氧化酶活性（共12篇）
氧化酶活性 篇1
辣根过氧化物酶是血红素过氧化物酶类中的一种,可催化无机物和有机物,如过氧化氢或烷基过氧化物类物质[1,2,3,4,5,6,7],此外,大多数苯酚类化合物可在胞外酶和过氧化物酶的作用下,自发进行氧化反应[8]。过氧化物酶类的传统意义上的酶活单位定义是由Willstalter 和 Stoll于1917年提出的,该定义是由间苯三酚的氧化速率来决定酶的活性。由于紫外光谱法测量酶活具有操作简单,快速,轻便,花费少等特点,是测定HRP酶活性最常用的方法[9]。自1954年以来,人们对上述技术进行了更为详细的研究[10],包括可能致癌和致突变物质在内的各种氢供体被用于测量过氧化物酶类活性[11,12]。另外,改进后的紫外光谱法将4-氨基安替吡啉和苯酚作为氢供体,其中的苯酚具有致癌作用,操作过程中要非常谨慎。这种方法测量反应速度是通过测量吸光度值的增加来实现的,过氧化氢在HRP作用下分解后形成的有色复合物导致了吸光值的增加[13]。
本项研究中,我们提出一种使用邻苯二酚-苯胺对作为新的氢供体组合,用于测定HRP酶活性,并完善了光谱学测定HRP酶活性的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
紫外可见分光光度计(Cary 100Bio,Varian),澳大利亚;色谱仪组件(Shimadzu C-R4A), 控制调节器(SCL-6A),紫外可见分光光度检测仪(SPD-6AV),液相色谱仪(LC-6A)和多空玻璃(100柱),RP-18(5 μm粒度)-LiChroCART 250-4。
纯度指标(RZ值)为2.0的Ⅱ型HRP、过氧化氢和超细氧化铝购于Sigma。苯酚、4-氨基安替吡啉、磷酸钠盐、邻苯二酚、2,2,6,6-四甲基哌啶酮肟盐酸化物(TMPOH)、苯胺以及乙腈(99.8%)购于Merck。所有实验溶液均用去离子双蒸水配制。
1.2 方法
1.2.1 实验采用有温度控制器的紫外可见分光光度计测量HRP酶活性
在恒温条件下,利用紫外光谱法测量HRP酶活性。首先,在0.2 M pH=7.0的PBS溶液中制备邻苯二酚(170 mM)和苯胺(2.5 mM)的混合物。然后,在空白对照和样本测试比色皿中分别加入450 μL上述混合液和500 μL 1.7 mM的过氧化氢(在每次测酶活之前,应首先测量过氧化氢浓度,根据过氧化氢在240 nm处吸光值和其消光系数ε240=43.6 cm-1 M-1获得过氧化氢浓度[14,15])。将紫外扫描波长设为510 nm,在25 ℃下,将两个比色皿放入紫外分光光度计中培养3～4 min至温度平衡。接着,适当稀释HRP浓度,使反应速率ΔA/min=0.02～0.04,之后,分别在空白对照比色皿中加入50 μL PBS,在样本测试比色皿中加入50 μL稀释后的HRP。最后,记录4～5 min之内的吸光值增加。根据对过氧化氢的分解过程以及生成的颜色产物(4-(邻苯二酚)苯-1,2-二醇)测量所获得的吸光值,我们可以来判断酶的反应速率。通过公式(1)计算得到HRP的酶活力:
其中4-(邻苯二酚)苯-1,2-二醇的消光系数ε510nm=5 cm-1 M-1。
将测得的实验结果与Worthington描述的常规方法测试的结果[13]进行比对,我们可以看到紫外分光光度计能够很好的测出HRP酶的活性
1.2.2 高效液相色谱分析
高效液相色谱分离法:在25 ℃时,在总体积为1 mL的溶液中含有0.2 M pH=7.0 PBS,H2O2(1.7 mM),邻苯二酚(170 mM),苯酚(2.5 mM)的混合溶液。为了防止酶污染色谱柱,将HRP酶溶液放入10 kDa的透析袋中,再放入反应混合液,逐渐形成粉红色的物质。然后吸取20 μL反应后的溶液直接注入色谱柱中,流动相乙腈溶液比率为10/90(V/V),以1.0 mL/min的流速从的起始点开始流动,60 min之后,比率慢慢变为90/10(V/V)。在254 nm处检测到邻苯二酚,苯胺,4-氨基安替吡啉,苯酚的吸收光谱图。当邻苯二酚-苯胺作为氢供体时,在510 nm波长处即可检测到酶促反应产物[16,17]。
2 结果与讨论
2.1 酶反应生成物
(光谱线从下往上每间隔30 s测一次;插图显示在510 nm处利用紫外分光光度计测得的酶促反应,同时在高效液相色谱法2.66 min处,也出现峰值)
考虑到有色物具有吸光的特点,所以在苯胺-邻苯二酚-H2O2存在的情况下,我们选择400～700 nm的波长研究HRP酶促反应的吸光光谱。在整个吸光光谱中,只出现了一个吸收峰,即在510 nm处具有最大吸光值(见图3)。这表明,在HRP酶促反应过程中,只发生了一个反应过程。为了证明这一点,将反应混合物放入高效液相色谱柱中进行分离层析,结果发现,在保留时间2.66 min处出现一个峰值(见图1插图)。这些结果与先前的研究报道是相一致的[18,19]。
2.2 与常规测酶活法灵敏度比较
测量HRP酶活性时,邻苯二酚-苯胺和苯酚-氨基安替吡啉两组氢供体组合在过氧化氢存在的情况下,利用发色团为显色试剂来测定HRP酶活性。如图2所示,测定HRP酶活性时,邻苯二酚-苯胺氢供体组合要比被广泛采用的苯酚-氨基安替吡啉氢供体组合具有更高的灵敏度(ΔA/min)[13]。
(插图表示在510 nm处吸光值与时间之间的关系;a:邻苯二酚-苯胺氢供体组合;b:苯酚-氨基安替吡啉氢供体组合)
2.3 重复性与检测限
测量检测限值(运用光谱法测定HRP浓度最小值),当酶浓度逐渐增加时,测量酶的ΔA/min值。如图3所示,从ΔA/min (510 nm处) HRP浓度曲线的交叉点测得检测限值为5.71×10-6 mg/mL。与测量HRP酶活性的常规方法相比,这种方法具有很好的优越性。
检查该方法的可重复性,在同样的条件下准备20份HRP检测样本,运用公式(1)计算出HRP的酶比活力(见图3)。根据20次实验所得到的测量结果,其相对标准偏差仅为2.9%,表明该方法具有很好的可重复性。
(插图表示测定HRP酶活的可重复性)
注:a.通过不同方法不同材料测定不同浓度HRP酶活性的过程得到的数值;b.在HRP浓度为1×10-5 mg/mL测其酶活,其他测试条件均按文中“材料与方法”所示;c.在同一实验条件下,通过5次测试结果算出R.S.D值。
从表1中可以看到,在测定HRP酶活性过程中,邻苯二酚-苯胺比苯酚-氨基安替吡啉灵敏度高,可靠性好。其中我们通过紫外分光光度计也测定其他氢供体组合对生成的产物颜色的变化,例如邻苯二酚-氨基安替吡啉,邻苯二酚-苯酚,邻苯二酚-TMPOH和苯酚-苯胺等氢供体组合,但是,结果不稳定,可重复性不好(数据未显示)。
为了研究pH对HRP酶活性测定的影响,在pH 4.5～8.5范围之间测定ΔA/min值。通过实验得到,在pH 4.5～6.5的范围内ΔA/min值逐渐增长,在pH 6.5～8.5的范围内达到平衡。因此,我们选择缓冲溶液PBS的pH=7.0作为整个实验的最适pH,并且与过氧化氢酶溶液的最适pH相一致[20,21]。
2.4 酶动力学研究
如图4所示,在邻苯二酚-苯胺和H2O2存在的情况下,利用Lineweaver-Burk(图4)和Michaelis-Menton(图4插图)绘制的HRP酶活图谱。在含有一定浓度过氧化氢酶,过氧化氢和苯胺的混合液中加入邻苯二酚后,所生成的颜色产物在510 nm处出现了明显的吸光值。如图4插图所示,邻苯二酚的起始浓度决定酶促反应的反应速率,而且,浓度至少在150 mM以上,才能获得稳定的状态。根据Lineweaver-Burk绘制的图得出,动力学参数Km和Vmax分别是12.5 mM和0.0122 mM min-1(12.2 mM min-1 mg-1)。
(插图为HRP米凯利斯-曼顿标绘图)
(ChemDraw Ultra(Cambridge Soft Corp)绘制)
3 结 论
当H2O2存在时,邻苯二酚-苯胺氢供体组合体系在酶促反应过程中,邻苯二酚与HRP自由基发生氧化,如图5所示,苯胺与邻苯二酚的自由基通过亲核攻击相结合,生成粉红色物质。在紫外可见光光谱法中,所生成的粉红色物质在510 nm处具有最大吸光值。因为邻苯二酚-苯胺比苯酚-氨基安替吡啉氢供体组合灵敏度高,因此可用于紫外光谱法测HRP酶活性。
摘要：对邻苯二酚-苯胺和苯酚-氨基安替吡啉构成的两组测定HRP酶活性的体系进行了研究和比较。紫外可见光光谱和高效液相色谱分析表明,在HRP催化过程中,邻苯二酚-苯胺氢供体对会生成为一种粉红色产物,该产物最大吸收波长在510 nm,可用于HRP的活性测量。且与常规使用的苯酚-氨基安替吡啉氢供体对的情况相比,具有更高的灵敏度、更低的检测限值和很好的重复性,在对HRP分别进行20次酶活测量,所得相对标准偏差仅为2.9%。使用邻苯二酚-苯胺氢供体对的方法可计算得到酶动力学参数Km(12.5 mM)和Vmax(12.2 mM min-1mg-1)。
关键词：辣根过氧化物酶,氢供体,邻苯二酚,苯胺,酶活测定
氧化酶活性 篇2
燃煤烟气脱硫氧化镁活性研究
为更好地提高镁法湿法烟气脱硫的脱硫效率,从脱硫剂氧化镁的活性出发,通过X射线衍射分析研究550～800℃高温煅烧制备的氧化镁,得出氧化镁活性与氧化镁制备温度及晶体结构之间的.关系,并通过鼓泡床脱硫实验得出活性大的氧化镁脱硫效率较高,对实际生产和运行具有一定的指导意义.
作 者：李娟 钱枫 李建宇 Li Juan Qian Feng Li Jianyu 作者单位：北京工商大学化学与环境工程学院,北京,100037 刊 名：环境污染与防治 ISTIC PKU英文刊名：ENVIRONMENTAL POLLUTION AND CONTROL 年，卷(期)： 27(3) 分类号：X5 关键词：烟气脱硫 氧化镁 活性 X-射线衍射氧化酶活性 篇3
关键词：生物活性肽；波纹巴非蛤；抗氧化活性
中图分类号： TS202.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0298-02
收稿日期：2013-12-06
基金项目：韩山师范学院青年科学基金（编号：LQ200811）。
作者简介：林丽云（1982—），女，广东潮州人，硕士，实验师，从事食品生物技术研究。E-mail：leayun_lin@126.com。抗氧化剂能够保护食物免受氧化损伤而变质，并且在人体的消化道内具有抗氧化作用，可以防止消化道发生氧化损伤；被人体吸收后，抗氧化剂可在机体其他组织器官内发挥作用。天然抗氧化剂具有较强的抗氧化活性和良好的食用安全性，因此在食品、保健品、药品等领域已经展现出良好的应用前景。随着海洋生物研究的深入和研究技术的提高，从海洋生物中寻找新的天然抗氧化剂已经成为海洋食品、药物、保健品研究的重要目标之一。
波纹巴非蛤（俗称花甲）是我国重要的海洋贝类资源，营养丰富、肉质鲜美，同时具有很高的食疗和药用价值。本试验以笔者所在实验室自制的波纹巴非蛤活性肽为原料，通过测定波纹巴非蛤活性肽清除亚硝酸根、过氧化氢、超氧自由基和羟自由基4种物质的能力，以期测定其抗氧化活性，从而进一步检验波纹巴非蛤活性肽的抗氧化能力，以期为波纹巴非蛤活性肽的后续研究提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
波纹巴非蛤活性肽，为笔者所在实验室自制。
主要试剂有茚三酮、酚酞、罗丹明B液、H2SO4、FeSO4、邻苯三酚、Tis-HCl缓冲溶液（pH值8.0）、浓盐酸、丙酮、NaNO2 标准溶液、0.01 mol/L藏红T溶液、靛蓝胭脂红、铜（Ⅱ）溶液等，均为分析纯。
1.2试验仪器
UV-2102/PC/PCS型紫外分光光度计，上海尤尼科仪器有限公司；pHS-3C精密酸度计，上海虹益仪器有限公司；KA-1000飞鸽牌高速离心机；气浴恒温振荡器，江苏省金坛市宏华仪器厂；电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；分析天平，潮州凯誉生物有限公司。
1.3试验方法
1.3.1波纹巴非蛤活性肽清除羟自由基（·HO）的能力
1.3.1.1羟自由基的测定取2支10 mL的刻度试管，在1支管中分别加入2.5 mL罗丹明B液、0.8 mL硫酸溶液、1.5 mL FeSO4溶液、1.0 mL H2O2溶液，加蒸馏水稀释至刻度处，摇匀并放置5 min后，置于1 cm比色皿中，用紫外分光光度计测定其吸收峰，确定其最大吸收波长为558 nm。然后用紫外分光光度计在558 nm处测定吸光度，计算其与空白参比的吸光度之差ΔD羟自由基。
1.3.1.2羟自由基清除率的测定在10 mL具塞刻度试管中依次加入2.5 mL罗丹明B溶液、0.8 mL硫酸溶液、1.5 mL FeSO4溶液、1.0 mL H2O2溶液，摇匀并放置5 min后，加入 1 mL 波纹巴非蛤活性肽溶液（浓度10 mg/mL），加蒸馏水稀释至刻度处，测定其吸光度D1；对照以溶剂代替，其余步骤同上，测定对照蒸馏水吸光度D对照1、空白体系（罗丹明B和H2SO4溶液）吸光度D空白1，计算清除率P1[1-6]：
P1=D1-D对照1D空白1-D对照1×100%。
1.3.2波纹巴非蛤活性肽清除超氧自由基能力的测定取5 mL 0.05 mol/L（pH值 8.0）的 Tis-HCl缓冲溶液，置于 25 ℃ 水浴中预热20 min，然后分别加入波纹巴非蛤活性肽样品液（蛋白浓度10 mg/mL）和0.4 mL 25 mol/L邻苯三酚溶液，混匀后置于25 ℃水浴中反应4 min，再加入8 mol/L HCl终止反应，于299 nm处测定溶液的吸光度（D2）。空白对照组以相同体积的丙酮代替待测样品，测定吸光度D空白2，计算清除率P2[2，5]：
P2=D空白2-D2D空白2×100%。
1.3.3波纹巴非蛤活性肽清除亚硝酸根离子能力的测定
2.2波纹巴非蛤活性肽对超氧自由基离子的清除率
由图2可知，波纹巴非蛤活性肽具有较强的清除超氧自由基离子的能力，清除效果明显，当相对分子质量在 43 000 u 左右时，达到最高峰，清除率达74%。
2.3波纹巴非蛤活性肽清除亚硝酸根离子的能力
由图3可知，波纹巴非蛤活性肽清除亚硝酸根离子的能力较弱，相对分子质量在31 000～54 000 u时，清除率在10%以上；相对分子质量在43 000 u左右时，达到最高峰，清除率达25%。
2.4波纹巴非蛤活性肽清除过氧化氢离子的能力
由图4可知，波纹巴非蛤活性肽清除过氧化氢离子的能力强，各阶段的清除率均在10%以上，相对分子质量在 43 000 u 左右时达到最高峰，清除率在60%以上。
2.5波纹巴非蛤活性肽清除4种离子的能力对比
由图5可知，波纹巴非蛤活性肽清除各种离子的能力为：超氧自由基>过氧化氢>羟自由基>亚硝酸根。波纹巴非蛤多肽液的相对分子质量在40 000～45 000 u时，清除4种离子的能力最强；当相对分子质量小于40 000 u时，随着相对分子质量的增大，抗氧化活性增大；当相对分子质量大于 45 000 u 时，随着相对分子质量的增大，抗氧化活性减小。
3结论
波纹巴非蛤活性肽应用于体外清除自由基的试验中效果
明显。波纹巴非蛤活性肽对超氧自由基清除率最高达74%，对过氧化氢清除率最高达61.5%，对羟自由基清除率最高达45%，对亚硝酸根离子的清除率最高达24%。当波纹巴非蛤活性肽分子量在40 000～45 000 u时，其清除超氧自由基、过氧化氢、羟自由基和亚硝酸根的能力均达到最大。
参考文献：
[1]范秀萍，吴红棉，王娅楠，等. 波纹巴非蛤糖蛋白的分离提取及体外清除羟自由基活性的研究[J]. 食品与发酵工业，2008，34（1）：138-140.
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佛手花抗氧化活性研究 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为佛手花,购自云南省腾冲县。供试仪器和设备为V-1100 型可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、SK2200H型超声波仪、AR224CN型电子天平、HH-S24S型数字显示恒温水浴锅(上海君竺仪器制造有限公司)、ZK 82J型电热真空干燥箱和EYELA N-1100型旋转蒸发仪。供试试剂为DPPH(国药集团化学试剂有限公司,纯度>99.0%)、槲皮素、山奈酚、咖啡酸、芦丁、没食子酸、香豆酸及香草酸标准品(国药集团浙江华东医药有限公司,纯度>98%)、番红花红、EDTA-Fe2+(现配现用)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、双氧水(现配现用)和乙醇等试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。
1.2方法
1.2.1 DPPH储备液的制备准确称取10mgDPPH,用无水乙醇溶解定容至100 mL,制得0.1mg·mL-1的DPPH储备溶液。然后用无水乙醇稀释成浓度为0.024mg·mL-1的标准溶液。
1.2.2佛手花提取物的制备将佛手花烘干,粉碎过筛,准确称取2.000 0g样品于100mL锥形瓶中,加入20 mL乙醇溶液,封口,超声提取3次,每次45 min,合并3次滤液于旋转蒸发仪中浓缩,转移到25mL容量瓶中,乙醇定容,备用。
1.2.3清除DPPH自由基能力的测定准确移取4.5mL DPPH标准溶液,依次加入一定体积的提取物制备液于10 mL比色管中,定容至5mL,置于暗处30min,在波长517nm下测定空白DPPH的吸光度值(A空白)及加入提取物后DPPH的吸光度值(A样品),按公式计算自由基清除率[4]。
1.2.4 羟自由基(·OH)的清除活性测定(1)准确移取1.00mL PBS于10mL比色管中,加入3.5 mL的蒸馏水,37℃ 水浴30 min,室温下冷却,调零。(2)对照组:依次加入1.00 mL PBS、1.50mL 40μg·mL-1番红花红、1.00mL EDTA-Fe(Ⅱ)、1.00mL蒸馏水于10mL比色管中,37℃水浴30 min,室温下冷却,测定吸光度A(λ =520nm),V总= 4.50mL。(3)空白组:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL 40μg·mL-1番红花红、1.00mL EDTA-Fe(Ⅱ)和1.00mL 3% H2O2于10mL比色管中,37℃水浴30min,室温下冷却,测定吸光度A0(λ = 520nm),V总= 4.50 mL。(4)样品组:依次加入1.00 mL PBS、1.50 mL40μg·mL番红花红、1.00 mL EDTA-Fe(Ⅱ)、10.0μL不同浓度的样品溶液以及1.00mL 3%H2O2于10mL比色管中,37℃水浴30min,室温下冷却,测定吸光度As(λ = 520 nm),V总=4.50mL[5]。
2 结果与分析
2.1 佛手花提取物对DPPH自由基清除率的影响
从图1可以看出,随着佛手花乙醇提取物浓度的增加,其对DPPH自由基清除率增大,当样品浓度达到1.6mg·mL-1时,清除率增加缓慢且呈平稳趋势。 佛手花总固形物浓度为0.08~1.28mg·mL-1时,通过测定佛手花乙醇提取物、没食子酸、咖啡酸、香草酸、芦丁和对香豆酸清除DPPH·自由基活性,得出对应的线性方程及各物质的IC50(见表1)。从表1可以看出,各物质清除DPPH自由基活性的能力顺序为:对香豆酸<佛手花提取物<香草酸<芦丁<咖啡酸<没食子酸。
2.2 佛手花提取物对羟自由基清除率的影响
由图2可知,羟自由基清除率随着样品浓度的增加而增大。根据所测定清除率与佛手花乙醇提取物总固形物浓度、槲皮素、芦丁、咖啡酸、山奈酚浓度的关系,得出清除率及佛手花乙醇提取物浓度、槲皮素、芦丁、咖啡酸、山奈酚浓度的线性方程(见表2)。从表2中可知,佛手花提取物、槲皮素、芦丁、咖啡酸、山奈酚清除羟自由基活性能力顺序为:芦丁< 咖啡酸< 佛手花提取物< 山奈酚<槲皮素。
3结论
氧化酶活性 篇5
研究了高铁氧化-活性污泥串联耦合工艺去除水中甲草胺的效能.高铁首先氧化降解废水中的甲草胺分子,然后进一步氧化其降解中间物.优化工艺条件下(高铁/甲草胺摩尔比2∶1,pH 7.0),高铁可在10min内完全去除40mg/L甲草胺,但无法实现对甲草胺的`完全矿质化,氧化后水体中仍有大量CODCr残留.延长高铁氧化时间可提高甲草胺废水的可生化性,并降低废水对活性污泥处理能力的抑制.优化工艺条件下高铁处理含40mg/L甲草胺废水20min可去除44.3%的CODCr;其可生化性指标(BOD5/CODCr)提高到0.87以上.该高铁氧化废水与市政污水按一定体积比混合后,可进一步采用活性污泥工艺最终对其实现完全矿质化过程.
作 者：张宝 欧阳涛 黄昭栋 李汉广 ZHANG Bao OUYANG Tao HUANG Zhao-dong LI Han-guang 作者单位：张宝,黄昭栋,李汉广,ZHANG Bao,HUANG Zhao-dong,LI Han-guang(江西农业大学,生物工程系,江西,南昌,330045)
欧阳涛,OUYANG Tao(江西省新余市,环境监测站,江西,新余,338000)
枳椇多糖体外抗氧化活性研究 篇6
关键词：枳椇；多糖；抗氧化
中图分類号： R284.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0316-03
收稿日期：2014-05-20
基金项目：四川理工学院大学生创新基金（编号：cx20120407）。
作者简介：魏丕伟（1983—），男，博士，讲师，主要从事生物技术方面的研究。Tel：（0813）5505979；E-mail：weipiwei2004@163.com。
通信作者：王凌云。E-mail： wanglingyun2004@163.com。枳椇（Hovenia acerba Lindl.）俗称拐枣，是一种遍布我国除东北、新疆、西藏以外大部分省区的鼠李科落叶乔木。枳椇果柄中含有丰富的多糖类化合物，其活性还未见报道。随着番茄红素抗氧化性的报道，番茄红素的保健品备受青睐，具有抗氧化活性的天然化合物的研究成为热潮。抗氧化性的评价有化学方法和生物学方法。化学方法可通过自由基的清除来表示，简单便捷，准确率高。自由基是生物体氧化过程中产生的中间代谢产物，当其过多时，会作用于生物膜磷脂不饱和脂肪酸、膜蛋白、代谢酶，影响细胞代谢的有序性和自调节能力，甚至使DNA分子变得不稳定，造成DNA损伤从而引起基因突变等[1]。尽管活的有机体一定程度上具有清除自由基的能力，但是适当补充外源性抗氧化剂仍然是有必要的。事实上，超氧阴离子自由基（ O-2· ）、二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）和羟自由基（OH·）等与衰老、癌症、心脑血管疾病和炎症的发生与发展密切相关。某些人工合成的抗氧化剂如BHT、BHA及PG等有一定的毒性，会对人体呼吸酶的活性造成不利的影响，甚至还有不同程度的致畸、致癌效应，这也引起了人们对人工化学合成抗氧化剂的担忧[2]。鉴于此，天然抗氧化剂的开发和使用，正成为现代食品工业发展所关注的焦点之一，具有广阔的应用前景。本试验对枳椇多糖的抗氧化活性进行测定，以期为枳椇的深入开发利用提供参考。
1材料与方法
1.1试验原料
枳椇购自安国药材市场，产地湖北。去除种子，取其果梗，蒸馏水清洗，置于烘箱55 ℃烘干，粉碎，过60目筛，粉末备用。
1.2试剂
二苯代苦味酰基自由基（DPPH·），Sigma公司；邻二氮菲，上海中秦化学试剂有限公司；维生素C，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；Tris（别名三羟甲基氨基甲烷、缓血酸胺），成都化学试剂厂；透析袋，成都奥克生物技术有限公司；甲醇、无水乙醇、盐酸、邻苯三酚、氯仿、正丁醇、过氧化氢、七水合硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、蒽酮等均为国产分析纯。
1.3主要仪器设备
UV1000紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；Alpha1-2 LD plus冷冻干燥机，德国CHRIST；JD100-4G电子天平，沈阳龙腾电子有限公司； RE-52A旋转蒸发器，上海红叶仪器设备公司；SHB-III循环水式真空泵，巩义市宇翔仪器有限公司；TDL-5C低速台式大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；粉碎机、电热鼓风干燥箱、恒温水浴锅等。
1.4试验方法
1.4.1枳椇粗多糖及精制多糖的制备由四川理工学院食品质量与安全实验室制备，方法参照文献[3]。
1.4.2枳椇多糖对羟自由基的清除试验枳椇多糖对羟自由基的清除是通过Fenton反应模型实现的，Fe2+与 邻二氮菲在 pH值2～9 的范围内可形成稳定的橙红色络合物，其最大吸收波长为510 nm[4]。Fenton体系中产生的羟自由基，可使Fe2+氧化为Fe3+，从而使在510 nm处的最大吸收峰消失，据此可推知系统中羟自由基的量的变化。当加入抗氧化剂时，枳椇多糖能清除溶液中游离的·OH，因而可以通过测量吸光度间接计算出样品对·OH 的清除率。精确称取一定量的枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和维生素C，均配制成0.50、1.00、150、2.00、2.50 mg/mL等5个浓度的待测液。试验分成5个平行组：调空白、空白组、对照组、样品组、本底组。取 0.75 mmol/L 邻二氮菲溶液1.0 mL于试管中，加入 0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH值7.4）2.0 mL和蒸馏水10 mL，充分混匀后，依次加入1.0 mL新配制的0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀，加入1.0 mL新配制的0.01%双氧水（H2O2），37 ℃下温浴60 min后，在510 nm处测吸光度，所测得的数据为损伤管的吸光度D损伤；未损伤管以1.0 mL蒸馏水代替损伤管中1.0 mL 0.01%双氧水（H2O2），操作方法同损伤管，可测得510 nm未损伤管的吸光度D未损；样品管以1.0 mL样品代替损伤管中的1.0 mL 蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得510 nm样品管的吸光度D样 ；将样品组中除样品不变，其余以对应体积蒸馏水代替，可测得510 nm样品管的吸光度D本底（详细加样量如表1）。记录数据，分别计算枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和维生素C对羟自由基的清除率。清除率（P）的计算公式为：P=（D样-D本底-D损伤）/（D未损-D损伤）×100%。式中的吸光度D详见表1。
nlc202309012238
2结果与分析
2.1枳椇多糖对羟自由基的清除作用
羟自由基毒性强、危害大，往往很难消除[7]。它的清除率是反映样品抗氧化活性的重要指标。枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和维生素C 3种样品溶液清除羟自由基的效果如图1所示。由图1可以看出，在试验浓度范围0.50～2.50 mg/mL，清除率与样品浓度有良好的线性关系。三者清除羟自由基的能力大小是维生素C>枳椇精制多糖>枳椇粗多糖。在浓度为0.50 mg/mL时，枳椇粗多糖对羟自由基的清除率为1089%，枳椇精制多糖对羟自由基的清除率为38.44%；随着样品浓度逐渐增大，枳椇粗多糖、枳椇精制多糖、维生素C清除羟自由基的能力都是逐渐增大，当浓度达到2.50 mg/mL时，枳椇粗多糖对羟自由基的清除率高达68.32%，枳椇精制多糖对羟自由基的清除率高达81.43%。可见枳椇多糖有明显的清除羟自由基的作用。
2.2枳椇多糖对DPPH自由基清除作用
二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）是一种很稳定的以氮为中心的自由基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，在517 nm有强吸收，其甲醇溶液呈紫色，当在其甲醇溶液中加入自由基清除剂时，DPPH·的单电子被配对，溶液的颜色会变浅，517 nm处的吸光度变小，而且颜色变浅的程度可以反映清除效果的大小[8]。枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和维生素C 3种样品溶液清除DPPH自由基的效果比较见图2。由图2可以看出，在试验浓度范围0.20～1.00 mg/mL，随着样品浓度逐渐增大，枳椇粗多糖和维生素C对DPPH自由基的清除率逐渐升高，而枳椇精制多糖对DPPH自由基的清除率变化不大，略有升高。当浓度为 0.20 mg/mL 时，枳椇粗多糖的清除率为43.58%，枳椇精制多糖的清除率达到67.57%，甚至高于维生素C的清除率（6081%），这说明在较小浓度范围内枳椇多糖就具有清除DPPH自由基的能力。当浓度为1.00 mg/mL时枳椇粗多糖、枳椇精制多糖与维生素C的清除能力相当，达到了80%左右。
2.3枳椇多糖对超氧阴离子自由基的清除作用
超氧阴离子性质活泼，具有很强的氧化性和还原性，过量生成可致组织损伤，在体内主要通过超氧歧化酶清除[9]。本试验以邻苯三酚自氧化反应产生超氧阴离子自由基为模型。邻苯三酚在碱性条件下自氧化产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子在体系中不断增加，生成有颜色的中间代谢产物，加入清除剂，可清除超氧阴离子自由基，阻止产物积累，使325 nm下的吸光度变小。故将枳椇多糖样品溶液及阳性对照物维生素C作为抑制剂加入到超氧阴离子自由基发生体系中，测定其吸光度的变化来判断样品对超氧阴离子自由基的清除效果。
枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和维生素C 3种样品溶液对超氧阴离子自由基的清除效果比较见图3。由图3可以看出，在试验浓度范围0.20～1.00 mg/mL，随着样品浓度逐渐增大，维生素C的清除率稳定，均高于90%，枳椇粗多糖的清除率略有上升，维持在30%～50%之间，枳椇精制多糖的清除率随浓度上升，但均低于15%。当浓度达到1.00 mg/mL时，枳椇粗多糖的清除率为48.24%，枳椇精制多糖的清除率仅为14.79%。可见在对超氧阴离子自由基清除效果方面，枳椇粗多糖要优于枳椇精制多糖，而维生素C又明显高于二者，说明枳椇多糖对超氧阴离子自由基有一定的清除作用。
3结论
本试验通过羟自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）和超氧阴离子自由基体系（ O-2· ），对枳椇多糖的体外抗氧化活性进行研究，以维生素C作为阳性对照，比较枳椇粗多糖、枳椇精制多糖对3种自由基的清除效果。研究表明，对Fenton体系产生的羟自由基，枳椇精制多糖有较好清除作用，清除能力大小为：维生素C>枳椇精制多糖>枳椇粗多糖。在浓度为0.50 mg/mL时，枳椇粗多糖对羟自由基的清除率为10.89%，枳椇精制多糖对羟自由基的清除率为38.44%；当浓度达到2.50 mg/mL时，枳椇粗多糖对羟自由基的清除率高达68.32%，枳椇精制多糖对羟自由基的清除率高达81.43%。在DPPH自由基体系中，枳椇多糖在较低浓度就表现出对DPPH自由基很高的清除能力，在浓度为1.00 mg/mL时枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和维生素C的清除能力接近，高达80%左右。枳椇多糖对超氧阴离子有一定清除作用，但清除效果不明显，枳椇粗多糖的清除率在30%～50%之间，枳椇精制多糖的清除率随浓度略有上升，但低于15%；清除作用大小为：维生素C>枳椇粗多糖>枳椇精制多糖。枳椇粗多糖与枳椇精制多糖比较，对羟自由基体系、DPPH自由基的清除效果，是枳椇精制多糖优于枳椇粗多糖，但对超氧阴离子自由基的清除效果是枳椇粗多糖优于枳椇精制多糖，可能是枳椇粗多糖中未除净的色素等杂质也起到了一定的清除超氧阴离子自由基的作用，使得枳椇粗多糖的清除率大于枳椇精制多糖。可见，并不是样品的纯度越高，清除自由基的效果越好。总之，枳椇粗多糖、枳椇精制多糖对羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基都有不同程度的清除作用，可以开发成枳椇多糖抗氧化作用的功能性食品。
参考文献：
[1]方允中，李文杰. 自由基与酶[M]. 北京：科学出版社，1989：244.
[2]阎果兰，靳利娥. 食品中抗氧化剂的发展趋势[J]. 山西食品工业，2005（3）：20-22.
[3]魏丕伟，王凌云，熊俐，等. 枳椇多糖提取工艺研究[J]. 江苏农业科学，2012，40（8）：272-274.
[4]凌关庭. 抗氧化食品与健康[M]. 北京：化学工业出版社，2005：340.
[5]索有瑞，王洪伦，汪汉卿. 柴达木盆地唐古特白刺果实降血脂和抗氧化作用研究[J]. 天然产物研究与开发，2004，16（1）：54-58.
[6]施建敏，俞志雄，庞会忠，等.华木莲叶黄酮类化合物抗氧化作用[J]. 江西农业大学学报，2006，28（5）：693-697.
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[8]朱利娜，強伟，史俊友，等. 唐古特白刺果粉的抗氧化作用研究[J]. 中国野生植物资源，2010，29（2）：41-43， 47.
[9]索有瑞. 柴达木盆地白刺研究与开发[M]. 北京：科学出版社，2010：323-330.
羽衣甘蓝抗氧化活性的研究 篇7
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验所用的材料为重庆花卉园的观赏用羽衣甘蓝。
1.2 试验方法
试验采用溶剂萃取法, 用丙酮作为萃取剂制备一定浓度的羽衣甘蓝提取液, 用时根据需要的浓度逐级稀释。分别用水杨酸法和α—脱氧核糖氧化法[2]测定其对羟自由基的清除作用以及加工处理、浓度、有机化合物和金属离子对其自由基清除能力的影响。采用固定反应时间法, 在相同体积的反应体系中加入一系列不同浓度的羽衣甘蓝提取液, 并以蒸馏水为参比, 与试剂空白液比较, 在510 nm处测量各浓度下的吸光度Ax, 便能测定被测物 (羽衣甘蓝提取液) 对·OH的清除作用, 其清除率计算公式为:清除率 (%) = (A0-Ax) /A0×100%其中A0为空白对照液的吸光度, Ax为加入提取液后的吸光度, 固定反应时间为1小时。在相同体积的反应体系:双氧水、硫酸亚铁、水杨酸-乙醇溶液 (9 mmol/L, 1 mL) 。
采用改良的烘箱贮存法测定其对猪油自氧化能力的抑制作用, 称取油脂样品 (猪油) 30.00 g于干燥的带塞锥形瓶中, 加入不同浓度和组合的试样, 充分摇匀, 置于60±1℃的恒温培养箱中, 每组试验平行作三个重复, 以空白作对照, 并定期摇动, 交换位置, 使条件均一化。采用美国油脂化学协会 (AOCS) 推荐的Na2S4O6-I2滴定法 (碘量法) [3], 测定过氧化值 (POV) 。
同时将其与Vc和柠檬酸对猪油的自氧化抑制作用进行了比较, 并测定了羽衣甘蓝提取液同二者的协同抗氧化效果。
2 结果与分析
2.1 羽衣甘蓝提取液对羟自由基的清除作用
由图1的结果可知, 羽衣甘蓝提取液有较好的清除羟自由基的功效, 在所用提取液的浓度为2.7%的前提下, 随着添加量的提高其清除率逐步加强, 最高清除率可达50.67%;当添加量达到5 mL时, 其清除能力趋于稳定, 说明在这个浓度下, 添加5 mL提取液对羟自由基的清除效果最佳。
2.2 羽衣甘蓝提取液对羟自由基的清除作用
2.2.1 羽衣甘蓝提取液对羟自由基的清除能力
注:A0=0.036, Ac=0.068。
由表1可知, 当提取液的浓度为25%时, 随着添加量的提高其清除率逐步加强, 最高清除率可达68.75%;当添加量达到0.5 mL时, 其清除羟自由基的能力趋于稳定, 说明在这个浓度下, 添加0.5 mL提取液对羟自由基的清除效果最佳。综合水杨酸法得出的结果可知:羽衣甘蓝提取液对FENTON体系中产生的羟自由基有较强的清除能力, 在一定的浓度下, 随着添加量的提高其清除率逐步加强, 且当添加到一定量的时候, 清除率就不再增加而趋于稳定;同时, 由图1中浓度为2.7%时, 最高的清除率为50.67%, 而浓度为25%时, 最高清除率为68.75%可初步推测, 其清除率是随着提取液的浓度的增加而增大的。
2.2.2 加工处理对羽衣甘蓝提取液的自由基的清除能力的影响
食品在其加工处理过程中往往经过一些处理, 如加热、杀菌、澄清、冷藏等, 这些处理如用于样品的提取物将会对其自由基清除能力产生影响, 表2给出了一些加工处理对羽衣甘蓝提取液的自由基清除能力的影响情况。
注:提取液的浓度为25%, A0=0.028, Ac=0.069。
从表2可以看出, 加热处理对羽衣甘蓝提取液的自由基清除能力并无影响, 活性炭处理和冷藏处理对其清除自由基的能力影响也不大, 但硅藻土处理会使其清除自由基的能力有所下降。这说明羽衣甘蓝提取液中具有自由基清除能力的有效成分在加热的条件下有很好的稳定性, 冷藏和加活性炭对其清除能力有略微的影响, 但其有效成分易被硅藻土吸附而损失。
2.2.3 浓度对羽衣甘蓝提取液的自由基的清除能力的影响
当对羽衣甘蓝提取液进行稀释后, 其自由基清除能力的改变如表3所示。从图中可以看出, 羟自由基的清除能力随着稀释倍数的增加而降低, 这说明提取液对羟自由基的清除能力与可溶性成分的浓度有关。当提取液稀释后, 可溶性成分浓度降低, 对羟自由基的清除能力随之降低。即提取液的自由基清除能力与其有效成分的浓度直接相关。
注:A0=0.026, Ac=0.060。
2.2.4 一些化合物对羽衣甘蓝提取液的自由基的清除能力的影响
注:A0=0.032, Ac=0.063。
从表4中可以看出:Vc和葡萄糖会增强羽衣甘蓝提取液对羟自由基的清除能力, 金属离子却减弱了羽衣甘蓝提取液对羟自由基的清除能力。这说明了具有还原性的有机化合物对羟自由基的清除有增效作用, 在将天然食品提取物作为原料生产保健饮料时, 添加糖等配料时不会对产品的羟自由基清除能力产生不利影响;相反金属离子特别是Ca2+, 由于其能催化还原性物质的氧化或者与具有羟自由基清除能力的有效成分作用, 从而减弱了羟自由基的清除能力。
2.3 羽衣甘蓝提取液对猪油自氧化的抑制能力的测定
2.3.1 自身抑制能力的测定
以浓度为2.7%的羽衣甘蓝提取液分别添加2 mL、4 mL、6 mL, 测定其对猪油自氧化的抑制作用。
由图2可知, 羽衣甘蓝提取液对猪油的自氧化有明显的抑制作用, 且随着加入提取液的量的增加, 抗氧化能力逐渐增强, 在一定范围内呈正相关。
2.3.2 与其它抗氧化剂的比较
以0.1 mol/L的Vc分别添加2 mL、4 mL、6 mL以及0.1 mol/L的柠檬酸分别添加2 mL、4 mL、6 mL, 将其与羽衣甘蓝提取液对猪油自氧化的抑制作用进行比较。
由图3可知, 6 mL、2.7%的羽衣甘蓝提取液与2 mL、0.1 mol/L的Vc对猪油自氧化的抑制效果相当, 其中6 mL、0.1 mol/L的Vc的抑制效果最佳, 且Vc的抗氧化能力与其浓度呈正相关。由图4可知, 6 mL、2.7%的羽衣甘蓝提取液与6 mL、0.1 mol/L的柠檬酸对猪油自氧化的抑制效果相当, 其中2 mL、0.1 mol/L的柠檬酸的抑制效果最佳, 但柠檬酸随着浓度的增加, 其对猪油自氧化的抑制作用是先增强再减弱的。综合图3和图4可知, 在羽衣甘蓝提取液、Vc、柠檬酸三者中, Vc对猪油自氧化的抑制作用最好。
2.3.3 与天然抗氧化剂的协同作用
将浓度为2.7%、体积为2 mL、3 mL、4 mL的羽衣甘蓝提取液分别和浓度为0.1 mol/L、体积为2 mL、3mL、4 mL的Vc溶液以及浓度为0.1 mol/L、体积为2 mL、3 mL、4 mL的柠檬酸溶液混合添加到猪油中, 以测定羽衣甘蓝提取液同V c和柠檬酸的协同抗氧化效果。
由图5和图6可知, Vc和柠檬酸对羽衣甘蓝提取液对猪油自氧化的抑制作用有明显的增效作用, 总的来说, 柠檬酸与羽衣甘蓝提取液的协同作用要好于Vc, 但是在6组数据中, 4 mL、2.7%的羽衣甘蓝提取液与2 mL、0.1 mol/L的Vc协同抗氧化作用最佳, 而2 mL、2.7%的羽衣甘蓝提取液与4 mL、0.1 mol/L的Vc协同抗氧化作用最差。Vc除了可通过捕获过氧化自由基, 阻断链反应而抑制油脂氧化外, Vc还有很强的还原性, 与油脂中的氧反应生成半脱氧Vc和脱氧Vc, 使油脂中氧浓度降低, 减慢自动氧化反应的速度;柠檬酸对羽衣甘蓝提取液的抗氧化活性有很好的增效作用, 是因为柠檬酸与油脂中的微量金属离子形成螯合物, 降低了金属离子对油脂氧化的催化活性, 从而增强了抗氧化剂的抗氧化效果。
3 讨论
从试验结果可以看出, 羽衣甘蓝对羟自由基的清除作用及对油脂自氧化的抑制作用都比较强, 加工处理对它的作用影响也不大, 且同其它抗氧化剂的协同作用也较好。其抗氧化的有效成分是叶黄素, 叶黄素的提取纯化有待进一步的研究。
参考文献
[1]宋曙辉, 薛颖, 武兴德.羽衣甘蓝的营养评价[J].营养学报, 2000, 22 (4) :358-359
[2]赵新淮.茶叶提取物对自由基的清除能力[J].东北农业大学学报, 1998, 29 (3) :284-288
芦根多糖的抗氧化活性研究 篇8
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
芦根购于安徽亳州药材市场;DPPH, Sigma公司;葡萄糖、无水乙醇、抗坏血酸、苯酚、乙醇、浓硫酸、NaOH、HCl、柠檬酸、磷酸氢二钠、NaNO2、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺和1-萘胺等均为分析纯;质量分数为33%二甲胺为化学纯。
1.2 仪器与设备
标准检验筛, 浙江上虞华美仪器纱筛厂;风选中药粉碎机, 山东省青州市精诚机械制造有限公司;FA2004电子分析天平, 上海越平科学仪器有限公司;KBS-250型数控超声波细胞粉碎机, 昆山市超声仪器有限公司;SENCO R201L旋转蒸发器, 上海申生科技有限公司;SHZ-D (Ш) 循环水式真空泵, 巩义市英峪予华仪器厂;XMT-152电热恒温干燥箱, 上海跃进医疗器械厂;HH-4型电热恒温水浴锅, 上海梅向医疗器械厂;DL-5低速大容量离心机, 上海安亭科学仪器厂;p HS-3C型酸度计, 上海雷磁仪器厂;7230G可见分光光度计, 上海精密科学仪器有限公司;UV-II型紫外灯, 北京炳洋科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 超声辅助提取
超声辅助提取工艺条件为芦根粉碎后过40目筛, 原料称取3.0g, 水为提取剂、液料比10mL/g、超声功率100W、超声温度60℃和超声时间50min, 在此条件下, 多糖得率为9.01%。
1.3.2 标准曲线的建立
按文献6方法稍加修改:精密称取葡萄糖125mg, 定容至50mL, 分别精密量取0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0m L至25mL容量瓶中, 加水至刻度, 摇匀, 取此系列溶液各2~10mL具塞试管中, 分别向上述试管中精密加入1mL 5%苯酚乙醇溶液和5mL浓硫酸, 摇匀, 置100℃水浴中反应15min, 反应完毕后取出, 放置至室温, 于紫外490nm处测定吸收值。以葡萄糖溶液浓度为横坐标, 其相应的吸收值为纵坐标, 绘制葡萄糖标准曲线:A=17.949C-0.017, R2=0.9977, 结果表明在0~0.05mg/mL之间线性良好。
1.3.3 抗氧化性的测定
1.3.3. 1 清除DPPH自由基活性的测定
按文献7方法稍加修改:将1mL不同浓度芦根多糖与3mL 1.42mmol/L的DPPH自由基反应, 测定反应平衡时 (40min) 517nm处的吸光值, 按下式计算芦根多糖对DPPH自由基的清除率:
式中:SR为清除率;Ac为未加试样只加DPPH的溶液的吸光值;Ai为加试样反应后DPPH溶液的吸光值;Aj为未加DPPH只加试样的溶液的吸光值。
1.3.3. 2 清除羟基自由基活性的测定
根据Fenton方法产生OH·自由基的模型, H2O2与亚铁离子反应生成·OH自由基, 该反应为:
H2O2+Fe2+→OH-+·OH+Fe3+
自由基一般存活时间比较短而且具有较高活性的特点, 而水杨酸能有效地捕捉羟基自由基且产生有色产物, 因此, 若在该体系加入一定量的水杨酸, 将发生如下反应:
生成的有色产物在510nm处被较强地吸收。这样, 我们可以在一定反应时间后, 测定吸光值 (此值可作为A0值) 。若在该体系中再加入多糖, 由于多糖具有清除羟基自由基的特点, 从而降低甚至完全清除羟基自由基, 而使有色物质的浓度极大降低。在此条件下测定体系的吸光值 (此值可作为清除一定量的羟基自由基的A值) , 即可用来测定多糖对羟基自由基的清除率。其清除效率可根据下式进行计算:
式中:SR为清除率;A0为空白对照液吸光值, 即只加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、双氧水, 未加试样的吸光值;Ax为加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、双氧水和加入相同体积的试样后的吸光值;Ax0为加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇和加入相同体积的试样, 未加双氧水引发反应的吸光值, 即本底吸光值, 在计算中予以扣除。
1.3.3. 3 对亚硝酸盐的清除作用
(1) 对亚硝胺合成阻断率的测定。在模拟人体胃液 (37℃, pH值为3.0) 的条件下, 二甲胺与亚硝酸钠可适宜地生成二甲基亚硝胺, 当往芦根多糖溶液中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时, 芦根多糖首先同亚硝酸钠反应, 使得二甲胺不能与亚硝酸钠反应, 达到阻断亚硝胺生成的目的。据此比较相同条件下生成亚硝胺量的多少来反映芦根多糖阻断亚硝胺合成能力的强弱, 生成亚硝胺量少, 其阻断能力就强, 反之则弱。
亚硝胺的测定采用紫外光解法。亚硝胺在紫外光照射下能分解释放出亚硝酸根, 与对氨基苯磺酸发生重氮作用形成重氮盐, 再与1-萘胺偶合生成红色络合物。用分光光度计测出该化合物的吸光值, 就可知反应液中的亚硝胺含量。再分别加入0.3517mg/mL的芦根多糖溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12mL于12支25mL比色管中, 然后都加入p H值3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液10mL, 再加入1.0mmol/L的Na NO2溶液1.0m L、1.0mmol/L的二甲胺溶液1.0mL, 用蒸馏水稀释到刻度, 于37℃恒温反应1h, 得亚硝胺溶液。取此亚硝胺溶液1.0mL于10mL的试管中, 加入0.5mL的质量分数为 (下同) 0.5%的Na2CO3溶液, 用紫外灯照射15min, 取出后加入1%的对氨基苯磺酸溶液1.5mL, 0.1%的1-萘胺溶液1.5mL, 蒸馏水0.5mL, 至试管中的体积精确为5.0mL, 摇匀, 静置15min后, 在最大吸收波长λmax=525nm处测其吸光值。
式中:BR为清除率;Ap为加入试样后NaNO2的吸光值;A为未加试样时NaNO2的吸光值。
(2) 对亚硝酸钠清除率的测定。亚硝酸盐在弱酸性的条件下, 与对氨基苯磺酸重氮化后, 再与N-1-萘基乙二胺盐酸盐偶合生成红色络合物, 用分光光度计测出该化合物的吸光值, 就可知道反应液中亚硝酸盐含量多少。根据这一原理比较同一条件下亚硝酸盐含量的多少来反映芦根多糖清除亚硝酸盐能力的大小, 亚硝酸盐含量少, 其清除能力就强, 反之则弱。分别精确吸取5.0mg/L的NaNO2标准液2.0m L于12支25m L比色管中, 再分别加入0.3517mg/mL的芦根多糖溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12mL, 37℃恒温反应20min。加入质量分数0.4%的对氨基苯磺酸2.0mL摇匀, 静置, 5min后再加入质量分数0.2%盐酸萘乙二胺1.0mL, 用蒸馏水稀释至刻度, 摇匀, 静置15min后, 在确定的最大吸收波长λmax=540nm处测定吸光值。
式中:SR为清除率;Ap为加入试样后NaNO2的吸光值;A为未加试样时NaNO2的吸光值。
2 结果与分析
2.1 对DPPH自由基的清除作用
由图1可知:芦根多糖对DPPH自由基有明显的清除作用, 在25~250μg/mL的浓度范围内, 其清除DPPH自由基的能力为23.11%~65.75%, 且随着浓度的增加, 其对DPPH自由基的清除能力增强, 即两者之间存在量效关系。
2.2 对羟基自由基的清除作用
由图2可知:芦根多糖对羟基自由基有明显的清除作用, 在10.67~128μg/mL的浓度范围内, 其清除羟基自由基的能力为10.91%~71.63%, 且随着浓度的增加, 其对羟基自由基的清除能力增强, 即两者之间存在量效关系。
2.3 对亚硝化反应抑制作用
2.3.1 对亚硝胺合成的阻断率
由图3可知:芦根多糖对亚硝胺合成的阻断率, 随芦根多糖用量的增加而增加, 当试验体系中加入的芦根多糖量达到12mL时, 阻断率可达58.13%, 说明芦根多糖可有效地阻断亚硝胺的合成。
2.3.2 对NaNO2的清除率
由图4可知:芦根多糖对NaNO2的清除率, 开始时随芦根多糖用量的增加而增加;但当试验体系中加入的芦根多糖量达到9mL时, 再增加用量, 其对NaNO2的清除率基本不变;当加入12mL芦根多糖溶液时, 其对NaNO2的清除率可达65.90%, 说明芦根多糖对亚硝酸钠有一定的清除能力。
3 结论
芦根多糖对DPPH自由基和羟基自由基具有良好的清除能力, 且随着多糖浓度的增大清除能力增强, 两者之间存在着量效关系;芦根多糖能有效地阻断亚硝胺的合成, 且对亚硝胺合成的阻断率, 随芦根多糖浓度的增加而增强;芦根多糖对亚硝酸钠也有一定的清除能力。
摘要：本文分别采用DPPH自由基法、羟基自由基法和对亚硝化反应的抑制作用, 研究了芦根多糖的抗氧化性。结果表明:芦根多糖对DPPH自由基和羟基自由基具有良好的清除能力, 能有效地阻断亚硝胺的合成, 同时对亚硝酸钠也有一定的清除能力。
关键词：芦根,多糖,抗氧化活性
参考文献
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柠檬精油抗氧化活性的研究 篇9
柠檬精油(lemon essential oil,LEO)是由柠檬皮中提取的一种天然产物,其主要成分为柠檬烯(limonene,LIM)[3]。茶多酚(tea polyphenol,TP)是多酚类衍生物的混合体,是一种非常重要的天然抗氧化物质。近年来的研究发现柠檬精油也具有抗氧化活性[4,5]。本课题组前期在国内外首先开展了柠檬精油防龋的系列研究,然而,对于其抗氧化的能力知之甚少。本实验采用经典的液体稀释法测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)以下5个浓度的柠檬精油对(DPPH·)和(·OH)的清除能力,并与柠檬烯、茶多酚作对比,以期为柠檬精油抗氧化活性的开发与利用提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料、仪器及主要试剂
材料:柠檬精油(自提);柠檬烯(97%)(英国Alfa Aesar公司);茶多酚(北京Solarbio科技有限公司)。试剂:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-three nitrophenylhydrazine,DPPH)(德国Sigma-Aldrich有限公司);95%乙醇,硫酸亚铁,水杨酸,双氧水,吐温80。仪器:三用恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司);紫外线分光光度计(德国Eppendorf公司);Mono Bloc型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 LEO溶液的制备
采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,取柠檬皮颗粒(直径:2 mm<粒径<4 mm)100g,置圆底烧瓶中,加水适量,浸泡后,加热回流,收集蒸馏出的挥发油(p H≈6.03)。由于柠檬烯与柠檬精油均不溶于水,因此实验中用吐温-80作为增溶剂。吐温-80(polyoxyethylene 80)易溶于水,是一种非离子型表面活性剂,可用作注射液及口服液的增溶剂或乳化剂等。将相同浓度的吐温-80乳浊液作为对照组,以排除吐温-80对自由基清除的影响。
1.2.2 DPPH自由基清除实验
分组:LEO(mg/ml):2.250、1.125、0.562、0.281、0.140。LIM(mg/ml):6、5、4、3、2。TP(mg/ml):1.6、0.8、0.4、0.2、0.1。吐温-80(mg/ml):0.250、0.125、0.063、0.031、0.016。
取3.0 ml去离子水与3.0 ml DPPH溶液混合,摇匀,于40℃恒温避光静置30 min后,测得吸光度Ao;同等条件下另取3.0 ml不同浓度的样品溶液,分别加入3.0 ml DPPH溶液,测定吸光度Ai;取3.0 ml对应浓度的样品溶液与3.0 ml去离子水混匀后测吸光度Aj(表1)。
清除率:P=1-(Ai-Aj)/Ao(1)
1.2.3 羟自由基清除实验
配置2.250 mg/ml LEO溶液、3 mg/ml LIM溶液、0.4 mg/ml TP溶液、3 mmol/LH2O2溶液、6 mmol/L水杨酸溶液、2 mmol/L Fe2+溶液备用。Fenton反应产生的(·OH)易攻击芳环化合物产生羟基化合物,因此在体系中加入水杨酸,用光谱测定法测定其羟基化产物-2,3-二羟基苯甲酸[6]。
在25.0 ml比色管中依次加入Fe2+3.0 ml、H2O21.0 ml,37℃水浴15 min,加入水杨酸3.0 ml,水浴15min,定容至25.0 ml,测得其吸光度Ao;另在不同的比色管加入Fe2+3.0 ml、H2O21.0 ml,分别加入待测液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 ml,37℃水浴,再加入水杨酸3.0 ml,水浴15 min后取出,定容至25.0 ml,测其吸光度Af(表2)。
清除率:P=(Ao-Af)/Ao(2)
1.2.4 自由基清除能力的测定
由于试样溶液的浓度不同,测得的清除率难以比较,因此抗氧化剂清除自由基的能力采用IC50值来表示。IC50值的意义:当达到50%清除率时,单位质量抗氧化剂所清除的自由基的质量。IC50值越高,抗氧化剂的自由基清除能力越强。
IC50(mg/ml)=50%×加入的自由基的质量/加入试样溶液中溶质质量(3)
1.3 数据分析
本实验每组药物重复实验6次,结果以±s的形式表示。采用软件SPASS 16.0统计分析,对符合正态分布的计量资料进行单因素方差分析(One-Way ANO-VA),检验水准α=0.05。
表1 LEO、LIM、TP对(DPPH·)的清除作用Tab 1 Scavenging effect of LEO,LIM,TP on(DPPH·)
注:3组药物F值均大于F0.05(4,25)=2.76,因此P≤0.05;吐温-80组P≥0.05
表2 LEO、LIM、TP对(·OH)的清除作用Tab 2 Scavenging effect of LEO,LIM,TP on(·OH)
注:3组药物F值均大于F0.05(4,25)=2.76,P≤0.05;吐温-80组P≥0.05
2 结果
2.1 柠檬精油、柠檬烯、茶多酚对(DPPH·)及(·OH)的清除作用
根据公式1~2计算样品溶液对(DPPH·)及(·OH)的清除率并作图。
从图1~2可以看出LEO、LIM、TP对(DPPH·)和(·OH)都有很好的清除能力,在测试浓度范围内,随着浓度的增加,清除率呈明显上升趋势。
2.2 自由基清除能力的比较
由图1~2可以看出,各组清除率与抗氧化剂的浓度之间接近线性关系。线性方程表示如下:
DPPH组:LEO:Y=38.192C+15.646,R2=0.993;LIM:Y=11.543C-11.822,R2=0.986;TP:Y=23.973C+27.917,R2=0.841。
羟自由基组:LEO:Y=89.938C-7.352 4,R2=0.975;LIM:Y=22.049C+3.423,R2=0.979;TP:Y=806.06C-36.529,R2=0.993。
式中Y为清除率(%)。C为抗氧化剂质量浓度(mg/ml)。
图1 LEO、LIM、TP对(DPPH·)的清除作用Fig 1 Scavenging effect of LEO,LIM and TP on(DPPH·)
图2 LEO、LIM、TP对(·OH)的清除作用Fig 2 Scavenging effect of LEO,LIM and TP on(·OH)
2.2.1 对DPPH自由基清除能力的比较
由线性方程计算出清除率为50%时3种抗氧化剂的浓度EC50分别为0.899、5.356、0.921。按公式(3)计算出IC50分别为0.014、0.002、0.014。因此,对DPPH自由基的清除能力:柠檬精油>茶多酚>柠檬烯。
2.2.2 对羟自由基清除能力的比较
由线性方程计算出3种抗氧化剂的浓度EC50分别为0.638、2.110、0.107。按公式(3)计算出IC50分别为0.013、0.004、0.079。由此可见,3种试剂对羟自由基的清除能力:茶多酚>柠檬精油>柠檬烯。
3 讨论
本实验采用的DPPH检测法是通过分子中1个稳定的DPPH自由基和抗氧化剂提供的1个电子配对结合,使DPPH的紫色消失[7,8],因此可以检测自由基的清除能力,亦作为评价活性物质抗氧化能力的指标。
Mizrahi等发现,用含有柑橘属植物精油的涂剂能够减轻口腔溃疡患者的疼痛,并能缩短愈合时间。将具有抗氧化活性的药物用于口腔颌面部手术后患者,能减小术后发热及术区肿胀情况。由此证明外源性氧自由基清除剂的应用能够清除局部增加的氧自由基而促进溃疡愈合,有助于抑制手术创伤后氧自由基对机体的进一步损伤。
柠檬精油提取过程中无任何添加剂,原液p H≈6.03,毒副作用小,对健康有益。本课题组于2007年开始研究证实柠檬精油及其主要成分有抑制常见口腔致龋菌的生长、抑制变形链球菌生长粘附的作用,LEO及LIM对链球菌的MIC分别为4.5、21 mg/ml[9,10]。柠檬精油还可以改变早期牙菌斑内细菌的构成[11],对变形链球菌及表兄链球菌的葡糖基转移酶、乳酸脱氢酶有抑制作用[3,12],并且对单纯疱疹病毒感染也有抑制作用[13]。茶多酚是从绿茶中提取的多酚类化合物,具有较强的供氢能力,是目前国际公认的一种理想的天然抗氧化剂,对变形链球菌的MIC为4.0 mg/ml[14]。本实验通过对比LEO和TP两种提取物对自由基的清除能力可知,柠檬精油具有与茶多酚相同的抗氧化能力。
本课题组前期研究分析表明,LEO的主要成分以烯类化合物为主,包括LIM、β-蒎烯、4-皆烯等同分异构体。该实验比较LEO及其主要成分LIM对自由基的清除能力,所得结果显示LIM对两种自由基的清除能力均小于LEO,由此可知,LEO作为一种混合物,除LIM外,尚有其他成分对自由基的清除起作用,对于其他成分的详细分析,仍有待于进一步的研究。
氧化酶活性 篇10
本实验工作主要涉及黔产鱼眼草植物生物活性研究,以期发现其活性部位及有效活性成分,为有效开发和利用提供科学的依据。
1 材 料
1.1 药材
鱼眼草植物采自贵州省贵阳市,经贵阳医学院陈德媛教授鉴定为菊科(Compositae)鱼眼草属(Dichrocephala)鱼眼草(Dichrocephala integrifolia (L.) O.Kuntze)全草,标本存于贵州大学化学与化工学院化学系。
1.2 药品
1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH),日本东京化成工业株式会社;α-糖苷酶(EC)和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG),Sigma公司;二甲基亚砜,天津基准化学试剂有限公司;阿卡波糖(Acarbose, Lot 16869),德国Serva 公司;4-硝基苯酚(4-Nitrophenol, PNP),美国Alfa Aesar公司;黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌,上海天呈生物信息有限公司;其余试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器
紫外可见分光光度计(UV-2000型),上海尤尼克仪器有限公司;万分之一分析天平,美国Mettler-Toledo公司;混合器(CS-H1型),北京博励阳科技公司;酶标仪,美国Thermo Electron公司;生化培养箱(LRH-150),上海一恒科学仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-30KB),上海申安医疗器械厂;洁净工作台(JJ-CJ-2FD),吴江市净化设备总厂。
2 实验方法
2.1 提取分离
干燥鱼眼草全草10 kg 粉碎,用95% 乙醇冷浸提取4 次(每次10 d)。减压回收乙醇,得浸膏(1200 g) ,加水分散,分别用石油醚,乙酸乙酯,正丁醇萃取,减压回收溶剂得到石油醚部分(170 g) ,乙酸乙酯部分(420 g) ,正丁醇部分(550 g)。
利用多种层析手段对鱼眼草乙醇提取物各部分进行分离和纯化,得到15个单体化合物,通过理化数据和波谱分析方法鉴定了13个单体化合物结构,分别是:正十八烷酸(1)、豆甾-7,22-二烯-3-醇(2)、α-香树脂醇(3)、表木栓醇(4)、十八酸甲酯(5)、正四十三烷(6)[2]、正二十二烷(7) 、正二十八烷酸(8)、正二十酸甲酯(9)、十六烷酸三十烷醇酯(10)、脱镁叶绿素甲酯(11)、柳穿鱼素(12) 、柳穿鱼素-7-葡萄糖甙(13)[3]。所有化合物均为首次从该种植物中分离得到。
2.2 抗氧化活性
DPPH 方法:按照文献[4],将样品用甲醇配制成一系列浓度,取0.1 mL样品加入3.5 mL DPPH甲醇溶液(0.06 mmol·L-1),混合30 min 后测定515 nm 波长处吸光度。每份样品平行操作 3 次,取平均值,计算出清除率,并计算出半数抑制率(IC50)。
利用体外DPPH微量抗氧化模型进行抗氧化活性筛选,结果表明:所得化合物和4个部位的抗氧化活性都不理想。
2.3 α-糖苷酶抑制活性
α-葡萄糖苷酶活力的测定参照文献方法,根据所采用的反应体系: 112 μL磷酸钾缓冲液(pH 6～8) ,加入20 μL 0.2 U·mL-1 α-葡萄糖苷酶, 8 μL DMSO, 37 ℃恒温, 15 min后加入215 mmol·L-1 PNPG 20 μL,摇匀, 37 ℃恒温反应15 min。再加入80 μL 0.2 mol·L-1 的Na2CO3 溶液,于405 nm波长下测OD值[5]。
初筛浓度为50 μg/mL,并对初筛抑制率大于50%的化合物进行复筛。其筛选结果如下表2。
采用α-葡萄糖苷酶抑制模型进行α-糖苷酶抑制活性测试,结果表明:脱镁叶绿素甲酯(IC50=19.23 mg·L-1)和柳穿鱼素-7-葡萄糖甙(IC50=30.27 mg·L-1)的体外抑制α-糖苷酶抑制活性远高于对照acarbose(IC50=1081.27 mg·L-1)。
2.4 抑菌活性
2.4.1 KB纸片法
纸片扩散法按照文献的方法[6],用微量加样器分别取5 μL 样品加到直径6 mm 的圆形滤纸片上,挥干试剂后,置于含菌平板,37 ℃恒温培养24 h,记录下抑菌圈的大小。每份样品平行操作3 次,用DMSO 作空白对照。
注: “-”表示无抑菌作用。
初筛结果表明:所有筛选样品中,化合物柳穿鱼素-7-葡萄糖甙和正丁醇部位对小麦赤霉病菌的抑制活性最好(抑菌圈直径d分别为2.4 cm, 2.5 cm),醇提物和石油醚部位对小麦赤霉病菌也有明显抑制效果(抑菌圈直径d分别为1.6 cm, 1.2 cm);醇提物部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位脱镁叶绿素甲酯、柳穿鱼素-7-葡萄糖甙对玉米大斑病菌有明显的抑制效果(抑菌圈直径d分别为1.7 cm, 1.3 cm, 1.2 cm, 1.5 cm, 1.1 cm);所有筛选样品中,醇提部位、石油醚部位和化合物脱镁叶绿素甲酯、柳穿鱼素-7-葡萄糖甙对番茄灰霉病菌的抑制效果最好(抑菌圈直径d分别为2.3 cm, 2.1 cm, 2.7 cm, 2.0 cm),乙酸乙酯部位、正丁醇部位对番茄灰霉病菌也有明显抑制效果(抑菌圈直径d分别为1.8 cm, 1.9 cm)。
2.4.2 肉汤稀释法
最低抑菌浓度(MIC) 的测定将出现抑菌圈的样品进行对半梯度稀释,按文献方法操作进行,每个浓度梯度平行3 次,取平均值。用DMSO 作空白对照出现抑菌圈的最低样品浓度即为MIC 值[7]。
运用肉汤稀释法进行抑菌活性实验,实验结果表明:石油醚部位和乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯氏菌,铜绿假单胞菌都具有抑制作用,乙酸乙酯部位的抑菌活性较好。
3 结 论
前期对新鲜鱼眼草的花和茎叶采用固相微萃取技术提取挥发油成分,用气相色谱-质谱联用技术对挥发油进行分析测定,发现β-蒎烯成分在鱼眼草花和茎叶挥发油中都有且含量较大[8],根据文献记载,此成分具有较强的抗炎作用[9]。
本实验通过提取分离化合物,并对各萃取部分和所得单体化合物进行抗氧化(DPPH)、α-糖苷酶、抑菌活性筛选,发现了鱼眼草的活性部位及其有效活性成分,为开发和利用这种药用植物资源提供了科学的依据。
摘要：通过对DPPH自由基的清除能力对鱼眼草的抗氧化活性进行评价;考察了鱼眼草的抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性和抑菌活性。应用体外α-葡萄糖苷酶筛选模型进行鱼眼草酶抑制活力的测定;采用KB纸片法和肉汤稀释法测定鱼眼草的抑菌活性。结果:鱼眼草的化学成分及各部位提取物的抗氧化活性并不理想;化合物脱镁叶绿素甲酯(IC50=19.23 mg.L-1)和柳穿鱼素-7-葡萄糖甙(IC50=30.27 mg.L-1)的体外抑制α-糖苷酶抑制活性远高于对照acarbose(IC50=1081.27 mg.L-1);KB纸片法表明部分化合物和提取物具有较好的抑菌活性,肉汤稀释法表明乙酸乙酯部位的抑菌活性较好(金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌的MIC分别为32、64、128μg.mL-1)。
关键词：鱼眼草,DPPH,α-糖苷酶抑制,抑菌活性
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氧化酶活性 篇11
关键词：糙米酵素；提取物；抗氧化性
中图分类号：TS210 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2015）06-0060-03
糙米酵素是由发芽糙米加入蜂蜜后利用酵母菌培养而成的。发芽是指糙米中所含的大量酶被激活释放，并从结合态向游离态的酶解过程。在此过程中，酵母菌吸取糙米营养并衍生出数十种新的酵素，使其营养价值超越了糙米本身。另外，酵素内含有β-胡萝卜素、维生素E、蛋白质分解酵素、淀粉分解酵素、脂肪分解酵素，以及丰富的蛋白质、粗纤维、糖质、铁、钙、钠等成分，可帮助营养素迅速吸收，提高人体免疫力，并能活化细胞，促进新陈代谢。目前，国内对糙米酵素的研究主要集中在工艺上，对糙米酵素提取物的抗氧化性的研究报道较少。为此，特对糙米酵素提取物抗氧化活性进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
糙米酵素：由糙米加蜂蜜发酵后制得；玉米胚芽油：中粮金龙鱼；酵母菌：实验室保藏的安琪酵母；稻谷：晚籼稻谷。其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器和设备
粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；UV-2000分光光度计：上海精密仪器厂；荧光分光光度计：上海精密仪器厂；电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；真空抽滤机：天津泰斯特仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 糙米酵素的制备 用砻谷机使稻谷脱壳变成糙米。准确称取糙米400 g，用水洗净，加水2 000 mL，于32 ℃浸泡21 h。选取芽长1 mm的发芽糙米作为试样，低温冻干后用万能粉碎机粉碎，过40目筛，于
-20 ℃冷冻保存。准确称取发芽糙米粉末20.0 g，加水量为150%，加蜂蜜量为8%，加玉米胚油量为5%；糙米酵素最佳发酵条件为酵母用量10%，发酵时间2 h，发酵温度35 ℃；发酵后用纱布粗过滤，在3 500 r/min下离心，抽滤，再离心，均分为4份备用。
1.3.2 糙米酵素提取物的提取 取1份糙米酵素加入100 mL 80%乙醇溶液，超声11 min，离心后取上清液，重复3次。混合上清液进行真空浓缩，用HCl溶液调整pH值至2～3，用己烷（50 mL×4，每次30 min）脱脂，用乙酸乙酯萃取。萃取液用Na2SO4脱水后蒸发浓缩，用甲醇溶解并定容至5 mL。
1.3.3 DPPH自由基清除率的测定 分别准确称取质量浓度为0.1 mg/mL的DPPH标准储备液（现用现配）于50 mL比色管中，配置质量浓度依次为0，2，4，8，12，16，20 μg/mL的标准系列溶液，在516 nm处测定上述标准系列溶液的吸光度，绘制标准曲线（如图1所示）。
取不同体积的提取液用乙醇稀释至3.0 mL，再加入1.0 mL 0.20 mmol/L DPPH乙醇溶液启动反应，使反应体系中DPPH的终浓度为0.05 mmol/L。摇匀后于室温下避光放置30 min，然后以乙醇为参比，测定反应液在516 nm处的吸光度。提取物对DPPH的清除率的计算公式为：
DPPH清除率（%）=1-[（A空白-A加样）/A空白×100%]
1.3.4 清除超氧阴离子（O2-·）能力的测定 采用间苯三酚自氧化体系法测定。对超氧阴离子清除率的计算公式为：
O2-·清除率（%）=（A空白-A加样）/A空白×100%
1.3.5 清除羟基自由基（·OH）能力的测定 采用Fenton反应分光光度法进行测定。对羟基自由基（·OH）清除率的计算公式为：
·OH清除率（%）=（A加样-A空白- A损伤）/（A未损伤-
A损伤）×100%
2 结果与分析
2.1 清除DPPH自由基的能力
糙米酵素提取物和BHT对DPPH的清除率如图2所示。
由图1可知：两种试样对DPPH自由基的清除能力随着溶液质量浓度的增加而增大。当质量浓度为0.64 mg/mL时，糙米酵素提取物清除DPPH的能力与BHT相等，为71%；当质量浓度小于0.64 mg/mL时，糙米酵素提取物清除DPPH的能力大于BHT；当质量浓度大于0.64 mg/mL时，糙米酵素提取物清除DPPH的能力稍小于BHT；当质量浓度为1.0 mg/mL时，糙米酵素提取物清除DPPH的能力为82%，稍小于BHT的89%。总体来说，糙米酵素提取物与BHT的清除DPPH能力相差不明显。
2.2 清除超氧阴离子（O2-·）的能力
糙米酵素提取物和BHT对超氧阴离子（O2-·）的清除率如图3所示。
由图2可知：两种试样对O2-·的清除能力随着溶液质量浓度的增加而增大。糙米酵素提取物清除O2-·的能力略低于BHT，但稳定增长。当质量浓度为1.0 mg/mL时，糙米酵素提取物清除O2-·的能力为40%，而BHT清除O2-·的能力为80%。
2.3 清除羟基自由基（·OH）的能力
糙米酵素提取物和BHT对羟基自由基（·OH）的清除率如图4所示。
由图3可知：两种试样对·OH的清除能力随着溶液质量浓度的增加而增大，但清除率增大趋势逐渐变缓。当质量浓度为1.0 mg/mL时，糙米酵素提取物清除·OH的能力为70%， 而BHT为78%。总体来说，二者清除·OH的能力相差不明显。糙米酵素对·OH具有较好的清除能力，其原因可能是糙米酵素中含有供氢体，能够提供氢质子，可使具有高度氧化性的自由基还原，从而终止自由基连锁反应，起到清除或抑制自由基的目的。但在高质量浓度时，抑制效果出现微增长现象，可能是糙米酵素中某物质能将Fe3+还原成Fe2+，增加了·OH生成反应的底物，导致·OH再次产生。
nlc202309041846
3 结论
当质量浓度为0.64 mg/mL时，（下转第64页）（上接第61页）糙米酵素提取物清除DPPH自由基的能力与BHT相等，为71%；当质量浓度小于0.64 mg/mL时，糙米酵素提取物清除DPPH的能力大于BHT；当质量浓度大于0.64 mg/mL时，BHT清除DPPH的能力稍大于糙米酵素提取物。糙米酵素提取物清除超氧阴离子和羟自由基的能力稍小于BHT，但相差不大。
通过试验可知，糙米酵素有较好的抗氧化效果，但对DPPH，O2-·和·OH的清除率规律性不强，需要进一步对提取物中的具体物质进行鉴定。
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Research on Antioxidant Activity of Brown Rice Ferment Extract
LI Jingsong， JIAN Zhongli*
（College of Grain Science and Technology， Shenyang Normal University， Shenyang 110034， China）
Abstract： In the article， it expounded the method of adding honey in germinated brown rice， used yeast fermentation to produce brown rice ferment， and studied antioxidant activity of brown rice ferment extract. The result showed that the clearance ability of brown rice ferment extract to DPPH free radical， superoxide anion and hydroxyl radical is very strong and no big difference comparing to ordinary antioxidant BHT.
Key words： brown rice ferment； extract； antioxidant
叶下花黄酮抗氧化活性研究 篇12
关键词：叶下花,黄酮,抗氧化,自由基清除
叶下花(Ainsliaea pertyoides Franch. var. albo-tomentosa Beauverd)也称白背兔耳风、白背叶下花、追风箭等,是菊科(Compositae )帚菊木族(Mutisieae Cass)兔耳风属(Ainsliaea DC)草本植物。在《本草纲目》等多种药典中均有收录[1]。叶下花作为骨科良药,资源丰富、药效优良,例如能治疗强直性脊柱炎,意义重大,应用十分广泛[2]。但除了叶下花的用药研究之外,实生苗训化、质量控制、有效成分药理学研究、化学成分系统研究以及用药安全等大部分领域的研究都还十分缺乏,给叶下花中药现代化带来困难。业已证明,植物黄酮是具有多种生理功能的活性成分[3],本实验用有机溶剂提取叶下花黄酮成分,以芦丁和抗坏血酸作对比,用3种体外模型研究了叶下花黄酮成分的还原力和抗氧化活性,以期为叶下花用药的中药现代化提供理论基础。
1 实验部分
1.1 中药材与主要试剂和仪器
叶下花干燥全草,采自云南省楚雄市树苴镇。芦丁(rutin)标准品,成都欧康植化科技有限公司。亚铁氰化钾(K3Fe(CN)6)、三氯化铁(FeCl3)、亚硝酸钠(NaNO2)、硝酸铝(Al(NO3)3)、氢氧化钠(NaOH)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸二氢钠
(Na2HPO4)、过氧化氢(H2O2)、三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)、硫酸亚铁、邻二氮菲(1, 10-Phenanthroline)、抗坏血酸(ascorbic acid, Vc)、水杨酸(salicylic acid)、无水乙醇等均为分析纯;实验用水为去离子水。
Unic 7200可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司),电子天平(Sartorius, Bs210s,北京赛多利斯天平有限公司),HWS12型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司),0408-1台式低速离心机(上海医疗器械集团有限公司),RE-200型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),RO-DI-50-RE纯水系统(厦门锐思捷公司)。
1.2实验方法
1.2.1 叶下花总黄酮提取
用电子天平准确称取10.0000g叶下花干燥全草粉末,控制水浴温度为65℃,用体积分数为55%乙醇-水回流提取,每次用300mL溶剂提取3次,共2h,滤过,合并,定容至1000mL,得棕黄色的叶下花总黄酮(flavonoid extract from A. pertyoides, FE)提取液。避光低温保存,待用。
1.2.2 芦丁标准曲线的绘制
采用NaNO2-Al (NO3)3-NaOH 法测定总黄酮[4]。精确称取芦丁标准品50mg, 置于50mL量
瓶中,加60%乙醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得芦丁标准溶液。
分别配制不同浓度的芦丁标准溶液,各取10.00mL,先分别加入质量分数5% NaNO2溶液1mL,摇匀, 放置6min后, 分别加入质量分数5% Al(NO3)3溶液1mL,摇匀,再放置6min后, 再分别加入质量分数10%NaOH 溶液10mL,用水稀释至50.00mL,摇匀,放置10~15min后, 采用试剂参比,在λ =510nm处测定吸光度A。用Origin6.1软件进行数据处理(下同),得标准工作曲线回归方程为A=0.009 84C+0.046 92,相关系数r=0.999 47,线性范围12.80~121.80mg/L。线性关系良好, 可以作为叶下花总黄酮含量的测定方法。
1.2.3叶下花总黄酮含量测定
取总黄酮提取液10.00mL,按与芦丁相同的方法测定吸光度值,并据芦丁标准工作曲线计算定容到100mL后黄酮提取液中总黄酮的质量浓度为401.0mg/L。进而计算在叶下花样品中总黄酮的质量分数为4.010% (40.10mg/g)。另将所得溶液在旋转蒸发仪中减压蒸干,准确称取少量固体,重新溶解,在容量瓶中配制成1000g/L的叶下花黄酮提取液,用于抗氧化活性的测定。
1.2.4 叶下花黄酮成分还原力的测定
参考Oyaizu[5]的方法,稍有改动,取2.5mL不同浓度的黄酮提取液于试管中,依次加入2.5mL0.2mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS, pH 6.6)和2.5mL1% K3Fe(CN)6溶液,于50℃水浴20min后快速冷却,再加入2.5mL10%三氯乙酸溶液(TCA),以3000r/min的转速离心10min,取上清液2.5mL,依次加入2.5mL蒸馏水,0.5mL0.1%FeCl3溶液,充分混匀,静置10min后,在700nm下测定其吸光度值(以蒸馏水代替样品的混合液作参比溶液),吸光度值越高还原力越强。
同法测定抗坏血酸和芦丁的还原力。
1.2.5 叶下花黄酮成分抗氧化活性的测定
采用邻二氮菲法[6]和水杨酸[3]法两种方法对叶下花黄酮成分的 ·OH清除率进行实验,以评价叶下花黄酮成分的抗氧化活性。
邻二氮菲法:分别取1mL7.5mmol/L邻二氮菲溶液于试管中,依次加入2mL0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)和1mL去离子水,充分混匀,加入1mL7.5mmol/LFeSO4混匀,加入1mL0.1% H2O2;于37℃水浴60min后,在536nm处测定吸光度值,所测的数据为损伤管的吸光度值A损伤。未损伤管以1mL去离子水代替损伤管中1mL0.1%的H2O2,操作同损伤管,可测得未损伤管的吸光度值A未损。样品管以1mL样品代替损伤管的1mL去离子水,操作同损伤管,可测得样品管的吸光度值A样品。
羟基自由基清除率=[ (A样品-A损伤)/( A未损-A损伤)]×100%。
水杨酸法:利用H2O2 对Fe2+ 混合产生 ·OH,在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质,该物质在510nm下有最大吸收。反应体系中含有8.8mmol/LH2O22mL、9mmol/LFeSO42mL、9mmol/L水杨酸-乙醇2mL,不同浓度的叶下花黄酮溶液2mL。最后加H2O2启动反应,37℃反应0.5h,以蒸馏水为参比,在510nm下测量各溶液的吸光度,考虑到本身的吸光值,以9mmol/LFeSO42mL,水杨酸-乙醇2mL。不同浓度的叶下花黄酮溶液2mL为黄酮的本底吸收。
羟基自由基清除率=[Ao- (Ax -Axo)]/Ao × 100%。
式中:Ao为空白对照液的吸光度,Ax为加入黄酮溶液后的吸光度,Axo为不加H2O2黄酮溶液的本底吸光度。
抗坏血酸和芦丁的羟基自由基清除率分别按照以上两种方法同法测定。
2 结果与分析
2.1 叶下花黄酮的还原力
抗氧化剂的还原力与其抗氧化性之间存在十分密切的关系。抗氧化剂是电子的给予体(electron donor),通过自身的还原作用给出电子而清除自由基,还原力越强,抗氧化性越强。因此,可通过测定还原力来说明其抗氧化活性的大小[7]。普鲁士蓝法测定还原力的原理是样品将铁氰化钾(K3Fe(CN)6)还原成亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6),亚铁氰化钾再与Fe3+作用,生成亚铁氰化铁(普鲁士蓝),在700nm波长处检测普鲁士蓝的吸光度,以表示还原力的大小,吸光度越高样品的还原力就越强。
用此法测定叶下花黄酮成分、芦丁、抗坏血酸的还原力,结果如图1所示。
从图1看出,3者还原力均随浓度增加而逐渐增大,呈现较好的量效关系,都具有较强的还原力。叶下花黄酮提取物的还原力与抗坏血酸的很接近,特别是在低浓度范围内超过抗坏血酸;与芦丁相比,还原力在所测定浓度范围内比芦丁强很多,同样在低浓度范围内叶下花黄酮提取物显示出更强的还原力。
2.2 叶下花黄酮成分抗氧化活性
2.2.1 邻二氮菲法
参照Fenton 反应[8]的方法建立 ·OH自由基产生模型。H2O2与二价铁离子混合后产生 ·OH的Fenton反应为:H2O2 + Fe2+=OH-+·OH+Fe3+,·OH具有很高的反应活性,存活时间短。如果加入抗氧化剂,将会有更多的Fe2+存留于溶液中,而使吸光度增加,从而可用计算出的羟基自由基清除率表示出抗氧化剂的活性。
抗坏血酸、芦丁、叶下花黄酮提取物的羟基自由基清除率的实验结果如图2所示。
从图2看出,随抗氧化剂加入量增加,羟基自由基清除率明显增大。当加入抗氧化剂的质量浓度为50.00mg/L时,抗坏血酸和芦丁的清除率分别为28.87%、30.01%;而叶下花黄酮为65.82%,是抗坏血酸和芦丁的两倍多;最高可达82.58%,接近抗坏血酸,在低浓度范围内则超过抗坏血酸;在所测定浓度范围内均比芦丁强得多。
通过Origin软件分析可知,叶下花黄酮提取物、抗坏血酸和芦丁的半清除率质量浓度SC50分别为39.17、66.50、91.06mg/L,从SC50来看,叶下花黄酮提取物的羟基自由基清除率约为抗坏血酸的2倍,更比芦丁的2倍还强。
2.2.2 水杨酸法
Fenton反应产生的 ·OH,也可在反应体系中加入水杨酸来有效地捕捉,并产生有色产物。该产物在510nm处有强吸收,若加入具有清除·OH功能的被测物,它会与水杨酸竞争 ·OH,从而使有色产物的生成量减少。采用固定反应时间法,测量含被测物反应液的吸光度,并与空白液比较,便能测定被测物对 ·OH的清除情况。图3为叶下花黄酮提取液、抗坏血酸(Vc)、芦丁3 种物质对羟基自由基的清除实验结果。
由图3可知,自由基清除率变化趋势与邻二氮菲模型中结果十分相似,也是随抗氧化剂浓度增加,自由基清除率增大,量效关系十分显著,变化关系更具规律性。同样,叶下花黄酮的羟基自由基清除能力接近抗坏血酸,并比芦丁强得多,最高可达61.96%。但加入量超过100.0mg/L后,清除率增加程度随浓度增加不是很显著。
在水杨酸-Fe2+-H2O2模型中,叶下花黄酮提取物、抗坏血酸和芦丁的SC50分别为97.04、88.22、211.4mg/L,叶下花黄酮的自由基清除能力小于抗坏血酸,且很接近,但比芦丁的强得多。
3 结论
生命活动的有氧代谢可以不断产生各种自由基,羟基自由基 ·OH是其中3种有代表性的自由基(超氧阴离子自由基 ·O2-、羟基自由基 ·OH、酯自由基RCOO· )之一,Fenton反应是体内产生羟基自由基的重要机理。羟基自由基是造成组织脂过氧化、蛋白质解聚、核酸断裂、多糖解聚的重要活性氧。羟基自由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标[9]。人体自身内源性自由基清除系统可以清除体内多余自由基,但毕竟有限,更多的是发掘外源性抗氧化剂——自由基清除剂,将其添加到药品中或食品中,阻断自由基对人体的入侵。
本实验利用普鲁士蓝法研究了叶下花黄酮提取物的还原力,并利用与人体内产生羟基自由基相似的机理(Fe2+-H2O2模型)研究了叶下花黄酮提取物的抗氧化活性。结果显示,还原力和抗氧化活性的变化关系具有一致性,均随浓度增加而逐渐增强,呈现很好的量效关系;羟基自由基清除率最高可达82.58%(在邻二氮菲-Fe2+-H2O2模型中);在与抗坏血酸和芦丁的比较研究中,可以看出,叶下花黄酮提取物的还原力和抗氧化活性接近抗坏血酸,在低浓度范围内则超过抗坏血酸,且在所测定浓度范围内均比芦丁强得多。总体来看,叶下花黄酮提取物具有较强的还原力和抗氧化活性,其活性与抗坏血酸相当,且比芦丁强得多,其顺序为抗坏血酸≈叶下花黄酮>芦丁。研究结果为从叶下花黄酮中分离提取具有较高活性的新型抗氧化剂奠定基础,也为叶下花用药安全、质量控制、药理作用、药物开发等中药现代化的基础研究提供依据。
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