干扰素抗体（共4篇）
干扰素抗体 篇1
γ-干扰素 (IFN-γ) 是机体免疫细胞产生的一种细胞因子, 具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等诸多重要的生物学活性。自1986年牛γ-干扰素 (BovIFN-γ) 被成功克隆和表达之后, 国内外相继展开了对重组牛γ-干扰素 (rBovIFN-γ) 及其单克隆抗体 (McAb) 的研究。近年来, 国内也有BovIFN-γ单克隆抗体制备的相关报道。研究用纯化的rBov IFN-γ蛋白免疫Balb/c小鼠, 通过淋巴细胞杂交瘤技术, 应用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞克隆, 成功获得稳定分泌抗rBovIFN-γ McAb的杂交瘤细胞系, 为进一步研究BovIFN-γ McAb在牛结核等疾病诊断中的应用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 重组质粒、细胞和试验动物
重组牛IFN-γ质粒, 东北农业大学李广兴教授惠赠;SP2/0细胞, 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所细菌病研究室保存;Balb/c小鼠, 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。
1.1.2 试剂
二甲基联苯胺 (DAB) 、四甲基联苯胺 (TMB) , 购自上海华舜生物工程有限公司;Ni-NTA His Bind Purification Kit, 购自Novagen生物工程公司;聚乙二醇 (PEG3350) 、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 、辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的兔抗牛酶标二抗, 购自Sigma公司;HAT选择培养基、HT选择培养基、胎牛血清, 购自Gibco公司;DMEM, 购自Hyclone公司;HRP标记的羊抗鼠酶标二抗, 购自北京中杉金桥公司;鼠源McAb亚类试剂盒, Invitrogen公司产品。
1.2 方法
1.2.1 IFN-γ基因的表达及蛋白纯化
将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) , 生长至对数生长期时用IPTG诱导表达。IPTG终浓度为1.0 mmol/L, 诱导时间为6 h。参照参考文献[1]对重组蛋白的表达与纯度进行鉴定。溶解蛋白进一步用Ni-NTA His Bind Purification Kit纯化。
1.2.2 免疫动物
制备rBovIFN-γ融合蛋白, 并调整其浓度为2.4 μg/μL, 与弗氏完全佐剂以1∶1比例混合, 充分乳化后以每只注射100 μL的剂量免疫小鼠, 每隔2周再用弗氏不完全佐剂重组抗原以相同的剂量进行二免和三免, 三免后采血清100倍稀释后测定抗体效价, 选取效价高的小鼠再加强免疫。
1.2.3 细胞融合
加强免疫3 d后, 取小鼠眼球血液并分离血清作为阳性对照。取小鼠脾细胞按照参考文献[2]中的方法与SP2/0细胞进行融合。
1.2.4 筛选方法的建立
稀释rBovIFN-γ抗原至终浓度为5 μg/mL, 然后包被酶标板, 加入杂交瘤分泌上清液和HRP标记的羊抗鼠酶标二抗作用, 用四甲基联苯胺底物显色, 以450 nm单波长测定各孔OD值。
1.2.5 阳性孔的筛选及亚克隆
以与阴性对照孔OD值的比值 (P/N) 大于2.1作为判断阳性或确定效价的临界点。将阳性孔通过有限稀释法进行多次亚克隆后扩大培养, 建株冻存。
1.2.6 腹水的制备及效价测定
给小鼠腹腔注射灭菌石蜡油500 μL/只, 7～10 d后腹腔注射5×105～5×106个杂交瘤细胞, 再经7～10 d后抽取腹水, 离心, 取上清液加入50%甘油, -20 ℃冻存。
1.2.7 杂交瘤与其他蛋白的特异性反应
用rBovIFN-γ融合蛋白、胎儿弯杆菌表面蛋白 (rSapA-N) [2]、牛分枝杆菌rMPB64蛋白[3]及猪胸膜肺炎放线杆菌rOMP蛋白[4]分别包被酶标板, 进行ELISA检测 (步骤同1.2.4) , 检测5株单克隆抗体的特异性。
1.2.8 SDS-PAGE电泳和Western-blot分析
参照《分子克隆实验指南》用纯化的rBovIFN-γ融合蛋白进行SDS-PAGE, 再电转至NC膜上, 用5%脱脂乳封闭, 加入杂交瘤细胞培养上清液, 作用后加2 000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG, 用DAB显色15 min观察结果。
1.2.9 单抗的亚类鉴定
按照Sigma公司的McAb亚类鉴定试剂盒说明书进行。
1.2.10 腹水效价的测定
采用间接ELISA法测定。在用rBovIFN-γ融合蛋白包被的酶标板内分别加入2倍比稀释的杂交瘤上清液和腹水, 其余步骤按照常规ELISA方法进行。
2 结果
2.1 单克隆抗体细胞株的建立及其稳定性测定结果
经3次亚克隆后, 最终获得5株能稳定分泌抗体的单克隆细胞株, 体外连续培养数代, 并经Balb/c小鼠体内传3代, 其分泌单克隆抗体的能力不变。将获得的5株单克隆抗体分别命名为A1C3、B1C5、D1F4、B2E6和C2H3。
2.2 单克隆抗体亚类的鉴定结果
经鉴定, 5株单克隆抗体均为IgG1型, 其轻链为κ链。
2.3 杂交瘤细胞上清液和腹水抗体效价的测定结果
采用间接ELISA法测定5株细胞株培养上清液及其腹水的抗体效价, 结果见表1。
2.4 单克隆抗体的Western-blot分析结果
5株单克隆抗体均能与rBovIFN-γ融合蛋白反应, 在转印膜上约25 ku处可见到反应条带, 而与其他蛋白无反应, 说明筛选得到的单克隆抗体可特异性地识别rBovIFN-γ融合蛋白 (见图1) 。
M.蛋白预染Marker;1～5.A1C3、B1C5、D1F4、B2E6和C2H3与BovIFN-γ蛋白的反应结果; 6～10.A1C3、B1C5、D1F4、B2E6 和C2H3与rSapA-N的反应结果。
2.5 杂交瘤细胞与其他蛋白的特异性反应结果 (见表2)
(OD值)
由表2可知, 5株单克隆抗体均能特异识别并结合rBovIFN-γ , 而与其他蛋白不产生交叉反应。
3 讨论
IFN-γ在抗感染、调节免疫功能等方面具有重要意义。Wood P R等[5]最先将抗原特异性IFN-γ试验用于牛结核病的检测。与传统检测相比, 抗原特异性IFN-γ试验简单、快速、灵敏、特异。基于抗原特异性的IFN-γ反应可用于评价机体特异性细胞免疫状态。特异性抗原刺激的外周血淋巴细胞IFN-γ体外释放试验已被广泛用于抗感染诊断。国外已有学者将基因rBovIFN-γ及其McAb用于牛病的研究, BovIFN-γ特异性抗原已被用于多种牛病的特异性检测, 尤以在牛结核病诊断中的应用最为广泛。
研究所得到的5株单克隆抗体特异性好, 效价高, 间接ELISA腹水效价可达1∶5×104以上。下一步将利用这5株单克隆抗体建立一种ELISA方法来检测牛结核病。
参考文献
[1]胡洋.牛干扰素基因克隆和表达及多克隆抗体制备[D].哈尔滨:东北农业大学, 2008.
[2]赵海玲, 刘思国, 刘慧芳, 等.牛胎儿弯杆菌ELISA诊断技术的研究[J].中国预防兽医学报, 2008 (11) :842-845.
[3]张秀华, 刘思国, 宫强, 等.牛分枝杆菌mpb64基因的克隆、鉴定及其表达[J].中国生物工程杂志, 2005 (4) :43-46.
[4]邵美丽, 刘思国, 王春来, 等.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达[J].中国兽医科学, 2006, 36 (1) :25-28.
[5]WOOD P R, CORNER L A, PLACKETT P.Development of a sim-ple, rapid in vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on theproduction of gamma interferon[J].Res Vet Sci, 1990, 49:46-49.
干扰素抗体 篇2
1材料与试剂
1.1标本来源
2013年7月至2014年7月,我院申请输血患者22 558例,标本采集条件为真空采血针采集EDTAK2抗凝全血3 ~ 5 m L,1 760 g离心5 min。
1.2仪器与试剂
ORTHO Autovue Innova全自动血液免疫检测系统,单克隆抗A、抗B血型正定型试剂( 美国IMMUCOR ) ,Ig M单克隆Rh D血型定型试剂( 美国IMMUCOR) ,标准反定细胞 ( 以下简称Ac、Bc、Oc,美国BIO-RAD) 、3系抗筛细胞( 美国BIO-RAD) ; 16系谱细胞( 荷兰Sanquin) ,抗球蛋白检测卡( 美国Ortho Biovue) 、血型检测卡( 美国Ortho Biovue) ,操作方法参照相关说明书进行。
2方法
2.1血型及不规则抗体筛查
采用ORTHO Autovue Innova全自动血液免疫检测系统,严格按照仪器使用说明书要求检测患者ABO及Rh D血型和不规则抗体筛查,对ABO血型正反定型不一致的患者标本,采用试管法复查; 对抗筛阳性患者,进一步进行抗体鉴定。
2.2抗体鉴定
患者血清与谱细胞分别在盐水介质和抗人球蛋白介质中检测,根据患者血清与谱细胞反应格局,并结合患者对应红细胞血型表型,鉴定患者血清中不规则抗体特异性。
2.3抗体类型鉴定
在盐水介质中凝集,抗人球蛋白介质不凝集的抗体为Ig M类抗体; 在盐水介质中不凝集,抗人球蛋白介质凝集的抗体为Ig G类抗体; 对于在盐水和抗人球蛋白介质都凝集的抗体,采用2-Me与患者血清等量混合,于37 ℃水浴30 min,再进行抗体鉴定,如果破坏后盐水和抗人球蛋白介质凝集均消失,提示抗体类型为Ig M,如果盐水介质凝集减弱或消失,抗人球蛋白介质仍有凝集,提示Ig M和Ig G类抗体均存在。
2.4对于怀疑不规则抗体干扰血型的处理
明确患者血清中抗体特异性,筛选对应抗原阴性的献血者红细胞,配置成反定细胞,重新进行血型鉴定。
2.5O细胞冷吸收方法
对于不规则抗体筛查阳性,但无法明确抗体特异性的患者标本,采用多人份O细胞混合,用生理盐水洗涤三次,制备成压积红细胞,与患者血清等量混合,于4 ℃冷吸收30 min,再对患者血清标本进行血型鉴定。
3结果
2013年7月至2014年7月期间共完成血型检测22 558例,其中57名患者因不规则抗体的存在,干扰血型鉴定。通过调查发现MNS、Rh、Lewis、Duffy、P血型系统产生的不规则抗体均发现可干扰血型鉴定,其中MNS系统41例,Rh血型系统10例,Lewis系统4例,Duffy和P系统各1例。抗-M最多,37例,占64. 91% , 其次为抗E相关抗体,5例,占8. 77% ; 从不规则抗体类型统计发现Ig G与Ig M类混合抗体最多,占37例,单纯Ig G类抗体14例,单纯Ig M类抗体6例。 具体分析结果见表1。
4讨论
ABO血型系统是人类最早发现的血型系统,也是与输血安全相关的最重要的血型系统,ABO血型不合输血可以导致溶血性输血反应,严重的急性溶血性输血反应,发病急骤、来势凶险,若处理不及时可危及患者生命; 因此,ABO血型鉴定是输血前检测的必检项目之一,准确的血型鉴定是保证输血安全、提高输血疗效、减少或杜绝溶血性输血反应的直接保障。
不规则抗体是指正常ABO血型系统以外的抗体,主要因机体受到免疫刺激产生缺乏对应抗原的抗体,主要包括Ig G和Ig M两种类型。不规则抗体可干扰ABO血型鉴定,表现为反定型不应该凝集的一侧出现凝集,O细胞可出现阳性或阴性反应,导致血型正反定型不一致,患者自身对照一般为阴性。 因无论自制还是商品化反定细胞均为人源红细胞制备,而人类红细胞血型系统非常复杂,红细胞表面抗原除包含ABO血型系统抗原外,还有众多其他血型抗原存在,目前已发现33个血型系统[3],当受检者血清中存在不规则抗体,而反定细胞上存在对应抗原时,即可发生抗原抗体反应,在合适的条件和介质中引起肉眼可见红细胞凝集,干扰血型鉴定。
本次研究发现影响血型鉴定的不规则抗体主要为Ig M类占75. 44% ,主要原因为Ig M类抗体为五聚体,可在盐水介质中引起肉眼可见的红细胞凝集, 干扰血型鉴定; 但有14例患者单纯存在Ig G类抗体,也干扰血型鉴定,其原因可能为血型检测所用的血型鉴定卡中加入某些增强介质,如PEG等,虽一定程度上提高了反应的灵敏度,缩短了反应时间,提高了检测效率,但也会导致某些Ig G类抗体在无抗人球蛋白介质存在的情况下发生凝集,给对血型鉴定带来干扰。曹微微等对55481例住院拟输血患者进行红细胞血型不规则抗体分析,发现各血型系统抗体分布为Rh系统抗体最多为59. 79% ,MNS系统其次为24. 74% ,Lewis系统第三为3. 09%[4]。 本次研究发现影响血型鉴定的不规则抗体与文献报道一致,但由于在人类血清中MN血型系统产生的不规则抗体多为Ig M类型,也有少量Ig G类型存在, 因此从扰血型鉴定方面统计发现MNS系统最多,占71. 93% ,其次为Rh血型系统,占17. 54% 。
当血型鉴定出现正反定型不一致时,首先应排除人为因素、试剂因素及样本自身因素的干扰,然后严格按照操作规程重复试验,根据具体问题分析原因并采取相应处理措施。当血型反定型不该凝集的一侧出现凝集,而且不规则抗体筛查阳性时,应注意排除不规则抗体干扰。排除办法为选择对应抗原阴性的红细胞制备成反定细胞,重新进行血型鉴定,这样既可以明确患者血型,又达到了进一步验证抗体鉴定结果的目的。如果无法明确抗体特异性,也可采用多人分O细胞混合,吸收患者血清后,再进行血型鉴定,该方法可一定程度排除同种抗体干扰。
参考文献
[1] Daniels G,朱自严.人类血型.北京:科学出版社,2007:36Daniels G,Zhu Z Y.Human blood groups.Beijing:Science Press,2007:36
[2] 临床输血技术规范.卫生部,2000Technical Specifications of Clinical Blood Transfusion.Ministry of Health,2000
[3] Reid M E,Lomas-Francis C,Olsson M L.The blood group antigen facts book.Third Edition,Academic Press is an imprint of Elsevier,2012:8—23
干扰素抗体 篇3
1 流行病学
FMDV有7个血清型:O型、A型、C型、亚洲1型、南非1型、2型、3型, 而同一个血清型中, 又包括大量不同的毒株。不同血清型之间没有交叉保护作用, 而同一血清型的不同毒株之间也仅有部分具有交叉免疫性。感染或接种一种血清型的FMDV无法抵抗其它血清型的感染。FMDV血清型的分布具有明显的地域性, 亚洲国家主要流行的血清型包括O型、A型与亚洲1型。其中O型感染最为广泛, 其次是A型, 亚洲1型很少见。2005年世界口蹄疫参考实验室将全世界的O型口蹄疫划分为10个拓朴型 (Topotype) , 常见的有东南亚型 (缅甸98株) 、中东南亚型 (泛亚株) 与Cathay (古典中国) 型, 当前我国流行的优势毒株属于缅甸98株。
2 免疫政策
目前我国政府实施了推动FMD强制性免疫, 农业部将其列为强制免疫注射的首要病种。为了有效防止猪口蹄疫的发生, 规定每年的春秋两季都要进行强制免疫, 要求应免动物的免疫密度达100%, 免疫抗体合格率必须≥70%。在疫苗选择上, 可选用政府免费提供的FMD疫苗, 也可以使用商品化的高效FMD疫苗。无论采用何种疫苗产品, 免疫后都必须进行抗体水平监测和免疫效果评估。
3 母源抗体干扰对免疫效果的影响
猪口蹄疫的防疫是一项复杂而艰巨的工作, 一些规模化猪场反映, 使用猪O型口蹄疫灭活疫苗进行免疫, 即使母猪群每年免疫3~4次, 仔猪群一生免疫2~3次, 而到了生长育肥阶段抗体几乎全部为阴性, 免疫完全失败。出现这种现象很可能是猪场免疫程序不合理, 引起母源抗体干扰所致。
母源抗体是指通过胎盘、初乳从动物母体直接传递给胎儿或新生动物的抗体。一方面母源抗体可有效保护仔猪免受FMDV的感染, 同时, 母源抗体也能够显著干扰仔猪的免疫效果。为了证实这种干扰现象, 笔者在某猪场进行了两组试验。
3.1 无母源抗体情况下的免疫效果
30日龄首免、58日龄加强;加强后14 d抗体开始上升, 28d时全部转阳。试验表明, 仔猪在没有母源抗体时, 对疫苗免疫效果无影响, 此时是接种疫苗的最佳时机。此外该试验结果表明, 仔猪经过1次免疫抗体很难达到满意水平, 加强后抗体才能达到完全保护水平且有效抗体持续时间长。
3.2 有母源抗体情况下的免疫效果
30日龄首免、60日龄加强免疫后抗体一直呈下降趋势, 到加强后35 d时抗体全部转阴。该试验结果表明, 仔猪在有母源抗体时, 仔猪在首免和加强免疫后抗体随着时间的延长逐渐降低到全部转阴, 母源抗体对疫苗免疫效果干扰严重, 这也合理地解释了有些猪场为什么在育肥阶段检测不到抗体。
3.3 干扰机理
据报道, 母源抗体可从细胞免疫和体液免疫2个方面对疫苗免疫产生干扰, 其作用机理主要是加速抗原物质的清除、对弱毒疫苗起中和作用、母源抗体对特异性抗原位点的“封闭”而阻止抗原位点与机体免疫相关细胞上的抗原受体结合等, 从而导致免疫系统不能对抗原物质产生反应。
4 推荐免疫程序
干扰素抗体 篇4
1 材料与方法
1.1 试验动物及处理
1日龄健康海兰褐蛋鸡, 购于泰安东岳种禽有限公司。对100只1日龄海兰褐蛋鸡只进行新城疫Ⅳ系活疫苗的免疫, 不进行任何禽流感和新城疫油乳剂灭活疫苗的免疫。在相同的环境下, 试验采用同种饲料进行饲喂和相同防疫程序进行免疫预防, 疫苗按照生产厂家的建议剂量进行注射。每隔10 d随机选取12只鸡采血 (30日龄前采用心脏采血的方法;30日龄后采用翅静脉采血) 直至120日龄, 并进行血清分离, 用HI法检测鸡只的抗体水平, 根据平均值绘制抗体消减曲线。免疫程序见表1。
1.2 试剂及疫苗
新城疫血凝抑制试验抗原、禽流感H9亚型血凝抑制试验抗原, 中国农业科学院提供;禽流感病毒H5亚型 (Re-4株和Re-5株) 血凝抑制试验抗原, 哈尔滨维科生物技术开发公司生产;鸡新城疫+传染性支气管炎二联活疫苗 (La Sota株+H120株) 、鸡新城疫+传染性支气 管炎二联活疫苗 (La Sota株+H52株) , 购于杨凌绿方生物工程有限公司;传染性法氏囊冻干苗, 购于青岛易邦生物工程有限公司;传染性支气管炎病毒变异株4/91活疫苗, 购于荷兰英特威动物保健品公司;鸡新城疫低毒力活疫苗, 购于乾元浩生物股份有限公司。
1.3 抗体水平的检测
参照《高致病性禽流感诊断技术》中华人民共和国国家标准GB/T 18936—2003, 采用血凝 (HA) 与血凝抑制 (HI) 试验进行ND、AI抗体水平的检测。
2 结果 (见表2、图1) 与分析
新城疫抗体的变化曲线呈“V”形, 最低点在1 lb, 70日龄抗体水平达到4 lb, 70～120日龄新城疫抗体在4.5 lb以上。H9亚型疫苗的抗体变化曲线呈“U”形, 随着日龄的增长, 抗体水平在逐渐下降, 24日龄母源抗体降到0, 并一直持续到50日龄, 50日龄左右抗体快速上升, 54日龄抗体效价达到4 lb, 此后 (54～120日龄) 抗体水平在5 lb左右波动;H5母源抗体不断下降, 在23日龄降至最低点 (0) 并持续 20 d, 在53日龄时抗体开始上升, 但幅度有限, 在0～1 lb之间波动。
3 讨论
鸡群在只进行新城疫活疫苗的免疫 (新支二联苗的免疫+65日龄的新城疫Ⅳ系饮水) , 不进行油乳剂灭活疫苗免疫的前提下, 抗体的变化呈“V”形, 最低为1 lb。前期新支二联苗的免疫并没有使新城疫抗体水平明显上升, 一直在1～4 lb之间波动, 这可能与雏鸡的免疫系统还没有发育完全、应激较大 (如雏鸡10 d前要断喙、接种多种疫苗) 等因素有关;65日龄的新城疫Ⅳ系饮水后抗体快速上升, 且HI抗体效价峰值比首免有所提高, 在免疫后的第15天出现抗体峰值, 接近7 lb, 此后70～120日龄新城疫HI抗体效价趋于集中。但是鸡群常规免疫程序 (新城疫Ⅳ系饮水+新城疫油苗) 免疫后, 抗体水平可达到10 lb以上, 且抗体效价维持时间长。这可能因为鸡只经滴鼻、饮水免疫后, 活疫苗刺激其呼吸道、消化道黏膜, 主要产生分泌型IgA, 发挥局部黏膜免疫作用, 并可调节和促进体液免疫的产生。灭活疫苗经注射免疫后, 在动物体内主要产生IgG, 其不仅含量高, 而且持续时间长。因此在疾病的预防控制中, 活疫苗与灭活疫苗同时免疫, 建立黏膜免疫与体液免疫双重屏障, 可保护鸡群免受病毒的侵袭[2]。
本试验中H9抗体的升高甚为奇怪, 整个试验过程中鸡群正常, 没有任何异常变化, 抗体的升高是什么原因引起的还有待于进一步研究。
鸡群在不进行任何H5亚型疫苗免疫的情况下, H5母源抗体不断下降, 在23日龄降至最低点 (0) , 并持续20 d左右, 53日龄抗体开始上升, 但幅度有限, Re-4株产生的抗体在1 lb左右波动, Re-5株产生的抗体在0.5 lb左右波动。总体来看, 在没有油苗免疫干扰的前提下, 整个过程H5Re-4抗体略高于H5Re-5, 这一点符合常规免疫情况下Re-4和Re-5抗体的变化规律。总体来说, 无论油苗免疫与否鸡只都会形成禽流感H5亚型抗体, 而且Re-4抗体约比Re-5高0.5～1个抗体效价。
纵向来看, 在新城疫、禽流感母源抗体的比较中, ND疫苗产生的抗体最高, 其次为禽流感H9亚型疫苗, 最低为禽流感H5亚型疫苗, 且H5亚型Re-4株产生的抗体高于Re-5株产生的抗体, 这一点符合种鸡群的抗体变化规律[3]。同时10～50日龄恰恰是母源抗体逐渐消失、自身抗体正在形成的关键时期, 所以此时的饲养管理和生物安全措施显得尤为重要。
参考文献
[1]卡尔尼克B W.禽病学[M].10版.高福, 苏敬良, 译.北京:中国农业出版社, 1999:691-726.
[2]宋阳, 何昭阳.新城疫人工主动免疫与被动联合免疫效果观察[J].中国动物保健, 2008 (8) :67-68.