细胞染色

细胞染色（共10篇）

细胞染色 篇1

坐标曲线题一直是近几年生物试卷中常见的题型,因其直观形象、信息量大、覆盖面广而备受命题者的青睐。有丝分裂为高中生物重点学习内容,需要具备将相关曲线与文字相互转化的综合能力。在与分裂过程相关的曲线中,细胞、细胞核中染色体、DNA数量变化曲线仅一字之差,学生很容易混淆。笔者通过多年的教学研究,对于两种曲线的区别有了自己的见解。其中细胞、细胞核的区别并不是指细胞核是细胞的一部分,它们的范围大小不同,如人的细胞核中存在DNA分子46个,而人的细胞中DNA数量多于46个。

下面以植物细胞(2n=4)的有丝分裂过程为例进行说明(图1)。

据图可归纳出有丝分裂过程中不同时期细胞、细胞核的数量如表所示(表1)。

说明:有丝分裂末期开始时,因为核膜、核仁的重新生成导致此时存在2个细胞核;而此时中央形成的细胞板还没有将细胞一分为二,细胞质还在整个细胞内流动,故此时只存在1个细胞,但该细胞内存在2个细胞核,每个细胞核内的染色体、DNA数量只有原来的一半。而在末期结束时,细胞板扩展成新的细胞壁将细胞分裂成2个子细胞,此时1个细胞内染色体、DNA数量是原来那个细胞内的一半。

故有丝分裂细胞中、细胞核中染色体、DNA数量变化如表所示(表2)。

综上所述,细胞中染色体、DNA数量从8个恢复到4个发生在末期结束的时候;而细胞核中染色体、DNA数量从8个恢复到4个发生在末期开始。将上表转换成曲线图,如下(见图2)。

从曲线图可以知道:有丝分裂细胞中染色体、DNA数量减半发生在末期结束时,而细胞核中染色体、DNA数量减半发生在末期开始时(此结论同样适用于减数分裂过程)。

我们可以用该结论解决相关曲线图题,举例如下:

图3是有关细胞分裂过程中DNA分子含量的测定结果模式图(图中曲线表示一个细胞中DNA分子含量的变化)。据图3回答:

(1)在__之间(用图中字母表示)表示了减数分裂,其中同源染色体上等位基因分离发生在__之间,姐妹染色单体分离发生在__之间。

(2)在__之间表示了有丝分裂过程,其中间期在__之间。

(3)图中J—L表示了__分裂周期的__。

(4)G点所能说明的生理过程是__。它和减数分裂对维持生物前后代体细胞中__相对稳定具有重要意义。

答案:(1)AF DE EF

(2)HL HJ

(3)有丝前、中、后、末期

(4)受精作用染色体数目

解析:题干中交代了曲线表示细胞中DNA分子含量的变化,故E点为减Ⅰ末期结束,F点为减Ⅱ末期结束,L点为有丝分裂末期结束。故AF为减数分裂,其中AE为减Ⅰ,EF为减Ⅱ;HL为有丝分裂过程,其中HJ为有丝分裂间期,JL为前、中、后、期。

笔者通过多年来的教学工作获得了上述结论,帮助学生有目的、准确地解决了此类问题,自己也受益匪浅。希望能借此与同行交流,为高中生物教学的疑难解答贡献自己的微薄之力。

注:间期:1个细胞(4条染色体、DNA数量加倍:4→8),1个细胞核(4条染色体、DNA数量加倍:4→8)前期:1个细胞(4条染色体、8个DNA),1个细胞核(4条染色体、8个DNA)中期:1个细胞(4条染色体、8个DNA),1个细胞核(4条染色体、8个DNA)后期:1个细胞(染色体数量加倍:4→8、8个DNA),1个细胞核(染色体数量加倍:4→8、8个DNA)末期开始:1个细胞(8条染色体、8个DNA),2个细胞核(每个核内有4条染色体、4个DNA)末期结束:2个细胞(每个细胞内有4条染色体、4个DNA),2个细胞核(每个核内有4条染色体、4个DNA)

参考文献

[1]周希澄,郭平仲,冀耀如.遗传学(第二版)[M].北京:高等教育出版社,1982.

[2]王士朝.例析减数分裂与生物学多个知识点的联系[J].生物学教学,2008,(2):48-50.

[3]温勇刚.有丝分裂和减数分裂[J].生物学教学,2007,(4):56.

[4]秦亚平.关于细胞分裂中DNA变化之比较分析[J].中学生物教学,2008,(6).

细胞染色 篇2

【实验目的】

1.认识光学显微镜下细胞的形态结构； 2.掌握临时制片和显微绘图的方法。

【材料、器材和试剂】

材料：人体口腔黏膜上皮细胞、洋葱鳞茎；

器材：显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸； 试剂：1%碘液。

【方法和步骤】

1.口腔黏膜上皮细胞的制片与观察

口腔黏膜细胞涂片标本的制备：吸取一滴碘液滴在一张洁净的载玻片中央，用一根事先灭菌的牙签伸入自己的口腔内壁轻轻刮取黏膜上皮细胞，然后，将其放入载玻片上的染液中并来回搅动使细胞散开，染色1 min左右后小心加盖玻片（尽量避免产生气泡），用滤纸吸去盖玻片周围的液体。

观察：将自制的口腔黏膜上皮细胞标本装片置于显微镜下观察，先用低倍镜观察较分散的、轮廓清晰的黏膜上皮细胞。由于该细胞体积较小、着色较淡，观察时应稍降低视野亮度以便于较快找到目标（在低倍镜下，用碘液染色的细胞呈黄色，成群或分散分布，形态大小多呈扁平椭圆形）。选择轮廓清晰的细胞移至视野中央，转换至高倍镜下观察。在高倍镜下，可见口腔黏膜上皮细胞外围有一层薄薄的细胞膜，扁圆形的细胞核呈深黄色，细胞质呈浅黄色或浅蓝色，核中央致密的结构为核仁。

2.洋葱鳞茎内表皮细胞的制片与观察

表皮细胞装片标本的制备：取一干净载玻片，在其中央滴一滴碘液，将洋葱鳞茎用小刀分为几块，取一块肉质鳞叶，用剪刀在内表皮划“田”字形小方格，每一小方格边长3-4mm，然后用镊子轻轻撕下一小方格的膜质表皮，置于载玻片的碘液滴中铺平，取一干净的盖玻片，将其一侧先接触标本旁的碘液，再缓缓地盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，用滤纸吸去盖玻片周围的液体。

观察：将制备好的装片标本放到显微镜下，先用低倍镜观察，可见许多长柱状、排列整齐、彼此相连的细胞，选择其中一个典型的细胞移至视野中央，再转换至高倍镜下仔细观察细胞壁、细胞核、细胞质和液泡等结构。

【实验结果】

绘图并进行适当标注：人口腔黏膜上皮细胞和洋葱鳞茎内表皮细胞。【讨论】

简述观察细胞形态时，制作临时装片和显微镜镜检时的注意事项。

实验四 线粒体和液泡系的活体染色

【实验目的】

1.掌握一些细胞器的超活性染色技术和原理。

2.观察动物、植物细胞内线粒体和液泡系的形态、数量和分布。

【材料、器材和试剂】

材料：人体口腔黏膜上皮细胞、洋葱；

器材：显微镜、牙签、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片；

试剂：Ringer溶液；1/5000詹纳斯绿B溶液；1/3000中性红溶液。

【方法和步骤】

1.线粒体的超活染色与观察

（1）人体口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色和观察

① 取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液； ② 用一根预先灭菌的牙签伸入自己的口腔内壁轻轻刮取黏膜上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10-15min（注意不可使染液干燥，必要时可再加一滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置于显微镜下观察；

③ 在低倍镜下，选择平展的口腔黏膜上皮细胞，转换高倍镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或棍棒状的线粒体。（2）洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色和观察

① 用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴在干净的载玻片上，然后用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于染液中，染色10-15min；

② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮展平，盖上盖玻片，显微镜下观察。在高倍镜下，可见表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至旁边，线粒体染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状。

2.液泡系的超活染色和观察

① 洋葱鳞茎内表皮一小块，置于1/3000中性红溶液中，染色5-10min；

② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮展平，盖上盖玻片，显微镜下观察，可见被染成砖红色的中央大液泡。

【实验结果】

1.根据实验观察，绘制洋葱鳞茎内表皮细胞和人体口腔黏膜上皮细胞线粒体分布图。2.根据实验观察，绘制洋葱鳞茎表皮细胞指示液泡系的形态和分布。

【讨论】

1.简述线粒体詹纳斯绿B活体染色和液泡系中性红活体染色的原理； 2.分析线粒体和液泡系活体染色时需要注意的事项。3.细胞内线粒体的形态和分布有何特点？

实验五 植物细胞骨架的光学显微镜观察

【实验目的】

了解细胞骨架的结构特征及其样品制备技术。

【材料、器材和试剂】

材料：洋葱鳞茎；

器材：普通光学显微镜、5Oml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸；

试剂：M 缓冲液；6mmol/L（pH 6.8）磷酸缓冲液；1% Triton X-100；0.2%考马斯亮蓝R250；3%戊二醛。

【方法和步骤】

1.撕取洋葱鳞茎内表皮（约lcm大小若干片）置于装有pH 6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉；

2.吸去磷酸缓冲液，用l% Triton X-100处理20-30min； 3.吸去Triton X-100，用M缓冲液洗3次，每次10min； 4.3%戊二醛固定O.5-lh；

5.pH 6.8磷酸缓冲液洗3次，每次10min； 6.0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30min；

7.用蒸馏水洗1或2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。

2【实验结果】

绘制洋葱鳞茎表皮细胞微丝束的分布图。

【讨论】

细胞染色 篇3

关键词：茄子；花粉母细胞；减数分裂；雄配子体发育

中图分类号： S641.101文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0107-03

收稿日期：2013-06-06

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（11）1005]。

作者简介：唐红艳（1990—），女，江苏泗阳人，主要从事蔬菜种子繁育工作。

通信作者：崔群香，博士，副教授，从事园艺作物遗传育种教学和科研工作。E-mail：cqx@jit.edu. cn。茄子（Solanum melongena L.）是茄科茄属的重要蔬菜，染色体数2n=24。茄子主要病害有黄萎病、褐纹病、青枯病、早疫病、病毒病、绵疫病等，以黄萎病危害最重。茄子近缘野生种含有多种优良抗病基因，通过远缘杂交创制新型异染色体系材料，开展染色体工程育种已成为茄子抗病育种的突破口[1]。因此，开展细胞、分子遗传学研究对于茄子染色体工程育种具有重要意义。了解花粉母细胞中染色体的构型、比例及其动态变化，准确识别花粉母细胞减数分裂特征，是研究栽培茄与其野生种染色体互作的前提，也有利于提高各种异染色体系材料的创制效率[2]。观察雄配子体的发育过程，有利于确定花蕾形态与雄配子体发育阶段之间的关系，提高花药、小孢子培养时供体材料花蕾选取的准确性。目前关于茄子的细胞学研究主要集中在染色体核型分析[3-4]以及减数分裂上[5]，雄配子体发育研究很少。花粉母细胞减数分裂研究中常用的方法包括改良苯酚品红法（卡宝品红）、苏木精染色法、压片观察技术，雄配子体发育需要结合使用染色、冬青油透明技术[6]。荧光染色结合透明技术用于观察染色体较小的不结球白菜二倍体、四倍体[7-8]，已应用于南瓜、向日葵等作物上[9-10]，但未见其应用于茄子减数分裂、雄配子体发育研究。本研究利用荧光染色法研究茄子减数分裂、雄配子体发育，以便快速确定植株染色体数目、配子体发育阶段，旨在为茄子分子生物学研究提供快捷有效的方法。

1材料与方法

1.1材料

供试茄子品种为沪茄四号，2011年11月上旬温室育苗，2012年3月中旬定植于连栋棚内，4月中旬晴天10：00左右取不同大小的花蕾，用自封袋放入冰盒带回实验室，4 ℃冰箱中放置24 h，然后将花蕾分成4个级别：（1）花萼未开及花萼刚张开，花瓣距花萼筒>2 mm；（2）花萼张开，花瓣距花萼筒≤2 mm；（3）花萼张开，花瓣超过花萼筒0～2 mm；（4）花瓣超过花萼筒2 mm以上。

1.2方法

将上述4个级别的花蕾剥去萼片挑出花药，分别用卡诺固定液进行固定，经95%、85%、70%、50%、30%梯度乙醇和蒸馏水各浸泡冲洗20 min，然后转入pH值为5.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液中放置24 h以上。25 ℃黑暗条件下，用20 μg/L H33258染色数小时并过夜。捣碎花药并吸取含花粉母细胞或雄配子体的碎片，滴在载玻片上，盖上盖玻片，轻轻按压，用Nikon80i荧光显微镜在紫外激发的荧光下观察、统计并拍照。

2结果与分析

2.1花粉母细胞减数分裂

在萼片未张开的花蕾中，很多花粉母细胞处于减数分裂时期。进入减数分裂的花粉母细胞体积增大，原生质体浓厚，容易与周围的其他细胞区分开来。前期Ⅰ持续时间较长，染色体形态变化较大。偶线期同源染色体开始联会，染色体呈花束状（图1-1）；粗线期联会已经完成，且染色体继续缩短变粗；双线期染色体进一步螺旋化并加粗，联会复合体已经解体，但各非姊妹染色体仍由交叉结连结在一起，表现为“X”等构型（图1-2）；终变期染色体进一步螺旋，达到最粗，并开始向细胞中央集中，逐步进入中期Ⅰ（图1-3）；完全进入中期Ⅰ的细胞中，二价体排列在赤道板附近，极面观12个二价体清晰可计数（图1-4），垂面观可见棒状、“E”形二价体，且二价体中的2条染色体有分开的趋势（图1-5）；由于纺锤丝的牵引，同源染色体分离，并且向两极移动，进入后期Ⅰ（图1-6）；染色体移至两极，核膜重新出现，此后直到染色体松散，进入前期Ⅱ，细胞质一直未见分裂（图1-7）；随着核膜消失，染色体凝缩至清晰可辨，进入减数分裂中期Ⅱ，垂面观可见二价纺锤面呈现一定角度（图1-8）；染色单体分离，核

膜形成，细胞壁尚未形成，进入末期Ⅱ，多数细胞中只见到3个细胞核（图1-9）；随后产生胼胝质壁，把4个细胞隔开，形成四分体，四分体也多为四面体型（图1-10），极少数为平面型（图1-11）。

2.2雄配子体发育

花萼已张开的花蕾中，多数花粉母细胞已完成减数分裂，处于四分体及随后时期。四分体胼胝质壁解体，释放出小孢子，进入雄配子体发育过程。同大多数作物类似，刚释放出来处于单核早期的小孢子形状不规则，细胞质中没有液泡，小孢子体积小；随后细胞核位于细胞中央，细胞不同部位开始出现小液泡，为单核居中期（图1-12）；受液泡的挤压，细胞核向细胞壁靠近，核膜清晰，为单核靠边期（图1-13）；随后核膜消失，出现清晰可辨的12条染色体，进入单核有丝分裂中期（图1-14）；有丝分裂完成后，小孢子进入二核期，刚分裂产生的2个细胞核，除1个细胞核荧光较亮外，形状、大小差异不大（图1-15）；随后较亮的细胞形状由圆变扁、由短变长，小孢子体积也不断增大，但细胞不再分裂（图1-16至图1-18）。成熟花粉粒多为椭球形，但不同花粉粒之间有一定差异（图1-19）。

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2.3雄配子体发育时期及与花蕾形态特征之间的关系

由于单核中期细胞大小与四分体类似，而四分体之前的花粉母细胞体积小于四分体，且从结构上易与小孢子区分开来，因此可以根据细胞体积判断雄配子体发育阶段：小于四分体则为单核早期，等于或接近四分体则为单核中晚期，明显大于四分体则为二核期。据此对（2）至（4）级花蕾中细胞发育阶段进行统计，发现（2）级花蕾中约有4%细胞为四分体，其余多数为单核小孢子；（3）级花蕾中均为单核小孢子，且仅3%处于单核早期，其余为单核中晚期；（4）级花蕾中80%以上的细胞处于双核期。

3结论与讨论

本研究首次用荧光染色观察法探讨了茄子花粉母细胞减数分裂及其雄配子体发育各个时期的主要特征，以及单核期小孢子所对应的花蕾形态特征。采用了24 h低温预处理、荧光染色方法，染色体在各个时期特征非常明显，染色体发出明亮的荧光，避免了细胞质中其他物质的干扰，对于茄子、白菜等花粉壁荧光不强烈的材料，即使观察雄配子体发育也不需要进行冬青油透明。适合茄属植物游离小孢子培养的花粉发育时期一般为单核期或单核中晚期[11-14]。小孢子发育时期与花蕾形态特征密切相关，多数研究者用花蕾直径、花蕾长、花药颜色[15]，花蕾瓣长与萼裂比[16]，花瓣长与萼裂基部之差等作为适宜培养的小孢子发育时期相关形态特征，并以此作为取样依据[17]。本研究表明，花瓣长度与花萼筒长度之间的差值可以作为茄子小孢子培养的取材依据，这与马欣的结论[17]类似。

参考文献：

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[17]马欣. 茄子游离小孢子培养及其形态发育学观察[D]. 保定：河北农业大学，2006.

细胞染色 篇4

1 材料和方法

1.1 材料健康雏鸡, 0.01%秋水仙素, 2%柠檬酸钠液, 0.075%

KCl, 甲醇, 冰醋酸, Giemsa原液, pH为7.2～7.5的磷酸缓冲液, 显微镜, 水浴锅, 离心机, 解剖器具 (剪刀、镊子) , 载玻片及盖玻片等。

1.2 方法

1.2.1 秋水仙素处理:

在雏鸡腹腔注射秋水仙素, 剂量为每克体重2 μg。

1.2.2 取骨髓:

注射秋水仙素3～4 h后, 将雏鸡处死, 立即取出两侧股骨, 剔净股骨上的肌肉, 以等渗的柠檬酸钠2%, 洗净股骨上血污及肌肉碎渣。剪断股骨。用尖镊子小心地取出骨髓, 置于放有少量等渗液的小培养器中捣碎, 再加入少量等渗液制成2～3 mL的骨髓细胞悬液, 也可用骨剪将股骨两端膨大的关节头剪掉, 使其露出骨髓腔, 用吸有适量柠檬酸钠液的注射器, 从股骨腔的一端插入注射针头, 将骨髓冲入离心管内, 可反复冲洗数次, 直至股骨变白为止, 此时离心管内的细胞悬浮液约有4～5 mL。

1.2.3 低渗处理:

将细胞悬液经1000 r/min, 离心10 min, 吸去上清液, 加预温的0.075% KCL低渗液5 mL, 立即将细胞团打匀, 在37℃条件下静置25 min。

1.2.4 固定:

低渗处理后, 向试管低渗液中加1～2 mL的固定液 (3∶1的甲醇∶冰醋酸) 进行5 min的预固定, 然后以1000 r/min, 离心10 min, 吸去上清液, 先向离心管内加入少量固定液, 用吸管轻轻吹打成细胞悬液, 再加入5 mL的固定液, 混匀后, 固定30 min。如此重复固定2～3次, 最后用适量的固定液 (大约5倍于沉积物) , 吸打均匀成细胞悬液。

1.2.5 制片:

从冰箱中取出冰冻载玻片, 用吸管吸取细胞悬液, 距离玻片10 cm左右的高度滴片, 每片滴1～2滴细胞悬液, 或者滴片后用嘴轻轻吹片, 以帮助染色体分散。必要时在酒精灯上微火烘片, 这样可促使染色体展开, 空气干燥保存。

1.2.6 染色:

将染色体玻片标本, 经10% Giemsa染液 (Giemsa原液与磷酸缓冲液之比1∶9) 染色30 min, 自来水冲洗, 洗去上面的浮色, 晾干。

2 结果与讨论

2.1 秋水仙素的注意事项

秋水仙素为一种植物碱, 它具有抑制细胞纺锤丝的形成, 使细胞分裂停止于中期, 以积累大量的中期细胞的作用。秋水仙素的浓度范围比较宽广, 可差几十倍之多。一般其浓度为0.25～0.5 μg/mL培养液。其浓度应根据不同的实验动物选用不同浓度和不同处理时间来控制染色体形成和收缩程度, 秋水仙素作用时间越长, 被阻止的中期细胞越多, 但染色体也越凝集和收缩。经过多次的对比实验, 我们总结出雏鸡骨髓细胞染色体标本制作中秋水仙素的注射量控制在2 μg/g较好, 处理时间控制在3～4 h为好。

2.2 低渗处理的注意事项

低渗液处理能使核膜膨胀, 破裂, 染色体分散而易于观察和计数。常用的低渗液有蒸馏水、柠檬酸钠和0.075% KCl, 实践证明, 应用0.075% KCl作低渗液, 对染色体结构影响较小, 且对制备显带标本效果最佳。不同动物的不同组织处理的时间有差异, 处理时间不足染色体铺展不好, 处理时间过长, 会引起细胞破碎, 染色体丢失, 甚至染色体胀得太大而导致形态结构模糊。因此, 对任一组织的低渗液都应事先进行预实验, 以确定最合适的处理时间。

2.3 固定注意事项

染色体标本的好坏受固定液及操作影响, 常用的固定液为甲醇∶冰醋酸 (3∶1) , 要注意现用现配, 用后倒掉, 否则会形成酯类, 发生沉淀, 影响固定的效果。为了消除中期染色体外层物质对染色体在载玻片上展开和对染色体亲和力的影响, 需要更换2～3次固定液, 每次20～30 min。如所制标本染色体固缩不良时, 可改变固定液的冰醋酸比例 (2∶3或1∶3视染色体分散程度而定) 。加入细胞悬液中, 混匀, 离心后再制片, 染色体分散程度可得到提高。但与3∶1固定液相比, 所制得的染色体标本, 形态易改变, 染色欠佳, 故一般情况下不宜用2∶3或1∶3比例的固定液。

细胞染色 篇5

高熹 1120152430（李安一）

（北京理工大学生命学院16121501班）

摘要：狭义的细胞骨架概念是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系微管、微丝及中间纤维组成的体系。考马斯亮蓝R250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合的一种物质，用于微量蛋白质染色。该实验通过植物和动物细胞的细胞骨架染色，观察细胞骨架，使我们掌握了动植物细胞内微丝的染色方法。关键词：细胞骨架；考马斯亮蓝；微丝；染色；实验 引言

由微管、微丝和中间丝所组成的蛋白纤维网架结构体系称为“细胞骨架系统”，与细胞内的遗传系统、生物膜系统、并称“细胞内的三大系统”。是真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，被形象地称为细胞骨架，它通常也被认为是广义上细胞器的一种。广义的细胞骨架概念是细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和胞外基质所形成的网络体系。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构。发现较晚，主要是因为一般电镜制样采用低温（0-4℃）固定，而细胞骨架会在低温下解聚。直到20世纪60年代后，采用戊二醛常温固定，才逐渐认识到细胞骨架的客观存在。真核细胞借以维持其基本形态的重要结构，被形象地称为细胞骨架，它通常也被认为是广义上细胞器的一种。细胞骨架不仅在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命活动，如：在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离，在细胞物质运输中，各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运；在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统；在白细胞(白血球)的迁移、精子的游动、神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关。另外，在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。

微丝普遍存在于所有真核细胞中，是一个实心状的纤维，直径为4nm-7nm一般细胞中含量约占细胞内总蛋白质的1%-2%，但在活动较强的细胞中可占20%-30%。在一般细胞主要分布于细胞的表面，直接影响细胞的形状。微丝具有多种功能，在不同细胞的表现不同，在肌细胞组成粗肌丝、细肌丝，可以收缩（收缩蛋白），在非肌细胞中主要起支撑作用、非肌性运动和信息传导作用。微丝主要由肌动蛋白构成，和肌球蛋白一起作用，使细胞运动。它们参与细胞的变形虫运动、植物细胞的细胞质流动与肌肉细胞的收缩。微丝是双股肌动蛋白丝以螺旋的形式组成的纤维，直径为7纳米，螺距为36纳米，两股肌动蛋白丝是同方向的。肌动蛋白纤维也是一种极性分子，具有两个不同的末端，一个是正端，另一个是负端。微丝与它的结合蛋白以及肌球蛋白三者构成化学机械系统，利用化学能产生机械运动。由微丝形成的微丝束称为应力纤维，常横贯于细胞长轴。脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，α型分布于心肌和横纹肌细胞中，α及γ型分布于平滑肌细胞中，β及γ型分布于非肌细胞中。聚合的及非聚合态的肌动蛋白能与其多种结合蛋白相互作用，这些结合蛋白对肌动蛋白的聚合及对微丝的稳定、长度及分布具有调节作用。考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15—20g），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。一般当细胞充分铺展时，经考马斯亮蓝R250染色，可看到沿细胞长轴伸展的粗大纤维束，即应力纤维。应力纤维上还周期性地分布着微丝结合蛋白，包括-辅肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、类肌钙蛋白等。应力纤维的端部连接着质膜上的粘着斑，与加强细胞对基质的附着、铺展及维持细胞特定形状有关。考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染色微丝，实验中用1％Triton X－100抽提掉胞质中除骨架蛋白外的其他蛋白，能清晰地显示微丝束。实验器材及试剂

2.1 器材

光学显微镜、温箱、细胞培养设备、平皿、直径30mm小染缸、载波片、盖玻片条（剪掉一角以区别细胞正反面）。2.2 材料

体外培养的贴壁生长的HeLa细胞、洋葱鳞茎。2.3 试剂

细胞培养基（DMEM、RPMI－1640等）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，pH7.4）、0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.3）、M－缓冲液、1％Triton X-100（用M－缓冲液配制）、0.2%考马斯亮蓝R250、3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）。实验步骤

3.1 HeLa细胞染色

（1）细胞培养在平皿中的盖玻片上，尚未致密时即可使用。取出盖玻片，用PBS洗3次。

（2）用1％Triton X-100处理25～30min，室温或37度均可。（3）立即用M-缓冲液轻轻洗细胞3次。

（4）略晾干后，用3.0%戊二醛固定细胞5～15min。（5）PBS洗数次，滤纸吸干。

（6）用0.2%考马斯亮蓝R250染色1小时，然后用水小心冲洗，蒸馏水冲洗，空气中略干燥。

（7）普通光学显微镜下用40×物镜或油镜观察。3.2 植物细胞染色

（1）取洋葱鳞茎表皮，大小约1cm2，放入盛有0.2mol/L磷酸盐缓冲液（6.8）的小烧杯中。

（2）吸去缓冲液，用1％Triton X-100处理洋葱表皮20～30min。（3）除去Triton X-100，用M-缓冲液充分洗3次，每次约10min。（4）加3.0%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制，pH6.8）固定0.5~1h。（5）用PBS洗3次，滤纸吸去残液。（6）0.2%考马斯亮蓝R250染色30min。（7）蒸馏水洗数遍。将样品置于载玻片上，加盖玻片，光学显微镜下观察。实验结果

图1 Hela细胞骨架染色图

图2 洋葱鳞茎细胞骨架染色图

结果分析

由实验结果来看，图2洋葱鳞茎细胞的细胞骨架染色较为成功，可以清楚地在图中看到染成蓝紫色的微丝细胞骨架。而Hela细胞骨架染色出现了一些问题，显著观察到的是细胞出现了破裂，造成细胞被染色的部分游离分散在了玻片上，由于分工不同，Hela是李安一同学做的，在与他交流后，分析可能是最后蒸馏水冲洗的时候操作不当，可能造成了细胞的吸水胀破，引发了细胞骨架的游离的现象。而这种现象在班里很多组里都有出现，因此，这里考虑实验步骤的错误，改进方法为可以用缓冲液去洗涤脱色。实验反思

本次实验步骤无明显错误，最后部分结果不太好，在排除自身操作的同时，对实验步骤产生一定的质疑，未来的实验不能按图索骥，要勤于思考，对每一步加深了解并给出自己的见解。参考文献

细胞染色 篇6

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用昆明种小鼠, 健康清洁级, 体重 (22±2) g, 由广东省医学实验动物中心提供。

1.2 主要药品与试剂

秋水仙素 (国药集团化学试剂有限公司, 批号:F20111215) ;吉姆萨染液 (天津市天新精细化工开发中心, 批号:20120521) ;甲醇、冰醋酸、KCl注射液、Na Cl注射液 (天津市大茂化学试剂厂) ;眼科剪;低速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂, 型号:TDL-80-2B) ;双目光学显微镜 (重庆奥特光学仪器, 型号:SMARTe-320) 。

1.3 方法

1.3.1 常规实验方法

(1) 实验动物处理:选取健康小鼠于实验前4小时腹腔注射10μg/g BW (体重) 秋水仙素。 (2) 收集骨髓细胞:颈椎脱臼法处死小鼠, 迅速剥取股骨, 小心去除股骨两端, 用注射器吸取5 m L低渗液 (0.075 mol/L KCl) 冲洗骨髓入离心管中, 反复离心至股骨泛白。 (3) 低渗处理:将离心管置于37℃水中, 水浴30分钟。 (4) 预固定:加入新鲜固定液 (甲醇∶冰醋酸=3∶1) 2 m L, 轻轻混匀后静置10分钟。 (5) 离心:1 000转/分离心10分钟。 (6) 固定:弃上清液, 将沉淀加入固定液5 m L, 轻轻混匀后静置30分钟。 (7) 收集细胞:相同条件再次离心, 弃上清液。 (8) 制细胞悬液:重新加入固定液0.3~0.5 m L, 混匀。 (9) 滴片:取-20℃预冷冻的洁净载玻片, 吸取少许细胞悬液, 于25 cm以上高度滴下, 立即吹气以便细胞悬液更快分散。 (10) 微烤:于酒精灯火焰上方往返5次, 自然晾干。 (11) 染色:置于吉姆萨染液中染色8分钟。取出标本, 流水冲洗, 室温晾干, 置于显微镜下进行镜检。

1.3.2 改进后的实验方法

(1) 实验动物处理:实验前14小时和4小时分别腹腔注射5μg/g和10μg/g BW秋水仙素。 (2) 同常规实验方法处死动物, 收集细胞。 (3) 低渗处理:0.070 mol/L KCl, 于37℃水中水浴15分钟。 (4) 预固定:加入固定液轻轻混匀静置2分钟。 (5) 离心:2 500转/分离心5分钟。 (6) 固定:加入固定液5 m L混匀后静置10分钟。 (7) 收集细胞:相同条件再次离心。后续步骤与常规实验方法一致, 但滴片高度提高到50~80 cm。

2 结果

常规实验方法制作的标本中, 可见形态清晰的中期染色体, 但中期分裂相少, 染色体分散性较差。改进后的实验方法制作的标本中, 可见大量数目完整、形态清晰、分散均匀的中期染色体。与常规实验结果相比, 中期分裂相明显增多, 染色体形态也更为清晰可见。

改进后的实验方法不但节省了实验操作时间, 还提高了学生实验操作效率, 两种方法的比较见表1。

3 讨论

3.1 秋水仙素的配制、注射技巧和作用时间

秋水仙素选用Na Cl注射液进行配制, 浓度为0.2 mg/m L。配好后于冰箱中放置几天, 使秋水仙素充分溶解, 以保证药效。秋水仙素可阻断纺锤丝微管的组装, 使染色体不往两极移动, 分裂期停滞在中期, 从而获得形态最为清晰、典型的中期染色体[6]。因此, 注射秋水仙素的剂量和作用时间与能否获得大量形态清晰的中期染色体密切相关, 也是最为关键的一步。注射时一定要牢牢固定住小鼠, 使其头部微微朝下, 在其右腹腔注射, 缓缓将药液推入, 注射过程中要防止小鼠的后肢将注射器蹬出。注射完毕应停留片刻, 有利于药液吸收。拔针时应旋转出针, 可有效避免药液回流, 以保证秋水仙素的注射剂量。

秋水仙素注射剂量太大、作用时间太长容易导致小鼠死亡, 还会使染色体过分收缩或着丝粒分离, 形态过于短小。注射剂量太少、作用时间太短, 则不能有效阻止细胞分裂停留在中期, 导致中期分裂相少[9,10]。因实验动物需提前注射秋水仙素, 所以一般只局限在下午开设实验课。为了解决时间限制的难题, 笔者设定了两个浓度梯度 (5μg/g BW和10μg/g BW) 的秋水仙素, 分别作用14小时和4小时。经过多次实验比较发现, 秋水仙素5μg/g BW作用14小时, 10μg/g BW作用4小时可获得较好的实验结果, 从而解决了该实验项目的时间限制问题, 更利于实验项目的开展。

3.2 低渗液的浓度及时间的选择

低渗处理也是实验成败的关键步骤之一, 低渗的目的是使细胞充分吸水膨胀但不至于破裂, 使中期染色体松散, 利于后期标本的制作。低渗时间太长、低渗溶液浓度过低容易使细胞提前破裂, 导致染色体丢失。低渗时间太短细胞吸水膨胀不够, 不利于后期细胞破碎和染色体分散[11,12]。为了节省时间, 提高实验效率, 笔者经多次反复实验比较发现, 将低渗液浓度由0.075 mol/L调低至0.070 mol/L[4], 低渗时间由30分钟缩短至15分钟, 后期可制作出中期分裂相多且分散好的标本。

3.3 固定液的要求和固定时间的选择

固定液选用甲醇和冰醋酸体积比3∶1进行混合, 一定要现配现用, 以防液体挥发影响固定效果。预固定和固定的目的是为了防止细胞结团, 使染色体形态清晰可见[12]。常规实验预固定和固定时间通常较长, 笔者通过多次实验发现, 预固定处理2分钟和处理10分钟甚至更长时间所得实验结果比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 结果与文献报道一致[9]。同时还比较了不同固定时间对染色体制备的影响, 发现固定10分钟即可获得形态清晰的中期染色体, 与其他固定时间效果比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。

3.4 离心速度和离心时间的选择

以往实验步骤中离心速度为1 000转/分, 离心10分钟。为了提高实验效率, 笔者将离心速度提高到2 500转/分, 离心5分钟。经过实验结果比较, 发现提高转速、缩短离心时间对实验结果无影响。

3.5冰载玻片的要求和滴片高度的选择

猪附红细胞体三种染色方法的比较 篇7

1 材料与方法

1.1 猪附红细胞体待检血液

采自自然发病的附红细胞体患猪的静脉血, 并用健康猪的静脉血做阴性对照。其中的阴性对照是用瑞氏、姬姆萨氏、吖啶橙染色后为阴性的健康猪的血液。

1.2 姬姆萨氏染色

1.2.1 姬姆萨氏染色液的配制

按常规配制。

1.3 瑞氏染色

1.3.1 染色液的配制

1.3.2 染色方法

推片自然干燥后, 滴加染色液, 染色3min, 然后加等量蒸馏水再染5min, 蒸馏水冲洗。

1.4 吖啶橙染色

1.4.1 吖啶橙染色液的配制

按文献 (任怡敏, 1996) 进行。将0.01g吖啶橙溶于100ml Tris-HCl (0.05mol/l, p H7.5) 缓冲液中。

1.4.2 染色方法

将涂有标本的玻片用甲醇固定, 待甲醇挥发干净后将玻片置湿盒内, 加适量吖啶橙染液, 37℃, 100min。用p H7.4的PBS轻轻冲洗两次, 在荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 姬姆萨染色

2.1.1 不同p H值染色液对染色效果的影响

在p H 8.0以上的碱性环境中, 姬姆萨染料对附红细胞体的着色效果较好, 附红细胞体着色较深, 比较清晰, 而在p H8.0以下的环境中则着色不好。见表1。

2.1.2 染色时间的影响

染色6或12h观察, 整个血片着色不好, 18h以上可获得满意效果, 镜下观察附红体着色深, 轮廓分明。姬姆萨氏染色后在红细胞表面上可见到0.5-1.5μm的蓝紫颗粒, 呈圆形、逗号状, 每个红细胞上可出现多个。

2.2 瑞氏染色

瑞氏染色后细胞较大, 红细胞和附红细胞体均为深蓝紫色, 附红细胞体着色较深。在星形红细胞的突出部位或红细胞表面, 可见到圆形深染的颗粒状物, 每个红细胞上有3-8个不等。

2.3 吖啶橙染色

在荧光显微镜下红细胞为暗淡的绿色, 附红细胞体为发明亮荧光的绿色小体。

在大多数红细胞边缘及表面上可看到一些明亮的小体, 直径1μm左右, 为被吖啶橙染色的附红细胞体。

2.4 不同染色方法比较

临诊出现发烧、贫血、皮红、紫绀等症状的病猪血液推片, 大多数可见星形红细胞, 吖啶橙染色可在90%以上的出现星形红细胞的样本中检出附红细胞体。见表2。

注:++++, +++, ++, +分别代表100%、75%、50%、25%的阳性;-代表阴性;A:紫绀B:皮红C:发烧D:贫血

3 讨论

目前, 临床兽医往往根据临床症状、病理变化或显微镜下有无变形的红细胞作为附红细胞体的诊断依据, 有些学者由于不能直接看到附红细胞体的存在, 不承认附红细胞体的致病作用 (王水周, 2004;张家静, 2003) 。本研究结果表明, 使用正确的染色方法, 可在大多数自然发病的病例中看到附红细胞体, 在严重病例中, 绝大多数红细胞上都可以看到附红细胞体, 而且数量越多, 看到红细胞体越多, 细胞变形越明显。三种染色方法都可以使附红细胞体着色, 但是各有优缺点。

姬姆萨氏染色的优点是着色效果较好, 缺点是染色所需时间较长。另外需要注意p H的影响, p H值偏碱有利于附红体的着色。附红细胞体的颜色与染液的p H值有密切关系, p H值愈高则染色愈深。这是因为姬姆萨氏染液由天青及伊红组成, 天青游离时带正电荷, 伊红游离时带负电荷, 被染物的主要成分为蛋白质, 蛋白质本身带两种电荷, 当在碱性液体中时增加, 天青离子附着得多些, 附红细胞体则较蓝。在稀释姬姆萨氏原液时如果使用蒸馏水 (通常偏酸) , 不利于区别红细胞和附红细胞体, 这可能是其他作者看不到附红细胞体一个原因。染色时间对附红细胞体的着色也很重要, 浸染18h以上才能获得满意的效果。

瑞氏染色的优点是简单快速, 但是瑞氏染液中常常出现一些颗粒影响观察。配制染料时要研磨仔细, 先倒入少量染料、少量甲醇及甲醇后继续研磨, 如此反复数次。配制好后要多次过滤, 使用时尽量使用中间层, 以防颗粒沉积于血涂片上, 影响观察效果。染色后如果标本片上附有较多颗粒, 可滴加少量染液, 稍后冲洗即可除去。

附红细胞体在急性阶段, 吖啶橙染色后荧光显微镜下呈浅至深橘黄色。在慢性病例中呈淡黄色至淡绿色的点状。本研究中吖啶橙染片后附红细胞体呈亮绿色。另外, 用吖啶橙染色时核仁和核碎片也可发出荧光, 因此, 血涂片应在采样的当天制作, 防止出现假阳性。

很多作者认为附红细胞体不是引起病畜死亡的主要原因, 主要原因是红细胞破损引起机体免疫功能下降, 从而引起继发症导致机体死亡。但本研究表明红细胞上有如此多的附红体, 机体必然要对其产生免疫反应, 最后导致红细胞严重变形、大量裂解, 而导致黄疸、溶血性贫血、死亡。

参考文献

[1]曹澎辉.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京:农业大学出版社, 1991.

[2]任怡敏, 白岚, 梁玉等.应用吖啶橙染色快速检测沙眼衣原体[J].中华医学检验杂志, 1996, 19 (2) :124.

[3]王水周, 睢春霞.对近几年部分猪附红细胞体病诊断报道的一些看法[J].养禽业, 2004 (2) :30.

[4]张家静, 刘小燕, 李召展等.对猪发生附红细胞体病的调查研究和讨论[J].河南畜牧兽医, 2003, 24 (1) :26-29.

细胞染色 篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料

本组患者选自笔者所在医院门诊及住院患者50例, 30～35岁9例, 36岁～40岁29例, 41岁-45例12例。实验室进行精液常规检查的患者。在直接涂片检验, 高倍镜下判定为“白细胞”, 其数量<10/HP, 精子精量<50×109/L的对其同时进行涂片染色检验。

1.2 方法

正甲苯胺过氧化物酶染色:试剂应用饱和NH4CI溶液 (250g/L) , 50g/L Na2EDTA磷酸缓冲液 (pH 6.0) , 正甲苯胺 (0.25mg/mL) , 30%H2O2蒸馏水溶液。此工作液含:1m L试剂1;lm L试剂2;9m L试剂3;和一滴试剂此溶液配制后可使用24小时。试验步骤将0.lmL精液与0.9m L工作液混合, 振荡2分钟, 在室温下放置20～30min, 再振荡, 过氧化物酶阳性细胞被染成棕色, 而过氧化物酶陇性细胞不着色, 用白细胞计数池重复计数200个白细胞两次, 并估计过氧化物酶阳性和阴性细胞的百分比。

2 结果

共检验出疑似“白细胞”标本50份, 采用正甲苯胺过氧化物酶染色检查后, 仅发现10份标本系白细胞。其中5份仅检出白细胞, 5份标本同时还检出各级生精细胞, 其数量各约占50%。有18份标本只发现个别白细胞, 绝大部分细胞系为各级生精细胞。余22份标本只发现各级精母细胞而未发现白细胞。

3 讨论

精子中最主要的结构为一浓集的细胞核, 携带遗传物质即DNA, 成熟的精子中胞浆少, 既无核RNA又无浆RNA。既不生长, 也不分裂仅含单倍体量的DNA。从一个双倍体精原细胞发育为近百个单倍体精子需增加几十倍的DNA。用放射自显影术证明这些DNA均在精子细胞有丝分裂过程中合成, 细线期初级精母细胞后不再有DNA合成。初级精母细胞中含四倍量DNA, 经两次成熟分裂到精子细胞期即成为单倍体细胞。也曾用放射自显影术研究RNA代谢, 精原细胞和精母细胞均有RNA代谢, 精子细胞早期有低水平RNA合成, 中期精子细胞后就不再合成[2]。精原细胞和精母细胞均可合成核仁RNA及非核仁RNA。细线期与偶线期精母细胞中核仁RNA合成达高峰值, 而非核仁RNA合成高峰在粗线期精母细胞。

试验发现葡萄搪对精子发生过程中的蛋白质合成系统有保护作用。体外的氨基酸掺入试验证明, 加入葡萄糖后各级生精细胞中氨基酸掺入均增加。粗线期初级精母细胞的掺入量最多, 早期精子细胞掺入量增加的幅度最大。葡萄糖还能大大减轻温度对睾丸蛋白质合成的破坏作用。目前来看, 葡萄糖供应对精子细胞的变态过程及其蛋白质合成系统十分重要, 而精原细胞及初级精母细胞的蛋白质合成对葡萄糖的依赖就不强。故FSH起一始动作用, 发动以后单独靠睾酮也可维持一定生精功能。三种激素均不能直接作用于生精细胞, 都直接或间接作用于支持细胞, 然后进一步创造适合精子发生的内环境。已在支持细胞表面证实有FSH受体, FSH并不能通过血睾屏障;在支持细胞内也证实有雄激素受体[3]。雄激素也可作用于曲细精管壁周围的类肌细胞。大多数学者认为ICSH主要促进间质细胞分泌雄激素, 然后刺激精子发生, 这些均提示支持细胞在精子发生的调控中占特殊地位。又发现支持细胞还可调节间质细胞合成与分泌睾丸酮。体外培养的支持细胞可分泌一种促进间质细胞分泌睾丸酮的因子, 同时支持细胞可分泌雌激素及LHRH样物质, 这两个激素却是间质细胞功能的抑制因子。支持细胞与间质细胞间也有复杂的功能关系。

睾网液内的精子有活动能力, 一旦进入附睾头段后即失活力。精子在附睾运行过程中运动方式有规则性的改变, 先出现原地摆动, 然后转圈状运动, 最后才有螺旋式的向前运动。所以观察精子的运动方式是衡量精子成熟的一个指标。精子成熟过程中细胞内cAMP增加与精子动力获得密切相关。使用磷酸二酯酶可使未成熟精子内cAMP含量升高并产生一定运动能力, 但并无前向运动。研究证实附睾头部磷酸二酯酶的活性为附睾尾的两倍, 这可能是精子成熟过程中cAMP升高的原因。附睾上皮还可产生一特异的前向运动蛋白, 这种糖蛋白与附睾精子结合时可促进其产生前向运动[4]。另外Ca2+也是调节精子运动的重要因素。

精子发生过程中, 其核中发生组蛋白型的转变。精子在附睾内运行过程中精子核中DNA与鱼精蛋白紧密结合, 故表现为精子成熟过程中精子核的DNA细胞化学染色 (如Fculgen) 不断减弱, 这也是精子是否成熟的重要指标。精子成熟过程中最重要的结构改变是蛋白质结合硫基减少, 而二硫键增加。这种改变可见于精子核、顶体下区、顶体后区、精子中段、鞭毛纤维鞘、精子膜。如此广泛的转换与精子结构的稳定密切相关。

精子成熟过程中磷脂、脂肪酸及硫基等的改变均意味膜结构的改变。附睾分泌一些物质附着精子表面使精子结构与性质明显改变。精子膜在受精过程中起关键作用, 这表明精子成熟过程中其膜结构已成熟到能完成受精作用的地步;但另一方面附睾精子要在射出以后转运到输卵管时才真正发生受精作用, 故附睾精子膜在成熟的同时还将覆盖上一些物质使之暂时不起作用。总之精子成熟过程中膜有两方面改变, 一是为受精做好准备, 另一是暂时阻抑其受精功能。精子在阴道内不会获能, 若宫颈口开放则可使精子获能。子宫是精子获能的主要场所, 输卵管分泌液卵泡液及卵丘也参与获能, 精子只有与子宫内膜接触才能获能。分析家兔子宫及输卵管中的淀粉酶均高于血清水平几倍, 淀粉酶也随性周期改变, 以排卵期最高。另精子在宫腔内有大量白细胞出现, 白细胞一进人宫腔, 精子即与其附着, 白细胞中的糖原分解成葡萄糖供精子能量需要, 另自细胞特殊颗粒释放水解酶以去除精子表面的去能因子未完成获能的第一步反应。

卵母细胞外有一层糖蛋白构成的透明带, 透明带外是富含粘多糖的卵丘与放射冠, 精子要同时消化粘多糖和蛋白质才能与卵结合。顶体酶系中有一些特殊的酶, 透明质酸酶可消化卵丘细胞, 放射冠分散酶可使放射冠解体, 顶体蛋白酶使精子穿过透明带。透明质酸酶最适pH是3.8, 此酶的活性有赖于钠、钾浓度, hCG诱发排卵后的子宫液能促进其释放, 孕酮及切除卵巢后的子宫液则抑制其活性。放射冠分散酶是一脂糖蛋白, 只作用于放射冠不影响透明带。顶体蛋白酶是一大类蛋白酶, 可使透明带分解, 又称为类胰蛋白酶。人精子中顶体蛋白酶可被宫颈粘液中的抗胰蛋白酶抑制剂及抗凝血酶所抑制, 此三种物质在排卵期的宫颈粘液中均减少。顶体蛋白酶具氨基肽酶、酯酶及蛋白酶活性, 对精氨酸键有高度选择作用。顶体中还有唾液酸酶, 是与顶体结合最紧的酶。一般认为它可改变透明带的结构, 不让其他精子再穿过。

摘要：目的 探讨精液中白细胞检验情况, 评估与不育的关系。方法 应用涂片染色法采用正甲苯胺过氧化物酶染色检查后对本组50例患者临床标本进行检测, 并对结果进行判定。结果 10份标本系白细胞。其中5份仅检出白细胞, 5份标本同时还检出各级生精细胞。结论精液中白细胞与生精细胞有相关性。

关键词：精液,白细胞,不育

参考文献

[1]党小军, 胡淑玲, 李芒会.流式细胞术在白细胞精子症精子质量评估中的应用[J].现代检验医学杂志, 2011, 26 (3) :45-46.

[2]李如凯, 郭龙华.C14orf48基因在人精液精子中的表达和生物信息学分析[J].中国实验诊断学, 2011, 15 (6) :23-24.

[3]李雪兰, 钟晓敏.尿液中含有精子对检测结果的影响[J].检验医学与临床, 2011, 13 (6) :65-66.

细胞染色 篇9

1 对象与方法

1.1 对象

2015年1-12月来我院产科门诊进行产前筛查的孕妇27 335例, 经血清标志物AFP、Free-βhCG、uE3检测, 对筛查出的高危孕妇1 095例进行羊膜腔穿刺、羊水培养及染色体核型分析, 1 095例产前筛查高危孕妇预产年龄17.71~47.16岁, 怀孕15+1~20周, 羊水穿刺前均详细告知孕妇穿刺的目的及注意事项, 并按要求签暑知情同意书。

1.2 仪器与试剂

AFP、Free-βhCG、uE3试剂由芬兰Wallac Oy公司生产, 仪器为美国PE公司生产AOTU1235全自动免疫荧光分析仪, 室内质控由宝莱科技公司生产, 室间质评参加卫生部临检中心免疫组产前筛查质控。羊水培养试剂由杭州宝荣科技有限公司生产。

1.3 方法

每例孕妇在规定的孕周内抽取静脉血3ml, 严格按照说明书操作要求测定AFP、Free-βhCG、uE3含量, 采用lifeCycle软件进行风险评估。羊水培养, 取羊膜腔穿刺羊水10ml, 置无菌离心管中离心后, 于培养基中培养, 每例接种2瓶, 于37℃中培养7~9d, 收获, 制片, G显带, 每例计数20~30个分裂相, 核型分析不少于5个。

1.4 判断标准

21-三体高风险切值1∶270, ≥1∶270为21-三体高风险;18-三体高风险切值为1∶350, ≥1∶350为18-三体高风险;开放性神经管缺陷高风险切值为2.5, AFP-MoM≥2.5为开放性神经管缺陷高风险。

2 结果

2.1 高风险孕妇筛查

27 335例接受检查的孕妇中, 筛查出21-三体综合征高风险1 538例, 筛查阳性率5.63%;18-三体综合征高风险41例, 筛查阳性率0.15%;开放性神经管缺陷高风险127例, 筛查阳性率0.46%;高风险总阳性率为6.24%。

2.2 孕妇异常核型分析

1 095例高风险孕妇的羊水染色体检查, 共检出异常核型86例, 异常率为7.85%, 不同年龄组的孕妇异常核型分布见表1。86例异常染色体核型分布见表2。常染色体数目异常28例, 其中21-三体综合征19例 (其中11例年龄≥35, 8例年龄<35) , 18-三体综合征8例 (其中4例年龄≥35, 4例年龄<35) ;常染色体结构异常7例, 涉及1、2、3、5、7、13、20号染色体;性染色体数目异常4例, 性染色体结构异常1例;染色体多态性变异46例。

3 讨论

在提高产前诊断的准确率、降低盲目性方面, 可以采用对孕中期孕妇血清标志物联合筛查作为有力的检测技术。这种联合筛查因为有效、简单、无创, 所以孕妇容易接受, 而通过对筛查出的高危对象进行羊膜腔穿刺、羊水培养和染色体核型分析是确认胎儿是否存在染色体异常的最终方法。本文共筛查了27 335例孕妇的血清标志物, 筛查出的高危孕妇有1 095例, 进行了羊膜腔穿刺、羊水培养及染色体核型分析, 一共检出异常染色体核型86例, 检出率为7.85%。86例中确诊常染色体数目异常28例, 其中21-三体19例, 18-三体8例, 均建议孕妇选择终止妊娠。21-三体和其他染色体病患儿风险、染色体异常检出率, 呈上升趋势, 并且随着孕妇妊娠年龄的增长而明显增加。根据本文分析结果, 孕妇年龄>35岁的异常染色体核型检出率为10.8%。有报道[1]21-三体综合征患儿的孕妇年龄有年轻化趋势, 这与环境因素如空气污染等, 不健康的生活方式如吸烟、饮酒等, 现代化生活节奏快、压力大以及妊娠期病毒感染等有一定关系。美国妇产科医师协会 (ACOG) 2007年在指南中提出, 不论孕妇年龄大小都应对所有孕妇提供产前筛查, 因此有必要将产前筛查作为孕妇产前常规检查项目。然而, 就现有的技术和设备, 还不可能实现100%准确筛查, 总会有漏诊现象。石祖亮等[2]曾报道唐氏儿漏筛的现象。因此, 对产前筛查应严格规范, 让孕妇知晓筛查不等于确诊, 并签订孕妇知情同意书, 避免医患纠纷的发生。

本文统计数据中还有性染色体数目异常4例, 性染色体结构异常1例, 这些都可能产生无法预估的临床后果, 因此都建议孕妇放弃继续妊娠。性染色体异常中有1例为嵌合体。羊水细胞中, 不仅包含有胎儿自身脱落细胞, 还可能存在来自胎盘等胎儿附属物, 也可能有母体细胞污染, 所以在产前诊断时发现嵌合体, 应该鉴别是否是细胞外培养异常还是胎儿外非重要组织细胞的增生、是真性嵌合体还是假性嵌合体等。出现这种情况, 在进行染色体核型分析时, 可将分裂相计数的个数增加, 计数正常核型和异常核型的比例, 异常核型比例越高, 胎儿异常的临床表现通常会越严重。

本文86例染色体异常核型中, 常染色体结构异常7例, 占8.14%, 主要为倒位和易位。染色体核型分析时易位和倒位还是比较常见的, 但是在临床工作中对于易位及倒位的咨询要十分严谨, 应对患儿父母双方的染色体检查, 以确定其遗传是来自父母还是新增的, 然后再作出是否终止妊娠的建议。本文中有3例倒位胎儿确定其遗传来自母亲。患儿父母一方有染色体平衡易位和倒位者, 如果胎儿的染色体是遗传于母亲或父亲, 且表型正常, 则可建议孕妇继续妊娠保留胎儿, 但此类胎儿成年后仍会面临生育风险。因此, 在染色体核型分析时遇到此类染色体异常, 对其潜在的风险应向孕妇及家属充分说明, 结合孕妇的实际情况, 与临床医生一起做出最合适的遗传咨询。不平衡易位的染色体必须建议终止妊娠, 同时建议下次怀孕时必须进行产前诊断[3]。

本文数据统计中, 染色体多态性异常共计46例, 说明多态性变异在产前诊断羊水核型分析中有一定比例, 如染色体臂间倒位、随体柄长度增加、次缢痕长度增加等属于正常变异, 对此类变异基本可考虑选择继续妊娠。但近年来研究[4]表明多态性变异与异常妊娠有关, 如9号染色体臂间倒位等等。生殖细胞减数分裂过程会受到染色质不平衡的影响, 引起胚胎发育异常。遇到此类结果的咨询时, 必须建议对患儿父母双方外周血的染色体检查, 以明确多态的来源, 向孕妇及其家庭成员分析多态可能出现的表型、潜在的风险及患儿成年后可能发生的生育风险。

随着人民对生活水平、生活质量的要求提高, 特别是放开二孩政策以后, 高龄产妇明显增加, 能否生育健康婴儿更是成为每个孕妇及其家庭的希望, 而如何避免生育风险则对医务工作者提出了更高的要求。本文结果显示, 产前筛查高风险孕妇进行羊膜腔穿刺、羊水细胞培养和染色体核型分析, 可以安全、有效地检出胎儿染色体异常, 对降低缺陷胎儿出生率、提高胎儿生命质量、指导优生优育方面具有重要意义。

摘要：目的:探讨羊水细胞染色体核型分析在防止异常染色体患儿出生方面的作用。方法:对龙岩地区27 335例妊娠15~20周的孕妇血清标志物AFP、Free-βhCG、uE3进行检测, 对筛查出的高危孕妇1 095例进行羊膜腔穿刺、羊水培养及染色体核型分析。结果:27 335例孕妇中, 筛查出高风险1 706例, 总阳性率6.24%。1 095例产前筛查高危孕妇, 羊水细胞染色体核型异常86例, 检出率为7.85%, 其中常染色体数目异常28例, 占异常核型的32.56%;常染色体结构异常7例, 占异常核型的8.14%;性染色体数目异常4例, 占异常核型的4.65%;性染色体结构异常1例, 占异常核型的1.16%;染色体多态性异常46例, 占异常核型的53.49%。结论:产前筛查高危孕妇进行羊水细胞培养、分析染色体核型, 可以安全、有效地检出胎儿染色体异常, 对优生优育、避免缺陷胎儿出生具有重要意义。

关键词：产前筛查,产前诊断,羊水细胞培养,染色体核型分析

参考文献

[1]朱俊真, 余小平, 张德峰, 等.唐氏综合征儿出生和母龄年轻化变动趋势及预防策略〔J〕.中国优生与遗传杂志, 2006, 14 (11) :49.

[2]石祖亮, 易松.35 961例孕妇产前筛查结果回顾性分析〔J〕.中国优生与遗传杂志, 2010, 18 (2) :47-49.

[3]李广萍, 吴忠琴.贵阳地区1946例羊水细胞染色体核型分析〔J〕.中国优生与遗传杂志, 2013, 21 (5) :51-52.

细胞染色 篇10

1 100例胸腔积液患者的资料和方法

1.1 100例胸腔积液患者的一般资料

随机选取我院收治的100例胸腔积液患者(2013年10月至2015年12月),作为研究对象,分成对照组和观察组。

观察组50例胸腔积液患者男女分别为36、14例,最小患者的年龄为21岁,最大患者的年龄为73岁,50例患者年龄均值为(42.56±1.35)岁。

对照组50例胸腔积液患者男女分别为35、15例,最小患者的年龄为20岁,最大患者的年龄为71岁,50例患者年龄均值为(42.33±1.28)岁。

将观察组和对照组胸腔积液患者的一般资料进行均衡性比较,统计学结果无显著差别,P大于0.05,组间具有良好可比性。

100例胸腔积液患者及其家属均对此次的研究内容及研究目的进行了详细的了解,且均已自愿签署知情同意书。

1.2 检测方法

对照组胸腔积液患者采用常规细胞涂片的方法,观察组胸腔积液患者予以细胞块免疫组化染色检测,具体检测方法如下:(1)标本收集:于清晨收集100例胸腔积液患者的新鲜胸腔积液(50毫升),对其实施离心操作,将其置于3至5个试管中进行离心处理,转速为每分钟3000转,离心时间为10至15分钟,离心结束后,吸出上清液(移液枪),用试镜纸包裹分离剩下的沉渣,将其固定在浓度为10%的福尔马林中性固定液中,对其实施常规处理后,并将其制备成细胞蜡块,然后对其实施细胞连续切片,切片厚度以3至4微米为宜,对细胞涂片、细胞块切片分别实施HE染色。(2)免疫组化:对检测标本实施SP法染色,选择福州迈新生物技术开发有限公司生产的Maxvision试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂,CK7、CE A、WT—1、Calretinin、CK5/6、TTF—1等抗体均购于自基因公司,在对检测标本实施染色的过程中,操作者应严格按照试剂盒的相关说明书进行检测。

1.3 评估指标

比较两种检验方法的诊断价值。阳性诊断标准:CK7、CEA、CK5/6在胞浆胞膜或胞浆同时出现棕黄色可诊断为阳性;WT—1、TTF—1的细胞核出现棕黄色可诊断为阳性;Calretinin在细胞膜、细胞浆、细胞核出现黄色可诊断为阳性;腺癌细胞或间皮细胞所占比例超过10%以上可诊断为阳性。

1.4 统计学分析

对两种检验方法的诊断价值应用SPSS21.0统计学软件进行数据分析,以α=0.05作为检验标准,比较方法采用χ2检验(计数资料),比较结果用率表示,当P<0.05时,表示两种检验方法之间比较的结果存在差异,统计学有意义。

2 研究结果

2.1 比较两组胸腔积液患者的阳性率

对照组50例胸腔积液患者中,有28例患者的检测结果为阳性,有22例患者的检测结果为阴性,其阳性率为56.00%;观察组5 0例胸腔积液患者中,5 0例患者的检测结果均为阳性,其阳性率为100.00%;两组胸腔积液患者比较可得,组间阳性率的结果存在差异,统计学具有意义(P<0.05),相关实验数据如表1所示:

2.2 比较腺癌细胞和间皮细胞的不同抗体表达情况

抗体表达结果显示,CK7、CEA、TTF—1是腺癌较为特异性的抗体,而WT—1、Calretinin、CK5/6是间皮性肿瘤细胞较为特异性的抗体,两组抗体表达结果比较可得,组间结果存在差异,统计学具有意义(P<0.05),相关实验数据如表2所示:

3 讨论

胸腔积液属于胸部肿瘤的常见的并发症之一,主要来源于肺腺癌、非小细胞肺癌、原发性间皮性瘤等,临床诊断腔腔积液主要对胸腔腔积液实施细胞涂片检查,但由于长期受胸腔积液的刺激,导致原发性间皮性肿瘤和转移性癌细胞的形态学发生相应的改变,最终使得原发性间皮性肿瘤和转移性癌症的细胞形态较相似,给临床医师诊断、治疗该病带来了较大的困难,因此,对腔腔积液实施病理鉴别诊断显得至关重要[3,4,5]。

有研究发现[6],对胸腔积液实施常规细胞块切片检查结合免疫组化染色方法的效果较佳,可有效提高阳性检出率。本研究为了分析胸腔积液细胞块免疫组化染色的病理诊断价值,对胸腔积液患者分别实施常规细胞涂片方法、细胞块免疫组化染色方法进行检测。常规细胞涂片方法具有操作简单、有效保持细胞形态等优势,但该检查方法的准确性和敏感性较低,有数据表明,常规细胞涂片方法对恶性胸腔积液患者的诊断准确性约为60%左右[7]。而免疫组化染色法主要是通过已标记的特异性抗体对未知抗原进行检测,并利用酶所产生的着色反应来表示细胞的活性、定位及其分布情况。相比于其他的检查方法,该方法具有操作简单、定位准确、特异性高、敏感性高等特点,检出效果明显。

此次实验数据表明,观察组50例胸腔积液患者的阳性率为100.00%,对照组50例胸腔积液患者的阳性率为56.00%,对其进行比较可知,观察组50例胸腔积液患者的阳性率比对照组50例胸腔积液患者的阳性率高出44.00%,数据具有显著差异性,且研究发现CK7、CEA、TTF—1是腺癌较为特异性的抗体,而WT-1、Calretinin、CK5/6是间皮性肿瘤细胞较为特异性的抗体,这说明对患者实施细胞块免疫组化检测,有助于提高患者的阳性检出率,鉴别区分癌症类型,可以为临床诊断和治疗提供有效的依据。

总结上述研究内容得出,对胸腔积液患者实施细胞块免疫组化具有重要的诊断意义,值得推广实践。

参考文献

[1]章文华,周虹,李丹丹等.胸腔积液细胞块切片免疫组化染色在鉴别肺腺癌与间皮病变中的价值[J].浙江医学,2015,37(18):1501-1504,1509.

[2]侯兴华,金素芬,李春杨等.组合型抗体在胸腔积液细胞块诊断中的应用[J].诊断病理学杂志,2014,21(8):510-512.

[3]余卫东,蔡育波,刘琼茹等.细胞块切片免疫组化染色在胸腔积液病理诊断中的应用[J].中国现代医生,2014,52(12):127-129.

[4]岳红梅,顾峰,倪志宏等.膜联蛋白Ⅱ在肺癌组织、肺泡灌洗液和胸腔积液中的表达水平及在肺癌诊断中的价值研究[J].中国全科医学,2014,17(11):1307-1310.

[5]杨红敏,李振芬.细胞块切片免疫组化染色在胸腔积液病理诊断中的应用价值[J].中外医疗,2014,33(1):179,181.

[6]沈湘萍,陈艳,张小伟等.细胞块免疫组化在恶性小细胞肿瘤胸腔转移中的临床病理分析[J].现代实用医学,2014,26(6):686-687,封3.