的特异性还依赖于两个引物设计的好坏, 依赖于引物与模板结合的准确性。3.3操作简便、快速整个PCR操作过程, 从标本处理、PCR扩增到产物分析。可在4h内完成全部实验。扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆, 摆脱繁琐的基因分析方法, 可直接从总RNA或DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因, 省去须先进行克隆后再作序列分析的模式。

4 SM-PCR技术优点[7]

SM-PCR指的是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR。

4.1

极少的模板数, 通常为1、5或者10个DNA分子。

4.2

更微型化的体系, SM-PCR体系大多在10μl左右。

4.3

可构建出大小可控的文库, 不同模板数构建的文库大小是不同的, 如DNA模板数位10个分子时, 文库大小是模板数为1个分子的10倍。

摘要：常规PCR技术大都以大量DNA分子 (一般为105个以上) 为模板进行DNA扩增。单分子PCR技术是以极少量DNA分子 (1、5或10个分子) 为模板进行DNA扩增。在高保真度DNA聚合酶作用下, 单分子PCR技术能扩增出高度一致的DNA;在低保真度DNA聚合酶作用下。单分子技术又能构建出大量突变基因的DNA文库。

关键词：常规PCR,单分子PCR,DNA聚合酶

参考文献

[1]查锡良.生物化学[M].第7版, 北京:人民卫生出版社, 2009:483-485.

[2]张杰道.生物化学实验技术PCR技术及应用[M].科学出版社, 2005:12-18.

[3]Yamane T, et al.Nippon Nofeik Kaishi, 2004, 78 (8) :751-753.

[4]王国华, 等.生物化学与生物物理进展, 2004, 31 (2) :159-161.

PCR技术 篇2

检验0905郭媛媛

PCR是我们研究 分子生物学的重要方法和工具，随着医学科技的不断发展，这种技术越来越被人们看重，越来越多的应用到我们的科技研究之中，作为医学检验工作者，这种技术也是我们必须掌握的从这篇文章中让我们了解一下它在实践之中的前景。

摘要：PCR(ploymerse chain reaction)技术[1]，即聚合酶链反应技术，又称基因体外扩增技术或和核酸体外扩增技术，利用两种与相反链杂交并利用附着于目标DNA两端的寡核苷酸引物在高温(95°C)使目标DNA片断的DNA双链变性，分解为单链，在较低温度(37-63°C)与引物退火，然后变温到72°C左右。在耐高温DNA聚合物酶的作用下引物被沿样板DNA单链延伸合成互补链，然后有变性→退火→延伸反复进行。引物大大过量，dNTP过量，酶在高温中是较稳定的，这样经过几十个循环，目标DNA片断就按2的n次方递增，用此法可以从mRNA中，cDNA库中扩出目标基因。总之，生物体内核酸的复制是半保留复制，PCR技术就是在体外对此进行复制模拟。

关键词：PCR技术；DNA；应用；工程效益扩大 1 引言

人类利用微生物的实践具有悠久的历史，公元前，人类就已经利用天然的微生物（酶）生产奶酪和酒。进入工业革命时代，人们开始对天然微生物进行筛选和诱变，生产某些简单的代谢产物，氨基酸，维生素和抗生素。

20世纪60年代至今，随着人类虽微生物认识的加深，DNA重组技术的出现，发酵技术的提高：更多的微生物可产生各种各样的抗生素，应用于医学微生物学(Medical Microbiology)中；更多微生物被发现可产生促生物质，有利于人和动植物的生长，对农业科学(Agriculture)有着极重要的支持；还有些微生物的代谢产物是重要的化工原料，加速了化工产业(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被广泛应用于法医鉴定(Forenic)、医学(Medical Science)、环境监测(Environment Supervise)分子克隆(Member Clone)、序列分析(Alignment Analysis)、考古研究(Archaeology Search)等重要学科，具有广泛的应用前景，这就是我要介绍的PCR技术。2 PCR技术原理

下面我通过摘录了一个实验[2]，来介绍一下PCR技术的过程及其原理(至于它详细的实验过程和方法详见参考文献)。.在94°C高温下双链变性，分离出DNA单链的模板，然后降温(55°C)，然添加的与DNA单链配对，紧接着温度升高(72°C)，在DNA聚合酶的作用下，脱氧核苷三磷酸开始渗入，并从引物的结合端开始，按5ˊ-3ˊ方向延伸，合成出新生的DNA互补链，这一过程称为一循环，然后重复该循环，模板DNA被大量复制。

在此，我要特别强调几点注意事项，这也是这个实验设计者提醒我们需要注意的地方：

(1)在配置PCR反映体系的过程中，Taq酶应在加入dNTP混合物后加入，因为有些酶的3ˊ-5ˊ的外切酶反应较强，反映体系如果不含dNTP，反应体系中的引物可能被分解。

(2)非特异性扩增产物，可能是模板有与引物同源性高的其他位点，其次是复性温度太低，适当提高复性温度就可以解决这些问题。

以上实验可清楚明了地向我们展示PCR技术的原理。3 PCR技术分类

PCR技术自从1985年由Millus创立后，经历了20年的飞速发展，是传统微生物学与现代基因学之间的完美结晶，已成为当今世界上不可或缺的一项重要的微生物应用技术，下面我将介绍几种常用的PCR技术[3] 3.1反转录PCR 反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)即以RNA分子为模板的扩增技术，主要用于克隆cDNA、检测RNA病毒、合成cDNA探针机构建RNA高效转录系统。3.2定量PCR 定量PCR(quantitative PCR)的基本原理是。假定其反应产物的数量同反映混合物中起始模板的mRNA或DNA的量成正比，因此通过琼脂糖电泳样品条带得比较，便可以确定两种PCR产物之间的数量关系。另外定量PCR还有广义和狭义之分[4]，在此就不详细介绍了。3.3实时荧光定量PCR 所谓实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用映光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过校正曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，还具有特异性更强、有效解决了PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。3.4重组PCR 重组PCR(recombinant PCR RP-PCR)是指用PCR法在DNA片段上进行点突变，即扩增产物中含有域模板序列不同的碱基。利用重组PCR可造成DNA片段的碱基插入或缺失，从而研究目的基因片段的功能。3.5反向PCR 反向PCR(inverse PCR IP-CR)是对一个已知的DNA片断序列两侧的未知序列进行扩增和研究的技术。3.6多重PCR 多重PCR(multiplex PCR)即在同一反应体系中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。多重PCR可同时检测多个突变位点或病原生物，有利于遗传病和感染性疾病的诊断。3.7不对称PCR 不对称PCR(asymmetric PCR)即在扩增体系中加入不同浓度的引物，而得到单链DNA产物。

另外还有几种新型的、最近兴起的PCR技术[5]，虽不十分成熟，但发展前景十分广阔。它们包括： 3.8原位PCR 原位PCR是指对组织细胞中特异DNA或RNA进行PCR扩增，然后再用原位PCR进行扩增，然后再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法。目前有报道[6]用这种方法可检测出组织细胞中的人乳头瘤病毒、艾滋病毒、结核杆菌等。3.9巢式PCR 巢式PCR比常规PCR灵敏度大大提高，同时第二次扩增又可鉴定第一次扩增产物的特异性。所以这种方法用于临床检验，目前血清中丙型肝炎的监测多用这种方法。

4.PCR技术应用实例

PCR技术自从建立以来，由于其敏感、高效、操作简便，在分子生物学研究、临床医学和其他很多领域中得到4.1分子生物学理论研究[7] 如：制备cDNA文库与筛选，要较多的组织。但如果用PCR技甚至几个细胞就可以构建cDNA高了工作效率。

再如：DNA测序、检测突变碱基、基因重组与融合、用简并引物法扩增未知序列，无不是PCR技术在分子生物学中的应用。4.2临床医学[8]

如：病原体诊断，利用PCR技术可以检测标本中的病毒、细菌、支原体，直至寄生虫等病原生物，标本可以是组织、血液、细胞、分泌物、排泄物等。以后还发展了遗传病基因的诊断、组织器官移植的配型选择、肿瘤的诊断转移和确定、法医学和其他临床医学领域。4.3考古学[9]

由于PCR技术对基因组的完整性要求不高，因而对分子考古学极为有帮助，科判定生物种类间的亲缘关系、进化途径等。

如：1997年德国慕尼黑大学动物研究所科学家宣称[10]，他们对欧洲原始人——欧洲尼安德特人化石中的基因残余物进行分析，结果表示著名的欧洲原始人尼安德特人不是欧洲现代人的祖先，这一结果又得到了英国、俄罗斯和瑞典科学家的进一步证实，为现代人的起源提供了新的论据。4.4 其他领域

PCR技术还在动植物研究领域、组织和群体生物学等领域已得到了广泛的应用[11]。5.前景与总结

结合对以上PCR技术的了解，我认为PCR技术可以加快实现它的工程化，效

既费钱费时，又需术，只要很少组织文库，并且大大提了广泛应用。益化，如：应用在现代环境工程污水处理工程的微生物载体研究上[12]，PCR技术暂时只是致力于理论方面和研究方面，它并没有像其他微生物技术那样给人类社会带来大规模的经济效益，假如可以实现这一设想，那么不但PCR技术本身可以得到更加快速的发展，而且我们还可以促进经济的发展。

比如说：在传统的生物发酵技术上可以结合PCR技术，利用DNA在体外的复制和杂交，并实现表达，可以实现基因工程的超远缘杂交的物种突破难进行的问题；再比如：可以通过PCR技术实现核酸杂交技术，核酸杂交法比抗原捕获特异、敏感，但半衰期短，放射性污染不易处理，显影时间长等缺点，目前国内外常用的生物素检测标本中致癌物质[13]。

另外，还有很多微生物的PCR技术在工程上的应用，这里就不一一列举了。关键是怎样扩大在工程上的应用，以扩大经济效益。这是PCR技术的关键。

PCR技术运用传统生物技术结合近代基因工程原理，包含反转录PCR技术、定量PCR技术、实时荧光定量PCR技术、重组PCR技术、反向PCR技术、多重PCR技术、不对称PCR技术等多种传统PCR技术和原位PCR技术、巢式PCR技术等一系列新兴PCR技术。最新的进展如[14]：结核杆菌诊断PCR；病毒学PCR技术；HIV感染PCR；检测人COX病；DMS/BMD基因；地中海贫血PCR；血友病A基因„

在工业在分子生物学、临床医学、考古学等众多领域取得了巨大成就，不但只是局限于研究领域，而且还从实用角度证明了PCR技术是一项令人类值得自傲的技术。自从1985年由Millus创立之后，又得到了近二十年的发展，所以PCR技术的发展前景是不可估量的。它绝对是现代生物学技术中一项值得发展的技术，在当今社会乃至未来社会都会有它的立足之地，充分运用它，人类会在文明发展的进程中，发出更耀眼的光芒。参考文献：

[1] 欧阳平凯,《》生物科技辞典,化学工业出版社,北京,2003.10:342 [2] 赵斌,何怡红,《微生物实验》,科学出版社,北京,2002,23(5):11-15 [3] 孙汶生,黄英才,马曹红等,《基因工程学》,科学出版社,北京,2004.8:131-136 [4] 魏平著,《关于定量PCR技术》,科学教育出版社,北京,2001.815:59 [5] 贺淹才,《简明基因工程原理(第二版)),科学出版社,北京,2005,8:175-197 [6] 俞华,《PCR技术发展及应用前景》,人民日报,2003.12(5),第7版 [7] 马中声等,《分子生物学》,教育出版社,北京,2004,7:135 [8] 陆德如等,《现代生物医学技术》,化学工业出版社,北京,2002,7:50-52 [9] 李立家,《PCR技术的应用及前景》,东北大学学报,2002,11:10-15 [10] Geoger White,《 Prospective of PCR Technology》, Science,2000,5(7):29-32

[11] Michael Brand, Methods in Molecular Medicine, Vol.26“《Quantitative PCR Protocols》” Edited by: B.kochanowski and V.Reischi, Humana press Inc.Totowa, NJ, 1999

[12] 李彦春,《关于废水处理的现代技术应用》,环境技术通报,2005,5(4):25-30 [13] 二雄吉平,吴涛译,《关于PCR技术的一些看法》,东京大学学报现代基因技术译丛, 2004,11(4):10-15

PCR技术 篇3

在诞生后二十几年的时间里，PCR技术因其实用性和极强的生命力，从无到有，从只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，发展到应用于各个领域的几十种PCR方法，在生物学、基础医学、法医学、考古学等领域作出突出贡献。这一推动生命科学和社会迅猛发展的新技术必然影响到学校教育。高中生物教材与时俱进，选用“利用PCR技术扩增目的基因”一节，介绍PCR的反应原理及操作，力图表达生命科学前沿知识，引导学生关注现代生物技术新进展和学科发展方向，增强科技创新意识，发展学生的思维能力。现笔者谈谈PCR技术在高中生物中的重要作用。

一、PCR技术的发明是培养学生科学态度和树立学生正确价值观的良好素材

PCR的产生倾注了发明者穆里斯的全部心力。1983年春天，穆里斯前往乡间度周末，他驱车行驶在蜿蜒的州际高速公路上，灵感闪现，孕育出PCR技术的原型，即DNA分子能在适当条件下摆脱染色体结构的束缚并获得指数扩增。穆里斯对这一新奇念头充满热切希望，回到西特斯，穆里斯做了关于先有技术的文献检索，没找到任何有价值的、有助于确定他所需要的实验参数的技术文献，但他坚信自己所走的是一条创新的道路，于是坚持不懈地对此设想进行了大量实验。开始时，他使用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段扩增目的基因，因该酶不耐热，每次加热变性DNA后需重新补加，而多份标本的操作更是耗时、费力且易出错，所以使得PCR技术在当时成了一种笨拙且中看不中用的实验室方法。

穆里斯苦苦思索，他曾写道：“我当然不知道什么是‘适当条件，也不知道自己所选择的条件是不是发生PCR所必需的。我能做的只是不断改进实验方法和程序，直到扩增反应能够顺利进行。在没有获得确切的DNA扩增结果前，我完全是在黑暗中摸索。只要有哪怕一丁点儿的扩增，我就能够通过改变部分实验参数的方法迅速优化反应体系。”正是穆里斯的执著和敏锐，努力不懈探索未知，使得耐热的TaqDNA聚合酶应用于PCR反应，实验条件逐步成熟完善，继而第一台PCR热循环仪实现了该技术的自动化，促成PCR技术迅速发展和广泛应用。

杰出生物学家穆里斯的卓越事迹对培养学生的科学态度和树立学生正确的价值观具有重要意义。在学习PCR技术发明的过程中，学生必然为科学家坚忍不拔的毅力、精益求精的劳作、勇敢超越的精神、举世瞩目的成就所震撼，由此转化为科学的态度和正确的价值观。同时，PCR技术发明的过程富含科学家的心路历程、科学发现的奇闻轶事，因而在培养学生的兴趣、好奇心、求知欲等方面具有极其重要的价值。并且，科学探索的艰难和曲折及科学发展承受的误区和歧义，会引发学生理性反思和审慎思考，进而培养学生不屈的进取精神、乐观的生活态度及对真理的追求与热爱。endprint

PCR，即聚合酶链式反应的缩写，是由美国“西特斯”（Cetus）生物技术公司的穆里斯（K.Mullis）等人于1988年发明的一种DNA（包括RNA）体外扩增技术，能在短时间内将极微量的特定核酸片段精确复制出成百万份的拷贝。在PCR技术问世前，要获得一个靶基因，必须依赖克隆技术，以活的生物体作为复制遗传物质的载体，先建立基因组文库，再从成千上万的菌落中通过Southernblot杂交筛选出含有靶基因的克隆，既费时又费钱，特别是真核基因的克隆难度更大。而PCR技术在摆脱活体依赖性方面前进了一大步，基因操作效率及灵活性等方面也明显提高，使微量的核酸操作变得简单易行。

在诞生后二十几年的时间里，PCR技术因其实用性和极强的生命力，从无到有，从只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，发展到应用于各个领域的几十种PCR方法，在生物学、基础医学、法医学、考古学等领域作出突出贡献。这一推动生命科学和社会迅猛发展的新技术必然影响到学校教育。高中生物教材与时俱进，选用“利用PCR技术扩增目的基因”一节，介绍PCR的反应原理及操作，力图表达生命科学前沿知识，引导学生关注现代生物技术新进展和学科发展方向，增强科技创新意识，发展学生的思维能力。现笔者谈谈PCR技术在高中生物中的重要作用。

一、PCR技术的发明是培养学生科学态度和树立学生正确价值观的良好素材

PCR的产生倾注了发明者穆里斯的全部心力。1983年春天，穆里斯前往乡间度周末，他驱车行驶在蜿蜒的州际高速公路上，灵感闪现，孕育出PCR技术的原型，即DNA分子能在适当条件下摆脱染色体结构的束缚并获得指数扩增。穆里斯对这一新奇念头充满热切希望，回到西特斯，穆里斯做了关于先有技术的文献检索，没找到任何有价值的、有助于确定他所需要的实验参数的技术文献，但他坚信自己所走的是一条创新的道路，于是坚持不懈地对此设想进行了大量实验。开始时，他使用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段扩增目的基因，因该酶不耐热，每次加热变性DNA后需重新补加，而多份标本的操作更是耗时、费力且易出错，所以使得PCR技术在当时成了一种笨拙且中看不中用的实验室方法。

穆里斯苦苦思索，他曾写道：“我当然不知道什么是‘适当条件，也不知道自己所选择的条件是不是发生PCR所必需的。我能做的只是不断改进实验方法和程序，直到扩增反应能够顺利进行。在没有获得确切的DNA扩增结果前，我完全是在黑暗中摸索。只要有哪怕一丁点儿的扩增，我就能够通过改变部分实验参数的方法迅速优化反应体系。”正是穆里斯的执著和敏锐，努力不懈探索未知，使得耐热的TaqDNA聚合酶应用于PCR反应，实验条件逐步成熟完善，继而第一台PCR热循环仪实现了该技术的自动化，促成PCR技术迅速发展和广泛应用。

杰出生物学家穆里斯的卓越事迹对培养学生的科学态度和树立学生正确的价值观具有重要意义。在学习PCR技术发明的过程中，学生必然为科学家坚忍不拔的毅力、精益求精的劳作、勇敢超越的精神、举世瞩目的成就所震撼，由此转化为科学的态度和正确的价值观。同时，PCR技术发明的过程富含科学家的心路历程、科学发现的奇闻轶事，因而在培养学生的兴趣、好奇心、求知欲等方面具有极其重要的价值。并且，科学探索的艰难和曲折及科学发展承受的误区和歧义，会引发学生理性反思和审慎思考，进而培养学生不屈的进取精神、乐观的生活态度及对真理的追求与热爱。endprint

PCR，即聚合酶链式反应的缩写，是由美国“西特斯”（Cetus）生物技术公司的穆里斯（K.Mullis）等人于1988年发明的一种DNA（包括RNA）体外扩增技术，能在短时间内将极微量的特定核酸片段精确复制出成百万份的拷贝。在PCR技术问世前，要获得一个靶基因，必须依赖克隆技术，以活的生物体作为复制遗传物质的载体，先建立基因组文库，再从成千上万的菌落中通过Southernblot杂交筛选出含有靶基因的克隆，既费时又费钱，特别是真核基因的克隆难度更大。而PCR技术在摆脱活体依赖性方面前进了一大步，基因操作效率及灵活性等方面也明显提高，使微量的核酸操作变得简单易行。

在诞生后二十几年的时间里，PCR技术因其实用性和极强的生命力，从无到有，从只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，发展到应用于各个领域的几十种PCR方法，在生物学、基础医学、法医学、考古学等领域作出突出贡献。这一推动生命科学和社会迅猛发展的新技术必然影响到学校教育。高中生物教材与时俱进，选用“利用PCR技术扩增目的基因”一节，介绍PCR的反应原理及操作，力图表达生命科学前沿知识，引导学生关注现代生物技术新进展和学科发展方向，增强科技创新意识，发展学生的思维能力。现笔者谈谈PCR技术在高中生物中的重要作用。

一、PCR技术的发明是培养学生科学态度和树立学生正确价值观的良好素材

PCR的产生倾注了发明者穆里斯的全部心力。1983年春天，穆里斯前往乡间度周末，他驱车行驶在蜿蜒的州际高速公路上，灵感闪现，孕育出PCR技术的原型，即DNA分子能在适当条件下摆脱染色体结构的束缚并获得指数扩增。穆里斯对这一新奇念头充满热切希望，回到西特斯，穆里斯做了关于先有技术的文献检索，没找到任何有价值的、有助于确定他所需要的实验参数的技术文献，但他坚信自己所走的是一条创新的道路，于是坚持不懈地对此设想进行了大量实验。开始时，他使用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段扩增目的基因，因该酶不耐热，每次加热变性DNA后需重新补加，而多份标本的操作更是耗时、费力且易出错，所以使得PCR技术在当时成了一种笨拙且中看不中用的实验室方法。

穆里斯苦苦思索，他曾写道：“我当然不知道什么是‘适当条件，也不知道自己所选择的条件是不是发生PCR所必需的。我能做的只是不断改进实验方法和程序，直到扩增反应能够顺利进行。在没有获得确切的DNA扩增结果前，我完全是在黑暗中摸索。只要有哪怕一丁点儿的扩增，我就能够通过改变部分实验参数的方法迅速优化反应体系。”正是穆里斯的执著和敏锐，努力不懈探索未知，使得耐热的TaqDNA聚合酶应用于PCR反应，实验条件逐步成熟完善，继而第一台PCR热循环仪实现了该技术的自动化，促成PCR技术迅速发展和广泛应用。

PCR技术的研究进展 篇4

1 PCR技术原理

PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物,在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成,一个循环包括连续的3个步骤:第1步是高温条件下的DNA模板变性,即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链;第2步是退火,即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火;第3步是延伸,即在4种d NTP底物同时存在的情况下,借助Taq DNA聚合酶的作用,引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后,合成了新链,可将其作为DNA模板继续反应,由此循环进行。循环进程中,扩增产物的量以指数级方式增加,一般单一拷贝的基因循环25~30次,DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单,但是具体的操作是复杂的,如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此,不同的反应体系应该确定适当的反应条件,以避免假阴性或假阳性等情况的产生。

2 PCR技术的分类

在传统PCR技术的基础上,根据人们的需要以及各个领域的应用要求,又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进,为进一步的研究提供了基础。

2.1 实时荧光定量PCR技术

1996年,学者经过研究,在传统PCR技术的基础上,首创了实时荧光定量PCR技术,新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势,还具有实时性、准确性、无污染,实现了自动化操作和多重反应,是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。

荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中,借助于荧光信号,累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的,因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行,无法对起始模板进行准确的定量,而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10,11]。一个PCR循环反应结束之后,定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号,荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况,这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段,PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系,然后进行定量分析[13]。

2.2 多重PCR技术

多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种,为同一管中加入多对特异性引物,与PCR管内的多个模板反应,在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段,也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。

在同一反应体系中,多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时,引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面,如果能选择适宜的反应体系和反应条件,可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、d NTP的用量、引物及模板的量等。另一方面,DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率,如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。

2.3 单分子PCR技术(SM-PCR)

单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的,基本循环过程相同,但在反应条件、模板数量、DNA聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。

单分子PCR技术反应中,DNA模板浓度极低,这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时,应该严格控制GC的含量和Tm值,同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下,若引物之间存在少量配对序列,扩增时极易形成二聚体,使反应无法进行,得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98℃)大多比常规PCR技术(94℃)略高,因而对DNA聚合酶热稳定性的要求也更加严格,需要有较好的热稳定性,以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。

3 PCR技术的应用

3.1 PCR技术在水产上的应用

基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化,或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19,20,21],研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响,表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大,可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常,并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达,这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料,采用实时荧光定量PCR技术,检测了P450arom A和P450arom B在不同组织的表达量,表明在各组织中均有2种基因的表达,但表达量显著不同,呈现组织特异性。

3.2 PCR技术在微生物检测上的应用

1990年,Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Legionella类菌种和大肠类细菌,其结果是通过点对点方法固定的多聚d T尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物,表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势,较优于传统的检测方法[25,26]。MetzgerBoddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价,结果显示,样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。

4 展望

传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来,已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善,荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面,其次是整合应用多重PCR与其他技术,必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。

摘要：PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点,已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述,并对其发展做出了展望。

PCR技术 篇5

来源：广东医学2010年2月第31卷第3期

周高英，叶锋

北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司(北京100176)

1985年，Mullis发明的聚合酶链式反应(PCR)技术在医学界掀起了基因诊断技术的热潮，PCR技术凭借快速、简便、灵敏等优点以惊人的速度广泛应用于临床基因诊断等领域，成为现代医学发展的又一里程碑。但十多年的临床实践表明，PCR技术本身在工作流程标准化、PCR仪器标准化和PCR产品标准化等方面还存在着若干弊端，这导致检测结果上的差异，这已经成为当前困扰临床医师、实验室技术人员以及患者的普遍问题。本文将从PCR技术产业发展回顾、诊断试剂的标准化以及PCR技术在临床检验领域的新契机等3个方面进行阐述。PCR技术及产业发展历史回顾

1985年，美国MULLIS等[1]发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实，并依靠此项技术获得1993年诺贝尔化学奖。1989年，Hoffmann—La Roche公司和Cetus公司开始将PCR技术应用于临床诊断领域。1996年，美国Applied Biosystems公司推出全球首款实时荧光定量PCR技术，并在欧美各国悄然兴起，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度高等特点，因而在各级临床实验室得以迅速推广[3]。PCR技术于90年代中期在国内全面展开临床应用工作，但是由于传统的PCR技术本身存在着许多局限性(如产物不能准确定量、容易交叉污染、导致假阳性等)，在1998年遭到了卫生部门的明令禁止。此后，由于荧光定量PCR技术的出现以及国内外学者的不懈努力，政府相关部门于2002年颁布《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》等一系列准入文件，从制度上规范了PCR实验室运作，建立起有效的质量保障体系[4]。目前，已有多家国内外生产厂商涉足研发生产适用于临床诊断的PCR检测试剂盒，并在PCR产品市场中占得先机。经过多年的发展和完善，荧光定量PCR技术在国内科研、检测和诊断领域已得到广泛应用，无论是产品种类、产品质量、技术优势和市场规模均可与国外厂家相媲美，另外，由于试剂价格远低于进口产品，国产PCR诊断试剂占领了绝大部分国内市场份额。临床PCR诊断试剂产品的弊端

临床实验室检验标准化并非单一因素，它由诸多关键性环节组成，其中工作流程标准化、PCR仪器标准化和PCR试剂产品标准化是PCR临床检验标准化的核心内容。目前国家颁布的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范》等一系列准入文件从根本上规范了工作流程标准化问题；对PCR仪器标准化而言，一些进口PCR仪器依靠高度的稳定性、可重复性和高效的数据分析软件，已实现了实验数据的可靠性和标准化操作流程；由于价格占优，国产PCR诊断试剂占据了国内的大部分市场，但是由于不同的厂家缺乏统一的检查标准，往往使得同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一标本检测间结果存在较大差异。这已经成为困扰临床医生、患者以及实验室技术人员的普遍问题，这也是当前不同实验室间结果有条件互认的一个巨大障碍。目前对于PCR诊断产品标准化主要存在以下4个问题：

2.1 定量的目的和意义不明 除少数种类试剂外，目前已上市的大部分试剂盒并不是报告原始样本中病原体的浓度，而是核酸提取后产物的靶基因浓度，并不能真正反映原取材样本的靶基因的真正含量。选择合适的实验标本是减少实验误差的第一个过程，然而不同实验的实验样品并不具有通用性，很难确保实验样品的均一性。在人体，血液样本容易收集、相对恒定、能确保不同样本间的比较，对血液中病原体进行定量检测更精确且有实际意义。然而对于如尿液、痰液、淋巴液、拭子、组织块等样本，由于采样时患者的生理状况和取样部位等因素，虽然用物理、化学或酶的方法对标本进行了处理，但仍然无法做到均一性

和可比性，因此其所谓的定量仅仅是针对核酸提取物中靶基因定量。

2.2 定量的依据不妥据调查，目前市场上PCR定量试剂无一例外都采用质粒做为试剂盒定量标准。由于质粒是一种人为构建的脱氧核糖核酸载体，环状物理构象存在特殊性，和线性的基因组DNA相比，PCR扩增效率上具有差别。因此，先进行质粒拷贝数定值，再通过比较各个样品扩增曲线Ct值来获得病原体基因组DNA的浓度，这样的流程缺乏严谨的逻辑依据。有些厂家甚至用质粒标定RNA(有的病毒遗传物质为RNA)拷贝数，就更加无据可依。同时，采用与待检样本性质差异很大的质粒作为标准品或质控品，也无法回避检测过程的基质效应。

2.3 定量的准确性不能保证核酸提取：临床样本的多样性给核酸的提取和纯化提出了新的问题，目前提取方法有手工提取、柱提取、磁珠提取等，不同的提取方法各有其的优势，因此很难建立一个标准化的临床标本制作处理过程，这对于样本的预处理、核酸的提取、提取的效率评估，也是核酸纯化方法标准化的重要指标。内标选择：目前多数PCR试剂生产厂商并没有引入质量控制措施(如内标)和校正品，这对于病原体数量准确定量就无从谈起。虽然医院对于某一两次检测值的精确度要求不是太高，但对于那些引起重大疾病的病原体，如乙型肝炎病毒载量的长期监控，准确量化就成为临床十分迫切的要求，这也是现阶段体外诊断试剂生产厂家亟待突破的瓶颈。PCR实验过程：不同的PCR仪器、不同厂家的试剂、不同的操作者也是造成实验定量不准确的重要指标之一。

2.4 试剂缺乏稳定性稳定性是体外诊断试剂必须具有的基本属性，是确保产品在使用过程中安全有效的重要指标。通过对不同条件下产品的主要质量指标随时间变化情况的检测，可以为产品的保存条件和有效期的确定提供依据。而试剂方法的标准化以及标准物质的应用是保证实验室检验结果准确性的前提，在日常检验工作中应用标准物质，将极大地改善不同实验室间检验结果的可比性，从而逐步实现不同实验室间检验结果有条件的互认。PCR技术在临床检验领域的新契机

分子生物学发展至今，人类基因组的草图早已绘就[6]，许多信号传导通道也已阐明[7]，PCR技术已经成为分子生物学十分便利的工具。然而谈到与临床检验相结合，仍有许多待改进的地方，未来的PCR临床发展之路，需要更加紧密地结合临床、体外诊断(IVD)基本要求和新材料、自动化技术等研究领域的基础理论，并在产品设计、制造工艺上取得新的突破，只有这样方能有效弥补目前PCR技术存在的缺陷，进一步拓宽这项技术的应用空间。

3.1 标准化首先，PCR技术面临的历史任务是解决标准化问题。应该说，定量这一概念的提出为PCR标准化进程迈出了第一步，但这还远远不够。标准化不仅意味着统一的量化形式，更重要的是建立固定、可重复的流程，严谨完备的质量控制体系，一致且具可比性的评估方法。满足这些条件，机器自动化无疑是最好的选择。

3.2 自动化近2O年，检验医学以惊人的速度和规模获得了巨大的发展，其中自动化的迅速发展尤为迅猛，它将传统的人工检测手段提高到自动化检测的新水平，为精确、微量、快速和组合检验提供了有力的保障，自动化已成为临床检验的趋势。PCR扩增的自动化早已实现，因而核酸提取纯化的自动化就显得更为重要。近年来各仪器厂商纷纷推出磁珠法提取仪器，如Roche MagNA Pure LC，利用电磁效应以及纳米级的磁性颗粒进行核酸的分离纯化，其提取效率相比之前的自动化系统有了明显提高[8]。核酸提取纯化与PCR扩增联为一体的自动化检测系统则是临床诊断的趋势，如Handy-Lab公司的Jaguar全自动检测系统。仪器的自动化是临床PCR标准化的最佳选择，自动化程度越高，标准化越容易实现。虽然目前这些仪器以及配套耗材的价格偏高，但并不影响各大医院对这些新生技术平台的接纳。近年来，政府对重大传染病(如乙肝、丙肝、结核等)项目予以资金上的支持，旨在加强这些重大传染病的监控与防治。目前这些仪器设备已进入医院和院方检验的需求进一步磨合，加上生产成本平摊之后，完全取代人工操作的情景必将成为现实。

3.3 高通量(1)绝对通量的提高。过去PCR 由于通量不高而一直受人诟病，不久前挪威公司DiaGenic联合关国ABI公司开发出类似普通生物芯片的Taqman微量液体反应板，让人们看到了PCR微型化并实现高通量的希望[9-10]。该仪器含有384孔独立反应体系，具有良好的灵敏度、特异性和宽泛的动力学范围。

在新的技术平台下，精细繁琐PCR加样的工作将完全由仪器取代，精密度进一步得到改善。另外，新的加样方式进一步微缩反应体系，1块普通的PCR反应板便能同时进行上万个反应，1次即能检遍人体内的多种基因的表达情况。Abgene公司推出的水浴热循环仪PCR一次可完成24块板(96孔、384孔、1 536孔)的PCR，最大通量1次测序反应可达到24×1 536=36 864个样本，真正实现了仪器的高通量。(2)相对通量的提高。相比于那些体积大的高通量仪器，临床实验室更需要一些系统结构简单、体积小、容易实现自动化操作、分析通量高的仪器。如ABI公司推出的StepOnePlus采用了独特的的VerriFlexTM 加热模块，它具有6个独立控制的peltier加热块，相当于6台PCR，为具有优化得到的有不同的退火温度的引物和探针的用户提供了操作的灵活性。

3.4 PCR技术的发展扩大了临床应用(1)应用种类和范围扩展。受益于生物信息学迅速发展，PCR检测的种类和范围也在日渐扩大，从一开始纯粹检测人体中的感染源，到现在检测各种基因的突变缺失，判断病原体的耐药性或人体对于某些疾病的易感性，从而实现个体化用药和治疗[11]。目前已在遗传病的产前筛查、致病病原体的检测、癌基因的检测和诊断、DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证、动植物检疫等方面展现了良好的应用前景。(2)结合其他分子生物学技术扩展。近十年来，PCR技术衍生出许多精细分支，它与免疫学方法、核酸杂交以及测序技术的结合大大丰富了分子生物学的应用领域，目前众多PCR衍生技术和相关技术已应运而生，并在临床上得到广泛的应用，如TaqMan MGB探针技术使得单纯使用PCR技术对单个碱基的突变进行检测成为可能，在临床上可以对疾病相关位点(如耐药位点)进行检测；PCR结合测序技术，测序技术是在产生PCR产物的基础上，一次能获得更多的序列信息，被视为核酸序列研究的“金标准”，特别适用于多个疾病相关位点的检测(如乙肝病毒P区耐药位点检测、EGFR、KRAS等靶向药物耐药突变检测)；单碱基延伸技术(single base ex-tension，SBE)，该技术可对突变位点进行检测，这是很多高通量SNP分型技术的基础。高通量的SNP分型在临床上适用于大量标本的快速检测，如在人群中筛查携带某个疾病相关位点的个体。高分辨熔解曲线技术(HRM)是在PCR体系中加入饱和荧光染料，通过控制体系的温度变化，绘制PCR产物的温度熔解曲线图。依据杂合异源双链的原理，不同的DNA双链由于长度、GC含量、错配性等存在差异而具有不同的温度熔解曲线。该技术特别适用于那些无需确定突变位置和类型的快速筛查，如Kras基因12、13位密码子的任一突变，若使用TaqMan，需要多个反应检测8种基因型，而HRM 只需要检测野生型和非野生型。这些新技术的应用极大地增强了PCR技术对于基因细小差别的分辨能力，将PCR技术精细化的应用潜力提升到了一个新的层面。结语

尽管PCR技术已经进入临床检验领域多年，但当前仍被视为一种辅助的临床诊断方法。不过随着分子生物学理论的快速发展，PCR技术与新材料、自动化科学的结合日益紧密，并融合新的工艺设计，逐渐凸显出以标准化、自动化、高通量以及精细化为代表的几大发展趋势。这些因素不仅为将来的PCR诊断试剂产业的发展预留了广阔空间，而且指明了方向，同时对现有的PCR产品和产业格局提出了挑战和变革要求。综上所述，PCR技术以及相关产业即将在临床检验领域迎来全新的发展契机。

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PCR技术 篇6

摘要:为建立一种利用多重PCR技术检测和鉴定沙门氏菌(Salmonellla spp)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的方法,根据沙门氏菌侵袭力蛋白A基因(invA gene)、单核细胞增生李斯特菌蛋白转录调控基因(prfA gene)、金黄色葡萄球菌自溶素基因(alt gene)、蜡样芽孢杆菌的促旋酶B亚单位基因(gyrB gene)设计引物,进行多重PCR扩增,并对多重PCR反应体系进行优化。在此基础上建立了4种致病菌的多重PCR检测体系,同时以国标法进行对比验证。结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高,具有很好的应用前景。

关键词:食源性致病菌;多重PCR;检测

中图分类号:TS207.4文献标识码:ADOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.06.002

Study and Application on Detection of Four Kinds of Food-borne Pathogenic Bacteria by Multiplex PCR

ZHAO Xin, WANG Yong, LAN Qing-kuo, ZHU Zhu,CHENG Yi

(Central Lab,Tianjin Academy of Agricultural Sciences,Tianjin 300381,China)

Abstract:In order to establish a rapid, sensitive and specific detection method for identification of four kinds of food-borne pathogenic bacteria including Salmonellla spp, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus by using multiplex PCR, according to invasion protein A gene(invA gene)of Salmonellla spp, transcriptional regulatory protein gene (prfA gene) of Listeria monocytogenes, autolysin gene (alt gene) ofStaphylococcus aureus and gyrase B subunit gene (gyrB gene) of Bacillus cereus, four pairs of specific primers were designed for multiplex PCR amplification. The multiplex PCR system and conditions of the amplification were optimized to make four kinds of food-borne pathogens have better amplification results. The results showed that the multiplex PCR method was rapid, specific and sensitive compared with national standard method. The multiplex PCR method developed in this study could provide an informative supplement to conventional microbiological methods for routine monitoring of food.

Key words:food-borne pathogenic bacteria; multiplex PCR; detection

农产品在采集、加工、运输、销售等环节容易受到微生物的污染,因此,微生物检测是农产品及其加工品卫生检测中的一项重要内容,而食源性致病菌检验是微生物检验的重中之重,关系到消费者的生命财产安全[1]。

致病菌是能够引起人类及动物发生疾病、造成生命和财产巨大损失的一群微生物(主要是细菌),其中最为典型的致病菌是沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、空场弯曲杆菌和蜡样芽胞杆菌[2,3],而包括中国在内的许多国家对这些致病菌的检验大多沿用传统的细菌培养及鉴定方法,检验步骤繁琐,检验周期长,同时对于有些细菌仍无法给出正确的鉴定,不符合农产品及加工品现代检测要求[4]。

本研究旨在利用多重PCR技术建立同步检测和鉴定沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌等主要食源性致病菌的快速、简便、灵敏度高的方法,以期克服传统致病微生物检测方法的诸多缺点,得到与国标方法一致的检测结果。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株的选择与培养乙型副伤寒沙门氏菌CMCC(B)50094、单核增生李斯特氏菌CMCC(B)54003、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、蜡样芽胞杆菌CMCC(B)63301均为本室保存。菌株复苏后接种于相应的增菌培养基中过夜培养。

1.1.2主要试剂和仪器PCR引物由上海生工公司合成,Taq酶、dNTP、Mg2+等购自Promega公司,高速冷冻离心机为Backman公司产品,凝胶电泳设备为BIO-RAD Power200及Power1000,PCR扩增仪为Thermo PX2,凝胶成像系统为SYNGENE公司产品。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成根据沙门氏菌invA靶基因、单核增生李斯特菌prfA靶基因、金黄色葡萄球菌alt基因、蜡样芽胞杆菌gyrB的基因序列,设计出扩增这4种致病菌特异性核酸片段的PCR引物,引物设计情况见表1。

1.2.2细菌DNA的提取取过夜菌液2 mL,13 200 r/min离心5 min,弃上清。沉淀中加入567 μL TE缓冲液,30 μL 10%SDS和3 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K,混匀后37 ℃温育1 h。加入80 μL CTAB/NaCl和100 μL 5 moL/L NaCl,65 ℃,10 min。加入等体积氯仿异戊醇混匀,13 200 r/min离心10 min,取上清液加等体积酚/氯仿,13 200 r/min离心5 min,取上清液加0.6倍异丙醇,离心70%乙醇洗沉淀,待沉淀自然风干加50 μL去离子水溶解,备用。

1.2.3多重PCR反应条件的优化分别以4种菌的DNA为模板,对PCR反应条件优化。循环参数为94 ℃预变性7 min,94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环;最后72 ℃延伸7 min。通过预实验发现退火温度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶浓度、dNTPs浓度对PCR结果影响较大,因此,对反应体系中这些重要参数需进行多重PCR优化实验。

1.2.4灵敏性试验将4种菌的DNA做10倍递增稀释,并采用上述PCR方法扩增,观察灵敏度。

1.2.5添加灵敏度实验取经高温灭菌的牛奶样品各6 mL,分别同时接种1,10,100 CFU/mL的4种菌悬液各1 mL,同时以不接种病原菌的牛奶作阴性对照,加入90 mL优化培养基中,30 ℃培养14 h。取2 mL增菌液提取DNA进行多重PCR检验。

1.2.6多重PCR方法和国标方法对样品检测结果的比较对30份生鲜牛乳、30份奶牛场土壤样品及22份市售散装茶叶样品同时应用多重PCR和国标方法进行检测。

2结果与分析

2.1PCR反应条件的优化

以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、单核增生李斯特氏菌的DNA为模板对PCR退火温度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶浓度、dNTPs浓度进行优化。优化后的多重PCR反应条件为:10×PCR缓冲液2.5 μL,Mg2+浓度2.4 mmol/L, Taq酶浓度6 U,600 μmol/L dNTPs。引物浓度为:沙门氏菌80 nmol/L、单核增生李斯特氏菌80 nmol/L、金黄色葡萄球菌80 nmol/L、蜡样芽胞杆菌160 nmol/L。循环参数为:94 ℃预变性7 min,94 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环,最后72 ℃延伸5 min,优化后电泳结果见图1。

2.2灵敏性试验

将供试菌株DNA经10倍梯度稀释后,在上述优化的多重PCR条件下,检测沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌DNA的敏感性分别为3.13,2.88,9.98,24.2 ng,见图2。

M:DL2 000;1～7:沙门氏菌DNA质量依次为313 ng,31.3 ng,3.13 ng,313 pg,31.3 pg,3.13 pg,313 fg;李斯特菌DNA质量依次为288 ng,28.8 ng,2.88 ng,288 pg,28.8 pg,2.88 pg,288 fg;金葡DNA质量依次为99.8 ng,9.98 ng,998 pg,99.8 pg,9.98 pg,998 fg,99.8 fg;蜡样DNA质量依次为242 ng,24.2 ng,2.42 ng,242 pg,24.2 pg,2.42 pg,242 fg

图2 多重PCR检测灵敏度

2.3添加灵敏度实验

应用多重PCR方法进行检测,结果见图3。从图中可以看出,多重PCR检测人为接种沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌的牛奶样品敏感性可达到0.1 CFU/mL,金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌的牛奶样品敏感性可达到1 CFU/ mL,见图3。

1:空白对照;2:阴性对照;3:阳性对照;4～6:牛奶同时含沙门菌、金葡菌、李斯特菌、蜡样芽胞杆菌菌量依次为0.1,1,10 CFU/mL:M:DL2 000

图3 人为接种病原菌牛奶样品的多重PCR检测敏感性

2.4多重PCR法和国标方法对样品检测结果比较

如表2所示,在所检测的82份样品中,国标方法和本研究所建立的方法均检出41份沙门菌阳性、63份金黄色葡萄球菌阳性、12份李斯特氏菌阳性、12份蜡样芽孢杆菌阳性,结果完全一致。

3结论

多重PCR引物设计过程中不仅要考虑其特异性,而且要尽量使多对引物的退火温度一致,并且避免同对引物或多对引物之间形成引物二聚体。本试验在引物设计时使各引物的退火温度保持在53 ℃左右,4对引物之间不存在3′端配对,并尽可能地减少引物之间多个连续碱基的同源性,相对减少了引物二聚体的出现机率[5]。在多重PCR反应中,由于金黄色葡萄球菌扩增片段较大,相对不易扩增,采用降低退火温度、增加循环参数的方法,可有利于大片段引物的扩增[6]。

本研究建立的多重PCR方法将传统方法中大量的生化试验转化为一次性扩增,具有操作简便、快速、灵敏度高等特点,便于批量检测,而常规培养方法需要7 d或更长的时间,不宜大批量操作,因此,使用本方法做样品初筛,结合国家标准或行业标准可大大缩短检测周期,降低检验成本,更加适应公共卫生事件应急处理快速反应的需要,更加符合农产品及加工品现代检测的要求。

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实时荧光定量PCR应用技术综述 篇7

1 实时荧光定量PCR技术的基本原理

实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来, 其基本原理是相同的, 主要不同之处是其定量的体系。在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团, 这些荧光物质有其特定的波长。仪器可以自动检出, 利用荧光信号积累, 实时监测整个PCR进程, 在PCR循环中, 测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个——Ct值 (Threshold Cycle) 概念, Ct值是指产生可被检测到的荧光信号所需的最小循环数, 是PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号, 可以用于定义一个样本的C值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线, 然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率, 所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数 (R2>0.99) , 这样才能认为实验的过程和数据是可信的, 使用这个方程式计算出未知样本的初始模量。实时荧光定量PCR仪都有软件, 可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。

2 实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类

目前, Real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有四种, 也主要有四种方法可用于DNA扩增产物的检测, 这些方法有着相近的灵敏感度。分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。它们又可分为扩增序列非特异和扩增序列特异两类检测。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子, 如SYBR greenⅠ。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法, 在PCR反应体系中, 加入过量SYBR greenⅠ荧光染料, SYBR greenⅠ荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何ds DNA序列的扩增, 不需要探针的设计, 使检测方法变得简便, 同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何ds DNA结合, 因此它也能与非特异的ds DNA (如引物二聚体) 结合, 使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲 (Melting Curve) 分析的软件加以解决。由于SYBR GreenⅠ对PCR有一定的抑制性, 并且荧光强度较低, 稳定性差。近来试剂公司针对SYBR GreenⅠ存在的缺点开发了一些性能改进的染料, 如SYBR GreenⅠ、SYBR Green ER、Eva Green TM等。荧光定量PCR所用到的探针可分为以下几类:内掺式染料、序列特异性探针、特异性引物、阴阳探针。

2.1 SYBR GreenⅠ染料

反应体系中, 加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。其优点是对模板没有选择性, 使用方便, 非常方便, 但也易与容易与非特异性双链DNA结合, 产生假阳性, 可以通过融解曲线的分析, 优化反应条件。

2.2 Taqman探针

目前在real-time Q-PCR中最广泛使用的TagMan系统就是运用了这个原理。它能被DNA合成酶 (例如Taq酶) 的5'-3'活性所降解, 探针的5'端有一荧光报告基团, 3'端有一荧光淬灭基团, 当两个基团相互先靠近的时候, 由于发生能量传递作用, 报告基团不能发出荧光, 但随着扩增反应的进行, 5'端的报告基团随着探针的水解而脱落下来, 不再与淬灭发生能量传递作用, 从而能发出荧光, 被信号探测器所捕获。针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题, 2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针-MGB探针。探针3′端采用了非荧光性的淬灭基因, 吸收报告基团的能量后并不发光, 大大降低了本底信号的干扰。此外, MGB探针的3′端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽, 可以大大稳定探针与模板的杂交, 升高探针Tm值, 使较短的探针同样能达到较高的Tm值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近, 淬灭效果更好, 荧光背景更低, 使得信噪比更高。

2.3 Scorpions

它由两个寡核苷酸分子组成, 一个是引物, 另一个是带荧光分子的探针, 但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连, 在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近, 不发荧光。变性阶段, 探针的发夹结构会解开, 在退火时则与模板相结合, 形成线性分子, 报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。在探针的设计上, 要求绝对保守, 长度为25~32bp, Tm在68~70度之间, 探针的5'端不能为G, 避免多个碱基同时出现, 尤其要避免4个G同时出现, 另外, 探针应靠近上游引物。

2.4 分子信标

分子倍标 (Molecular Beacon) 是一种单链DNA形成的发夹结构, 在其一端有一报告基团, 在另一端有一淬灭基团, 当它形成发夹结构时, 由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近, 两者之间发生荧光信号能量共振转移, 当热循环温度达到分子Beacon的解链温度时, 其构象改变, 与模板结合而完全伸展成线性分子, 使得FRET消失, 报告基团发出荧光信号。荧光基团被激发时, 淬灭作用被解除, 发出激发光子。

3 实时荧光定量PCR技术的实验方法

3.1 RT-PCR

以RNA为起始实验材料。分为两种: (1) 一步法, 反转录反应和PCR反应在同一反应管中进行。操作简单、反应连续、污染几率低, 适合于病原体的检测。 (2) 二步法, 反转录反应和PCR反应分两步进行, 反转录反应液 (cDNA) 作为PCR反应的模板, 适合于mRNA表达量的解析。

3.2 PCR

以DNA材料为起始实验。

4 实时荧光定量PCR技术存在的问题及应用前景

实时荧光定量PCR技术由于具有定量、特异、灵敏和快速等特点, 是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法, 与传统的PCR技术相比, Real-time Q-PCR的不足之处是 (1) 由于运用了封闭的检测, 减少了扩增后电泳的检测步骤, 因此也就不能监测扩增产物的大小; (2) 因为荧光素种类以及检测光源的局限性, 从而相对地限制了实时荧光定量PCR的复合式检测的应用能力; (3) 目前Real-time Q-PCR实验成本比较高, 从而也限制了其广泛的应用。随着技术不断改进和发展, 目前Real-time QPCR已成为科研的主要工具, 使得研究人员又多了一种比较简单且自动化的研究手段, 该技术未来的应用前景是非常广阔的将成为生物定量分析的强有力段。

摘要：实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高灵敏度的核酸定量技术。使用EB加入PCR反应体系, 经改装的带有CCD的PCR仪检测样品的荧光强度, 其优势性决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法, 而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。与传统PCR技术相比, 实时定量PCR能够更加快速、灵敏, 并有效地对核酸进行实时定量检测。

PCR-SSCP技术及其应用 篇8

1 PCR-SSCP原理及实验方法

1.1 实验原理

单链构象多态性是指单链DNA在溶液中形成立体构象, 等长的DNA片段因其序列中核苷酸的组成和排列顺序不同, 形成的构象不同, 在非变性聚丙烯酰按凝胶电泳时表现为电泳速度的差别, 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象, 当有一个碱基发生改变时, 会影响其空间构象, 使构象发生改变, 空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同, 通过非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳 (PAGE) 可以敏锐地将构象上有差异的分子分离开。

1.2 PCR-SSCP的实验方法

1.2.1 PCR扩增靶基因

即聚合酶链式反应, 在试管内短时间里大量扩增样品DNA的生化反应。引物设计是PCR技术中关键的一步其主要要求是:引物长度以20~30bp为宜;引物中G+C比例应达50﹪~60﹪;上下游引物退火温度要保持一致;上下游引物的设计要考虑被扩增的片段长度在SSCP技术可分辨的范围之内, 一般来说在400bp以下[1]。Mg离子浓度、退火温度对扩增的特异性影响也较大。

1.2.1 将特异的PCR扩增产物变性

取PCR扩增产物, 加入上样缓冲液混匀。98℃变性10min后, 迅速插入冰中, 放置10min, 使之保持变性状态。

1.2.3 将适量的单链DNA分子进行非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳

制胶:将梳子插入模板 (玻璃模板必须用蒸馏水洗干净否则在后步拨胶易烂胶) , 使模板向加胶端倾斜, 慢慢加胶, 边加边放端模子以防止气泡形成, 室温放置1h使之凝固, 然后拔掉梳子, 顶部加入1×TBE封闭。

电泳:取PCR产物, 加入变性剂 (95%甲酰胺, 10mmol/LEDTA, 0.02%溴酚蓝) 、石蜡油, 煮沸5min, 取出立刻放入冰浴中8min以上, 再全部上样, 10~15℃ (具体温度依实验而定, 不能太高) 下电泳。开始在200V电压下电泳10min, 然后在120V (电压不能高于120, 否则有可能使条带跑弯) 电泳10h, 取下凝胶, 进行银染。

1.2.4 银染法

染色的方法有3种:可用ErB (溴化锭) 染色、银染或放射性自显影。本文介绍银染法。将凝胶浸入10%乙醇固定5min, 1%硝酸脱色3min, 再浸入2%AgNO3溶液中15min。这些步骤前凝胶必须用蒸馏水清洗1~2次, 然后3%的Na2CO3溶液显色, 直至出现特异带纹, 停显, 加入一定量的蒸馏水或7%的HAc处理即可将停显的凝胶放在摄像平板上, 用凝胶成像系统或数码照相机拍照。

2 优点与缺陷

PCR-SSCP分析法的优点在于:操作简单, 不需要特别贵重的仪器, 技术容易掌握, PCR产物变性后无需特殊处理就可直接电泳;实验步骤少, 周期短﹑最快可在1.5h内给出结果;所用试剂常见, 成本较低;适合于大样本筛查, 在做测序之前采用此法可大大避免盲目测序所带来的工作量, 加快测序速度, 既能分析DNA的多态性, 又可检测DNA片断中的各种突变, 还可应用于基因制图等领域。

缺陷在于:不能识别突变位置;且当碱基转换或颠换不影响DNA构象时检出率较低, 而且突变位点周围序列的变化对SSCP分析结果影响非常小, 检测存在假阴性;用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时, 突变检出率可达70%~95%, 片段大于400bp时, 检出率仅为50%左右, 该法可能会存在1%的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件, 同时该法不能测定突变的准确位点, 还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段, PCR-SSCP对于大于300bp的DNA片段随着长度的增加, 检测的敏感性也逐渐降低。除实验条件的局限之外, 少数突变不能检出可能是由于点突变引起的空间构象变化甚微, 迁移率相差无几, 尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。目前该技术仍不成熟, 在各种报中, SSCP分析所用的各种条件各不相同, 且存在较大分歧, 温度主要影响SSCP条带泳动的速率及其分离的程度, 如18℃下的条带泳动速率明显快于4℃, 甘油对某些条带的泳动有抑制作用。PCR-SSCP对进口的电泳装置和银染标记的依赖, 限制其普遍应用。

3 PCR-SSCP技术的优化

3.1 凝胶浓度以及交联度

丙烯酰胺与N, N'-亚甲双丙酰胺的比例决定交联度的大小, 19∶1、37.5∶1和75∶1的比例分别可得到5%、2.6%和1.3%的交联度。因此, 在配制凝胶至要考虑两个因素:即交联度和凝胶的浓度:最初使用5%的凝胶, 5%的交联度进行SSCP分析。近来多使用较高浓度的凝胶和较低的交联度, 因为后者可检测到更多的突变。在进行SSCP分析时选用的凝胶浓度与待检测DNA片段的长短有关, 不同浓度的凝胶有其具体的检测范围, 具体范围参见Sambrook等著《分子克隆》一书。

3.2 电泳缓冲液浓度

1×TBE电泳缓冲液条带的泳动速率明显慢于0.5×TBE电泳缓冲液。PJ分离物的条带也只有单条带, 无法分开。缓冲液种类有TAE (Tris-乙酸盐缓冲液) , TBE (Tris-磷酸盐缓冲液) , TBE (Tris-硼酸盐缓冲液) , 其中TAE的迁移率和分辨率比TBE、TPE, 都要高, 但其价格较贵[2]。

3.3 电泳温度

电泳温度常采用室温, 但也可在低温 (4℃) 下进行, 恒温极为重要, 可采用恒温板电泳, 电泳以低压长时间效果较好。在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时, 开始的5min应用较高的电压 (250V) 以后用100V左右电压进行电泳。在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压[3]。

3.4 性剂与扩增产物的比例

有2:10、3:9和2:6, 具体比例与具体实验和扩增物浓度相关。

4 PCR-SSCP的应用

PCR-SSCP因为其具有的各种优势已应用于基因突变的鉴定, 遗传病致病基因分析和基因诊断。

4.1 检测和肿瘤发生有关的基因突变

PCR-SSCP方法在对16例肝癌组织、12例癌旁组织和4例正常肝组织的nm23-H1基因的第1、2、4外显子进行突变检测, 结果共有5例发生nm23-H1基因突变。在1例癌旁组织中检测到nm23-H1基因第2外显子纯合缺失;在1例肝癌组织中第1外显子、1例第2外显子, 癌旁组织中2例第2外显子检测到基因突变[4]。SSCP分析已逐渐成为最广泛应用的基因突变筛查技术。

4.2 用于病毒的分型及变异, 监测PCR实验中的污染情况、病原体传播途径的研究

如快速检测我国水稻条纹病毒变异[5], 柑橘衰退病毒 (Citrus tristeza virus, CTV) 是一种广泛分布于世界柑橘产区、能引起柑橘发生柑橘衰退病害的病毒, 我们可以应用PCR-SSCP技术分析我国柑橘衰退病毒的混合感染[6]。

4.3 在对动物遗传育种的研究

有报道表明在猪的LPL基因、第八外显子部分片段、MSTN基因的第二和第三外显子区域、Mu阿片受体基因、PRLP座位、ESR基因和EGF基因等基因座位均存在PCR-SSCP多态性[7~9]。有很多学者对猪的FSHβ亚基位点进行了研究, 结果表明FSHβ亚基基因在二花脸、姜曲海和民猪群体中均存在多态性, 且与产仔数、乳头数显著相关[10], 可以作为对高繁殖力进行选择的遗传标记[11], 这些都是PCR-SS-CP的基因应用。

5 前景展望

PCR-SSCP自问世以来, 在方法学上发生了重大改进, 从而使其在技术上更加完善, 操作上更加简便, 检测的敏感性也得到了不断提高, 但至今无一通用的条件可以使用, 不同学者有各自的“最佳”实验条件。因此PCR-SSCP在方法学上仍需要进一步深入研究, 使其在各类应用领域内发挥更大的作用。现在它已经运用到越来越多的领域, 随着分子生物技术的发展, 其价值和作用将越来越显著。

参考文献

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PCR技术在食品检验中的应用 篇9

PCR技术的基本原理以及特点

PCR技术自20 世纪80 年代诞生以来, 一直在食品安全检测中发挥着不可替代的作用, 该技术是一项DNA体外扩增技术, 被广泛应用于微生物领域。PCR技术基本原理是检测食品中微生物的核酸序列, 即通过高温94℃变性、低温55℃退火以及适温72℃延伸三个步骤大量复制微生物的DNA, 这样在食品中即使有一个微生物存在, 经过PCR技术就可以很快检测出来。PCR技术之所以能够在食品微生物检测领域快速发展, 主要源于其自身的特点。第一, 方便性, 传统的检测食品中微生物的方法一般较为繁琐, 自动化程度不高, 在很多时候需要大量人力的投入, 对于食品检验是非常不便的。但是PCR技术不同, 其仅仅通过三个步骤就能检测出食品中的微生物, 方法简单并且便于操作, 大大提高了机械化程度, 减少了人力劳动。第二, 快捷性, 传统的食品检测方法非常耗时, 有时甚至需要一个星期的时间, 这对于急需得到食品检验结果是不可行的。但是PCR技术由于提高了自动化程度, 加快了食品检测的速度, 可以快捷地得出检查结果。第三, 准确性, 由于之前食品检测的方法需要较多的人为操作, 在这个过程中可能因为人为的失误造成食品源的污染, 大大降低了检测的准确性。但是PCR技术在检测食品过程, 人员参与较少, 大大提高了检测的准确性。

PCR技术的发展历程

随着科技不断进步, PCR技术也在不断进步, 极大提高了食品检测微生物的准确性, 为保证人们的身体健康作出了杰出贡献。第一, 普通的PCR技术, 即最原始的PCR技术, 对于食品中微生物的检测只能够简单检测出食品中有没有微生物的存在, 即使这项技术难以实现精确性, 但是给食品检验发展带来了极大进步。第二, 定量PCR技术, 之前普通的PCR技术只能够检验出食品中是否有微生物的存在, 并不能够准确检验出微生物存在的数量, 定量PCR技术可以实现这一点。第三, 实时定量PCR技术, 该技术即在PCR技术中加上荧光, 这样在检验食品微生物的过程中就可以通过荧光实时检验微生物在食品中的运动过程, 可以对于微生物的运动过程进行分析。第四, 竞争定量PCR技术, 这是检验微生物最有效的核酸定量方法, 在食品样品中增加两种相似模板, 通过一系列反应之后, 产物可以有效地反应两种模板的初始浓度。

PCR技术在食品检验中的应用

PCR技术有着方便性、快捷性、准确性的特点, 使其在检验食品中的微生物时发挥着重要作用, 并且有着巨大的发展潜力。

单核细胞增多症李氏杆菌的检验

对食品中单核细胞增多症的检验, 在过去很难依靠简单的分离技术实现, 但是PCR技术可以快速分离李氏杆菌, 并且耗时短, 一般只需要12 个小时就可以在食品中检测出是否存在李氏杆菌, 并且对于李氏杆菌的检验基本上只需要5 ~ 50 个就可以得出结论。

金黄色葡萄球菌的检验

金黄色葡萄球菌中的毒素可能会引起人类食物中毒, 危害人类身体健康, PCR技术对于这种细菌有着较强的感应性, 可以快速检测出食品中是否存在金黄色葡萄球菌。

顽固性梭状芽胞杆菌的检验

顽固性梭状芽胞杆菌这种病菌经常存在于肉类食品中, 其致病因素主要有两种:毒素A和毒素B。PCR技术根据毒素A的非重复性区段设计了两对特异性引物, 并且根据毒素A的重复区段又设计了另外一对引物。PCR技术可以快速检验出肉类食品中是否存在毒素A, 进而也就可以快速检验出食品中是否含有顽固性梭状芽胞杆菌。

沙氏门菌的检验

沙氏门菌主要会引起肠道不适, PCR技术可以根据其特异性设计出相应的引物, 并且检验的敏感性以及特异性达到了百分之百, 能够快速检验出肉类食品中的沙氏门菌。

虽然PCR技术有着高度的准确性、便捷性等, 在现代检验食品中是否存在微生物有着不可替代的作用, 但是其并不是完美无缺, 仍然存在着许多需要注意的问题, 其中污染问题最为严重。由于PCR技术敏感程度较高, 一旦有外源性DNA的污染, 就可能使得检验结构呈现错误结果。除此之外, 如果PCR技术在检验食品时的实验条件不符合相应要求, 也会对实验结果产生误导。最后, PCR技术对于食品中每一种微生物的检验都需要不同引物, 引物运用错误也有可能使得检验结果不确定, 这些都是亟待解决的问题。

PCR技术 篇10

1材料与方法

1.1 菌株及标本

空肠弯曲菌 (ATCC 11168) 。68份人及家禽粪便样品和34份环境水样品, 42℃微需氧 (微需氧产气袋) 培养24～48 h后, 挑选出11株可疑菌株, 传代培养做PCR检测。

1.2 引物设计与合成[5]

参照中国疾病预防控制中心扩增弯曲菌所用的引物, 由TakaRa宝生物工程 (大连) 有限公司合成 (表1) 。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA

的提取 将1 ml过夜菌液培养物加到1.5 ml EP 管中, 直接水煮沸5～10 min, 4 000 r/min离心3～5 min , 吸取上清。

1.3.2 PCR 反应体系和循环参数

20 μl体系:10×buffer 2 μl , 2.5 mm Dntps 1 μl , 上下游引物各0.4 μl, Taq酶0.6 μl, 水11.6 μl , 加入4 μl模板 。循环参数为94℃预变性5 min, 94℃ 1 min, 52℃ 1 min, 72℃ 1 min, 共35个循环;最后72℃延伸5 min。

1.3.3 PCR检测

用上述引物分别做空肠弯曲菌标准菌株及11份可疑样品PCR扩增, 通过电泳后对产物进行分析。

2结果

2.1 弯曲菌属的PCR检测

用上述弯曲菌属特异性引物扩增空肠弯曲菌标准菌株及11份可疑样品, 结果有7份可疑样品检测到阳性条带 (图1) 。

2.2 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的PCR检测

进一步用空肠弯曲菌的特异性引物MapA和结肠弯曲菌引物CeuE扩增7份可疑样品, 结果从7份样品中检测到3份空肠弯曲菌MapA片段, 4份样品中检测到结肠弯曲菌CeuE片段 (图2) 。

M:DL2000Marker;1:空肠弯曲菌标准菌株;2～12:检测样品

M:DL2000Marker;1, 2, 6:阳性标准菌株;3～5:空肠弯曲菌;7～10:结肠弯曲菌

3讨论

病原菌的分离和检测方法大致经历了传统培养和生化鉴定法、免疫学方法和基因检测等三个阶段。传统培养和生化鉴定法、免疫学方法因繁琐、费时、敏感性低等缺点, 不能适应现代流行病学调查和临床病原菌检测所需的快速、简便的要求。本实验所建立的PCR方法特异性好, 针对弯曲菌属16S rRNA片段设计的一对引物[6], 可以作为弯曲菌属的快速确认方法。同时, 传统的涂片染色、生化鉴定试验至少需要48 h才能鉴别出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌, 笔者针对空肠弯曲菌特有的MapA片段和结肠弯曲菌CeuE片段基因为模板设计的引物, 可以同时检测出空肠弯曲菌和结肠弯曲菌, 而其他弯曲菌和其他细菌都不能扩增出特异性片段。全部实验 (包括PCR扩增、杂交、显色) 可在4～5 h内完成, 具有简便、快速的优点, 且特异性高、敏感性较好, 因此该方法为鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌提供了一种简便的方法。

参考文献

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气肿疽梭菌PCR检测方法的建立 篇11

关键词：气肿疽梭菌；细胞毒素CctA；PCR诊断

中图分类号： S858.23 文獻标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0053-03

气肿疽别称黑腿病，是由气肿疽梭菌（Clostridium chauvoei）引起的以皮下组织和肌肉丰满部位发生气性、炎性肿胀，按压之有捻发音为特征的急性、热性和败血性传染病[1]。病牛是本病的主要传染源，但并不直接传染给健康牛，而是随污染的土壤经饲料或饮水间接进入消化道而感染[2]。其芽孢能在土壤中长期生存，成为持久的传染源。本病一年四季均可发生，尤以炎热干旱的夏季容易发生，严冬则较为少见；呈地方性流行，低温高湿、低湿山谷或低洼地区更易发生[3]。

由于气肿疽梭菌的生长速度和其他梭状芽孢杆菌相比较为缓慢[4-5]，因其与其他梭状芽孢杆菌易发生交叉感染，所以很难从病原学和免疫学的角度对其病原体进行准确检测[6]；因此建立快速高效的检测方法显得尤为重要。近年来，随着生物技术的不断发展，逐步建立了一些新的血清学诊断方法和分子生物学诊断方法。本试验根据气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因设计了1对特异性引物，旨在建立灵敏、准确的针对气肿疽梭菌的PCR检测方法，对已发生气肿疽病的牧场其他个体进行快速、高效的诊断，并广泛应用于临床实践。

1 材料与方法

1.1 试验样本及试剂

试验样本为气肿疽梭菌C54-1标准株；Ex Taq DNA 聚合酶、DNTP、pMD 18-T Simple vector均购自大连宝生物工程有限公司；NI-DL3000 DNA marker购自Newbio industry公司；凝胶回收试剂盒、质粒少量提取试剂盒购自美国Omega生物技术公司；D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌均由延边大学预防兽医学实验室保存。

1.2 引物的设计与合成

根据GenBank上气肿疽梭菌细胞毒素CctA基因序列（登录号：JQ692583.1），用Primer Premier 5.0设计了1对引物P1（5′-CGGGATCCGGTGGGTATTATCAAGC-3′）、P2（5′-CCCTCGAGAGTTCCTTTTGGTGC-3′），由北京新产业公司合成。

1.3 基因组DNA的提取

采用酚-氯仿抽提法提取气肿疽梭菌菌体核酸DNA。

1.4 PCR反应体系及条件

PCR在25 μL反应体系中进行，双蒸水16.25 μL、10×Ex Taq buffer 2.50 μL、DNA模板 2.00 μL、dNTP 2.00 μL和P1、P2各1.00 μL、Eq Taq 0.25 μL，共计25 μL。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，48.8 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.5 PCR产物的回收、克隆及测序

PCR产物50 μL进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收目的条带；将回收产物与pMD 18-T simple vector进行连接，再转化进DH-5α大肠杆菌感受态细胞内，继而接种于含有氨苄抗性的LB固体培养基上，经37 ℃恒温培养12～16 h，挑取单个菌落于含有氨苄抗性的液体培养基中增菌培养，并提取质粒，经PCR和酶切鉴定后将质粒送往上海立菲生物技术有限公司测序。将测序结果与GenBank中气肿疽梭菌ATCC 10092菌株CctA基因进行同源性比较。

1.6 特异性试验

将D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌的DNA按照气肿疽梭菌的DNA浓度稀释，用本研究建立的方法进行PCR扩增，并设阴性对照。

1.7 敏感性试验

提取气肿疽梭菌菌体DNA，测其D260 nm值，将DNA模板按1 ∶ 10比例连续稀释后进行PCR扩增，以此来确定本PCR方法的敏感性。

2 结果与分析

2.1 气肿疽梭菌CctA基因目的片段的PCR扩增

以气肿疽梭菌菌体DNA为模板，经PCR扩增出了大小为501 bp的目的片段（图1）。

2.2 目的基因的序列分析

将测序得到的结果与GenBank中气肿疽梭菌ATCC 10092菌株CctA基因序列（JQ692583.1）进行同源性比较，结果显示，核苷酸序列同源性达99.4%，共存在3处突变（图2），表明该引物适用于气肿疽梭菌的检测。

2.3 特异性试验

分别以气肿疽梭菌、D型产气荚膜梭菌、E型产气荚膜梭菌、腐败梭菌和巴氏杆菌的基因组DNA为模板，按照“1.4”节所述的扩增体系和反应条件进行PCR扩增，并以灭菌去离子水作阴性对照，后经琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果显示，只有气肿疽梭菌扩增出目的条带，而其他均未出现目的条带，表明本试验建立的PCR检测方法具有较好的特异性（图3）。

nlc202309021002

2.4 敏感性试验

取气肿疽梭菌菌体DNA标准品，按1 ∶ 10倍比稀释后，用上述PCR方法进行检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察，结果表明，该PCR最低检测量为12.30 fg/μL（图4）。

3 讨论

气肿疽梭菌是引起气肿疽的病原体，常随污染的土壤经饲料或饮水间接进入消化道而感染[2]，也可经皮肤伤口或通过吸血昆虫叮咬进行传播[7]。该菌的芽孢潜伏期长、存活能力力强，能在土壤中长期生存，可成为持久传染源，故很难从根本上预防和控制本病的发生及流行，这些特性严重制约了

畜牧业的发展。而随着其易感群体的逐渐扩大，气肿疽梭菌也越来越多地威胁到了人类的安全。

目前常用的检测手段存在一定的弊端，病原学检查和免疫學试验都很容易与梭菌属的其他细菌发生干扰，并不能达到良好的效果。与常规检测方法相比，分子生物学方法更有优势，可准确检测低含量的病原菌。

本试验以牛气肿疽梭菌细胞毒素A（CctA）基因为基础建立的PCR检测方法，所获得的序列与GenBank（登录号JQ692583.1）上公布的序列同源性为99.4%，与产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌等病原体无交叉反应，证明其具有很好的特异性；最少可检测到12.30 fg/μL的DNA，证明其具有较好的敏感性；说明本试验建立的检测方法可广泛应用于对临床样本进行快速、高效的诊断，与其他诊断方法相比更适用于气肿疽梭菌的诊断。

参考文献：

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[2]郭洪友，郑 聃. 牛气肿疽病的诊治[J]. 现代农业科技，2010（7）：367，369.

[3]陆安法，徐官红，简廷安，等. 牛气肿疽的防制[J]. 动物医学进展，2003，24（6）：131-131.

[4]白 实，郭宇鹏，李艳华. 敦化地区黄牛气肿疽的防治与诊断[J]. 吉林畜牧兽医，2007，28（6）：38-39.

[5]Kuhnert P，Krampe M，Capaul S E，et al. Identification of Clostridium chauvoei in cultures and clinical material from blackleg using PCR[J]. Veterinary Microbiology，1997，57（2/3）：291-298.

[6]Halm A，Wagner M，Kfer J，et al. Novel real-time PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum in clostridial myonecrosis[J]. Journal of Clinical Microbiology，2010，48（4）：1093-1098.

[7]孙 瑛，雷国云，于林洁. 牛气肿疽诊断与综合防治[J]. 中国畜禽种业，2008（17）：59-60.刘广卿，丁 芳，孙喜云，等. 速生高抗雄性杨的组织培养与快繁研究[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：55-56.

PCR技术 篇12

关键词：实时荧光定量PCR技术,优点与缺陷,应用情况,研究探讨

实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time fluorescent quantitative PCR,Real-time PCR)技术是由美国应用生物系统(Applied Biosystems)公司在1996年推出的。该技术的推出实现了PCR以往只能定性分析而无法定量分析的瓶颈,与常规PCR相比,实时荧光定量PCR技术具有自动化程度更高、特异性更强、能够快速有效解决PCR易污染问题等特点,使得其已在生物技术、医药技术、环境技术等领域得到广泛应用。

1 实时荧光定量PCR技术的原理

在实时荧光定量PCR技术中,它是基于荧光共振能量转移的基础而形成的。荧光共振能量转移的原理是,当一个荧光分子(即分子供体)的荧光光谱的另一分子(即分子受体)和供体荧光团的激发光谱重叠的荧光强度相同的荧光分子是与荧光强度的衰变分子会增加。Ct值表示周期为每个管的荧光信号达到限制值的数目所经历的循环数。实时荧光定量PCR中的Ct值是一个非常重要的因素,C代表循环(Cycle),t代表阈值(Threshold)。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。通过使用已知的初始拷贝数的标准品可做出标准曲线,所以,依据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量存在对应关系,因此只需对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值,获得的荧光信号的值可以从项目的拷贝样品数的标准曲线来计算。

相比于常规PCR,实时荧光定量PCR用于改变在荧光信号的实时监测PCR反应的扩增产物的过程中循环,模板的初始量可以定量分析。简言之,实时荧光定量PCR技术的基本原理增加样品核酸由相同的系统和反应条件的指数扩增,正比于产品的对数扩增样品的DNA含量,因为该系统的用于着色或传播的响应结合的荧光标记(荧光探针)的荧光的光产率正比于所用的核酸样品的量进行检测的扩增产物的量就可以通过荧光的量来确定[1]。

2 实时荧光定量PCR技术的优势与缺陷

2.1 实时荧光定量PCR技术的优势

与传统的PCR技术相比,实时荧光定量PCR技术有了更多的改进之处,具体如下[2]:

(1)实时荧光定量PCR实现了核酸的定量化研究,极大的扩展了PCR技术在各个领域的应用;

(2)实时荧光定量PCR技术的核酸对于检测目标核酸具有很高的灵敏度:科尔布(Kolb)等[3]使用实时荧光定量PCR技术来检测环境中的甲烷氧化细菌(Methane oxidizing bacteria)的数量,检测极限能够实现10 cells/样品[4];

(3)实时荧光定量PCR技术可以在一个大范围内的检测目标核酸数量,简便快捷:对靶DNA的实时荧光定量PCR的标准曲线,通常可以超过7个数量级以上;

(4)实时荧光定量PCR技术安全性高:在样品的定量检测在PCR反应完成后,没有进一步的后续处理,减少了工作量,以除去使用的溴化乙锭(ethidium bromide,EB)等诱变风险的过程。

2.2 实时荧光定量PCR技术的缺陷

实时荧光定量PCR技术是一种高效,灵敏,安全的分子生物学手段,已经成为主流定量核酸的技术之一,但此技术还不是很成熟,在使用过程中还存在一些缺陷,具体如下[1,2,3]:

(1)核酸荧光标记是无法客观地区分目标核酸和非目标核酸的,这会对实验结果的准确性有一定的影响;

(2)标准曲线制作过程是非常复杂的,目前还没有统一的标准方法,这将在一定程度上使得研究人员对各种调查结果缺乏可比性;

(3)许多一定数量的核酸在体内的拷贝数不明确,目前的大多数研究是基于平均份数进行评估,其精度是可疑的;

(4)设计荧光探针和分子信标是十分复杂的技术,目前在我国还没有广泛的应用基础;

(5)实时荧光定量PCR技术所需的基本实验条件和实验费用都相比普通PCR有着较高的要求[3]。

2.3 实时荧光定量PCR技术的应用

实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究的各个领域。大量的资料显示,荧光定量PCR技术已经被广泛应用于环境领域。Tay[4]利用特异性16S r DNA引物扩增自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)和分枝杆菌(Mycobacterium)两种甲苯降解菌来检测环境微生物在河流随季节的变化情况。Grüntzig V[5]通过对反硝化亚硝酸盐还原酶基因(nir S)的定量来研究施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)种类的丰度,说明了该种微生物不是海底的主要反硝化微生物。Vaitomaa J[6]利用实时荧光定量PCR技术对湖泊中微囊菌和项圈藻微囊藻素合成酶E拷贝数进行定量,表明湖泊中主要的微囊藻素是微囊菌产生的。Cummings[7]利用荧光定量PCR技术对沿湖泊重金属污染浓度梯度中的还原铁离子泥土杆菌(Geobacteraceae)家族的丰度进行了定量,发现分布相对均匀,泥土杆菌家族的分布基本与重金属离子浓度的影响无关。Hall S J[8]通过采用荧光定量PCR技术对污水处理厂的活性污泥中的Nitrospira spp进行了监测和定量分析。Harms G[9]通过荧光定量PCR对城市污水处理厂MLSS中的硝化螺菌(Nitrospira)和氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)的总量进行了定量监测。

在国内荧光定量PCR技术在环境领域的应用也是越来越广泛。李光伟等[10]通过实时荧光定量PCR对五氯苯酚(Pentachlorophenol,PCP)好氧颗粒污泥中氨氧化细菌的定量分析进行监测,研究表明五氯苯酚对氨氧化细菌的数量影响不大,并且氨氧化细菌的数量与氨氮的去除率无直接关系。李磊等[11]通过实时荧光定量PCR对A2/O短程硝化反硝化系统内的氨氧化菌进行了定量分析,结果表明随着亚硝酸盐积累率的上升,系统内氨氧化细菌的数量也在大幅度上升并且亚硝酸盐积累率的下降相对于AOB菌群数量的下降有一定的滞后性。谢润欣等[12]对城市污水中病原性大肠埃希氏菌毒力基因eae A和rfb E进行实时荧光定量PCR检测,表明污水二级处理对这两种毒力基因的去除效果明显。李晓岩等[13]利用荧光定量PCR检测腺病毒气在大气中的相对基因拷贝数,表明重组腺病毒气溶胶主要分布在采样器的第五级,腺病毒气溶胶与粒子相比较大。何恩奇等[14]利用荧光定量PCR方法对产毒微囊藻mcy A基因进行了定量的分析,实现了产毒微囊藻的快速定量监测分析。

3 结语