角蛋白膜（精选4篇）
角蛋白膜 篇1
摘要：将羊毛溶解制得人工角蛋白膜,采用紫外、红外、拉曼光谱和扫描电镜表征其组分及致密性。实测结果表明,人工角蛋白膜对紫外光具有强吸收能力;角蛋白膜中大分子的构象以β-折叠链为主,与羊毛大分子的构象以α-螺旋链为主不同;膜的拉曼光谱也进一步解释和印证了羊毛角蛋白在经过溶解再固化过程后二级结构的变化;扫描电镜形态观察证明该成膜法制得的角蛋白膜为致密膜。
关键词：角蛋白膜,羊毛,光谱分析,形态
角蛋白膜是人工产品,自然界中的角蛋白物质众多,主要为毛皮、羊毛、头发、羽毛、皮肤,以及动物的外部附属物爪、喙、角、指甲、翎毛等。人们已能将这些物质溶解,再生制得液体[1]、膜[2]、粉末[3]、纤维[4]和骨材[5]等。这类人工角蛋白膜的应用最为普遍,其中膜的组成最为人们所关注。膜结构的组成对其使用性能至关重要,其组成将影响使用的安全性,即是否含有其它物质或有害物质[6];膜的多孔和致密性结构将影响膜材料的力学性质[7]和传递性质[8]。本研究针对自制的角蛋白溶液和角蛋白膜进行了成分和致密性分析,以期为该类材料的生物医用性能提供基本数据。
1 实验
1.1 试剂和仪器
溶解对象为普通羊毛。溶解用化学试剂:尿素,分析纯,分子式为(NH2)2CO,分子量为60.06;巯基乙醇,分析纯,分子式为C2 H6OS,分子量为78.14;十二烷基硫酸钠SDS,分析纯,分子式为CH3(CH2)10CH2OSO3Na,分子量为288.38;蒸馏水、甘油等。
实验用具:恒温水浴锅、平板、刮刀、烘箱等。
检测仪器:日本SHIMADZU公司的UV-2500紫外-可见光分光光度计;美国Nicolet公司的Avtar360型红外光谱分析仪;法国HPRIBA JOBIN YVON公司的LabRAM HR800 UV激光共聚焦显微拉曼光谱仪;日本日立公司的X-450型电子显微镜。
1.2 实验准备
1.2.1 羊毛角蛋白溶液的制备
采用巯基乙醇还原法制备羊毛角蛋白溶液,其步骤为:选择原料,预处理原料,溶解羊毛,固液分离以及提纯和浓缩溶液。
1.2.2 羊毛角蛋白膜的制备
称取一定质量的蛋白溶液,加入0.2%的甘油,将铸膜液倾倒在玻璃板上(一般为经过严格选择的平整玻璃板);用特制的刮刀使之铺展成具有一定厚度的均匀薄层,然后移植到烘箱中使溶剂完全挥发,烘干温度控制在100℃以下。
1.3 测量
采用紫外-可见光谱仪、红外光谱仪、拉曼光谱仪和扫描电镜测量分析羊毛角蛋白膜。
2 结果与分析
2.1 紫外光谱测试分析
试样1和试样2分别为80℃和20℃条件下烘干的羊毛角蛋白膜。图1为羊毛角蛋白溶液和羊毛角蛋白膜的紫外光谱对此。由图1可以看出,羊毛角蛋白膜的紫外光谱在紫外区有强的吸收,但是形峰不是很明显,说明羊毛角蛋白膜具有很强的紫外吸收能力。
2.2 红外光谱测试分析
蛋白质红外光谱图中最典型的特征峰是酰胺基团的吸收峰,蛋白质中的酰胺属仲酰胺,分为酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带、酰胺Ⅳ带、酰胺Ⅴ带、酰胺Ⅵ带、酰胺Ⅶ带,其谱带的位置指定如表1所示。酰胺Ⅰ带由酰胺的羰基C=O伸缩振动产生;酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带由N-H弯曲振动和C-N伸缩振动产生,其中,酰胺Ⅱ带偏重N-H弯曲振动而酰胺Ⅲ带偏重C-N伸缩振动[9];酰胺Ⅳ带为O=C-N弯曲振动,同时混有其它振动方式;酰胺V带归属于N-H弯曲振动[10]。此外还出现了N-H的伸缩振动吸收峰,而且异构结构可能形成双峰。
注:str为伸缩振动;def为变形振动;Tor为扭摆
图2是不同成膜温度下羊毛角蛋白膜的红外吸收光谱(其中(a)是全吸收峰,(b)是1000～1250倍的放大图,(c)是1500～1750倍的放大图)。从图2中可以看出,羊毛角蛋白膜的红外光谱具有十分明显的酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带及酰胺A带,表现为典型的蛋白质物质。红外光谱中1200～1000cm-1是S-O振动区,而3000～2800cm-1是C-N振动区[11]。
图2(b)和图2(c)为特征波段放大后的图谱,S=O振动谱带在1101cm-1、1078cm-1、1043cm-1、995cm-1处出现了多重吸收,均为胱氨酸氧化物特征吸收峰,都是羊毛角蛋白膜异于羊毛本身的红外吸收,它的出现表明二硫键已经发生断裂,有新的产物生成。
酰胺Ⅰ带的谱峰指认目前较成熟的是:1700～1660cm-1处为β-转角;1658～1650cm-1处为α-螺旋;1650～1640cm-1处为无规则卷曲;1640～1610cm-1处为β-折叠[12]。羊毛角蛋白膜的酰胺Ⅰ带均出现在1649cm-1处,且试样1在1642cm-1和1631cm-1处还有2个小峰,而1650～1657cm-1处出峰并不明显,只有1个平台,见图2(c),说明羊毛角蛋白膜主要的二级结构是无规则卷曲和β-折叠,表明羊毛溶解后破坏了羊毛大分子间的有序排列,增加了羊毛大分子的无序结构。
2.3 拉曼光谱分析
红外光谱和拉曼光谱都属于分子振动光谱,分别对振动基团的偶极矩和极化率的变化敏感。红外光谱为极性基团的鉴定提供有效的信息,而拉曼光谱对研究物质的骨架特征特别有效,故蛋白质的拉曼光谱对蛋白质的结构认定十分敏感,不仅能得到其氨基酸组成信息,还能得到二级结构信息;不仅能得到主链构象(特别是酰胺Ⅰ、Ⅲ带,C-C、C-N伸缩振动),还可得知其侧链的构象。
主要通过肽键和骨架C-C和C-N来分析蛋白质主链的构象。蛋白质的拉曼光谱中,由酰胺键引起的各类振动与红外光谱基本相似,其中酰胺Ⅰ、Ⅲ带对构象十分敏感,表2说明了酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ谱带的位置。
属于骨架的C-C伸缩振动的谱线是构象灵敏的,其中α-螺旋区域在890～945cm-1,无规则卷曲在945～960cm-1[13];C-N伸缩振动在1070～1130cm-1也是构象灵敏的由羊毛角蛋白膜的拉曼光谱图(见图3)可以看出,C-C伸缩振动的谱线在933cm-1和934cm-1处,蛋白质的主链构象在α-螺旋区域,而C-N伸缩振动谱线在1060cm-1处,比较靠近低频,这与红外光谱的酰胺Ⅰ带指定有差异。
进一步分析侧链的拉曼光谱:
(1)酪氨酸(Tyr)对羟苯基环的呼吸振动和环平面外弯曲振动的倍频间费米共振引起的830cm-1和850cm-1双峰是构象灵敏的谱线,当强度比I850/830>1时,该酪氨酸是“暴露”的,强度比I850/830<1时,该酪氨酸是“埋藏的”,理论上可以计算出2种残基的摩尔分数。属于酪氨酸的谱线还有648cm-1、1180cm-1、1210cm-1、1607cm-1和1621cm-1。羊毛角蛋白膜中I850/830>1。
(2)色氨酸(Trp)吲哚环引起的谱线分别在544cm-1、577cm-1、761cm-1、879cm-1、1014cm-1、1338cm-1、1363cm-1、1553cm-1、1582cm-1和1620cm-1附近,它的吲哚环N-H弯曲振动谱线则在1432cm-1处,共11条,其中1363cm-1处的谱线对环境和聚集状态的改变敏感。当色氨酸残基为“埋藏”的时,该谱线呈尖锐的峰形。
(3)苯丙氨酸(Phe)单基取代苯基环在1002cm-1处有强峰(见图3),但其构象不灵敏。属于苯丙氨酸的谱线还有5条,分别是624cm-1、1032cm-1、1203cm-1、1607cm-1和1620cm-1。
(4)二硫键S-S有3种构象,在(510±5)cm-1处的谱线属于扭曲-扭曲-扭曲构象;(525±5)cm-1处的谱线属于扭曲-扭曲-反式构象;(540±5)cm-1处的谱线属于反式-扭曲-反式构象。碳硫键有2种构象:630～670cm-1处的谱线属于扭曲构象,700～745cm-1处的谱线属于反式构象。羊毛角蛋白膜中的二硫键谱线位置在509cm-1处,碳硫键位置在644cm-1和642cm-1处,与文献[16]中羊毛的二硫键和碳硫键的位置一致,说明羊毛被分解后重新构建的角蛋白膜中形成的新的二硫键也是分子间形成的,这也是羊毛角蛋白膜为什么同样具有优良力学性能的原因。
关于酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ带的比较,参考表2得到羊毛角蛋白膜中角蛋白的主要二级结构是无规则卷曲和β-折叠结构,α-角蛋白的比例减少。此结果与红外光谱的信息基本一致。根据Lucia E.等和Huson M.等的研究,无序肽链酰胺Ⅲ的谱带强度I1248/I1450反映了角朊纤维大分子聚集态结构的无序程度,该比值越大,角朊纤维聚集态结构越无序;I1653/I1450反映了有序α-螺旋链的含量,该比值越大,角朊纤维中有序α-螺旋链的含量越高。试样1的I1248/I1450为0.67,试样2的I1248/I1450为0.56,说明高温下羊毛角蛋白膜迅速形成交联,有序化程度高。而试样1的I1653/I1450为0.474,试样2的I1653/I1450为0.543,说明试样2中α-螺旋的有序结构含量更高。
2.4 膜的致密性观察
采用扫描电子显微镜观察角蛋白膜的表面和内部结构。图4为2种成膜条件下羊毛角蛋白膜的SEM照片(×1000倍)。图4(a)、(b)是在80℃条件下烘干的膜的截面和表面照片(膜1),图4(c)、(d)是在室温下(20℃)烘干制成的膜的截面和表面照片(膜2)。图4中角蛋白膜都有比较平整的表面,没有明显的孔洞。透气性测量发现几乎很少透气,表明该膜致密性良好。当然也可以调节成膜条件,使之产生微孔。
3 结论
通过研究膜的光学性质发现,羊毛角蛋白膜具有强紫外吸收能力,其透光性良好,透光性的差异来源于角蛋白溶液本身的性质。对不同还原羊毛角蛋白膜的红外测试与研究发现,所有还原羊毛角蛋白膜都具有蛋白质明显的酰胺带的吸收峰且极其相似,说明所有试剂都没有破坏羊毛的大分子主链。羊毛与羊毛角蛋白膜另一个比较明显的区别为羊毛中大分子主要以α-螺旋形式存在,而在羊毛角蛋白膜中大分子的构象以β-折叠链为主。膜的拉曼光谱分析也进一步解释和印证了羊毛角蛋白在经过溶解再固化过程后二级结构的变化,说明分子重构后形成新的二硫键也是分子之间形成的,这也解释了羊毛角蛋白膜具有优良力学性能的原因。
膜蛋白跨膜螺旋区段的预测研究 篇2
在细胞中约占所有蛋白总数30%的膜蛋白,在细胞的生命活动中扮演着极其重要的角色,担负着多种多样的生理功能。随着功能基因组学和蛋白质组学研究的开展,有待分析的膜蛋白序列急速增加,迫切需要有效的、准确度高的算法来预测膜蛋白的跨膜螺旋区段 (TMHs) 和跨膜方向,以指导膜蛋白的研究;另一方面,通过对不同算法预测精确度的比较,能够揭示出隐含的生物学意义,从而指导膜蛋白的生物学实验。因此,膜蛋白的结构预测,特别是膜蛋白的跨膜螺旋区段预测引起了研究人员的浓厚兴趣。
如今,已经出现了多种预测膜蛋白跨膜螺旋区段和跨膜方向的算法[1]。其中最早的预测方法始于1982年Kyte和 Doolittle提出的对膜蛋白氨基酸序列的疏水性分析法[2], von Heijne在1986年提出了著名的“正电荷居内规则”,为预测提供了进一步的指导。SOSUI、PRED-TMR是建立在前两种方法基础上提出的预测新方法,随后又出现了基于统计的预测方法,如DAS、TMAP,人工神经网络方法PHDhtm,基于隐马氏模型的方法TMHMM、HMMTOP。小波变换于1996年首先被引入生物信息学研究领域,近年来在该领域已经引起了广泛的关注[1,3]。本文利用氨基酸序列的疏水特性以及离散小波变换的多分辨率特点,将膜蛋白序列分解成一系列不同层次的结构,根据序列在不同尺度的信息来预测膜蛋白TMHs的数目和位置。选取Tusnady G E等[4]创建的跨膜蛋白数据集中的编码膜蛋白,构建成测试集,并且将预测结果与DAS,HMMTOP2.0,PRED-TMR2,SOSUI,TMHMM2.0 5种常用预测方法的主要预测结果进行了比较。结果表明,本文提出的方法具有较高的预测准确度。
1 材料和方法
1.1 材料
选取Tusnady G E等[4]创建的跨膜蛋白数据集中的编码膜蛋白,这些数据都是经过X射线晶体衍射法测定的,因而可以作为可靠的已知样本。选用25条膜蛋白序列构建成独立的测试集,共含有132个TMHs,3427个氨基酸残基,膜蛋白序列数据可以从http://www.enzim.hu/PDB_TM下载整理。
1.2 方法
蛋白质是由20种氨基酸通过肽键相连形成的生物大分子。不同的氨基酸具有不同的侧链,从而决定了各种氨基酸具有不同的理化特性,其中疏水作用是最重要的,疏水作用很大程度上决定了蛋白质结构的稳定性[1]。由于疏水特性在蛋白质二级结构和三级结构的形成中起到了关键性的作用,所以,采用著名的Kyte-Doolittle疏水值[2]将膜蛋白的氨基酸序列映射成膜蛋白的疏水值序列,以此作为小波分析的原始信号。
1.2.1 小波变换的方法
小波变换是一种时间窗口和频率窗口都可以改变的时频局部化分析方法。Mallat在构造正交小波基时提出离散小波理论中的多分辨分析 (MRA) 的概念,给出了Mallat算法。
假定平移尺度函数{φ(t-k),k∈Z}和平移小波函数{ψ(t-k),k∈Z}是正交的,令{c
通过小波理论,还有另一种的表示:
从式(1)和式(2)以及尺度函数和小波函数的正交性,将0尺度序列{c
和
重复运用上述分解,可以得到:
和
反之,可以从等式(1)和式(2)中推导出重构公式
上述公式可参见文献[1]。
用公式(5)和公式(6)将原始信号分解为低频部分{c
使用了重要的Daubechies (dbN)小波系作为母小波。通过对测试集中所有数据的分析,采用db10为最佳小波基,并且在5个不同尺度水平下进行小波重构。为方便起见,把本文提出的预测方法称之为WavePred。
1.2.2 评价指标
为了检验预测方法的准确性,主要从跨膜螺旋区段、氨基酸的残基两个层次对测试结果进行分析[1]。
主要采用以下三个指标来检验所预测跨膜区的准确性:1) 假阳性片断数:FP,FP指的是预测到的TMHs与已知的TMHs重合的残基数小于9个;2) 假阴性片断数:FN,FN指的是已被生物学实验证实但没有被预测到的TMHs;3) 跨膜螺旋区段的预测准确度:Qp=
2 结果与讨论
以从测试集中选取PDB代码为1F88 的膜蛋白为例,描述该方法预测膜蛋白TMHs的数目和位置。它共有348个氨基酸残基,是一个七跨膜蛋白[5]。采用小波基db10,它的原始疏水图谱和在5个不同尺度水平下重构后的小波图像见图1。小波滤波后的信号峰对应着真实的TMHs,每个峰顶对应于一个TMH的核心,通过上述方法,就可以得到一组预测的TMHs。
由图1可以看出,尺度水平为1,2,3时,滤波效果不明显,尺度水平为5时出现了明显的过度滤波,从而丢失了许多信息。尺度水平为4时,1F88疏水值序列的小波滤波后的图像与真实的TMHs有非常好的对应关系。从图1中看到,当尺度水平取4、最佳阈值为0.834时,TMHs的预测准确度达到100%,残基的预测准确度为97.0%。
通过对25条膜蛋白数据集的分析,选取db10为最佳小波基,在尺度水平为4、最佳阈值取0.834时,总共预测到的TMHs个数为129,其中125个与实际一致,TMHs的平均预测准确度为95.8%,残基的平均预测准确度为76.3%,而假阳性片断数为4,假阴性片段数为7。把25条膜蛋白序列提交到DAS,HMMTOP2.0,PRED-TMR2,SOSUI,TMHMM2.0 5种预测方法提供的服务器上,通过统计分析,其主要预测结果见表1。
从表1中可以看到:WavePred方法预测TMHs的准确度最高,达到了95.8%,其次是基于隐马氏模型的预测方法TMHMM2.0、HMMTOP2.0,预测准确度分别为95.7%和94.6%,基于统计的DAS方法预测准确度最低,仅为89.5%,与我们的方法相差6.3%。残基的预测准确度TMHMM2.0最高,达到了78.6%,HMMTOP2.0的预测准确度为76.5%,而WavePred的预测准确度为76.3%。结合常用几种预测方法的分析,结果表明,本文提出的方法达到现有预测算法的水平,能够准确、方便地预测膜蛋白TMHs的数目和位置。
3 结 语
预测膜蛋白序列中TMHs的位置和数目是当前生物信息学中重要的研究课题,因为通过对膜蛋白的TMHs预测能够为该蛋白行使何种功能提供重要的线索。提出了基于DWT的方法来预测膜蛋白序列中TMHs的数目和位置,通过对几种常用预测方法的比较,结果表明,本文提出的方法具有较高的预测准确度。
参考文献
[1]Yu B,Meng X H,Liu HJ,et al.Prediction of transmembrane heli-cal segments in transmembrane proteins based on wavelet transform Shanghai University(English Edition),2006;10(4):308—318
[2]Kyte J,Doolittle R F.A simple method for displaying the hy-drophathic character of a protein.J Mol Biol,1982;157(1):105—132
[3] Liò P. Wavelets in bioinformatics and computational biology: State of art and perspectives.Bioinformatics, 2003;19(1): 2—9
[4] Tusnady G E, Dosztanyi Z, Simon I. Transmembrane proteins in the Protein Data Bank: Identification and classification. Bioinformatics, 2004;20(17): 2964—2972
细胞角蛋白19片段的临床应用 篇3
关键词：细胞角蛋白19片段,肿瘤标志物,临床应用,文献综述
近年来,肿瘤越来越受到大家的重视。肿瘤是指机体在多种导致肿瘤发生的因素的协作下,部分组织的某些细胞在基因水平上的生长和分化发生调控失常,致使其克隆性异常增生而形成的新生物。随着肿瘤的产生,各种肿瘤标志物也随之应用于临床。肿瘤标志物是肿瘤组织分解代谢和分泌产生的分子产物,代表细胞或体液的生理及化学特性[1]。肿瘤标志物同时还具有非侵入、简单经济、快速有效的特点。细胞角蛋白19片段(cytokerantin-19-fragment,CYFRA21-1)即是一种新型的肿瘤标志物,在多个系统的肿瘤中可进行检测及临床评估。现将近几年来对CYFRA21-1的临床应用作一简要的综述。
1 CYFRA21-1的结构
CYFRA21-1是细胞角蛋白家族中的一个类型,相对分子质量为40 000,等电点5.2,是存在于上皮细胞中的细胞结构蛋白,其可溶性片段上的2个抗原决定簇可特异性地与2个单克隆抗体BM19-21、KS19-1相结合。
2 CYFRA21-1的表达
一般来讲,CYFRA21-1含量非常低,常以寡聚物形式存在。伴随着上皮细胞发生癌变,激活的蛋白酶促进细胞角蛋白的降解,很多CYFRA21-1释放出来,导致其在尿液、血液等体液中的水平上升[2]。CYFRA21-1分布于鳞状上皮、复层上皮以及单层上皮细胞如结肠、乳腺导管、汗腺、气管、腺泡、子宫内膜和肝细胞等,其分布的部位非常广泛[3]。
3 CYFRA21-1在各种肿瘤诊治中的临床应用
由于CYFRA21-1分布广泛,可用于乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、上皮性卵巢癌、肺癌、胃癌、胆道肿瘤、宫颈癌等的预后、病情监测及疗效评价等。
3.1 乳腺癌
20世纪以来乳腺癌的发病率在世界各地均有上升的趋势。乳腺癌的诊断也越来越受到重视。白树祥[4]通过采用电化学发光免疫法检测62例乳腺癌患者、57例乳腺良性疾病患者及50例健康对照组的血CYFRA21-1、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和糖类抗原153(carbohydrate antigen-153,CA153)水平,得出结果:CYFRA21-1在乳腺癌患者中明显高于乳腺良性肿瘤和健康对照组(P<0.01);血清CYFRA21-1在3个肿瘤标志物中特异性最高,为89.7%,其敏感性为45.2%,但是CYFRA21-1作为单一的肿瘤标志物具有一定的局限性,与CEA、CA153联合检测可提高敏感性和准确性,弥补单一检测的不足,同时可用于术后随访和监测疾病复发。
3.2 胰腺癌
胰腺癌是一种恶性程度和病死率都很高的肿瘤,早期症状不明显,一经发现多为晚期。饮食结构不合理、生活缺少规律,可诱发胰腺癌[5]。CYFRA21-1已经作为生物标志物在一些上皮的恶性肿瘤中应用。然而,其在胰腺癌的作用还需进一步研究。
Boeck等[6]将72例胰腺癌患者纳入研究,其中45例接受治疗。在前瞻性临床试验中分别测定治疗前和每周CYFRA21-1、糖类抗原199(carbohydrateantigen-199,CA199)、CEA的水平,这些每周测定值由姑息一线化疗中得到。该试验通过生物标志物的数据,利用单向和多变量分析疾病进展时间(time to progression,TTP)和总生存期(overall survival,OS)。试验结果:TTP中位数为3.9个月,OS中位值7.7个月;治疗前CYFRA21-1水平与体能状态(P=0.039 9)和疾病的阶段(P=0.000 1)均显著相关联。化疗之前标志物水平和2个月的3种标志物分段标记值被认为是对治疗效果的重要预测。在多变量分析中,只有CYFRA21-1和体能状态为胰腺癌的独立预测因子。结论:CYFRA21-1可以用作晚期胰腺癌监测治疗反应和评估预后的宝贵工具。
3.3 鼻咽癌
鼻咽癌是一种头颈部恶性肿瘤,因临床表现不一且复杂、前期症状不明显、起病隐匿,不容易确诊。鼻咽癌患者主要依靠影像学检查监测复发、远处转移及治疗效果,但不能动态反映疗效及监测复发[7]。CYFRA21-1的研究有利于改变鼻咽癌的现状。
国内一项研究[8]通过测定332例鼻咽癌患者治疗之前血清CYFRA21-1水平,研究其与OS、无瘤生存期(tumor-free survival,TFS)、局部复发时间(time to local recurrence,TLR)和远处复发时间(time to distant recurrence,TDR)的关联。结果:多因素分析表明,治疗前血清CYFRA21-1水平和肿瘤分级高是OS缩短和TDR的独立预测因子。高水平的治疗前CYFRA21-1是更短的TFS和TLR的独立预测因子。结论:治疗前血清CYFRA21-1的水平将是一个可靠的生物标志物,用以评估患者的未分化鼻咽癌的长期预后。
3.4 上皮性卵巢癌
卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤,具有发现晚、治疗效果差、转移早等临床特点,病死率居妇科恶性肿瘤首位[9]。
Wu等[10]回顾性分析42例未经治疗的上皮性卵巢癌患者的血清的CYFRA21-1浓度,采用单变量和多变量分析该疾病的不同预后,同时测定血清标志物糖类抗原125(carbohydrate antigen-125,CA125)浓度,并分析比较。此试验得出结果:CYFRA21-1和CA125的血清水平与腹膜后阳性淋巴结和铂电阻有关;与比较低的水平CYFRA21-1相比,较高水平的CYFRA21-1(3.0 ng·ml-1为截点)与更短的无病存活率(16个月vs 28个月P=0.001)和总生存期(29个月vs 41个月,P=0.007)相关。进一步的单变量分析显示,CYFRA21-1和腹膜后淋巴结转移均与铂电阻和死亡率有关。多变量分析显示腹膜后淋巴结转移和血清CYFRA21-1水平可作为TFS和OS的独立危险因素。结论:未经治疗的上皮性卵巢癌血清CYFRA21-1水平有显著的预后意义,当它超过3.0 ng·ml-1时预后差。
测定血清CYFRA21-l的水平对卵巢癌的预后进行评估,随时监测病情变化,具有重要意义。
3.5 肺癌
肺癌是造成肿瘤患者死亡的重要因素,其发病率高,而且不易早期诊断,不仅病死率高,治疗后效果也不佳。
国内一项研究[11]通过电化学发光法测定血清CEA和CYFRA21-1的水平,这些血样采自102例肺癌患者,45例良性肺疾病患者和36例健康对照者。结果:在肺癌患者中,血清CYFRA21-1水平和阳性率[(14.08±8.34)ng·ml-1,62.7%]显著高于良性肺部疾病患者[(3.27±2.87)ng·ml-1,7.7%;P<0.05]和健康对照组患者[(2.69±2.02)ng·ml-1,3.8%;P<0.05]。肺癌患者处于不同TNM阶段,其CYFRA21-1水平都不同程度地增加:Ⅱ期(10.05±6.76)ng·ml-1,Ⅲ期(15.93±6.66)ng·ml-1,Ⅳ期(22.78±4.12)ng·ml-1。结论:CYFRA21-1单独采用对肺癌的诊断有帮助。
在肺癌的诊断中以组织病理检查和细胞学为诊断依据,特异性高,但敏感性不强,所以肿瘤标志物成为了理想的指标[12]。CYFRA21-1的出现,对肺癌诊断提供了便利条件。同时,CYFRA21-1便于确定病理类型,若联合检测可以提高肺癌诊断的敏感性,大大提高肺癌的检出率[13]。
3.6 膀胱癌
膀胱癌为泌尿系统中常见的恶性肿瘤。膀胱癌复发率很高,约一半的患者可能复发,一小部分复发患者可进展为浸润性肿瘤[14]。
Washino等[15]通过研究血清CEA、CA19-9和CYFRA21-1水平来分析它们对膀胱癌的诊断和监测的有效性,血样来自85例膀胱癌患者。在不同的肿瘤临床分期和病理分级中,比较每个肿瘤标志物的绝对水平和阳性率。标志物的变化用来评估患者有无疾病进展,同时评估生存与这些肿瘤标志物之间的关系。结果表明:较高的CYFRA21-1血清水平与较高的肿瘤分期关系密切(P<0.01),同时与较高的病理分级(P<0.05)相关。CYFRA21-1的水平随着疾病的进展显著升高[从(7.33±13.3)增至(55.9±127)ng·ml-1,P<0.01]。CYFRA21-1阳性的患者疾病特异生存率更差,(P<0.000 1,时序检验)。结论:血清CYFRA21-1在膀胱移行细胞癌的诊断上似乎是一个先进的标志物,CYFRA21-1可以有效地监测膀胱癌的进展及评估其预后。
3.7 胃癌
近些年,各种肿瘤标志物已被应用在胃癌的管理中,只有少数报道描述CYFRA21-1。
Gwak等[16]通过试验评估CEA、CA19-9、糖类抗原72-4(carbohydrate antigen 72-4,CA72-4)、CYFRA21-1和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)在胃癌患者中的潜在诊断性能。结果表明:在胃癌的初期阶段,根据两个不同的临界值(推荐的和调整的),CYFRA21-1(≥2.0和1.2 ng·ml-1)有各自的敏感性,分别为50%和78.1%;CEA(≥7.0和3.9 ng·ml-1)的敏感性分别为8.3%和18.8%;CA19-9(≥37和26.7 ng·ml-1)的敏感性分别为15.6%和18.8%;CA72-4(≥4.0和13 ng·ml-1)的敏感性分别为28.1%和9.6%;NSE(≥14.7和15.0 ng·ml-1)的敏感性分别为7.3%和7.3%。CYFRA21-1在ROC曲线下的面积(AUC)0.978(95%置信区间,0.964~0.991)是相对最高。结论:CYFRA21-1是最敏感的肿瘤标志物,并显示出在5个胃癌管理肿瘤标志物中最强大的诊断性能。
3.8 胆道肿瘤
胆道肿瘤包括肝内、肝门部、远端胆管和胆囊癌。血清CYFRA21-1水平升高在胆道肿瘤中有少量报道。
Huang等[17]通过研究探讨血清CYFRA21-1在胆道癌亚型中的临床意义。该实验随访134例恶性和52例良性病变患者,测定其血清CYFRA21-1、CA199和CEA术前、术后的值,分析了生物标志物的受试者特征曲线。CYFRA21-1水平与患者临床病理特征及随访数据相关。结果:CYFRA21-1在胆道恶性肿瘤中显著上调,而且在不同的亚型中有表达差异。在确诊胆囊癌和肝内胆管癌方面,CYFRA21-1比其他肿瘤标志物具有更好的诊断性能;在手术切除肿瘤后下降,在肿瘤复发时升高,它与肿瘤的侵袭性和TNM分期相关。这是一个多因素分析中1年无复发生存率和总生存率的独立预测因子。结论:血清CYFRA21-1在应用于诊断胆囊癌和胆管癌上,是一种可靠的生物标志物。
3.9 宫颈癌
宫颈癌是一种恶性的妇科肿瘤,其预后评估受到极大的重视,具有重要的临床意义。Piao等[18]通过回顾性分析506例宫颈癌患者根治性子宫切除术或次同步放化疗治疗的数据。治疗前测定患者血清鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCAg)和血清CYFRA21-1水平,采用Cox比例风险模型进行多因素分析,探讨治疗前变量的预后意义。结果:治疗前CYFRA21-1(P=0.010)血清水平独立影响总生存率。同样,在非鳞状细胞癌患者中,治疗前CYFRA21-1的血清水平是影响无病生存期和总体生存率的独立预后因素(P<0.001,P=0.006)。结论:参考血清SCCAg,治疗前CYFRA21-1水平可作为宫颈癌的一个有效预后指标。
3.1 0 其他肿瘤
CYFRA21-1不仅在乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、上皮性卵巢癌、肺癌等疾病中检测出,同时在其他肿瘤中也被检测出,如食管鳞状细胞癌。丁文秀等[19]采用电化学发光法分别检测健康对照组(45例)和初次诊断食管鳞状细胞癌患者(90例)血清中CYFRA21-1和CEA浓度,并对出现淋巴结转移和(或)远处转移者再次检测血清中CYFRA21-1和CEA的浓度。该实验结果表明:CYFRA21-1对食管鳞状细胞癌的诊断及预后有重要价值,而且优于CEA。
4 CYFRA21-1在慢性炎症性疾病中的临床应用
华红等[20]通过研究表明:CYFRA21-1不仅在肿瘤疾病中有所表达,同时在结核性胸膜炎等慢性炎症疾病中有所表达,但CYFRA21-1在结核性胸膜炎中的水平不及肿瘤高。
5 结语
角蛋白膜 篇4
关键词：生物技术,角蛋白微生物降解,营养改善,家禽羽毛
1 引言
家禽羽毛占家禽体重的5%~7%, 是一种废弃物, 但作为动物饲料又具有应用的潜力和限制。尽管羽毛对鸟类来说具有重要作用, 但在离开了鸟的身体后, 它们的生物学利用似乎不太理想。家禽羽毛可能组成了自然界中最丰富的角蛋白资源。家禽在被人们食用后, 其羽毛就被当作废弃物堆积起来。因此废弃物就产生了很大的污染影响, 尤其随着全球家禽类产品的增长。
可以理解, 家禽羽毛中大量有潜在使用价值的蛋白与氨基酸 (如表1) , 可以用作动物饲料, 这使得羽毛资源循环利用成为了动物营养学家感兴趣的课题。因为羽毛作为蛋白饲料, 在价格和替代性上都具有潜力。然而, 羽毛利用的限制主要是其不容易消化, 生物学价值低, 以及缺乏一些有营养价值的必须氨基酸, 如蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸 (Baker et al, 1981;Papadopoulos et al, 1985;Dalev et al, 1997) 。同时, 羽毛组成的氨基酸是多变的 (Wang and Parsons, 1997) 。另外, 随着家禽年龄增长, 其毛中总必需氨基酸含量下降, 尤其是蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸, 而总非必需人氨基酸相对增加 (Stilborn et al, 1997) 。天然羽毛蛋白的营养缺陷主要来源于维持羽毛蛋白结构刚性的氨基酸组成与分子结构。同样的原因也可以解释天然角蛋白不能被大多数蛋白水解酶降解。蛋白链中大量存在的α螺旋 (α角蛋白) 或β折叠 (β角蛋白) 形成超螺旋多肽链, 从而使羽毛具有很强的机械稳定性与抗蛋白酶水解性。大量双硫键的形成也使多肽链的交联度提高。
大量的半胱氨酸促进了双硫键的形成。多肽链中的氢键, 疏水作用以及超螺旋的稳定性进一步促进了角蛋白的强度和耐水解性。
然而, 生产易消化蛋白粉的传统方法是热降解法。根据Papadopoulus (1989) , Latshaw et al. (1994) 和Wang and Parsons (1997) 可知, 热处理对营养的改善有限, 必需氨基酸像赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸会遭受损失, 并且会形成非营养氨基酸如溶素丙氨酸、羊毛硫氨酸等 (表1) 。
在有限的营养改善背景下, 考虑到羽毛传统加工的热能耗成本, 从营养改善, 环境友好和谐, 生物资源最优化以及成本有效化入手探索一种替代性技术是合理的。
涉及到微生物及其酶的生物技术方法是一种概念上合理的处理技术。然而, 还没有文献记录角蛋白水解微生物的工业应用前景, 尤其是强调角蛋白酶产品、性能和其水解的机理和缺陷的文献。因此, 为了促进生物技术处理羽毛将其用作动物饲料, 本文综述了生物法水解角蛋白的最新信息。羽毛营养价值升级可以生产出高蛋白饲料, 从而可以大大节约家禽饲料中大豆和鱼粉的使用。此外, 可以预测, 羽毛的生物转化会有益于养禽业、人类以及环境。
2 微生物角蛋白水解和角蛋白酶产品
2.1 自然界中角蛋白水解的证据
尽管角蛋白非常稳定, 但在自然界中羽毛也不会积累, 因此可证明确实存在天然的角蛋白分解者或食用者。从人类或家禽的蹄、指甲、角质层、角、头发等角蛋白部分的致病性皮肤真菌和生长 (感染) 可以获得进一步证据, 或许会是自然界中角蛋白降解的一个更好的研究方面。皮肤真菌一种微生物, 可以寄生于活体动物的角质基层中。当此类微生物在含有角蛋白的介质中培养时, 它们可以将角蛋白基质作为碳源和氮源而食用。皮肤真菌在角蛋白基质中的生长说明它们有能力合成降解复杂角蛋白的蛋白水解酶。
2.2 微生物角蛋白降解以及它们生物技术应用的理由
很多科研工作者 (Yu et al, 1969;ElmayergiandSmith, 1971;Takiuchi et al, 1984;Asahi et al, 1985;Wawrzkiewicz et al, 1987;Abdel-Hafezand El-Sharoumy, 1990;Malviyaet al, 1992;Santos et al, 1996;Simpanya and Baxter, 1996;Singh, 1997) 已经证明和报道过很多微生物都能分解角蛋白, 这些微生物中大多数是真菌和细菌。一些腐生菌和寄生菌可以降解角蛋白 (Safranek and Goos, 1982) 。还有很多新孤立的微生物表现出降解角蛋白的性能。最近, Lin et al. (1995) 测序并表达了ker A基因, 它能翻译出地衣芽孢杆菌PWD-1 97%序列一致的角蛋白水解酶。
观察角蛋白底物的天然降解与寄生虫感染降解, 在实验室条件下进行重复性实验, 结果表明, 作为动物饲料通生物技术提高羽毛利用是可靠的。这与Lin, Dozie和Santos等人的断言一致。
生物技术在羽毛加工上的应用具有以下重要意义。第一, 微生物的培养和角蛋白酶的活力可能会改变羽毛角蛋白的结构。这就有可能改变对食用动物消化酶的抵抗性 (Elmayergi and Smith, 1971;Barabas, G.等, 未公开结果, 1986;Benedek等, 1985;Willianms and shih, 1989) 。此外, 可以有从微生物蛋白质的生物量的羽毛粉, 可能是互补或添加剂的营养富集。Barabas, G等 (未公开发表结果, 1986) 发现, 与未发酵羽毛相比, 发酵羽毛中赖氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量更高, 得出结论, 不仅羽毛角蛋白可以作为蛋白来源, 微生物也可以。Earlier, Elmayergi和Smith (1997) 已经报道过, 通过S.fradiae的一种蛋氨酸分泌突变体发酵的羽毛蛋氨酸和赖氨酸含量有少量增加。第三, 氨基酸的生产也是可行的, 尤其是饲料级的赖氨酸和其它来自于羽毛微生物发酵产生的氨基酸 (MohammedEl-Akied, 1987;Williams和Shih, 1989) 。表2和表3提供了发酵羽毛营养改善 (氨基酸含量增加) 的证据。
2.3 角蛋白降解微生物的生态学
角蛋白降解微生物在自然界普遍存在, 尽管倾向于靠角蛋白基物生长。或许研究最透彻的就是皮肤癣菌因为大多数研究者对病理学很感兴趣 (Grappel和Blank, 1972;Higuchi等, 1981;Wawrzkiewicz等, 1987, 1991;Apodaca和Mckerrow, 1989;Hanel等, 1991;Porro等, 1997) 。Geophilllic皮肤寄生真菌得到了很大关注 (Abdul-Fatah等, 1982;Al-Musallam, 1988;) 。角蛋白降解微生物已经从污泥中分离 (Ulfig和Korcz, 1983, 1994) 。一种嗜动物性皮肤真菌发癣菌对鸡毛有高度专一性 (Wawrzkiewi cz等, 1987) 。
具有角蛋白降解能力的非寄生真菌也被分离来对它们的酶进行提纯和角蛋白水解性评估 (Malciya等, 1992, 1993a, b;Dozie等, 1994) 。Williams和Shih从混合了粪便与鸡毛的消化池中分离了B型地衣杆菌。从土坑壤中分离了链霉菌sp.A11, 可产生解朊和角蛋白水解活性 (Mukhopadhyay和Chandra, 1990) 。Santos等人1996年报道了烟曲霉菌, 这是一种在人体, 鸟类和其它动物中普遍存在并伺机靠空气传播的病原体, 将鸡毛作为其唯一的碳和氮源。
角蛋白降解微生物在不同生态和环境条件下生长, 并且溶解角蛋白基物和其它复合蛋白基物的能加很宽泛。微生物主要是通过合成和分泌蛋白酶将底物降解和分解为可吸收的小分子营养素。然而, 有相关文献已经报道了具有角蛋白水解活性的蛋白内切酶或细胞结合酶 (Yu等, 1971;Lamkin等, 1996) 。同时对于它们在复合蛋白底物中的分子机理的理解仍远不够。
2.4 角蛋白降解酶的特性
通过能够降解角蛋白的微生物在细胞内或外加工释放出的特性蛋白酶命名为角蛋白酶或角蛋白水解酶。这种酶与其它类似的蛋白水解酶相比, 水解复合底物的活性更好, 从而就区分了角蛋白酶与其它蛋白酶或肽酶。
多数角蛋白酶在很大程度上是诱导性的, 需要角蛋白作为外源诱导物。某些微生物的角蛋白酶有消抑制作用, 如念珠菌、白色念珠菌 (Kapica和Blank, 1957, 1958和金孢子菌 (DOZIE等, 1994) 分化带来他们从组成前分泌表达的细胞结合的角蛋白酶。
许多角蛋白酶在细胞外是有活性的, 从合成物的细胞内位点释放出。然而, 与细胞相关活力的证据蛋白酶已有报道癣菌 (Yu等, 1971) , 和一种被充分研究过的角蛋白降解微生物毛癣菌 (Lamkin等, 1996) 。但T.rubrum的内切酶对蛋白质底物具有宽的选择范围, 不像T.gallinae。
本文献描述了不同微生物对角蛋白的水解活力和酶底物的专一性。这可能是方法论和物种不同的原因。例如, Lin等1992年发现从B.地衣杆菌中提取的蛋白酶可以水解所有被测的蛋白底物, 包括牛血清蛋白、胶原、弹性蛋白和羽毛角蛋白。与上述一致, Bockle等1995年观察了从鸡毛不同可溶底物 (酪蛋白与明胶) 与不可溶底物 (天然与热压处理) 所含肽的释放情况。相反, Dozie等1994年报道了一种亲热性角蛋白水解酶。这种酶从C.keratinophllum中获得, 只水解角蛋白, 但对酪素、牛血清蛋白或角蛋白粉无水解活力。这表明分离的酶对角蛋白底物具有专一性。从另一个角度, Bockle等1995年发现, 在40~70℃范围内用角蛋白降解S.pactum的培养滤液可以将完整鸡毛分解, 远超过了生理需求, 然而, 纯化酶的溶解率还不到底物的10%。
高度专一性细胞内角蛋白酶通过T.gallinae加工释放 (Wawrzkiewicz等, 1987) 。从一些角蛋白降解微生物中提取的特征角蛋白酶的物理化学性能总结在表4中。
2.5 微生物角蛋白水解的机理
角蛋白微生物水解的基本是一种蛋白降解的过程, 因为底物 (角蛋白) 本质上就是蛋白质, 也就说蛋白重量占95%。尽管角蛋白酶的物理化学性能不同, 但它们对角蛋白具有相同作用这一点毋庸置疑。大多数角蛋白水解酶特性可以作为蛋白酶, 对角蛋白有活性。然而, 对于角蛋白水解的重要机理和角蛋白降解微生物的新陈代谢还不太清楚。尽管对角蛋白酶的动力行为缺乏完整理解, 但很多证据证明以下流程存在的可能性。
2.6 机械的角蛋白水解
这只用于真菌和菌丝体的生产, 角蛋白降解微生物。机械角蛋白水解可以理解为是由角蛋白底物或菌丝压力引起的角蛋白降解。Malviya等1992注意到, 在细胞外发现角蛋白酶活性之前角蛋白就开始水解了, 而且降解与菌丝体生长有关。这或多或少预示了机械降解。真菌菌丝体生长与伸长对复合底物产生压力或作为完整的角蛋白水解机理, 机械降解的证据已被预先讨论过 (Wawrzkiewicz等1987) 。
真菌对宿主的入侵结合了机械压力与酶的水解。通过Figueras等最近的研究, 在不考虑成分结构角质化的前提下, 使用超微结构显微照片可以观察出真菌垂直侵蚀毛发的能力。菌丝的机械渗透是有必要的, 有利于暴露出更多酶解肽键的反应位点。
从可获得的证据来看, 或许可假设机械角蛋白降解促进了酶的水解, 实际上当菌丝产生外切蛋白酶时更是这样。机械水解和酶水解和协同作用或许发生在起始过程之后。然而, 纯化角蛋白酶的初始化能力, 持续羽毛降解的能力也许会对以上假设产生质疑。
2.7 硫解
因为羽毛粉中半胱氨酸含量较高, 才出现了硫解的标志。可以理解, 羽毛中含有半胱氨酸的优势就是通过形成双硫健使生物分子结构更加稳定。大从数研究工作者已经认为角蛋白降解的一种可能机理就是双硫键的断裂。然而, 验证性研究在这方面很缺乏。
2.7.1硫解证据
在角蛋白的降解过程中, Kunert的调查对硫解提供了深刻的理解。从Ruffin等和Malviya等的研究中也获得了贡献性证据。双硫键是角蛋白具有突出稳定性与抗降解性的主要原因。只有通过双硫键断裂使蛋白变性, 角蛋白才可以完全水解, 大家对此达成共识。
根据Kunert (1992) , 癣菌和非癣菌将代谢出的自由的或结合的半胱氨酸作为硫源和氮源 (Ziegler等1969) 。通过真菌代谢的胱氨酸产物是无机硫和其它中间产物。Kunert (1992) 认为过量的硫以氧化态的硫酸盐和亚硫酸盐形式排泄回介质中。根据下面反应式, 在中性至碱性p H范围内, 亚硫酸盐与胱氨酸反应, 生成半胱氨酸和硫磺基半胱氨酸。
根据Kunert (1992) , 结合在蛋白质上的胱氨酸也会发生这种反应, 包括角蛋白。因此由于亚硫酸盐的释放, 角蛋白在被蛋白酶降解之前就已经变性了, 这就导致了双硫键的分解。Kunert, Malviya等人提供了双硫键断裂与角蛋白分解同时进行的充实证据。实事上, Malviya等人发现只有超过一半的角蛋白被降解后才能在培养介质中检测到角蛋白。这也就意味着角蛋白有非酶或非水解方式的降解。在角蛋白培养液中出现像磺化半胱氨酸, 硫代硫酸盐, 硫酸盐以及半胱氨酸这样的硫解产物进一步证明双硫键断裂。然而, 很多研究者几乎未检测到中间产物。对于这种现象的解释是真菌优先将半胱氨酸作为硫源。Malviya与Mohammed El-Akied的研究表明培养液中残留半胱氨酸量持续下降, 很明显是因为被真菌代谢消耗。
此外, 当加入DDT, DMSO, 巯基乙醇盐, 苏糖醇等还原剂时可以加强角蛋白水解, 这就可以提供物理化学的证据。为了确认亚硫酸盐分泌降解角蛋白先于真菌蛋白酶降解角蛋白, Kunert比较了五种还原剂磺酸钠、半胱氨酸、谷氨酰胺、巯基乙醇和苏糖醇对微孢菌蛋白酶活性的影响效果。结果表明, 亚硫酸钠在浓度为3.78 mg/m L时, 蛋白酶活性提高最多, 达到2.9倍。半胱氨酸, 巯基乙醇, 谷氨酰胺的效果逐步下降, 并且浓度在0.3~1.0 mmol时效果最好。效果最差的是苏糖醇。Kunert发现, 24 h内, 胱氨酸桥键断裂32%、66%和97%并且转化为硫磺基半胱氨酸后, 水解效果分别增加3.7、29和43倍。Kunert讨论了获得的结果, 从而揭示出随着硫解程度增加, 蛋白水解的敏感性迅速增加并且底物的溶解也可以从微观证明和重量测定。Bockle等人也证明了添加DDT对细菌蛋白酶混合物和纯角蛋白酶的角蛋白水解活性有催化效果。作者还发现如果没有1%的DDT加入, 角蛋白降解率只有大约10%, 然而加入后能够达到70%。此前, Takami等人发现巯基乙酸盐催化时, p H12, 温度70℃, 1 h内就可将毛完全溶解。并且, 在无还原剂的情况下, 蛋白酶几乎无角蛋白水解活性。Sinha等人还报道了S.fradiae的两种丝氨酸蛋白酶, 在加入DDT后蛋白酶活性增强。加入巯基乙酸盐时, S.pactum的蛋白酶无活性, 但加入DDT后有活性。这就表明, 微生物酶对能还原双硫键的化学试剂具有不同反应。
其它验证性间接数据也有, 两种非专一性蛋白酶胰蛋白酶和链霉蛋白酶硫解天然羊毛相同的降解效果, 这可以作为验证性的间接数据。Everett之前也报道了一种类似的发现。组织化学反应也揭示出在硬角蛋白降解的位点上有大量硫磺基团。然而, 不同微生物的硫解能力不同, 这或许与它们寄生潜能的差别相关。
2.8 蛋白水解
然而, 角蛋白的水解阶段或许被过度简化了, 并且与肽键水解类似, 角蛋白酶的敏感性不同。不同的相对分子质量、活化剂以及最适环境条件 (p H, 温度) 表明仍缺乏酶解蛋白机理的相关知识。的确, 非专一蛋白酶降解硫化角蛋白的能力使角蛋白酶的专一性进一步复杂化。这种矛盾在纤维素、甲壳素、多糖这类复杂有机化合物的微生物代谢中普遍存在。
但是, 与其它蛋白酶相比时, 微生物角蛋白酶的高水解性是一个突出的因素。此外, 纯角蛋白对长链和复杂分子的特殊偏爱也对支持角蛋白专一性提供了补充证据。角蛋白酶对底物的专一性也暗示了不同作用方式的可能, 但仍然有待了解。
2.9 角蛋白水解的反应顺序
对角蛋白降解提出精确的反应顺序是有困难的。然而, 对于真菌和放线菌, 大概从菌丝的生长开始, 接着分泌破坏双硫键亚硫酸盐, 最后蛋白水解。过了初始阶段, 几个过程同时进行, 微生物也仍在生长。当有细菌体、纯酶或粗酶加入时, 或许是一种不同的降解机理。这基本上需要角蛋白底物的分解。Kunert经过大量研究证实了真菌存在时角蛋白降解的假设路径, 当使用纯酶时, 角蛋白酶分离纯化后的结果可以从表面上说明可能的机理。也很可能是一种单独的作用模式, 或许不会适用于所有类型的角蛋白降解微生物。
2.1 0 羽毛粉的微生物处理:生物技术应用的可能性
大多数研究者同意作为饲料蛋白羽毛 (角蛋白) 的微生物转换代表了一种改善羽毛使用价值微生物技术。通过在羽毛中培养角蛋白降解微生物, 接着在细胞外分泌角蛋白酶, 可以达到羽毛的生物降解。不用微生物单独使用含有角蛋白酶或粗酶的培养滤液, 或着单独使用纯酶也可达到羽毛的生物降解。
2.1 1 羽毛粉营养改善的证据
Elmayergi和Smith的研究为我们作了先驱工作, 他们评价了S.fradiae发酵后羽毛粉的氨基酸的营养补充情况。尽管发酵产品的蛋氨酸、赖氨酸和色氨酸含量仍很低, 但与未发酵产品相比, 蛋氨酸含量增加 (表3) 。Elmayergi和Smith表示羽毛发酵后所有氨基酸的浓度均大大提高。然而, 通过喂养试验得出的结果表明发酵与未发酵羽毛粉的营养价值无太大区别 (表5) 。这也就解释了产品不能用于鸡类的原因。通过补充蛋氨酸以达到生物需求继续实验, 即给肉鸡喂食分离的大豆, 最终肉鸡的生长率发生了明显的变化。在一个类似的研究中, Barabas, G等人发现与完整羽毛相比微生物发酵的羽毛粉中赖氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量更高 (表2) 。作者分析了两组老鼠喂养试验, 发现喂食羽毛水解物的老鼠体重未减少, 而喂食少蛋白食物的老鼠体重减少。尽管喂食羽毛粉的老鼠可能因为蛋氨酸缺乏而有体重下降的可能, 但这些研究也可确认羽毛水解物的可消化性和使用性。从他们的研究中可以得出结论, 不仅羽毛粉 (角蛋白) 可以当作蛋白质喂食动物, 同时产酶菌的生物量也可以。
2.1 2 粗角蛋白酶的使用
Lee等人报道了粗角蛋白酶作为饲料添加剂首次使用。角蛋白酶从地衣芽孢杆菌中获得。他们发现, 添加了角蛋白酶后原毛总氨基酸的可消化性从30%增加到66%, 而商品毛从77%增加到了99%。在第二个以8天为基准的实验中, 对年龄三周大肉鸡分别喂食大豆粉、商业羽毛粉、角蛋白酶补充处理的羽毛粉, 肉鸡的日增长量分别为66g, 50 g, 56 g。从两个实验可以得出结论, 添加角蛋白酶可以提高羽毛产品的可消化性, 这样就扩大了角蛋白酶在增强羽毛粉营养方面的应用。
2.1 3 纯角蛋白酶的使用
莱纳大学J.C.H Shih和他的同事获得了纯角蛋白酶作为饲料补充的大量应用证据。为了降低酶的自分解, 研究者最近所作的努力是将从地衣杆菌分离的纯角蛋白酶固化。固化角蛋白酶对不可溶的羽毛角蛋白和可溶性的酪素都表现出水解活性。而且与未固化角蛋白酶相比表现出更高的热稳定性和耐酸性, 因此增加了其在更多应用上使用的潜能。
2.1 4 生物技术方法对羽毛营养改善的建议途径
考虑到生物技术应用于羽毛营养改善具有很大潜能, 在羽毛加工上, 微生物技术的应用范围如下:
(1) 获得完全的羽毛结构降解。通过化学处理或微生物处理或几种方法结合处理达到硫解是可行的。需要全面实施对外部内部以及培养过程中辅因子的研究, 因为这些辅因子或许会优化酶的催化作用。
(2) 加强羽毛粉的营养价值, 尤其是蛋氨酸和赖氨酸的含量。可能以下任何生物技术工具的结合都是相关的。
1) 像赖氨酸这种主要有限氨基酸的转肽作用或氨基酸结合或共价结合作用。
2) 通过角蛋白降解微生物的突变或蛋白质工程进行基因操控。
3) 角蛋白酶基因在无害微生物的翻译, 因为很多活性角蛋白水解微生物具有致病性。
(3) 使用一种联合方法设计出一种微生物复合酶很有意义, 这种方法能将角蛋白水解酶与肽解酶进行共同加工。也需要考虑结合能分有限氨基酸 (蛋氨酸和赖氨酸) 的细菌作为联合成员的可能性。从混合培养物中发现了很多这种微生物协同作用的例子, 如在动物饲料中添加益生茵, 又如微生物纤维素酶复合物用作饲料添加剂。能产生多组分酶复合物的真菌将会是理想的考虑对象。
(4) 使微生物在高温下获得稳定性是生物技术应用的先决条件, 并且在中性条件下具有活性也是有益的。或许在较高的培养温度下并且通过使用具有还原性的添加剂 (化学试剂) 可以获得较高的角蛋白水解率。有关文献报道说, 酶中一些二价金属的稳定效应导致了它们的高活性。
(5) 进一步为角蛋白酶产品筛选具有极高活性的非致病微生物, 以及酶在无需分离和纯化条件下的使用。它们的生物量可能对最终产品的蛋白质和氨基酸含量有贡献。
(6) 通过对皮肤杆菌致病机理知识的整理综合深刻了解了角蛋白结构降解的机理。这种合作性研究将会对家禽羽毛的营养优化产生有效的生物技术策略。
3 结论
【角蛋白膜】推荐阅读：
角蛋白质09-24
角蛋白酶09-30
血小板膜蛋白07-22
白蛋白/球蛋白09-04
胶原蛋白与胶原蛋白肽09-22
尿蛋白和尿白蛋白06-23
尿蛋白和蛋白尿的区别10-21
动物蛋白07-18
蛋白沉积07-18
胶原蛋白07-18