玉米蛋白多肽（共6篇）
玉米蛋白多肽 篇1
一氧化氮 (nitric oxide, NO) 广泛分布于生物体内各组织中, 是一种新型生物信使分子, 在体内是依赖于一氧化化氮合成酶 (nitric oxide synthase, NOS) 生成的, 具有脂溶性, 不需要任何中介机制, 可快速透过生物膜扩散, 将一个细胞产生的信息传递到它周围的细胞中, 在心脑血管、神经、免疫调节等方面有着十分重要的生物学作用, 1992年被美国《Science》杂志评选为明星分子[1]。NO是一种极不稳定的生物自由基, 分子小, 极易参与传递电子反应, 参与机体的氧化还原过程[2]。玉米蛋白多肽是生物活性肽的一种, 是以玉米蛋白粉为原料加工而成的、分子质量一般在2 000 u以下的一种生物活性多肽[3,4]。鉴于此, 研究以鹅为研究对象, 通过在鹅日粮中添加不同水平的玉米蛋白多肽, 检测其不同生长阶段血清中的NO水平, 从而探讨NO对鹅的影响, 以便为玉米蛋白多肽作为鹅饲料添加剂提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 试验动物及分组
选取1日龄昌图豁鹅240只, 在沈阳农业大学鸡场舍饲, 采取单因子完全随机设计, 按照公母各半的原则随机分为4组, 即对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组, 每组设6个重复, 每个重复10只, 舍饲, 自由采食和饮水。
1.2 试验日粮
试验日粮:对照组饲喂基础日粮 (由禾丰牧业股份有限公司提供) , 低、中、高3个剂量组分别在每千克基础日粮中添加玉米蛋白多肽[中食 (山东) 生物技术有限公司生产]100, 300, 500 mg。
1.3 测定项目与方法
分别于鹅30, 60日龄时, 各组随机抽取8只鹅进行采样。采样前禁食12 h (自由饮水) , 然后颈静脉采集血液制备血清, 并用紫外可见分光光度计 (HITACHI U-1800) 法测定豁鹅血清中NO的含量, 具体步骤按照试剂盒说明书操作。
1.4 数据处理
数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析。
2 结果与分析
鹅不同阶段血清中NO含量的检测结果见表1。
注:同列数据肩注小写字母相同表示差异不显著 (P>0.05) , 不同表示差异显著 (P<0.05) ;大写字母不同表示差异极显著 (P<0.01) 。同行数据肩注**表示差异极显著 (P< 0.01) 。
由表1可见:饲喂添加玉米蛋白多肽的饲料30天时, 3个剂量组鹅血清NO含量均高于对照组, 且中剂量组>低剂量组>高剂量组;60天时, 3个剂量组均低于对照组, 且低剂量组>中剂量组>高剂量组, 但各组间比较差异均不显著 (P>0.05) 。说明短期添加玉米蛋白多肽可以增加鹅血清中的NO含量, 并以中剂量水平作用最为明显;但较长时间添加则会降低其含量, 以高剂量水平作用最为明显。2次采样比较, 各组NO含量均表现为30天时大于60天;对照组2次采样比较差异不显著 (P>0.05) , 各剂量组间均差异极显著 (P<0.01) , 说明随着鹅日龄的增加, 血清NO含量有下降的趋势, 而玉米蛋白多肽的添加加速了这种趋势。
3 讨论
NO作为一种生物信使分子, 在心脑血管、神经、免疫调节等方面有着十分重要的生物学作用[1]。由于它是一种极不稳定、反应性极强的生物自由基, 分子小, 极易参与传递电子反应, 参与机体的氧化还原过程[2]。分子的配位性又使它与血红素铁和非血红素铁具有很高的亲合力, 以取代O2和CO2的位置。据报道:血红蛋白-NO可以失去它附近的碱基而变成自由的原血红素-NO, 这就意味着自由的碱基可以自由地参与催化反应;自由的蛋白质可以自由地改变构像;自由的血红素可以自由地从蛋白中扩散出去, 这三种变化中的任何一个或它们的组合, 都在鸟苷酸环化酶的活化过程中起重要作用[3]。
另外, NO也是一种自由基清除剂, 适量水平的NO可中和超氧阴离子, 减轻其毒性, 但过量的NO可与超氧阴离子起协同作用, 加重其毒性[4]。本试验结果表明, 短期添加玉米蛋白多肽可使鹅血清中NO含量明显增加, 但是否达到过量水平而致毒尚有待考证。有研究表明, 当体内内毒素或T淋巴细胞激活巨噬细胞和多形核白细胞时, 能产生大量的一氧化氮合酶 (NOS) 和超氧化物阴离子自由基, 从而合成大量的NO和H2O2, 这在杀伤入侵的细菌和真菌等微生物、肿瘤细胞、有机异物及在炎症损伤方面起着十分重要的作用[5]。而经激活的巨噬细胞释放的NO可以通过抑制靶细胞线粒体中三羧酸循环、电子传递和细胞DNA合成等途径, 发挥杀伤靶细胞的效应[2]。另有研究表明, 在生物体内, 与NO有关的自由基和化合物有数十种, NO及其相关产物相互反应, 在机体内生成一系列具有重要生物功用的自由基和硝基化合物, 即所谓的生物活性氮[6]。
近年来的一些研究表明, NO具有抗脂质过氧化和脂蛋白氧化修饰的作用[7]。Morishita研究发现, NO能促进血管平滑肌细胞的凋亡, 减少平滑肌的生成和血管重构, 减轻动脉硬化;并观察到NO使血管舒张, 抑制细胞增生及黏附作用, 及产生抗氧化还原反应, 减缓动脉硬化进程。因此, 在本研究中, 日粮中添加一定水平的玉米蛋白多肽, 可以通过增加鹅血清NO含量而加强机体的抗氧化能力;但是较长时间添加则降低NO含量, 且添加剂量越高这种作用越为明显。这一现象具体是通过哪种NOS作用或者其他途径实现的, 有待考证。同时本研究还发现, 随着鹅日龄的增加, 血清NO含量有下降的趋势, 而玉米蛋白多肽的添加加速了这种趋势, 这可能跟鹅机体内不同NOS表达有关, 具体原因有待进一步试验验证。
4 结论
总之, 随着日龄增加鹅血清中NO含量有降低的趋势;一定时间内 (30 d) , 日粮中添加一定水平的玉米蛋白多肽可以增加鹅血清中NO的含量, 但添加时间过长 (60 d) 则会降低NO含量。
参考文献
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多肽尿素在玉米上应用效果 篇2
1 试验材料与方法
试验地土质为白浆土, 地势平坦, 土壤肥沃, 排水良好, 播前土壤基础肥力为碱解氮46.1mg/kg、铵态氮9.5mg/kg、硝态氮71.7mg/kg、速效磷70.5mg/kg、速效钾199.2mg/kg, 有机质含量3.57%, pH值为6.15, 耕层30cm, 秋整地、秋起垄。前茬作物是玉米, 施肥水平是尿素50kg/hm2、磷酸二铵160kg/hm2和钾肥70kg/hm2, 拔节期追肥200kg/hm2, 施肥方式是机车播种侧深施肥。2014年气候特点:当年气候条件适合玉米生长, 无明显的灾害性天气。
试验材料:供试玉米品种为绿单1号, 公顷保苗6.5万株。供试肥料:多肽尿素由浩化分公司提供, 含纯N46%;普通尿素、磷酸二铵、钾肥由当地提供, 普通尿素含纯N46%, 磷酸二铵含纯N18%、P2O546%, 氯化钾含K2O60%。
采取小区试验, 随机区组排列, 3次重复, 小区6行区, 10m行长, 68cm垄距, 每小区面积40.8m2。上年秋季整地, 2014年5月19日采用人工开沟侧施肥穴播, 播后及时镇压。5月24日播后苗前封闭除草, 90%乙草胺2.5kg/hm2+38%莠去津3.75kg/hm2+宝收50g/hm2, 6月14日间苗, 6月21日中耕, 该年份气候正常, 不需灌溉, 7月1日按试验要求进行人工追肥一次, 7月30日和8月12日人工拿大草两遍。10月5日取样, 按子粒水分14%计产, 每小区收一垄6.8m2。
试验共设4个处理, 处理1为100%多肽尿素试验, 尿素换成等氮量的多肽尿素, 均用多肽尿素, 施肥量及施肥习惯同对照;处理2为90%氮肥试验, 多肽尿素施入时期同对照, 均用多肽尿素, 用量为对照施肥量的90%;处理3为80%氮肥试验, 多肽尿素施入时期同对照, 均用多肽尿素, 用量为对照施肥量的80%;处理4为对照, 采取常规施肥, 基肥是普通尿素80kg/hm2、磷酸二铵175kg/hm2、氯化钾66.7kg/hm2, 拔节期追施普通尿素200kg/hm2。
2 试验结果与分析
从试验结果可以看出, 玉米使用多肽尿素的处理, 生育期无明显变化。但各处理穗长分别较对照有不同程度的增加;从百粒重上看, 处理1、2较对照分别增加0.6g和1.5g, 处理3与对照持平;从粒重上看, 处理1、2、3较对照分别增加7.5、6.6、1.4g;处理1、2、3较对照公顷分别增产450、396、141kg;处理1、2、3与对照相比, 增产率分别为4.2%、3.7%、1.3%。
3 小结
玉米蛋白多肽 篇3
贵德黑裘皮羊, 原名贵德黑紫羔, 主要分布在青海省贵南县的黑羊场和塔秀乡的达龙村, 是青藏高原的一个特殊畜种, 曾以生产二毛球皮而驰名省内外[2]。
1 材料与方法
1.1 血液的采集
供试羊, 来自青海省贵南县黑裘皮羊场, 颈部乙醇消毒后, 采集血液5~10 m L (加入0.1%肝素钠) , 冰冻运回实验室。4 000 r/min离心30 min, 取上层血清分离, 置于2 m L EP管中冷冻 (-20℃) 保存, 备用;下层红细胞用3倍体积的0.85%Na Cl溶液洗涤, 4 000 r/min离心10~30 min, 弃上清液, 重复洗涤3次, 加入与红细胞等体积的纯化水及少量氮仿剧烈搅匀5 min, 4 000 r/min离心1.0~1.5 h, 取上层清亮液 (红细胞溶血液) , 装于消毒的青霉素小瓶中, 冰箱内冷冻 (-20℃) 保存。
1.2 电泳测定条件 (见表1)
1.3 数据的统计分析
每个座位基因杂合度群体内某一位点的杂合度 (h) =1- (∑Pi) 2, 平均杂合度 (H) =∑hj, 有效等位基因数 (Ne) =1/ (∑Pi) 2, Nei氏标准遗传距离、遗传距离和遗传相似系数的计算参照参考文献[3]。Ne、Nei氏遗传同质度 (I) 和标准遗传距离 (D) 参照参考文献[3-4]。
2 结果与分析
2.1 基因及基因型频率 (结果见表2~4)
由表2~4可知, 贵德黑裘皮羊 (G) 、青海白藏羊 (Q) 、欧拉羊 (O) 在Hb、Tf、Es基因座上存在丰富的多态性, 其中Hb和Es位点受1对等位基因控制, 共构成3种基因型, 均以Hb B基因为优势基因型。研究中, Hb A的基因频率变化是欧拉羊>贵德黑裘皮羊>青海白藏羊, 分别为0.437 5, 0.342 6, 0.250 0;而Hb B的基因频率变化是青海白藏羊>贵德黑裘皮羊>欧拉羊, 分别为0.750 0, 0.657 4, 0.562 5。Tf位点在贵德黑裘皮羊群体中共检测出Tf AA、Tf BB、TfCC、Tf AB、Tf AC、Tf CD、Tf BC、Tf AD、Tf BD 9种表现型, 受Tf A、Tf B、Tf C、Tf D 4个共显性等位基因控制, 以Tf AC、TBB基因型占相对优势, Tf B为相对优势基因, 基因频率为0.499 8, 只检测出最常见的等位基因和基因型。而在青海白藏羊和欧拉羊中只检测出Tf AA、Tf BB、Tf CC、Tf AB、Tf AC、Tf BC 6种表型, 以Tf AB、Tf CC基因型占相对优势, Tf B和Tf C为相对优势基因, 基因频率分别为0.375 0, 0.325 0, 受Tf A、Tf B、Tf C 3个共显性等位基因控制。Es位点:在被检测的3个群体中, Es均出现Es++、Es+-和Es--3种表现型, 受1对共显性等位基因Es+和Es-控制, 贵德黑裘皮羊的优势基因型和优势基因为Es--和Es-, 基因型频率和基因频率分别为0.460 0, 0.650 0, 青海白藏羊的优势基因型和优势基因均为Es+-和Es-, 基因型频率和基因频率分别为0.425 0, 0.526 2, 而其他基因座上均呈现单态。
2.2 Hardy-Weinberg平衡的检验
对3个群体的血液蛋白质 (酶) 多态位点进行Hardy-Weinberg平衡状态分析, 结果见表5。
注:χ2=8.600 0, P=0.014 00 (<0.017 00) , *表示差异显著。
由表5可知, 这些群体的各血液蛋白质 (酶) 多态位点平衡状态不一致, 3种羊间Hb位点基因型频率间差异极显著 (χ2=1.013 6, P=0.034 00) 为高度不平衡位点, 经两两比较贵德黑裘皮羊和欧拉羊基因型频率间差异显著 (χ2=8.600 0, P=0.014 00) 为不平衡位点, 贵德黑裘皮羊和欧拉羊及青海白藏羊和欧拉羊基因型频率间差异不显著 (P>0.05) , 为平衡位点。在Es位点中, 经检测均为平衡位点, 3个品种差异不显著。
2.3 多态蛋白位点变异程度分析
2.3.1 有效等位基因数、多态座位百分数
结果见表6。
由表6可知, 贵德黑裘皮羊和青海白藏羊、欧拉羊的有效等位基因数分别为1.036 8, 0.979 6, 1.138 6;多态座位百分数均为43%, 说明各绵羊群体内均具有一定的遗传变异, 欧拉羊的有效等位基因最大, 欧拉羊的遗传变异最大, 其各品种的遗传变异相对较低。
2.3.2 平均杂合度
结果见表7。
由表7可知, 3个被检测品种中, 贵德黑裘皮羊和青海白藏羊与欧拉羊的品种内遗传变异较大, 其平均杂合度分别为0.223 1, 0.224 3, 而欧拉羊则为0.235 2。
2.3.3 Nei氏遗传同质度和标准遗传距离
一个群体在同一位点上各等位基因频率不同于其他群体在这一位点的等位基因频率, 其差异大小即构成群体间的遗传距离。根据遗传距离的大小可以确定品种间亲缘关系的远近, 为杂交利用提供最佳组合方式。遗传相似性的含义是指两群体各基因位点等位基因相同的概率, 它反映了不同群体间的亲缘关系, 遗传相似性越大, 两群体的亲缘关系越近;反之遗传相似性越小, 则群体的亲缘关系越远。经检测, 贵德黑裘皮羊和青海白藏羊之间的遗传距离最近, 它们与藏系绵羊的遗传距离较近;而与欧拉羊的遗传距离均较远, 这些群体的聚类结果与它们形成的地理环境及育成历史基本相符。贵德黑裘皮羊、青海白藏羊、欧拉羊品种的平均杂合度相对变异均较小, 其值分别为0.223 1, 0.224 3, 0.235 2。3个群体的Nei氏遗传同质度和标准遗传距离, 见表8。
2.3.4 不同品种间的遗传关系及聚类分析
结果见图1。
3 讨论
绵羊血液蛋白质 (酶) 多态性受几对等位基因的控制, 呈简单的孟德尔式遗传, 广泛应用于阐明绵羊品种的起源、品种间的亲缘关系、进化及驯化, 查清绵羊畜群的遗传潜力, 探明了它与生产性能、繁殖力、抗病性、生态环境适应性的关系, 因此它可以作为畜禽的一种有用的遗传标记, 在动物育种中作为一种辅助手段。应用血液蛋白质 (酶) 多态性对家畜生产性能进行选择虽然已经进行大量工作;但还停留在研究阶段, 至今未能应用于育种, 主要存在一些问题未能解决, 如已发现的标记性状是否具有代表性, 与其他重要经济性状之间有没有负相关存在等。因此, 单纯对血液蛋白质 (酶) 多态性进行研究远不能满足家畜育种的需要, 必须将生化标记渗透到分子遗传领域, 对其进行更深入的探讨, 才能充分发挥作用。有关应用血液蛋白质 (酶) 多态性分析品种或品系的遗传结构进行杂种优势估测方面已有不少探讨和研究, 有较好的发展前景, 但数量较少时可能导致基因频率偏离, 影响可信度。总之, 血液蛋白质 (酶) 多态性在家畜育种中有良好的应用前景, 但要真正有效地应用于家畜育种, 还需要做许多工作, 在研究的方向、方法、手段和观念上还需要进一步改进[5]。
参考文献
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玉米蛋白多肽 篇4
1 药代相关动力学影响
引入聚乙二醇基团后药物分子大小提升, 其相关物理化学性质也会发生变化, 主要体现在结构组成、水溶性、等电点、亲电性等方面。最终蛋白多肽类药物在人体内的代谢机制发生微变, 亦影响药物类分子和受体细胞之间结合, 进而造成药物相关药代动力学变化。
1.1 吸收
导入聚乙二醇基团后的蛋白多肽类药物的血管给药过程无明显变化。药物分子进入机体后不先吸收, 而是直接进分散和消减。血管外的给药过程恰好与之相反, 先吸收掉接着分散消减。
据相关研究显示, 蛋白多肽类药物IFNα-2a的正常吸收半衰期为2.3h左右, 一旦导入聚乙二醇基团后变为50h左右。在机体内达一次血药峰值过程为80~100h左右, 体现了其持续性缓慢作用的特征。其机制为: (1) 分子量提升随之带来渗透作用过程弱化; (2) 导入位点为活性基团, 防止了酶的水解作用。除此之外据相关数据来看, 血管外给药后, 导入聚乙二醇亦会影响蛋白多肽类药物分子相关生物学活性。把导入聚乙二醇的SOD分别以三种方式皮下给药、腹部给药和肌肉给药作用于实验大鼠机体内。数据表明, 同正常条件的静脉注射相比, 导入聚乙二醇后的SOD在以上各条件下最终的生物学活性为71%、54%以及29%。另外正常的SOD在同样方式下生物学活性只为导入聚乙二醇后的SOD的约1%。近来有数据表明, 导入聚乙二醇修饰也会帮助口腔入药吸收, 例如当某蛋白多肽类药物连上几条高分子量的PEG后, 肠道处检测到的吸收比率明显呈提高趋势。
蛋白多肽类药物在导入聚乙二醇之后, 如果静脉给药, 数据显示药物分子在人体内首先通过四周组织扩散。其分布的具体方式一般它分子自身和机体共同决定。另一方面, 机体与药分子间还存在一定的物理作用力, 也是一个因素。
1.2 排泄与消除
药物排泄与消除方式一般为几种情况, 酶作用、肾功能作用、肝功能作用、免疫代谢作用以及人体自身相关降解作用。
聚乙二醇修饰的作用分子点一般为亲核性活泼基团, 由于聚乙二醇自身分子的亲电性, 两者相互作用后可防止水解作用。另一方面, 聚乙二醇可在药物表面与水分子相作用, 类似一层水分子保护层。以上方面是提升蛋白多肽类药物分子在机体内作用时间的主要缘故。
2 导入聚乙二醇后的生物学活性
PEG化对药物蛋白来说具有提升稳定性、延缓半衰期、减弱抗原性等作用。另一方面, 蛋白多肽分子中导入聚乙二醇基团后会在一定程度上造成其活性消减。机制是药物分子、聚乙二醇及其之间相互化学键的缘故, 除此此外, 导入作用的条件、相关过程中的副产物亦有影响。药物分子种类不一样, 其作用亦随之变化, 这体现在导入聚乙二醇基团具体过程的复杂多变。每一种药物分子都有相应最佳的作用方式。主要研究内容是修饰剂种类以及作用过程的条件。现今涉及到的主流探索方向多集中于导入作用目标数以及导入的聚乙二醇基团大小。实际操作观察中显示, 从导入的聚乙二醇活化一直到整个作用过程的所有方面会产生不同程度的影响。故此考虑一种修饰剂是否合适时务必全面的分析它的自身稳定性、相关活性、作用位点、化学键和抗原性等特点。
2.1 修饰反应条件
对热敏性蛋白的修饰要在低温下开展。酸碱度条件亦是作用过程一敏感因素。通常, 采取变换聚乙二醇分子与受体分子的式量比与pH值即可快捷得出相应合适的实验条件。以液相条件下导入聚乙二醇基团来看, 药物分子与聚乙二醇的摩尔比通常为1∶3~5;pH 6~7;反应温度4~8℃;时间8~16h。接下来用冰乙酸改变pH到4左右, 反应随之结束。另外, 导入成功的与未导入的药物分子可采用增加缓冲液体系下盐的成分浓度来达到分离目的。
2.2 聚乙二醇式量及数目
导入支链结构的聚乙二醇后会减缓作用药物分子在肾组织中的作用过程。增加作用的聚乙二醇数目, 亦导致半衰期增加。药物种类不同, 作用程度亦差异化。
基因工程的持续探索进展使得更多具有活性的生物分子被研究出来, 关于蛋白多肽类药物最大生物活性和相关引起不良反应的研究课题也渐渐发展起来, 故此, 导入聚乙二醇进行的改良工作刻不容缓。其研究方向大致有: (1) 寻找各方面性能更加优良的修饰剂; (2) 探索最佳修饰条件;3.制定更加理想全面的分析检测方案。
3 PEG衍生物
在蛋白多肽类药物中导入聚乙二醇基团一般要求条件温和。初代的聚乙二醇衍生物常常选择活化其结构末端位置羟基, 导入到药物分子中后选择性的与α或者ε位氨基相结合。在研究初期其取得重大突破, 不足的是修饰过后药物抗原性及半衰期变化不明显, 且易引起蛋白质多肽的交联团聚, 另外不足的是相互作用产生的化学键往往不太稳定, 目标选择性不是很好。第二代的聚乙二醇药物则表现更加优良。
3.1 作用于氨基的聚乙二醇药物
(1) 烷基聚乙二醇化药物:经还原剂还原之后, 可以选择的和药物一端的α-氨基相作用。从伯胺在一定条件下转变成仲胺, 这样过程的作用键稳定性以及选择性都表现较好。聚乙二醇和蛋白多肽上的残基结合由残基自身的亲核性决定。在药物体系pH值不低于选择位点残基的pKa条件下, 相互作用发生率高。导入聚乙二醇基团后的丙醛在体系约pH为5时可选择性地和多肽药物分子最末端α-氨基相作用成稳定性较高的连接键。聚乙二醇化乙醛稳定性不高, 常常缩合作用生成缩醛存在。 (2) 酰基聚乙二醇药物:Veronese的研究表明, 酰化聚乙二醇衍生物引进亚甲基之后能够影响其反应的活性。比如导入聚乙二醇基团后有三个亚甲基团的SBA在pH 8和温度为25℃时, 检测半衰期为23min;而只有2个的聚乙二醇化的SPA在以上情况下的半衰期数据较短, 为16min。数据显示, 氨解选择性也随pH越高而增加。
初代聚乙二醇化SS是一种普及性最高的修饰剂, 它的骨架存在酯键作用力, 所以在机体内很容易水分解, 除此之外残留的酯片段分子也存在一定程度的免疫作用。第二代的聚乙二醇化衍生物诸如聚乙二醇SPA和聚乙二醇SBA, 它们的结构中没有酯键, 故能够与蛋白多肽类药物分子作用成稳定性较高的化学键。Somavert通过采用聚乙二醇SPA 5000Da提升了治疗肢端肥大药物的相关药动学参数。
导入聚乙二醇基团的NHS是一种功能单一的修饰作用剂, 只有唯一一个作用位置。正常情况下它基本无法穿过药物分子的空间。分枝型的空间构成直接导致相互作用的空间位阻变大, 延长了相互作用过程。
3.2 硫基聚乙二醇衍生物
硫基团在相关药物构成中一般的比率不是较低。不过位点少变化, 故此也存在对某些对无关相关生物活性且活性化的硫基来导入聚乙二醇基团的可能性, 有定点优势。除此之外, 某些无活泼的硫基也可通过生物工程手段在无明显影响的位点导入游离的活性基团之后再导入聚乙二醇。
与硫基作用的聚乙二醇类药物有多种, 其中以聚乙二醇MAL在实际中比较普遍。一定条件下, 它和硫基相互作用成稳定性较高的硫醚化学键。不足之处在于其易水解形成开环。另一种作用剂PEG-VS在弱碱性体系下, 经一定时间作用后有稳定性相对更高的硫醚化学键产生, 整个过程随着碱性增强而更易作用。聚乙二醇IA的亲核取代作用与药物分子生成的硫醚化学键更加不易断裂。其可取之处在于强酸条件下水解后可快捷检测。作用过程有一点需考特别虑避光条件, 防止分解游离出碘。遇酸碱能够和药物分子特异性作用成二硫键的聚乙二醇吡啶二硫, 它和药物分子的结合物在机体内易水解, 这种作用帮助活化药分子。
3.3 其他
除以上之外还有一些如修饰羧基的聚乙二醇衍生物, 分支状聚乙二醇衍生物, 修饰精氨酸的聚乙二醇衍生物等。
除了线型构型的聚乙二醇分子之外, 实际中还存在不少分支链状构型的聚乙二醇的衍生物。这一类物质是由两个线型化构型的聚乙二醇和作用剂的结构中其中两个基团相互作用而生成, 剩下的第三个的活性基团和药物分子相互作用。此过程在机体代谢过程中起到保护药物分子作用特点。聚乙二醇化的1, 3-二氧代衍生物能够和蛋白多肽类药物分子上的精氨酸基团相互作用成化学连接键, 不足在于作用过程过于缓缓, 生成的产物在相对稳定性方面表现不太好, 选择性亦欠缺。除此之外, 其他一些氨基酸诸如组氨酸与赖氨酸等亦可与之相互作用, 但就目前来看, 此类探索的相关数据还比较少。
4 结束语
聚乙二醇由于其在蛋白多肽类药物修饰方面的优良特点被广泛的研究, 目前聚乙二醇修饰探究的新方向大多集中在:改良聚乙二醇基团与各类蛋白多肽类药物分子相互作用后生成的化学键的相对稳定性;聚乙二醇分子上合适的未被发现的具有生物活性的位点;防止作用中中药物失活的新连接方式等。伴随着时代的日新月异化发展, 相关辅助手段更先进, 聚乙二醇修饰研究也越来越快的在发展着, 市场上也能见到越来越多的此类药物, 而且能够看到, 这种快速的趋势亦将越来月明显。
摘要：对于蛋白多肽类药物来说, 在其上导入聚乙二醇基团是一种改良相关生物、物理化学性质的重要方式。目前比较热门的研究方向大多集中在相关药代动力学、生物学活性影响等方面。
关键词：聚乙二醇,蛋白特性,影响
参考文献
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玉米蛋白多肽 篇5
鸡卵清蛋白是主要的日常食用的蛋白,与其他蛋白相比它通常认为是“完美”的蛋白。在过去二十年间,对其抗高血压活性的研究较多[1,2]。已有体内体外实验证实其抗高血压活性,并分离纯化出了一些抗高血压的多肽[3,4,5,6]。从上一个十年中期开始,中国在畜禽出栏率和鸡蛋产量方面都居世界首位。食品科学和工程领域的一个主要任务是寻找能替代BHT和BHA等合成抗氧化剂的安全的食品添加剂[7,8,9]。这为鸡卵清蛋白的利用指明了新利用方式。
最近几年中,从不同原料来源的物质中分离得到了很多具有清除DPPH·自由基能力的多肽片段。从海鲡鱼皮[10]、圆鲹[11]中分离得到具有较强清除自由基活性的多肽。此外,从猪皮胶原蛋白[12],猪肌纤维蛋白[13],苹励蚧[14],蛙皮[15],金枪鱼蒸煮液[16]金枪鱼脊椎蛋白[17]和无须鳕鱼皮[18]中分离鉴定出具有清除自由基能力的多肽。Tsnge[19]等人从鸡卵清蛋白水解物中分离得到的抗氧化活性肽段Ala-His-Lys。
本项实验研究了胰凝乳蛋白酶作用的鸡卵清蛋白水解物的抗氧化活性,及抗氧化生物活性肽的序列。我们通过包括凝胶过滤层析和反相高效液相色谱的连续分离得到多肽,并用清除DPPH·自由基能力测定其抗氧化能力。
2 材料与方法
2.1 材料
新鲜鸡蛋购于武汉当地市场。胰凝乳蛋白酶购于Novo Nordisk公司;Sephadex G-25和Sephadex G-15购于GE Amersham公司;DPPH和氨基酸标样:胰岛素,杆菌肽,Gly-Gly-Tyr-Arg和Gly-Gly-Gly均购于Sigma公司。乙腈购自Tedia公司,其他药品及试剂均为分析纯。
2.2 鸡卵清蛋白水解物的制备
鸡蛋置于100℃中煮熟,剥离卵清蛋白并捣碎。鸡卵清蛋白浆和水按1:1的比例混合,调整pH至7.0后,60℃水浴加热,按1:10的比例加入胰凝乳蛋白酶水解3h。水解完成后,100℃灭酶10min。收集上清液喷雾干燥即得鸡卵清蛋白水解物。
2.3 鸡卵清蛋白水解物氨基酸测定
氨基酸测定按照中华人民共和国国标GB/T 5009.124-2003进行。6MHC1加入鸡卵清蛋白水解物中,100℃真空条件水解22h。氨基酸自动分析仪检测,水合茚三酮柱后衍生显色。
2.4 清除DPPH.自由基测定
清除DPPH·自由基活性测定按照Shimada和Nakamura的方法稍作修改进行。待测样溶于50%乙醇中,加入新鲜配制的0.4mM DPPH乙醇溶液,混合均匀,室温置于暗处反应50min,于517nm处测定吸光度。清除DPPH·自由基能力计算如下:
DPPH·自由基清除能力=[(空白吸收一样品吸收)/空白吸收]×100%
结果取三次平行实验的平均值。DPPH空白值为1mL 50%乙醇和200μL 0.4mM DPPH的混合。
2.5 鸡卵清蛋白水解物分子量分布
色谱柱:TSKgelG2000SWXL,300mm×7.8mm;流动相:乙腈:水:三氟乙酸=20:80:0.1;流速:0.8mL/min;进样量:10μL;检测波长:220nm;柱温:室温。标准品:胰岛素、杆菌肽、Gly-Gly-Tyr-Arg、Gly-Gly-Gly为外标。其分子量分别为:5,733,1,422,451和189Da。以分子量对数值和保留时间作图。Agilent 1100化学工作站采集数据,用Agilent GPC-Addon Rev.A.02.02软件处理数据。
2.6 抗氧化活性肽的分离[20]
鸡卵清蛋白多肽经Sephadex G-25凝胶柱层析(Φ2.6cm×80cm),洗脱液为蒸馏水,上样浓度为100mg/mL,上样体积为5mL,洗脱流速为4mL/min,254nm检测。根据记录仪显示出峰收集,42℃旋转蒸发浓缩,并冷冻干燥,对各组分进行DPPH清除能力测定,其余贮存备用。
Sephadex G-25分离出具有较强DPPH·自由基清除能力的组分经Sephadex G-15凝胶柱(Φ16×700mm)洗脱,洗脱液为蒸馏水,上样浓度为100mg/mL,上样体积为1.5mL,洗脱流速为2mL/min,254nm检测,根据记录仪显示出峰收集,42℃旋转蒸发浓缩,并冷冻干燥,对各组分进行DPPH清除能力测定,贮存备用。
选择Sephadex G-15分离后抗氧化活性最高的组分进行半制备色谱分离,色谱条件为:色谱仪:Agilent 1200;检测器:vwd;色谱柱:Hypersil ODS-C18 (2.5μm,10mm×250mm)大连依利特分析仪器有限公司;流动相:A.2%的乙腈+0.1%的三氟乙酸,B.60%乙腈+0.1%的三氟乙酸(线性梯度洗脱,55min乙腈3%～60%);波长:230nm;流速:05mL/nin;进样量:200μL;样品浓度:40mg/mL,按峰收集,冻干。清除DPPH·自由基能力最强的组分用反相高效液相进一步分离,色谱条件为:色谱仪:Agilent 1200;检测器:vwd;色谱柱:Agilent Zorbax 300 SB-C18(5μm,4.6mm×250mm)美国安捷伦公司;流动相:A2%的乙腈+0.1%的三氟乙酸,B.60%乙腈+0.1%的三氟乙酸(线性梯度洗脱,55min乙腈3%～60%);波长:230nm;流速:0.3mL/min;进样量:200μL;样品浓度:10mg/mL。
2.7 RP-HPLC-MS/MS多肽鉴定条件
样品经Ziptip C18柱脱盐后,溶于水-乙腈缓冲液(95:5,v/v),经自动进样器进入色谱进行分离。液相条件为:毛细管柱为C18反相柱(150×0.1 mm×3μm,200 A),进样量:10μL,流动相:乙腈-甲酸(20:1,v/v)(A相)和乙腈-甲酸(980:1,v/v)(B相),梯度洗脱条件:0～1 mn,2%B;1～10 min,2～30%B;10～40 min,30～60%B;40～53 min,60～98%B;53-63 min,98%B;63.65 min,98～2%B,流速0.3μL/min。质谱仪:Q-TOF电喷雾串联质谱仪(美国AB公司);离子方式:ESI+;毛细管电压:2.2KV,离子源温度150℃,质量扫描范围m/z 100～1800。Proteinpilot软件处理数据。
3 结果与讨论
3.1 鸡卵清蛋白水解物氨基酸分析
鸡卵清蛋白水解物中主要氨基酸为Glu,Asp,Ser,Leu,它们在鸡卵清蛋白中所占含量分别为:10.94%,7.48%,6.82%,6.64%。
3.2 鸡卵清蛋白水解物及分离组分的分子量分布
高效液相体积排阻色谱显示:标准品相对分子质量的对数值(y)和保留时间(x)在相对分子质量5733～189D范围内成线性关系,回归方程为:y=-0.5951x+10.406 (R2=0.977)。通过软件分析得出鸡卵清蛋白水解物及其分离组份的分子量主要集中在800～100Da区间。经过两次凝胶色谱分离,分子量主要集中于500～100Da之间。
3.3 鸡卵清蛋白水解物清除DPPH·自由基活性
DPPH是一种人工合成的稳定的自由基,乙醇溶液中,517nm处有最大吸收峰,其吸光值会随着抗氧化剂提供质子而降低,颜色由紫色变为黄色,并形成稳定的DPPH-H分子。图2显示鸡卵清蛋白水解物在0.5mg/mL至9mg/mL范围内的清除DPPH·自由基活性。虽然在0.5mg/mL～5mg/mL范围内浓度和清除率之间呈现一定的线性回归(R2=0.996),但是随着浓度增加,清除率曲线趋于平缓。当浓度达到10mg/mL时,鸡卵清蛋白水解物不能完全溶于50%乙醇。因此,测定鸡卵清蛋白水解物清除DPPH.自由基活性的最佳浓度范围在1mg/mL至5mg/mL。此外,从回归曲线中查出,3mg/mL的鸡卵清蛋白水解物的清除率为44.3%,与0.05mg/mL谷胱甘肽清除自由基能力相近。
3.4 抗氧化肽的分离纯化
鸡卵清蛋白水解物溶于蒸馏水中,浓度为100mg/mL,经0.22μm微孔滤膜过滤后,上样于Sephadex G-25凝胶柱,分离得到七个组分(A1～A7),并对七个组分进行了DPPH清除能力的测定(如图4、图5)。组分A3清除DPPH.自由基能力最强,清除率达到63.80%(3mg/mL)。组分A3经Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱层析分离成四个组分,其中组分B1清除率最强,达到84.02%(3mg/mL)(如图6、图7)。组分B1在ODS-C18半制备柱上分离成六个部分,组分C6具有86.10%的最强清除DPPH.自由基能力(如图8、图9)。并进一步在分析型的C18柱上分离成三个组分,组分D2清除率最强,达到27.70%(500μg/mL)(图10、图11)。
3.5 RP-HPLC-MS/MS鉴定多肽
为鉴定具有抗氧化活性多肽,组分D2进样液质联用。如图12显示MS和MS/MS谱图。m/z为731.3的分子离子峰指示该物质的分子量为730.3Da。
肽断裂时,沿着其多肽链的方向会产生三种不同的断裂类型:C-CO,CO-N和N-C。当含有原多肽结构中的N端,其c端含一个电荷的离子分别称为a、b、c离子。当含有原多肽结构中的C端,其N端含一个电荷的离子分别称为x、y、z离子。除了这六种不同的离子外,其侧链也可发生断裂,这就使得MS/MS谱图很复杂。但可以通过碎片推断得出其合理的结构。人工分析可知其结构可能为Cys-Pro-Asp-Gly-Asn-Ile(Leu)-Leu(Ile)。由于Leu和Ile具有相同的分子量,在质谱图中无法辨认。这使这一序列结构的可能性增至四种。通过NCBI数据库检索可知,该片段为位于鸡卵清卵粘蛋白α亚单元的1742～1748位点的Cys-Pro-Asp-GlyAsn-Ile-Leu序列。在这一序列中含有的Cys因能提供砜基质子,具有自由基清除活性。此外含有的两种能增强自由基清除率的氨基酸Pro和Leu。
3.6 化学合成多肽片段
运用化学合成法,合成氨基酸序列为Cys-Pro-Asp-Gly-AsnIle-Leu的肽端,对其进行液质联用分析,确定肽段序列为Cys-ProAsp-Gly-Asn-Ile-Leu。
4 讨论
4.1 本文运用胰凝乳蛋白酶酶解鸡卵清蛋白,经连续的柱层析分离得到了一种新的具有自由基清除活性的肽。
经液质联用鉴定为一种新多肽。其序列为:Cys-Pro-Asp-Gly-Asn-Ile-Leu。结果显示鸡卵清蛋白水解物有可能成为食品工业中的潜在抗氧化剂。
4.2 通常认为氨基酸的供质子能力在其清除自由基能力方面起到了很大的作用。
玉米蛋白多肽 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
2010年4月～2013年8月,选取在我院诊疗的RA患者42例,其中男19例,女23例,年龄29～73岁,平均(37.4±11.3)岁。另选取53例非RA患者作为对照,正常健康体检者31例,均按照相应诊断标准选入;年龄23～57岁,平均(35.7±9.3)岁。
1.2 方法
1.2.1 RF检测
应用美国贝克曼公司生产的IM-MAGE自动分析仪进行检测,严格遵照标准采用速率散射比浊法,当RF值>20 U/mL时确定为阳性。
1.2.2 AKA检测
该检测应用德国欧蒙实验诊断试剂有限公司生产的AKA检测试剂盒,按照标准采用间接免疫荧光法(IIF)进行正规检测,当发现角质层出现线状、板层状的典型荧光染色时为阳性。
1.2.3 抗CCP抗体检测
该技术应用广州万孚生物技术有限公司生产的抗CCP抗体检测试剂盒,应用ELISA方法检测,使用方法按说明书进行。采用标准曲线判断其检测的结果:在标准曲线上用样品OD值详细的检测出抗体浓度,当其≥20 U时为阳性,<20 U时为阴性。
1.3 统计学处理
在统计学上,均应用χ2检验,当P<0.05时为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 采用三种抗体单独及联合检测对RA诊断的敏感性、特异性统计(见表1)
注:敏感性:▲与其它组比较,P<0.05;特异性:*与其组比较,P<0.05
进行单独检测时,其结果是RA的敏感性比较依次为RF>抗CCP>AKA,特异性比较则依次为AKA>抗CCP>RF。单独检测时,结果显示RF敏感性为71.1%,抗CCP敏感性为65.1%,两者经统计差异无统计学意义(P>0.05),而两者与AKA检测比较差异均有统计学意义(P<0.05)。单独检测RF时其特异性为74.5%,而抗CCP的特异性为94.3%、AKA的特异性为95.3%,可见对RF单独检测其特异性较其它两项检测均呈现出明显的降低(P<0.05),经统计差异则无统计学意义(P>0.05)。但是把RF、AKA和抗CCP进行联合检测时,其RA诊断的敏感性、特异性的结果则分别为RF+AKA为34.9%、97.2%,RF+抗CCP的结果为45.8%、98.1%,RF+AKA+抗CCP的结果为28.9%、100.0%。因此得出结论,当应用联合检测时,对该病诊断的敏感性会有所下降,但诊断的特异性却有不同程度提高,其中,进行RF+AKA+抗CCP联合检测特异性最高。
2.2 AKA、抗CCP阴性的RA患者中RF检测阳性结果统计
在20例RA的AKA阴性的患者中,其中5例患者确诊为RF阳性,但在抗CCP抗体阴性的14例患者中,却也有5例被确诊为RF阳性。
2.3 RF阴性的RA患者中AKA及抗CCP抗体的阳性结果统计
在11例RA的RF阴性患者中,分别有5例患者AKA阳性,16例(69.1%)抗CCP抗体阳性。
3 讨论
RA作为自身免疫性疾病,其危害性较高,死亡率较高。如何早期特异地做出正确的诊断,是摆在广大学者面前的一项重要课题,也成为近几年研究的主要方向。目前诊断RA的唯一血清学指标是RF,因为检测较简捷、灵敏度相对较高而得到较广泛的使用,但也可出现部分阳性结果,这些缺点使RF在RA诊断中的价值大大受限。
本文的结果还明确显示,相比较而言,抗CCP抗体的敏感性和特异性是综合诊断水平最好的。所以有的研究者指出,在抗CCP抗体阳性的RA患者中,其骨关节的破坏程度较阴性者要更严重些,表明抗CCP抗体检测在预测RA患者疾病的严重性方面,具有较高的应用价值。AKA的成分主要是IgG,AKA对RA的诊断也有较高的特异性。以往资料显示,AKA阳性但关节炎较轻的“正常人”,几乎都能发展成RA,说明AKA在RA的早期诊断中有重要价值,故AKA被认为是诊断RA最特异的生物学指标。本文也显示对RA的诊断特异性最高的是AKA检测(95.3%),AKA往往在疾病的临床表现之前出现,对RA的早期诊断很有帮助,但常预后不佳。有学者推测AKA与抗CCP有一定的重叠性。因为RF、AKA及抗CCP能够在RA的发病过程中可以早期的出现,所以这三项指标可作为该病早期诊断的有力依据。本文通过对42例RA患者和53例非RA患者的血清进行了三项详细的临床检测,最终结果显示:在对RA的诊断过程中,当单独检测单种抗体时RF敏感性表现的最高,抗CCP表现的敏感性次之。采用不同方式联合检测对RA疾病诊断的敏感性有所下降,但特异性却有所提高,因此笔者认为如果当有些疾病确实出现不完全符合分类的诊断标准时,要采用联合检测,当三项抗体同时为阳性时就基本可以确诊RA。
本研究结果还表明,RF阴性的患者中出现两种情况,其中一部分呈AKA阳性,还有一部分呈现抗CCP阳性,后者阳性率较高,提示进行AKA、抗CCP检测可避免因RF阴性所致的漏诊,尤其对那些早期症状不典型或X线检查尚无病变的患者诊断价值表现更高。因此有学者认为无论哪种抗体单独检测时对诊断RA都会不同程度的出现一定的局限性,三项指标同时进行联合检测才能查漏补缺,达到最佳检测效果。但假如患者为了节省费用只选择二项指标联合检测,按照操作方法简便,准确率高的标准,故我们推荐RF与抗CCP联合检测。
总之,作为诊断RA的检测指标,RF、AKA及抗CCP抗体各有其优点,可相互补充,进行联合检测在提高诊断RA疾病的特异性方面存在优势,当同时进行三项指标联合检测时其结果特异性最高,故在临床上对RA的早期诊断、治疗和改善预后都具有重要的意义。
关键词：类风湿关节炎,类风湿因子,抗角质蛋白抗体,抗环瓜氨酸肽抗体
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