灭菌温度（通用4篇）
灭菌温度 篇1
0 引言
绝大多数工业发酵是需氧的纯种发酵,因此,所使用的培养基、各种设备和附件以及通入罐内的空气均须彻底灭菌,这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。如果发酵中染了菌,不只是消耗了营养物质,更重要的是杂菌能分泌一些或抑制产生菌生长,或严重改变培养液性质,或抑制产物生物合成的有毒副作用的物质;或产生某种能破坏所需代谢物的酶类。轻者影响产量,重者导致“全军覆没”。所以工业发酵中杂菌污染是极大的威胁,我们就培养基的灭菌原理及方法重点介绍如下。
1 灭菌方法的选择
灭菌是指利用物理或化学法杀或除去物料及设备中一切有生命物质的过程。灭菌方法大致可分为物理方法和化学方法两种。物理方法主要有蒸汽(高温)、电磁波和辐照等方式,蒸汽灭菌属于经典式的灭菌方法,而电磁波灭菌多采用2450nm和915nm微波灭菌和超声波灭菌。辐照灭菌可分为离子性辐照和非离子性辐照。非离子性辐照采用最广泛的是253.7nm波长的紫外线,由于光源发出的强度所限,虽不存在残留问题,但以上物理灭菌方法都有一定的局限性。化学方法多采用强氧化剂,如过氧化氢、过氧乙酸、环氧乙烷、卤素等,化学灭菌主要是依靠强氧化剂的氧化能力与细胞酶蛋白中的-SH-巯基结合转化为-SS-基,破坏蛋白质的分子结构,干扰细菌酶系统的代谢,使其失去活性。按照分子生物学的观点,就是对细胞的DNA进行氧化性损伤,从而抑制细胞的增殖。使用化学灭菌会对容器和包材以及设备产生一定量的残留污染,必须采取严格的措施控制残留,以保障最终产品的安全性。
利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。由于蒸汽具有很强的穿透能力,而且在冷凝时会放出大量的冷凝热,很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。从灭菌的效果来看,干热灭菌不如湿热灭菌有效,温度升高10℃时,灭菌速度常数仅增加2-3倍,而湿热灭菌对耐热芽孢的灭菌速度常数增加的倍数可达到8-10倍,对营养细胞则更高。
2 湿热灭菌原理
在发酵工业中,对培养基和发酵设备的灭菌,广泛使用湿热灭菌法。工厂里,蒸汽比较容易获得,控制操作条件方便,是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。用湿热灭菌的方法处理培养基,其加热温度和受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的破坏将影响菌种的培养和产物的生成,所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾,恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。
微生物受热死亡的原因,主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质,如酶等,发生凝固、变性,从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力,但其物理性质不变。在一定温度下,微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论[1]。在灭菌过程中,活菌数逐渐减少,其减少量随残留活菌数的减少而递减,即微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比,称之为对数残留定律,也即反映为一级化学反应动力学为:
式中,N—残存的活菌数;t—灭菌时间(s);
K—灭菌速度常数(s-1),也称反应速度常数或比死亡速度常数,此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关;
d N/dt—活菌数瞬时变化速率,即死亡速率。
上式通过移项积分得:
式中:N0—开始灭菌(t=0)时原有活菌数;Nt—经时间t后残存活菌数。
上式是计算灭菌的基本公式,灭菌速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的,K值愈小,则此微生物愈耐热。
即使对于同一微生物,也受微生物的生理状态、生长条件及灭菌方法等多种因素的影响,其营养细胞和芽孢的比死亡速率也有极大的差异,就微生物的热阻来说,细菌芽孢是比较耐热的,孢子的热阻要比生长期细胞大得多。例如,在121℃时,枯草杆菌FS5230的K为0.047-0.063s-1,梭状芽孢杆菌PA3679的K为0.03s-1,嗜热芽孢杆菌FS1518的K为0.013s-1,热芽孢杆菌FS617的K为0.048s-1。从上述的微生物对数死亡规律和对数残留方程式可知,如果要达到彻底灭菌,即灭菌结束时残留的活微生物数Nt=0,则灭菌所需的时间应为无限长,这在实际中是不可能的。因此,工程上,在进行灭菌的设计时,常采用Nt=0.001,即在1000次灭菌中,允许有一次失败。
3 灭菌温度和时间的选择
当培养基被加热灭菌时,常会出现这样的矛盾,在加热杀死微生物的同时,培养基中的有用成分也会随之遭到破坏。实验结果证明,在高压加热的情况下,培养基中的氨基酸和维生素极易被破坏,如在121℃,仅20min,就有59%的赖氨酸和精氨酸及其他碱性氨基酸被破坏,蛋氨酸和色氨酸也有相当数量被破坏。因此,选择一种既能满足灭菌要求又能减少营养成分破坏的温度和受热时间,是研究培养基灭菌质量的重要内容。
微生物的受热死亡属于单分子反应,其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示:
式中:A—频率常数,也称阿累尼乌斯常数,s-1;R—气体常数,8.314J/(mol·K);T—绝对温度,K;E—微生物死亡活化能,J/mol。
由此可见,E/R是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量,此值越大,表明微生物死亡速率随温度的变化越敏感;反之,就越不敏感,因此,在灭菌操作中,E/R是一个十分重要的参数。
绝大部分培养基的营养成分的破坏也属于一级分解反应[2],其反应动力学方程式为:
式中,C—反应物浓度,mol/L;t—反应时间,s;K—化学反应速度常数,1/s。
化学反应中,在其他条件不变的情况下,则反应速度常数与温度的关系可用阿累尼乌斯公式表示:
式中,K′—培养基内易被破坏成分的分解速率常数;A′—频率常数,也称阿累尼乌斯常数,s-1;R—气体常数,8.314J/(mol·K);T—绝对温度,K;E′—培养基成分分解所需活化能,J/mol。
式(3-2)、(3-5)为一直线方程,以ln K(ln K′)对1/T作图,可得一直线。实际测得,一般杀死微生物营养体的E值为200-270k J/mol,杀死微生物芽孢的E值为400 k J/mol以上,一般酶类和维生素分解的E值为80 k J/mol左右。
当灭菌温度从T1上升到T2时,灭菌的反应速度常数K值和营养成分分解的反应速度常速K′值的变化情况如下:
灭菌的K值变化,ln K1=ln A—E/RT1;ln K2=ln A—E/RT2(K1、K2分别为温度T1、T2时的反应速度常数)。两式相减得:
同样,当温度从T1升至T2时,营养成分分解的反应速度常数的变化也有上述关系:
式(3-6)除以式(3-7)得:
由于杀死微生物的活化能E大于营养成分的活化能E′[3],所以即随温度的升高,灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分破坏反应速度常数增加的倍数。也就是说,当灭菌温度上升时,微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。所以采用高温快速灭菌方法,即可达到杀死培养基中的全部有生命的有机体,又可减少营养成分的破坏。如将芽孢杆菌和维生素B2放在一起灭菌的试验发现,当温度升至118℃,加热时间为15min,可杀死99.99%的细菌芽孢,维生素B2破坏率为10%;而在温度128℃下加热1.5min,细菌芽孢的死亡率仍为99.99%,而维生素的破坏率为5%。由此可见,在高温下灭菌,时间是一个非常重要的因素,表1表示杀死细菌芽孢与保留B族维生素的时间与温度关系以及在不降低规定的灭菌前提下(Nt=0.001),灭菌温度、时间和营养成分破坏量的关系。
4 总结
采用湿热高温快速灭菌法,不但可达到完全灭菌的要求,而且灭菌时间短,物料中营养物质破坏少,物料质量几乎不变,营养成分保存率达92%以上,生产效率很高,所以现在被发酵工业广泛采用。
摘要：用湿热灭菌方法对培养基灭菌时,加热的温度和时间对微生物死亡和营养成分的破坏均有作用。由于培养基营养成分的破坏和菌体死亡都属于一级动力学反应,其反应速度常数与温度的关系皆可用阿累尼乌斯方程式表示;由此公式导出,当灭菌温度上升时,微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。所以采用高温快速灭菌方法,即可达到杀死培养基中的全部有生命的有机体,又可减少营养成分的破坏。
关键词：菌体死亡速率常数,培养基成分的破坏速率常数,高温快速灭菌
参考文献
[1]熊宗贵.发酵工艺原理[M].北京:中国医药科技出版社,2001.
[2]高平,刘书志.生物工程设备[M].北京:化学工业出版社,2006.1.
[3]于文国.微生物制药及反应器[M].北京:化学工业出版社,2005.6.
灭菌温度 篇2
1 灭菌温度不达标的原因
1.1 气源含水过多:由于气源离供应室较远, 送气管道过长, 大量冷凝水生成, 至使温度不升。
1.2 灭菌器正常情况下, 充入蒸汽上泵4～5 min内灭菌器内温度可升到132℃, 维持灭菌时间5 min。有时灭菌温度维持不到5 min?就开始下降, 造成灭菌时间延长或失败。
2 处理措施
2.1 灭菌时发现温度不升, 多为压力不够。 汽源压力过低<0.23 MPa或供气管道漏气。应提高蒸汽压力, 使其达到≥0.4 MPa。如果夹套、内室压力都不够, 可调节减压阀, 让夹层升至所需压力。
2.2 如果内室压力够而温度不升, 说明灭菌器内室有水, 可打开内室旁通道排水10～20 s。
2.3 操控面板温度显示器若显示“0”或“1”则为传感器故障, “0”为短路, “1”为开路。
2.4 温度与压力不对应 (饱和蒸汽时132℃对应压力约0.20 MPa) , 可通过操控面板温度显示器修正温度, 使之对应。
2.5 压力正常 (即灭菌时压力已达到0.2 Mpa以上) , 而温度达到一定值后不升反降, 这时为疏水器故障, 应进行清洗。
2.6 温度不稳定, 忽高忽低, 一般温度跳跃范围较大 (在5～10℃范围内) , 造成这种现象有两种可能: (1) 线路接触不良; (2) 时间、温度显示器损坏。
总之, 设备出现故障是多种多样的, 只有找出原因才能排除故障, 才能保证设备正常运行。
参考文献
[1]郑万松, 金桂秋, 胡子荣, 等.医院信息管理系统的开发与应用[J].中国现代医学杂志, 2002, 12 (4) :107-108.
灭菌温度 篇3
JJF 1101—2003环境实验设备温度、湿度校准规范提供了各种环境试验设备中各种计量参数的校准要求，在制药行业广泛应用的高压、高温灭菌设备在进行压力、温湿度验证时可参照此规范进行。
蒸汽压力灭菌设备在制药企业被广泛使用，依据GMP对灭菌设备的检测、验证手段也必须得到完善和控制，以监督消毒灭菌的效果，保证消毒灭菌的质量。为了保证灭菌和清洗消毒的质量，欧、美及其他发达国家对高压灭菌锅和清洗消毒机等制订了严格的检测标准，要求必须定期对高压灭菌设备进行检测和验证。而目前我国的灭菌操作、检测、监测系统情况不容乐观。
主要存在以下几方面的问题：(1)与欧盟标准和发达国家标准相比，我国灭菌检测技术设备落后，手段简单;(2)按照我国的消毒技术规范、灭菌操作规程进行操作时，对装载灭菌效果的判定主观因素很大，装载有可能达不到灭菌效果;(3)压力灭菌设备的使用条件与规定的条件不同，或灭菌装载与参考装载不同，或维修保养、调试后设备重新投入使用时，设定灭菌程序主要是根据操作人员的经验。
这些因素导致我国制药行业的灭菌效果存在诸多隐患，一定程度上影响了制药行业产品质量控制和消毒灭菌的有效性。
由于最新的电子检测方法目前还没有得到普及，在我国，人们通常使用化学检测的方法。BD试纸的原理是通过颜色由浅入深的变化指示灭菌效果。而实际上操作人员只能依靠经验通过目测颜色的深浅做出判断，做出的判断无法避免人为因素的干扰。我国消毒技术规范中推荐的利用生物指示剂的检测方法，是一种鉴定结果严重滞后的方法，不能及时确定灭菌器实时运行参数是否合格，无法准确、具体给出灭菌过程中压力蒸汽灭菌设备内所达到的温度、压力和时间这3个最具说服力的数据，它只能作为一些特殊情况下的补充手段。另外BD纸属一次性耗材，累积用量大，支出费用高并且不易保存。
在实际灭菌操作中，许多操作人员只是把灭菌器本身温度计指示的温度值作为依据，来判断是否达到了灭菌温度。而灭菌器本身的温度计仅用于灭菌器的工作循环、指示灭菌器舱内温度的监控情况。有装载(特别是满装载)时，蒸汽穿透要耗费一定时间，所以装载内的实际灭菌时间未必达到灭菌要求。目前，为保险起见，惯用的作法是将灭菌时间延长甚至加倍或将温度提高，以保证灭菌装载的温度达到灭菌温度和保持时间的要求。而时间延长的或长或短完全依赖于经验，主观性、随意性很大。对于那些经验不丰富的操作人员，只是按照灭菌器上的温度计的指示值判断，但对实际装载是否达到灭菌要求情况不明。这是我国在灭菌检测方面的一个重大隐患。因为对于易穿透的物品，意味着浪费了太多的能源;而对于不易穿透的物品，即使延长了时间、提高了温度，包内的杀菌温度和时间仍未必达到要求，消毒杀菌依然不合格。而通过本文介绍的验证仪进行检测和验证，可测出不同物品不同的灭菌穿透时间，对如衣物、小型器具、大型器具分别进行消毒，就能做到节能、安全、有效。
2 采用先进的电子技术实现数据化的检测验证
随着科学的进步，电子技术进入人们的生活，为检测高压灭菌锅和清洗消毒机提供了一种更直接、更精确的新方法。通过传感器检测物理参数，可以记录参数值的整个时间变化过程，而且传感器测量值可以溯源到国家标准装置上，通过在标准装置上分度、校准，能够保证其测量值的准确性、可靠性。相比较而言，物理量的测量比化学量测量更准确、方便，并具有更好的时效性，参数的可控性也高得多。
东药公司采用德国颐贝隆公司所开发的蒸汽压力灭菌设备验证仪，主机/探针一体温度记录器(如图1所示)检测并记录灭菌过程中的温度、压力和时间数据。其内置高精度铂电阻(PT1000)传感器，全量程精度±0.1℃，灭菌过程完成后，使用配套智能信号转换器、专家版软件读取所记录的数据。所记录的数据通过图表和数据报表真实表达灭菌设备中被灭菌物品所经受的实际灭菌的温度、达到时间和持续时间，实现对消毒灭菌质量的直观、准确检测。存储功能，所有信息可存在电脑的软盘或硬盘里，简化操作并完善了信息分析处理工作，便于提高质量监督水平和消毒灭菌工作的现代化管理水平。
为保证压力蒸汽灭菌设备的正常运行，需定期进行验证，下面以某公司生产的DMQ-0.3Ⅲ型脉动真空蒸汽灭菌器灭菌温度为121℃、灭菌时间为30 min的程序为例，介绍温度验证的方法及过程。其中，灭菌过程的保持时间是指灭菌设备内所有各点的温度保持在灭菌温度范围内的持续时间段。
为达到更好的验证效果，需注意记录器的摆放位。测试点的位置应布放在设备工作室内的3个校准面上，简称上、中、下3层，中层为通过工作室几何中心的平行于底面的校准工作面，测试点与工作室内壁的距离不小于各边长的1/10。在灭菌器的温度探头及排水口附近应尽量各放置1支温度记录器。
测试点的数量一般为：当设备容积<2 m3时，温度测试点为9个;当容积>2 m3时，温度测试点为15个;当容积>50 m3时，测试点可适当增加。
真空蒸汽灭菌程序过程一般分为：抽真空阶段(空气及惰性气体通过交变的过压和低压排出)、灭菌阶段、冷却及干燥3个阶段，记录器的记录时间应至少包括灭菌阶段。
2.1 空载热分布试验
热分布试验是调查灭菌设备灭菌性能的一项重要试验。通过热分部试验可得知在灭菌过程中灭菌设备腔室中各个不同位置的温差情况，确定“冷点”的位置及冷点温度滞后的时间，为热穿透试验提供依据。布点情况如图2所示。
设定测量记录的时间间隔为30 s，验证时，将温度数据记录器放置在蒸汽压力灭菌设备内所选取的各点上。记录器放妥后，按照所要求的灭菌程序进行灭菌。连续测定3次，以确认灭菌过程的重现性。取灭菌保温时间段，温度测量值应在121～124℃，任意时刻检测点最高温度与最低温度温差允许≤±1.0℃。
灭菌程序结束，取出温度数据记录器与电脑连接，读取各测温点在整个灭菌过程中每个时间点的温度情况，找出灭菌设备的冷点。通过对灭菌温度图表的分析可得出调整灭菌程序的方案。
2.2 满载热分布试验
按空载热分布试验时的图2，将温度数据记录器放置在蒸汽压力灭菌设备内所选取的各点上。满载热分布实验是为了检查并确认灭菌器在满载运行时灭菌室的温度均匀性，确认灭菌器装载方式对温度均匀性的影响程度。在满载的情况下，设定测量记录的时间间隔为30 s，验证时，记录器放妥后，按照所要求的灭菌程序进行灭菌。连续测定3次，以确认灭菌过程的重现性。取灭菌保温时间段，温度测量值应在121～124℃，任意时刻检测点最高温度与最低温度温差允许≤±1.5℃。
2.3 热穿透试验
待灭菌物品因其热负荷以及所需蒸汽穿透力量不同时，对灭菌温度、时间的要求也不同。待灭菌物品相同时，因其在灭菌锅内的摆放方式不同，要达到相同的F0值(标准灭菌时间)所需要的灭菌时间也不同。因此，应对不同的待灭菌物品或不同的摆放方式，制定不同的灭菌程序，这就需要完成热穿透试验。
进行热穿透试验时，将温度数据记录器放在灭菌包或灭菌设备内，验证仪的温度数据记录器还有一个BD试纸，即：带有特殊铠装探针型的记录器，探针可任意弯曲，直接插入容器内，检测内部的温度。取灭菌保温时间段，温度测量值应在121～124℃，任意时刻检测点最高温度与最低温度温差允许≤±1.5℃。
图3为灭菌过程温度记录图。
灭菌结束后，取出温度数据记录器，连接电脑读取数据。所获得的数据即为待灭菌物品实际所经受的灭菌温度及持续时间。通过分析，获知灭菌是否达到预期要求或灭菌是否过度，然后根据需要对灭菌的温度、时间进行调整，精确地制定出相应的灭菌程序，从而达到既保证灭菌的安全性又节省能源和人力的目的。用于验证的温度数据记录器需每年到上级计量部门作一次校准。
2.4 出现测量结果不符合要求情况的处理
如果出现测量结果不符合要求，应采取以下措施：(1)检查装载是否正确;(2)测量探针的定位;(3)再次校准测量系统;(4)由生产厂家或服务公司匹配过程参数(如外壳压力、内箱压力、蒸汽持续时间等)。
以上所作的灭菌设备的温度验证过程基本符合国家计量校准规范JJF 1101—2003环境实验设备温度、湿度校准规范的要求，在制药企业温度验证过程中可参照使用。
3 结语
灭菌温度 篇4
故障原因分析及排除方法:
(1) 内室真空度偏低。程序脉动时至少要抽空三次。第一次空气排出量80%;第二次排出量96%;当抽空第三次后, 排出量理论值可达99.2%。汽化的水蒸汽需上升到液相线以上, 灭菌时此种蒸汽所含的水微粒或不洁净物应低于1%。如果达不到标准, 会存在湿饱和蒸汽。解决方法:进行真空保压测试。测试时需要在灭菌器内室空载的前提下进行。测试后, 900s内压力变化不超过2k Pa时, 真空泄漏测试合格。如果不正常则必须检查门密封及管路系统、真空泵功能, 找出渗漏点, 排除后重新测试。
(2) 温度系统故障。安装于内室下部排气口的位置有一铂热电阻, 电阻将感应到的温度转变成阻值, 再将其阻值数据传送至温度变送器, 最后由变送器传给模拟量模块, 经转换, 送给触摸屏显示出其实际的温度值。如何判断温控系统是否正常?解决方法:把留点温度计放在包裹类中灭菌, 进入灭菌程序后, 记录灭菌时显示屏的最高温度。最后取出温度计, 对比留点刻度与记录的最高温度, 如果相差大, 说明温控系统故障, 更换铂热电阻或温度变送器即可解决。
(3) 温度值与压力值不能相互对应, 检查内室压力与温度是否相互对应, 灭菌温度的偏差一般是水蒸气不饱和所导致。排除方法:进行“偏差校正”, 进入温度校正设置, 观察画面中温度与内室压力的变动对应关系 (饱和水蒸气132℃对应压力应为接近0.2MPa。按照参考说明书进行温度的增减设定, 比如温度比对应压力的参考值低2℃, 便校正“+2℃”。
(4) 内室压力偏低。要达到132℃, 内室压力应接近0.2MPa。如远低于0.2MPa, 作如下处理:观察气源压力是否在0.4~0.7 MPa之间, 如果低于0.4 MPa, 应相应调至标准压力之间;检查疏水阀是否调得过大或功能失灵。“低温报警”有可能有过多的水蒸气通过疏水阀, 大量的热蒸汽流失, 使到内压降低。解决方法:调小疏水阀的排量即可, 如不能调作更换;夹层压力偏低。夹层内蒸汽可有效隔离外界冷空气对内室的影响, 还可以维持内室温度, 以减少内室蒸汽的冷凝, 因此内室压力应达到标准。解决方法:调大夹层压力控制器。注意不能调到超出夹层安全阀的整定压力范围, 否则安全阀出现打开泄压。笔者建议调到0.215 MPa。
(5) 蒸汽含水量过多, 导致蒸汽与水混合降低其潜伏热。饱和水蒸气中的水雾应该≤1%。解决方法:查看起源是否含水分过多, 时常释放压缩机腔存液和清理油水分离器;检查蒸汽过滤器是否失效, 滤芯材质多为聚四氟乙烯 (粉末烧结) , 可做简单更换, 令其过滤冷凝水更加有效。
结论:灭菌温度控制的影响因素较多, 应加强对灭菌过程的温度检测, 以便及时发现异常情况, 减少温度对灭菌效果的影响, 为医院创造更多的社会效益和经济效益。
参考文献
[1]脉动真空灭菌器使用说明书, 山东新华医疗器械股份有限公司.
[2]宫素萍, 宋明萍.脉动真空压力蒸汽灭菌柜常见故障原因分析及对策[J].基础护理, 2005 Vol, 19 NO.18.