mRNA水平论文

mRNA水平论文（通用8篇）

mRNA水平论文 篇1

在试管婴儿技术中, 卵子质量及发育潜能是决定治疗成败的关键性因素之一, 如何准确评估卵子的发育潜能一直是生殖医学领域的重要课题。传统的形态学评分方法具有较强的主观性, 不能完全客观、准确地反映卵子的发育潜能。最近发展起来的“组学”研究, 包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、分泌组学和代谢组学等, 开辟了“分子诊断”的新领域, 提高了胚胎评估的客观性[1]。如果能在众多的分子指标中确定几个最准确、最有效的评估指标用于解决生殖医学领域目前面临的胚胎选择难题, 将对试管婴儿技术的临床工作极具指导意义。

卵泡颗粒细胞可分为壁细胞和卵丘细胞, 后者与卵子在结构上紧密连接, 在功能上具有密切的双向联系, 通过缝隙连接等多种方式进行相互的信息交流及营养物质的传递。近年来研究表明, 卵丘细胞上某些特定基因的表达水平可以用于预测卵子的发育潜能[2,3]。由于卵丘细胞容易获取且检测方便, 并且不影响卵子和胚胎的后续培养和发育, 所以作为一种非侵入性评估卵子发育潜能的方法在临床上具有很好的应用价值。

卵源性因子 (oocyte secreted factors, OSFs) 主要由卵子和颗粒细胞分泌, 包括生长分化因子9 (growth differentiation factor 9, GDF9) 和骨形态蛋白15 (bone morphogenetic protein 15, BMP15) 。OSFs参与卵泡发育的整个过程, 从始基卵泡的募集一直到排卵发生, 甚至在排卵后的黄体形成过程中都发挥着重要的调节作用[4~7]。研究发现卵泡液中GDF9和BMP15水平越高其卵子成熟和优质胚胎的比例也越高[8,9]。本研究通过检测卵丘细胞中GDF9 mRNA和BMP15mRNA的表达水平, 分析其与卵子和早期胚胎发育的关系, 以期为今后挑选优质胚胎探索新的分子指标。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究已获得中山大学附属第六医院伦理委员会批准, 所有参与研究的患者均签署知情同意书。研究的对象为因男方因素行卵细胞浆内单精子注射 (intracytoplasmic sperm injection, ICSI) 治疗的252例女性不孕患者, 患者资料及标本收集于2012年10月至2013年6月, 基本资料见表1。患者的纳入标准为: (1) 促排卵方案为标准长方案; (2) 年龄≤42岁; (3) 体重指数 (BMI) 为17~28 kg/m2; (4) 基础FSH≤12 U/L; (5) 达到绒促性素 (HCG) 注射日的标准 (3个主导卵泡直径≥18 mm) 。排除标准为: (1) 卵巢早衰、卵巢功能减退、子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征; (2) 影响胚胎种植的子宫疾病, 如黏膜下子宫肌瘤、宫腔粘连、中隔子宫等; (3) 反复种植失败 (既往3次及以上移植胚胎失败者) ; (4) 明确的输卵管积水。男方精液均为取卵当日射出精, 密度<1×106/ml。

1.2 促排卵方案及卵丘细胞的收集

所有患者促排卵均采用标准长方案。于黄体晚期注射1.25 mg长效曲普瑞林 (达菲林, Ipsen) 进行垂体降调节, 2周后给予150~300 U重组人促卵泡激素 (果纳芬, Serono) 刺激卵泡生长。当有3个优势卵泡≥18 mm, 肌内注射10000 U绒促性素 (HCG, Serono) , 36小时后在B超引导下经阴道穿刺取卵。获得的卵丘复合物于体外培养4小时, 在倒置显微镜下用透明质酸酶消化剥除卵丘细胞, 用磷酸盐缓冲液 (PBS) 冲洗2遍, 离心后贮于-80℃待检。

1.3 卵子受精胚胎质量评估及分组

倒置显微镜下观察卵子成熟情况, 若镜下可见第一极体则定义为成熟期卵子 (MII) 。采用ICSI方法将单个精子注射至卵子胞浆中促使其受精, 受精后18~19小时观察卵子受精情况并进行原核评分, 观察到2个原核定义为正常受精 (2PN) , 则将患者纳入正常受精组。若没有观察到任何原核或观察到1个或多个原核则定义为异常受精, 则将患者纳入异常受精组。受精后43~45小时观察卵裂情况, 正常受精的胚胎进一步发育为4~6细胞定义为正常卵裂, 若停止发育为未卵裂。受精后67~69小时观察胚胎发育情况并进行卵裂期评分, 若卵裂球数目为7~9个, 大小均匀, 碎片比例<10%的胚胎评分则评为优质胚胎。若患者至少有一枚胚胎满足上述条件, 则纳入优质胚胎组。若患者无任何胚胎满足上述条件, 则纳入非优质胚胎组。将受精后第3天胚胎移植入宫腔, 5周后在B超检查下显示孕囊及胎心搏动定义为临床妊娠。

1.4 GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平检测

在收集的卵丘细胞中加入Trizol细胞裂解液, 提取卵丘细胞总RNA, 采用SuperscriptⅢ (Invitrogen, CA) 将其逆转录为c DNA。PCR定量测定采用Taqman荧光探针法, 仪器为ABI Prism 7700检测系统。PCR反应条件为:93℃3分钟, 然后93℃45秒, 55℃1分钟, 共40个循环。探针和引物序列见表2。

1.5 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件, 所有数据均进行正态检验, 非正态分布数据采用对数转化使其形成正态分布。采用Pearson相关法分析GDF9mRNA和BMP15 mRNA表达水平与卵子及胚胎发育指标之间的关系。两组间GDF9 mRNA和BMP15mRNA表达水平的比较采用t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平与卵子及胚胎发育指标的相关性

Pearson相关法分析结果显示:GDF9 mRNA表达水平与卵子成熟率、正常受精率和卵裂率呈正相关关系 (r=0.312;r=0.385;r=0.596, P<0.001) , 见图1A。BMP15 mRNA表达水平与卵子成熟率、正常受精率和卵裂率也呈正相关关系 (r=0.336;r=0.392;r=0.597, P<0.001) , 见图1B。

2.2 正常受精组与异常受精组GDF9 mRNA和BMP15 mRNA的表达差异

252例患者中正常受精183例, 异常受精69例。正常受精组GDF9 mRNA表达水平为5.92±1.71, BMP15 mRNA表达水平为4.36±0.25。异常受精组GDF9 mRNA表达水平为2.65±0.078, BMP15 mRNA表达水平为0.86±0.13。两组间GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。

2.3 优质胚胎组与非优质胚胎组GDF9 mRNA和BMP15 mRNA的表达差异

252例患者中优质胚胎组134例, 非优质胚胎组118例。优质胚胎组GDF9mRNA表达水平为4.89±0.28, BMP15 mRNA表达水平为2.65±0.35;非优质胚胎组GDF9 mRNA表达水平为3.42±0.32, BMP15 mRNA表达水平为1.63±0.35。两组间GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平比较, 差异均有统计学意义 (P<0.001) 。

2.4 临床妊娠组与未妊娠组GDF9 mRNA和BMP15mRNA的表达差异

252例患者, 临床妊娠130例, 未妊娠122例。临床妊娠组GDF9 mRNA表达水平为4.52±1.32, BMP15 mRNA表达水平为2.81±0.16;未妊娠组GDF9 mRNA表达水平为2.72±0.22, BMP15 mRNA表达水平为1.96±0.27。两组间GDF9 mRNA和BMP15 mR-NA表达水平比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。

3 讨论

本研究通过收集接受ICSI助孕治疗患者的卵丘细胞, 采用PCR技术检测卵丘细胞OSFs中GDF9mRNA和BMP15 mRNA的表达水平, 并分析这两种OSFs的转录水平与卵子及胚胎质量的关系, 旨在为今后挑选优质胚胎探索新的分子指标。

本研究发现, 卵丘细胞中GDF9 mRNA和BMP15mRNA表达水平与卵子的成熟率、正常受精率和卵裂率均呈正相关关系 (P<0.001) 。虽然先前也有研究通过检测卵丘细胞基因表达水平预测卵子发育潜能, 但是之前的研究对象主要为OSFs作用途径的下游基因, 并没有直接对卵丘细胞中OSFs的表达水平进行检测[10,11]。与之不同的是本研究对OSFs本身直接进行检测, 以期能更好地预测卵子的发育潜能。事实上, OSFs既是自分泌因子也是旁分泌因子。研究已证实, GDF9和BMP15不仅存在于卵子胞浆中, 在卵子周围的卵丘细胞上同样也有表达[12]。GDF9和BMP15在卵子发育过程的作用已得到肯定, 二者既可以促进颗粒细胞增殖和代谢, 还可促进颗粒细胞中kit配体的产生, 后者作用于卵子表面的kit受体, 参与对卵子自身生长发育的调控[13]。正因为卵子和卵丘细胞之间存在如此密切的信息交流, 所以通过检测卵丘细胞上GDF9和BMP15表达水平可以客观地反映卵子的质量及后续的发育潜能。

受精发生和卵子成熟度有关, 核成熟的卵子才可能正常受精。本研究发现, GDF9 mRNA和BMP15mRNA表达水平与卵子成熟率呈正相关 (P<0.001) , 提示这两种因子的表达水平可能反映促排卵周期中一簇卵泡的总体质量。另外, 受精过程也需要卵子胞浆成熟[14], 本研究中GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平与卵子受精率呈正相关 (P<0.001) , 提示这两种因子的表达水平与卵子质量有关;正常受精组两种因子的表达水平高于异常受精组 (P<0.05) , 也从不同角度提示这一结论。卵子质量不仅决定了受精情况, 而且还决定了后续的胚胎发育情况, 质量较差的卵子形成优质胚胎的机会也低于优质卵子。本研究中优质胚胎组GDF9 mRNA和BMP15 mRNA的表达水平显著高于非优质胚胎组 (P<0.01) , 提示二者的表达水平与胚胎质量关系密切。临床妊娠是评估胚胎质量的一个重要指标, 而卵子质量始终是决定临床妊娠结局的最关键的因素, 优质的卵子往往容易形成优质的胚胎, 临床妊娠机会也相应增加。在本研究中, 临床妊娠组卵丘细胞中GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平显著高于未妊娠组 (P<0.01) , 提示这两种因子的表达水平与卵子发育潜能有关。总之, 本研究提示卵丘细胞GDF9 mRNA和BMP15 mRNA表达水平可以作为卵子质量和胚胎发育的评估指标, 这可能为今后预测胚胎质量提供新的有潜力的分子指标。

由于卵丘细胞本身容易获得, 又不影响卵子的继续培养和发育, 并且PCR技术在短时间内就能够精确地检测OSFs mRNA的表达水平, 因此卵丘细胞中的GDF9和BMP15的表达水平可以快速、准确地预测卵子发育潜能, 在临床上具有广阔的应用前景。但是, 本研究的局限在于没有单独收集每个卵子的卵丘细胞, 无法将GDF9和BMP15表达水平与每个卵子及胚胎一一对应, 不能追踪每个卵子的后续发育情况。

mRNA水平论文 篇2

适宜西瓜mRNA差异显示分析的几种总RNA提取方法的比较

以西瓜花蕾为材料,初步建立了mRNA差异显示技术体系.利用改进的SDS/酚法、改进的`异硫氰酸胍法和BIOZOL试剂提取法提取西瓜花蕾总RNA,比较RNA产率、纯度和电泳图谱等分析来确立适于西瓜花蕾RNA分离的方法.研究结果表明,改进的异硫氰酸胍法提取的RNA呈现28S rRNA,18S rRNA和5S rRNA 3条较清晰的条带,其A260/ A280值可达1.944,具有很高的纯度.用异硫氰酸胍法提取的总RNA进行差异显示分析表明,可得到理想的扩增片段.

作 者：于远 张显 于蓉 杨玉梅 YU Yuan ZHANG Xian YU Rong YANG Yu-mei 作者单位：西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌,712100刊 名：西北农业学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA AGRICULTURAE BOREALI-OCCIDENTALIS SINICA年，卷(期)：15(6)分类号：S651 Q785关键词：西瓜 花蕾 RNA 分离提取

mRNA水平论文 篇3

1 材料

10月龄健康本地犬9只, 雌雄不限, 购自西南大学动物中心, 饲喂1周后未发现异常, 注射4联疫苗, 免疫后1个月进行安乐死, 剖杀, 立即剪取约 0.4 cm3的器官组织, 每种组织均取3个样品, 分别置于焦炭酸二乙酯 (DEPC) 水处理过的EP管中, 放入液氮保存。

2 方法

2.1 主要试剂和仪器

Trizol试剂、PCR试剂盒、DNA Marker、核酸染料SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit、反转录试剂盒PrimescriptTM RT Reagent Kit、T4连接酶, TaKaRa公司生产;DEPC、感受态细胞JM109, Promega公司生产;PEZ-T载体, 西南大学中兽医实验室提供。

2.2 组织总RNA的提取

将在液氮中保存的新鲜组织 (约0.2 g) 取出, 置于液氮预冷的研钵中磨至极细粉末状, 然后加入1 mL Trizol, 充分混匀, 静置10 min;将提取液完全吸出移入DEPC水处理过的EP管中, 静置5 min;加入200 μL氯仿, 用力颠倒摇晃至浑浊, 冰浴静置5 min;4 ℃、12 000 r/min离心15 min;取上清液加入新的EP管中, 加入等体积异丙醇, 轻微摇晃, 静置10 min;4 ℃、12 000 r/min离心10 min;弃上清液, 加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀, 4 ℃、12 000 r/min离心5 min;回收沉淀, 风干, 加30 μL 灭菌DEPC处理水溶解沉淀, 混匀。用3%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量, -80 ℃保存, 备用。

2.3 组织总RNA的反转录

2.3.1 引物的设计

根据已有的犬血管内皮生长因子mRNA和犬内参基因Actin的序列, 利用Primer Premier 5.0软件设计2对实时定量PCR引物[由宝生物工程 (大连) 有限公司合成], 引物序列见表1。

2.3.2 RT-PCR 按照PrimescriptTM RT Reagent试剂盒说明进行操作, 反应体系:

样品RNA 6 μL, Random 6 mers 1 μL, Prime Script RT Enzyme MixⅠ1 μL, Oligo dT Primer 1 μL, 1.5×PrimeScript Buffer 1 μL, 加Rnase Free dH2O至20 μL。振荡混匀后置于37 ℃作用15 min;85 ℃作用10 s;置于冰域上冷却, 最后将合成的cDNA置于-20 ℃冰箱中保存, 备用。

2.3.3 PCR扩增

以反转录合成的犬腹部肌肉cDNA为模板, 分别将血管内皮生长因子基因与内参基因Actin进行PCR扩增, 反应体系:反转录样品产物2 μL, MgCl2 2 μL, dNTP Mixture 2 μL, 上、下游引物各0.5 μL, Taq酶0.2 μL, 10×Buffer (Mg2+) 2.5 μL, 用三蒸水补至25 μL。反应条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性10 s, 62.7 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40个循环;72 ℃再延伸10 min。取8 μL PCR扩增产物在3%琼脂糖凝胶上电泳, 紫外灯下观察电泳结果。

2.4 血管内皮生长因子和内参基因标准曲线的绘制

将上述犬腹部肌肉PCR扩增的血管内皮生长因子基因和内参基因的产物分别做10倍梯度稀释 (1×100～1×10-5) , 分别对目的基因血管内皮生长因子和内参基因Actin进行荧光定量PCR检测。反应体系:SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ 12.5 μL, PCR上、下游引物各0.5 μL, cDNA模板2.5 μL, 加灭菌三蒸水至25 μL。每个样品和基因各设3个重复管, 放入实时荧光PCR仪进行扩增。反应条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s, 62.7 ℃退火30 s, 72 ℃延伸15 s, 读板, 共40个循环;65～95 ℃测定、分析熔解曲线, 判定PCR反应的特异性。

2.5 基因测序验证

从琼脂糖凝胶上切下目的片段, 使用DNA片段纯化试剂盒进行纯化后, 与PEZ-T载体进行连接, 继而转化入感受态细胞JM109, 均匀涂抹于含有Amp的LB琼脂平板上, 37 ℃培养12 h;分别挑取2个白色菌落, 继而进行菌液PCR鉴定, 将鉴定结果为阳性的菌液送往宝生物工程 (大连) 有限公司测序。

2.6 血管内皮生长因子和内参基因表达的荧光定量PCR检测

在荧光定量PCR管中分别依次加入SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ 12.5 μL, PCR上、下游引物各0.5 μL, cDNA模板2.5 μL, 加灭菌三蒸水至25 μL。每个样品和基因各设3个重复管, 在相同反应程序下进行PCR扩增:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s, 62.7 ℃退火30 s, 72 ℃延伸15 s, 读板, 共40个循环。

2.7 数据分析

所有样品均重复测定3次, 并采用经典的相对比较△△Ct法分析定量RT-PCR的试验结果, 首先计算出每只犬各种组织样品中目的基因与内参基因的Ct差值, 即△Ct=Ct 目的基因-Ct内参基因, 然后计算9只犬每种组织样品△Ct的平均值, 最后选取肝脏组织样品为对照, 用其他组织的Ct差值减去肝脏Ct差值, 即为比较的Ct值 (△△Ct) , 故△△Ct= (Ct目的基因-Ct内参基因) 各种组织- (Ct目的基因-Ct内参基因) 肝脏, 最后将这些差值转化为相对的倍数关系, 即相对差异倍数 (QR) = 2-△△Ct。

3 结果

3.1 组织mRNA的提取和目的基因扩增

琼脂糖凝胶电泳结果表明, PCR反应扩增分别得到与预期大小相符的、特异性很强的单一条带。测序结果表明, 扩增的内参基因Actin基因片段长139 bp, 血管内皮生长因子基因片段长150 bp, 分别与目的基因碱基相同, 使用Blast进行检索, 同源性高达98%, 表明PCR试验数据能够用于内参基因Actin、血管内皮生长因子基因的相对定量分析。

3.2 实时荧光定量PCR产物的特异性和扩增效率

由熔解曲线图1、图2分析得出, 目的基因血管内皮生长因子的熔解温度 (Tm) 为87 ℃, 内参基因Actin的熔解温度为83.5 ℃, 2个基因片段的熔解曲线均呈现出单峰走向, 说明无引物二聚体以及其他非特异性扩增产物。由目的基因血管内皮生长因子的标准曲线图3可知, 扩增效率为100.6%, 回归系数为0.999;由内参基因β-actin的标准曲线图4可知, 扩增效率为99.8%, 回归系数为0.999。由血管内皮生长因子的扩增曲线图5可知, 扩增效率均在80%～105%之间, 回归系数均大于0.99, 表面扩增效率较好, 能够满足荧光定量PCR的要求。

3.3 犬不同组织中管内皮生长因子mRNA的转录水平

试验将β-actin作为内参基因, 采用△△Ct相对定量PCR方法检测分析血管内皮生长因子mRNA 在犬体内不同器官组织中的表达情况, 见表2。血管内皮生长因子基因mRNA在犬体内不同器官中均有不同程度的表达, 尤其在膈肌、虹膜、肌肉、晶状体、卵巢、皮肤等组织中的表达量相对较高, 分别为肝脏组织的5.525 15, 2.804 28, 18.783 93, 3.123 57, 7.381 96, 3.778 88倍, 其中肌肉的相对表达量最高。而十二指肠、肺脏、空肠、盲肠、舌头、子宫等组织中的相对表达量较少, 分别为肝脏组织的0.011 71, 0.001 51, 0.000 32, 0.000 55, 0.033 90, 0.016 66倍, 而剩余其他组织中的相对表达量居中。

4 讨论

血管内皮生长因子是最有效的促血管生长因子, 它的家族在胚胎发育时期以及出生后的血管发育过程中均起着十分重要的调节作用, 其家族成员与3种酪氨酸激酶受体 (VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3) 相结合后发挥生物学作用[3]。主要功能有:1) 促进血管内皮细胞移动, 增加微血管通透性;2) 参与淋巴内皮细胞发育, 淋巴结转移和肿瘤淋巴浸润;3) 促进血管内皮细胞有丝分裂和增殖, 发挥等同于组胺、凝血酶的作用;4) 刺激成骨细胞核单核细胞的迁移。它们主要参与了新生血管和淋巴管的形成。在临床上, 犬的各种疾病如恶性肿瘤、角膜疾病等尤为突出, 而其中血管内皮生长因子在这些疾病中起到了至关重要的作用。其中犬的乳腺肿瘤发病率十分高[4], 由于与遗传和环境因素有关, 该病的发病率为人类的3倍左右[5]。又如角膜血管瘤、高危角膜移植等, 新生血管是否出现, 出现的数量如何, 会直接影响这些疾病治疗和最后的转归[6,7]。本试验建立实时荧光定量RT-PCR方法检测血管内皮生长因子在犬各组织中相对表达水平, 结果表明, 血管内皮生长因子几乎表达于各器官组织中, 包括肌肉、隔肌、晶状体、虹膜、卵巢、胆囊、皮肤、膀胱、肝脏、角膜、脾脏、胃、直肠、玻璃体、气管、神经、肾脏、心脏、十二指肠、肺脏、空肠、盲肠、舌头、子宫等组织。其中肌肉的相对表达量最高, 估计与肌肉中富含毛细血管, 各种运动或轻微损伤促进微血管内皮细胞增生;而卵巢次之, 估计与卵巢上的周期性活动有密切关系。而肠段的表达相对较低, 提示正常情况下, 血管内皮生长因子在肠段呈现低表达。但有研究表明, 在肠癌发生的时候, 血管内皮生长因子的表达量迅速上调, 且与肿瘤的浸润情况呈正相关[8,9]。心脏中血管内皮生长因子的表达相对较低, 有研究表明, 血管内皮生长因子家族及其受体在胚胎发育的第3, 4周开始表达, 并随着胎龄的增长而出现先增强而后减弱的现象, 第7周左右消失[10], 估计是与心脏各结构生长稳定有关系。

参考文献

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mRNA水平论文 篇4

1 材料和方法

1.1 动物分组与设计

选取30只雄性成年的大白鼠, 平均体重在223.48 g, 按体重靠近的原则, 随机分成空白对照组, 应激对照组, 牡蛎粗多糖高、中、低剂量组, 每组6个重复。空白对照组和免疫应激组饲喂基础日粮, 牡蛎粗多糖高、中、低剂量组分别喂含有0.9%、0.6%、0.3%牡蛎粗多糖的基础日粮, 试验期为28 d。试验前12 h断水断料, 试验各组按每千克体重腹腔注射LPS 100μg, 空白对照组注射等量生理盐水。于注射3 h后采血, 剖检。

1.2 材料

LPS (大肠杆菌血清型O55:B5, Sigma公司) , ELISA试剂盒 (Cusabio Biotech Co., LTD) , Trizol, Prime Script?RT reagent Kit Perfect Real Time (Ta Ka Ra Biotechnology Co., Ltd) , 荧光试剂盒 (北京百泰克生物技术有限公司) , 琼脂糖。

1.3 测定方法

1.3.1 样品处理

采取的血液室温静置后, 以3 000×g离心10 min, 分离血清置于-20℃保存;采血后随机取1只剖检, 取淋巴结, 肾上腺, 脾脏, 肝脏等, 用锡纸包裹, 液氮运输, -40℃保存, 待测TLR-4 m RNA的表达水平。

1.3.2 引物的设计

根据Gen Bank中收录号为NM_214379和DQ845171.1的基因序列, 利用primer5.0各设计引物一对, 并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

β-actin (扩增长度为300) :Sense primers:5'TGCGGAAGGATCATTAACGGA 3';

Anti-sense primers:5'AGTAGGAGAGGAGC-GAGCGACC3'。

TLR 4 (扩增长度为101) :Sense primers:5'TATCCAGAGCCGTTGGTGTATC3';

Anti-sense primers:5'CCACTTTCTCAAGGA-CAATGAAG3'。

1.3.3 总RNA的提取和c DNA合成

按照传统方法提取总RNA[7], 并检测总RNA的浓度和纯度。c DNA的合成按照Prime Script?RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒说明书进行。

1.3.4 荧光定量PCR反应

采用Bioteke Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture荧光定量试剂盒, 用CFX-96型Real-Time PCR扩增仪对反转录产物进行扩增。反应体系:10μL的2×Premix, 浓度为10μmol/L的上下游引物各0.4μL, 模板DNA2μL, 灭菌蒸馏水7.2μL, 终体积为20μL。反应条件为:95℃预变性2 min, 95℃变性15 s, 60℃变性30 s, 40个循环。

2 结果

从图1可知, 与空白对照组相比, 应激对照组肝脏、脾脏、肾上腺和淋巴结中TLR-4 m RNA的相对表达量极显著性升高 (P<0.01) , 而牡蛎粗多糖低剂量组TLR-4 m RNA的相对表达量在淋巴结、脾脏中显著性降低 (P<0.05) , 在肝脏和肾上腺中极显著降低 (P<0.01) ;牡蛎粗多糖中剂量组TLR-4 m RNA的相对表达量在淋巴结、脾脏中显著性降低 (P<0.05) , 在肝脏和肾上腺中极显著性降低 (P<0.01) ;牡蛎粗多糖高剂量组TLR-4 m RNA的相对表达量在淋巴结和脾脏中显著性降低 (P<0.05) , 在肝脏、肾上腺中极显著性降低 (P<0.01) 。与应激对照组相比, 牡蛎粗多糖高, 中, 低剂量组TLR-4 m RNA在肝脏、肾上腺、淋巴结和脾脏中的相对表达量极显著性降低 (P<0.01) 。其中, 当剂量为0.6%~0.9%时TLR-4 m RNA相对表达量在肝脏、肾上腺、淋巴结和脾脏中更接近于空白对照组。

3 讨论

刘士强[8]研究表明, LPS应激对断乳大鼠的免疫功能和血液生化指标可造成一定的影响。查阅相关文献表明, 现在对于多糖可以缓解免疫应激的研究主要以血液炎性细胞因子和激素水平方面为主, 而对于Toll样受体4 (TLR-4 (和免疫应激方面的研究较少。Toll样受体 (Toll-like receptor, TLR (是模式识别受体家族中的一员。TLR4作为首先被发现同时也是最重要的TLR, 不仅识别外源性配体如内毒素 (LPS (、磷壁酸、肽聚糖等, 还能识别内源性配体如热休克蛋白60、70, 硫酸肝素片段等[9]。TLR-4不仅参与了原微生物介导的炎症反应, 有研究发现其在组织或器官IR损伤的炎症反应中也发挥巨大作用[10]。现在在TLR-4的构造以及其所参与促炎反应、促进免疫细胞成熟分化及调节免疫应答等方面的研究比较清晰, TLR-4介导的信号转导途径包括髓样分化蛋白88 (Myd88 (依赖性和非依赖性, 前者经过一系列的级联反应后导致NF-κB的活化, 从而产生大量致炎因子如TNF-ɑ、IL-1、IL-6等[11,12]。后者主要是诱导干扰素-β和干扰素诱导基因的表达, 并引起NF-κB的晚期活化, 最终导致干扰素-β和干扰素诱导蛋白10等致炎因子的释放[13,14]。肝脏是机体内主要的解毒器官, 聚集了大量的单核-巨噬细胞, 对LPS刺激后所产生的炎症反应强烈[15]。肾上腺作为机体内重要的内分泌器官, 由皮质和髓质构成, 皮质可以分泌皮质醇, 测量其中的皮质醇含量可以反映大鼠是否处于应激状态。脾脏和淋巴结是作为机体内比较大的免疫器官, 是机体免疫应答发生的场所, 对LPS刺激导致的免疫应激反应强烈, 研究TLR-4在胸腺、脾脏和淋巴结中的表达量一定程度上可以反映大鼠在经过LPS刺激后机体内的免疫应激状况。与前者相对应正常生理状态下, 动物机体存在着各种TLRs的负调控机制, 从而维持免疫反应的平衡。机体为了保证TLRs介导正确的免疫应答, 存在精确的负调控机制, 及时抑制TLRs信号, 维持机体的免疫平衡[16]。

注:Ⅰ:空白对照组;Ⅱ:应激对照组;Ⅲ:多糖低剂量组;Ⅳ:多糖中剂量组;Ⅴ:多糖高剂量组。凡是具有相同小写字母表示差异不显著 (P<0.05) , 凡是具有相同大写字母表示差异不极显著 (P<0.01) 。

试验发现, 在免疫应激对照组中, TLR-4 m RNA在肝脏、肾上腺、淋巴结和脾脏等部位均有表达, 且免疫应激导致这些器官在3 h内的TLR-4 m RNA相对表达量极显著性上升。这与杭涛等[17]的研究一致, 即小鼠失血后1 h心肌TLR2及TLR4基因的表达水平增高。与之相对比, 饲喂牡蛎粗多糖的免疫应激组在肝脏、肾上腺、淋巴结和脾脏中TLR-4 m R-NA的相对表达量与应激对照组比较极显著性降低, 这与孙雪芳等的研究有一定的相似性, 黄芪多糖能有效抑制LPS诱导的心肌肥大, 表现为蛋白含量降低, 体积减小;并能有效减少炎症反应, 表现为TLR-4 m RNA表达降低[18]。从试验结论可以看出, 牡蛎粗多糖可以通过诱导动物机体负反馈调控TLR-4 m RNA的表达和其炎性细胞因子的释放, 从而防止炎性细胞因子过高对动物机体造成不可逆的损伤, 从而缓解机体的免疫应激。由图1各组试验数据得出, 高剂量组与中剂量组TLR-4的相对表达量更趋于生理状态下空白对照组的相对表达量, 由此可以得出牡蛎粗多糖缓解免疫应激的最佳剂量处于0.6%~0.9%。

4 结论

mRNA水平论文 篇5

1材料与方法

1.1实验动物

选择45只正常成年健康新西兰白兔作为实验动物,体重2. 5 ~ 3. 0 kg,雌雄不限,清洁级,由专人饲养。

1.2实验试剂

Trizol试剂购自Promega公司,逆转录酶、Taq酶和d NTP均购自北京中山生物技术有限公司; BMP2、 Cbfα1和GAPDH上下游引物由上海生工生物工程公司合成,普伐他汀购自中美上海施贵宝制药有限公司。

1.3研究方法

根据数字表法将实验白兔随机分为对照组( n = 15) 、模型组( n = 15) 和普伐他汀组( n = 15 ) 。模型组与普伐他汀组构建激素性股骨头坏死模型,构建方法: 间隔24 h向兔耳缘静脉注射1次脂多糖,剂量为10 μg· kg- 1,共2次,最后注射结束后间隔24 h臀肌注射甲强龙,剂量为20 mg·kg- 1,共3次。造模后第5周,普伐他汀组采用1. 2 mg·kg- 1普伐他汀灌胃,1次· d- 1。对照组和模型组均采用同等体积生理盐水溶液灌胃,1次·d- 1。分别在造模后第8、12、16周时从各组中随机选择5只实验白兔处死,在无菌状态下截取相同部位的股骨头。

1.4组织病理学检查

各组兔股骨头采用4%多聚甲醛溶液固定处理24 h, HE染色处理后比较各组组织切片骨小梁、骨陷窝及血管数等指标。

1.5BMP2mRNA及Cbfα1mRNA水平检测

1. 5. 1 RNA提取方法称量100 mg新鲜骨组织,待完全研磨成粉末状后转移至匀浆器中,采用Trizol提取RNA,检测RNA浓度。

1. 5. 2 RT-PCR方法称量2 μg总RNA,42 ℃ 逆转录处理90 min。反应条件为: 95 ℃变性5 min; 94 ℃40 s, 56 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,72 ℃ 延伸10 min,共30个循环反应过程。

1. 5. 3引物设计BMP-2上游引物为5'-TGAACACA GCTGGTCTCAGG-3',下游引物为5'-ACCCCACATCAC TGA AGTCC-3',PCR产物为170 bp; Cbfa1上游引物为5 ' -GAGCACAAACATGGCTGAG A-3 ' ,下游引物为5 ' TGGAGATGTTGCTCTGTTCG-3',PCR产物为238 bp; GAPDH上游引物为5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG3',下游引物为5'-TCCACCACCC TGTTGCTGGA-3',PCR产物为307 bp。

1. 5. 4结果判读PCR产物电泳后扫描条带光密度,获得条带平均灰度值,BMP2 /GAPDH值表示BMP2 mRNA的相对表达水平,Cbfα1 / GAPDH值表示Cbfα1 mRNA的相对表达水平。

1.6统计学处理

研究数据采用SPSS 13. 0统计软件包进行分析, 计量资料比较采用t检验,计数资料比较采用 χ2检验, 以P < 0. 05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组股骨头组织病理学比较

各组股骨头血管数、血管直径及骨陷窝空缺百分率比较,差异均有统计学意义( P < 0. 05) ,普伐他汀组血管数及其直径均明显大于其他两组( P < 0. 05) ,而骨陷窝空缺百分率低于其他两组( P <0. 05) ,见表1及图1。

与模型组及对照组比较,a P < 0. 05

2. 2各组BMP2 mRNA表达水平比较

普伐他汀组造模后第8、12、16周时BMP2 mRNA表达水平均明显高于对照组和模型组( P < 0. 05) ,且随治疗时间延长,BMP2 mRNA表达水平明显升高 ( P < 0. 05) ,见表2、图2。

2. 3各组Cbfα1 mRNA表达水平比较

普伐他汀组造模后第8、12、16周时Cbfα1 mRNA表达水平均明显高于对照组和模型组( P < 0. 05) ,且随治疗时间延长,Cbfα1 mRNA表达水平进一步升高 ( P < 0. 05) ,见图3、表3。

与普伐他汀组比较,a P < 0. 05; 与造模后第 8 周比较,b P < 0. 05

与普伐他汀组比较,a P < 0. 05; 造模后第 8 周比较,b P < 0. 05

2.4BMP2mRNA与Cbfα1mRNA表达水平的相关性

经检验,BMP2 mRNA表达水平与Cbfα1 mRNA表达水平之间呈正相关( P < 0. 05) 。

3讨论

目前较多研究[3]认为,糖皮质激素使用过量与激素性股骨头坏死之间存在密切的相关性。此外还有相关研究[4]发现,糖皮质激素使用过量可导致成骨细胞和骨细胞凋亡数目明显增加,从而加快股骨头坏死速度。普伐他汀是一种3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的竞争性抑制剂,药理实验研究[2]证实,普伐他汀可明显提高BMP2 mRNA与Cbfα1 mRNA的表达水平,促进股骨头坏死部位毛细血管的生成,增强成骨细胞的生理学活性,加快新骨组织的形成、矿化和坏死骨组织的修复重建速度[5]。

Cbfα1是成骨细胞分化过程中的特异性转录因子,较多成骨细胞分化相关基因的启动子区域均可存在Cbfα1的结合作用位点,故可显著影响成骨细胞和破骨细胞的生物学活性功能,从而对骨形成、骨吸收过程予以有效控制[6]。BMP-2是一种生物学功能较强的成骨因子,可促进骨髓干细胞早期分化成为成骨细胞,并增强Cbfα1的表达水平[7]。细胞实验研究[8]结果显示,BMP-2可明显增强成骨细胞分化和诱导体外成骨的功能,rh BMP-2可明显促进成骨细胞的增殖速度。近年的相关研究[9]显示,Cbfα1是BMP信号传导通路的下游因子,而后者可正性或负性调节和控制成骨分化过程,Cbfα1作为一种成骨诱导作用基因,可有效避开BMP信号传导通路上游的负性调节因子,从而对处于下游的成骨基因发挥直接性作用。因此推测, Cbfα1的成骨作用较BMP更为强大和直接[10]。且国外实验[11]也发现,BMP-2可明显提高类软骨细胞TC6中的Cbfα1 mRNA表达水平,且通过上调Dlx5的生物学活性作用而促进Cbfα1的表达水平提高。

mRNA水平论文 篇6

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级Sprague-Dawley (SD) 健康大鼠40只, 体重 (250±20) g, 由佳木斯大学实验动物中心提供。

1.2 实验药物

RNA提取试剂盒购自美国Sigma公司;Realtime试剂盒购自日本Ta KaRa公司。

1.3 实验动物模型

健康SD大鼠40只, 实验前普通饲料适应性喂养1周后, 随机分为4组:正常对照组;模型组;小剂量GSTT治疗组;大剂量GSTT治疗组。参照Nagasawa和Longa等[3]报道的线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞动物模型, 并在此基础上加以适当的改进。预处理组大鼠术前7d, 小剂量GSTT治疗组, 给予6.3mg/kg GSTT;大剂量GSTT治疗组, 给予12.6mg/kg GSTT, 每天经腹腔注射给药1次, 缺血2h再灌注24h后取大鼠脑组织进行相应指标的检测。

1.4 神经功能评分

按照Longa提出的5分制评分标准[3]。评分在1~3分为有效模型, 排除评分为0分和4分者, 随机补全模型, 以保证每组动物数不变。

1.5 实验指标

Real-time方法检测大鼠脑组织中IL-1、TNF-α的mRNA水平的表达。

1.6 统计学方法

采用SPSS17.0软件处理进行统计学分析, 结果以均数±标准差的方式表示。多组样本均数的比较采用AVON分析。

2 结果

2.1 GSTT对大鼠脑缺血后神经功能的影响

模型组大鼠脑缺血后神经功能评分数值明显高于正常对照组 (P<0.05) , 提示大鼠大脑中动脉缺血导致神经功能受损, 说明MCAO模型建立成功 (P<0.05) ;与模型组相比较, 大、小剂量GSTT治疗组, 大鼠神经功能评分较模型组明显降低, 且大治疗组改善效果更加显著。见表1。

*与正常对照组比较P<0.05;**与模型组比较P<0.05。

2.2 Real-time方法检测IL-1、TNF-α在mR-NA水平的表达

与模型组相比较, 大、小剂量GSTT治疗组, 在mRNA水平上明显上调IL-1、同时显著下调TNF-α的表达, 且大治疗组效果更加显著 (P<0.05) 。见表2。

*与空白对照组比较P<0.05, **与模型组比较P<0.05。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤是影响急性脑梗死病人临床恢复的重要并发症, 其发生机制复杂, 许多研究领域尚无明确定论。但其防治已成为目前研究虽待解决的课题[4]。大鼠大脑中动脉阻断模型 (middle cerebral artery occlusion model, MCAO) 是在生物医学科学研究中所建立的模拟人类缺氧缺血性脑病表现的实验动物模型[5]。自Nagasawa和Longa等[3]报道了此模型的制作方法, 历经完善, 已经被国际上广泛应用于脑缺氧缺血的研究, 是目前公认的建立局灶性脑缺血再灌注模型的理想方法[3]。本实验中大鼠脑缺血后神经功能评分数值明显升高, 并且大鼠表现出相应的缺血症状, 说明MCAO实验动物模型建立成功。以往对于脑缺血性损伤疾病的临床治疗原则之一是尽早恢复血供, 以使缺血脑组织重新得到氧的供应, 提供代谢所必需的营养物质并清除代谢废物, 由此有利于减轻脑缺血损伤。然而近年来发现, 缺血后的血流恢复在某些情况下能导致进一步的组织损伤和功能障碍, 造成缺血再灌注损伤 (Ischemia and Reperfusion Injury, IR) , 因此抑制再灌注损伤成为目前治疗缺血性脑卒中的关键环节。临床上一般用溶栓治疗来解除梗塞, 建立缺血区域血流再灌注。对于缺血引起的脑组织损伤尚无有效治疗药物。尽早治疗, 恢复脑血流, 减少再灌注损伤, 减轻脑水肿[6]。

因此, 寻找新型有效的缺血性脑卒中治疗药物是目前研究热点。近年来, 在ICVD防治中, 脑保护药物的研究与开发进展迅速。由于很多中药具有活血化淤的功效, 所以在脑保护药中中药占有重要地位。我国拥有丰富的中药资源, 中药用于ICVD的防治已有很长的历史, 近年来大量从中药中提取的有效活性部位或成分具有明显的ICVD防治作用, 如三七总皂苷、灯盏花素、阿魏酸钠、葛根素等。其中, 蒺藜总皂苷对脑缺血引起的损伤具有很好保护作用, 近年来倍受关注, 已作为临床一线用药。现在治疗脑缺血的总原则就是

本实验对蒺藜总皂苷作用于大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后神经元的拮抗保护作用机制进行了实验研究, 并且得出其能够抑制炎症因子IL-1, 促进抗炎症因子TNF-α表达的结论。此结果说明蒺藜总皂苷具有明显抑制炎症因子的形成以及促进抗炎因子生成的作用, 从而减轻脑缺血/再灌注的损伤作用。此研究结果进而为蒺藜总皂苷在临床上应用于缺血性脑血管疾病的治疗给予我们一些新的启示, 为其临床应用提供了坚实的理论基础。

摘要：目的:观察蒺藜总皂苷 (gross saponins from tribulus terrestris, GSTT) 对大鼠脑缺血再灌注损伤模型IL-1、TNF-α在mRNA水平表达影响的实验研究。方法:SD大鼠40只, 适应性喂养一周后, 随机分为:正常对照组;MCAO模型组;大、小剂量GSTT治疗组。制备大鼠大脑中动脉栓塞模型, 缺血2h, 再灌注24h后, 检测大鼠神经功能评分;预处理组大鼠术前7d, 按照GSTT大、小剂量给予治疗, Real-time方法检测IL-1、TNF-α在mRNA水平的表达。结果:与正常对照相比较, 模型组, 大、小剂量GSTT治疗组, 大鼠神经功能平分较高 (P<0.05) ;与模型组相比较, 大、小剂量GSTT治疗组, 明显上调IL-1、同时显著下调TNF-α在mRNA水平的表达 (P<0.05) ;且大治疗组效果更加显著。结论:GSTT抑制炎症因子IL-6表达的同时, 促进抗炎因子TNF-α的表达, 从而实现其对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后神经元的拮抗保护作用。

关键词：缺血再灌注损伤,大鼠,IL-1,TNF-α

参考文献

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[2]胡文兰.高密度脂蛋白抗动脉粥样硬化的研究进展[J].国外医学内科学分册, 2003, 30 (6) :235-23

[3]Longa E Z, Weinstein P R, Carlson S, et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989, 20 (1) :84-91

[4]姜尧佳, 杨晓玉, 刘永刚, 等.高压氧对脑缺血再灌注损伤的临床疗效观察分析[J].黑龙江医药科学, 2013, 36 (3) :99-100

[5]Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et a1.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke, 1986, 17:472-476

mRNA水平论文 篇7

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级Wistar大鼠30只, 雌雄不限, 体重 (200～250) g, 由中科院上海分院动物部提供。实验组按照5个时间点 (大脑中动脉栓塞 (MACO) 后1、3、6、12、24h) 随机分为5组, 每组5只。其余5只作为正常对照组, 不做处理。

1.2 MACO

参照Koizumi和Zea Longa线栓法制作MACO模型。将3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉 (10m L/kg体重) 的大鼠仰卧位固定, 颈正中切口, 分离、结扎右侧颈总动脉。在颈总动脉分叉处近端剪开一小口, 用尼龙线 (0.25mm) 插入颈内动脉约17mm, 遇轻微阻力后阻塞大脑中动脉起始处。术中及麻醉期间小电热毯维持动物直肠温度36.5～37℃, 注意观察呼吸及心率变化。

1.3 组织取材

分别MACO后1、3、6、12、2 4 h, 按上述方法麻醉各亚组大鼠, 经左心室快速灌流生理盐水150mL冲洗血管, 然后1.5%戊二醛、4%多聚甲醛 (0.1mmol/L, pH7.4配制) 250mL缓慢灌流, 共约1h。参照文献[2,3]报道, 采用组间等位定法设定半暗带的等值区。低温剥取左侧大脑距离嗅球尖端 (7～11) mm之间、大脑矢状裂至外侧裂上1/3皮质组织块。对照组处理同上。

1.4 原位杂交测定组织VEGF、FLT-1, FLK-1mRNA的表达水平

(1) 探针制备:根据NCBI公布的SD大鼠VEGF、FLT-1及FLK-1的序列设计引物并以SD大鼠正常脑组织cDNA为模板进行PCR扩增, 产物经测序验证正确后, 采用Qiagen公司PCR产物回收试剂盒进行纯化;采用Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I对PCR产物进行地高辛标记得到相应的探针。按照以下引物序列扩增探针, 各引物序列为:VEGF, F5`TGC ACT CGA CCC TGG CTT TAC3`R5`CGG CAA TAG CTG CGC TGG TAG3`;FLT-1, F5`TTT TGT TTG TTG TCG CTG TT3`, R5`TCG TTT GCT GTT CTC CCT3`;FLK-1, F5`GTG AAG CCA TCA ACA AAG3`, R5`TGG AAT GCC ACA ATC AAG3`。 (2) 杂交方法:组织块迅速经DEPC处理的4%多聚甲醛进行后固定, 常规的脱水、透明、石蜡包埋, 连续切片, 厚度5～8um, 粘片, 脱蜡。蛋白酶K处理 (200μg/mL) 37℃30min, Tris-Glycine漂洗终止反应, 4%多聚甲醛4℃平衡5min后, 2×SCC漂洗15min, 每张切片滴加杂交液进行预杂交37℃F2h, 移去杂交液, 滴加含有探针的杂交液, 并以不含探针的杂交液作为对照, 42℃杂交过夜。用SCC进行充分的漂洗, 最后加适量的NBT/BCIP, 避光室温显色, 显微镜观察显色情况。待显色充分后用5×TE终止反应, 封片。 (3) 图像分析与数据采集:采用Leica Q WC图像分析系统, 放大200倍输入图像, 采用相同参照测定相对灰度值作表达水平, 数据以-χ±s表示。

2 结果

在正常对照组很少见到阳性细胞, VEGF mRNA、FLT-1与FLK-1 mRNA低表达。在实验组中, 阳性细胞出现棕黄色颗粒, VEGF mRNA在神经元、胶质细胞中等均有表达, 而F L T-1与FLK-1 mRNA主要表达于血管内皮细胞。大鼠MACO后半暗带等值区早期V E G F、FLT-1、FLK-1 mRNA表达水平的动态变化见表。VEGF mRNA在缺血后3h开始升高, 至12h达到高峰, 而后下降。FLT-1 mRNA在缺血后24h内均处于较低水平表达, 二者略有不同:FLT-1 mRNA在缺血后6h略有升高, FLK-1有逐渐升高趋势。

3 讨论

本研究发现, 大鼠MACO后24h内, VEGF及其受体 (FLT-1、FLK-1) mRNA在缺血半暗带内的表达存在明显不同的规律:前者广泛分布于神经元、胶质细胞等组织, 在缺血因素刺激下迅速升高, 并形成高峰;而后者主要分布于血管内皮细胞, 且始终于低水平表达。

3.1 关于缺血半暗带

尽管缺血半暗带的概念和重要性早已得到公认, 但由于脑梗死体积和动态变化的差异, 目前不能直接进行统一的组织定位和时限界定。多数作者认为在脑梗死后至少24h半暗带内均存在可以挽救的神经元。因此为控制方法学上的不确定性, 我们采用被以往严格动物实验证实的组间等位法进行等值区研究, 并以MACO后24h为研究时限。

3.2 关于VEGF、FLT-1、FLK-1 mRNA的表达和意义

VEGF与受体结合是实现其生物学作用的前提。本研究显示, VEGF mRNA在缺血因素刺激下迅速升高, 并于MACO后12h形成高峰;而FLT-1与FLK-1 mRNA的在MACO后24h始终低水平表达, 二者差异明显。前者反映了机体的自然保护机制, 后者则限制了自然保护机制和外源性干预作用的实现。造成这种差异的原因并不十分清楚, 可能与以下因素有关: (1) 与文献报道[4]相似, 在本研究中发现VEGF mRNA可以在神经元、胶质细胞等组织中广泛表达, 而FLT-1与FLK-1 mRNA则主要表达于血管内皮细胞, MACO后血管内皮细胞有可能遭受了更加直接的损伤; (2) VEGF与其受体mRNA表达调节过程不同, 文献报道, 低氧诱导因子 (hypoxia-induciblefactor) 1和2的a亚型, 以及TNFα参与了缺氧后VEGF与其受体mRNA表达的调节, 但具体信号介导过程存在差异。显然, 对于如何上调FLT-1与FLK-1 mRNA的表达需要进一步研究。

另一方面, FLT-1与FLK-1mRNA在缺血后24h均处于较低水平表达, 并且主要分布在血管内皮细胞而非神经元, 这一现象有助于理解VEGF治疗作用的实际机制。国外动物实验证实, 外源性VEGF治疗具有时间依赖性, MACO1d后治疗可以明显改善神以功能, 而1h后即开始治疗却可以引起神经功能恶化。而本研究的结果表明, 缺血后24h内FLT-1与FLK-1 mRNA主要分布在血管内皮细胞而非神经元, 因此VEGF促进神经生成和神经保护的作用难以发挥, 其与血管内皮细胞受体结合而较早引起的血脑屏障破坏作用可能占优势。据此推测, 外源性VEGF治疗的最佳时间应在急性脑梗死24h以后, 而FLT-1与FLK-1在神经元上的表达规律需要通过延长实验时间来进一步观察。

此外文献报道[1], VEGF主要通过FLK-1实现促进血管和神经生成以及神经保护的作用。本研究尚不能得出FLK-1 mRNA表达强于FLT-1的结论, 且未发现FLK-1 mRNA在神经元上的明显表达。但从趋势上看FLK-1 mRNA的表达可能正处于逐渐增加的过程中, 似乎支持FLK-1在此后的生物学效应中将发挥更大作用。

综上所述, 在大鼠MACO后24h内, VEGF及其受体 (FLT-1与FLK-1) mRNA表达存在时空不一致现象;推测外源性VEGF治疗的最佳时间应在急性脑梗死24h以后;而如何在急性脑梗死24h以后;而如何在急性脑梗死24h内上调FLT-1与FLK-1 mRNA的表达以及24h后二者时空分布特点和作用值得进一步研究。

参考文献

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[3] 肖延龄, 杜元灏, 李谈, 等.针刺内关穴对心肌梗塞模型大鼠缺血VE GF及VEGF mRNA的影响[J].中国中医基础医学杂志, 2003, 9 (2) :51～53, 62.

mRNA水平论文 篇8

1对象与方法

1.1研究对象。观察组(T):随机选取符合以下诊断标准和剔除标准的患者100例(男95例,女5例),年龄(47.25±10.99)岁,全部

来自本院2014年8月至2016年2月的门诊患者。1急性痛风性关节炎诊断标准:应用美国风湿病协会(ACR)1997年制定的诊断标准。2入选和剔除标准:a.符合ACR诊断标准的急性原发性痛风性关节炎。 b.排除心血管、肾脏、血液疾病、肿瘤疾病引起的继发性痛风。c.排除合并感染性疾病患者。d.排除自身免疫性疾病及全身系统疾病患者。e.年龄18~75岁。f.一般情况良好。g.未服用降尿酸药物治疗者。 对照组(C):随机选取青岛本地居民健康查体者100例(男95例,女5例),年龄(46.15±11.80)岁,排除高尿酸血症患者。高尿酸血症的诊断标准:是指正常嘌呤饮食状态下,非同日2次空腹血清尿酸水平(37 ℃)男性>420 μmol/L ,绝经前女性>360 μmol/L,绝经后女性的诊断标准同男性。

1.2治疗方案:在低嘌呤饮食、足量饮水前提下,AGA药物治疗方案:1镇痛:为主要治疗措施。秋水仙碱片,服药疗程14 d:前3 d0.5毫克/次,3次/天,餐后服;然后0.5毫克/次,2次/天,餐后服,连续用药7 d;后4 d 0.5毫克/次,1次/晚,睡前服。依托考昔片,服药疗程10 d:前3 d 120毫克/次,1次/天,餐后服;3 d后60毫克/次,1次/天,餐后服,连续用药7 d。2碱化尿液:抑制尿酸在肾脏形成晶体,促进尿酸肾脏排泄。尿p H值维持在6.2~6.8。给予口服枸橼酸钾钠颗粒(逍适柠)2.5克/次,4次/天(三餐后及睡前)。治疗过程中若出现肝、肾功能异常及胃肠道反应则予以排除。

1 . 3观测指标:1测定两组的一般生理指标:年龄( A g e )、 身高(BH)、体质量(BW)、收缩压/舒张压(SBP/DBP)、 腰围(WC)、臀围(HC)。计算腰臀比(WHR)及体质量指数(BMI)。BMI=体质量(kg)/身高(m)2。2测定两组的空腹血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、 尿酸(UA)、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、C-反应蛋白(CRP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。测定两组全血白细胞总数(WBC)、中性粒细胞数(NEUT)、中性粒细胞百分比(NEUT%)。3测定观察组治疗前(第0天,D0)及治疗后第3天(D3)、第7天(D7)、第14天(D14)PBMCs中NLRP3 m RNA、ASC m RNA及caspase-1m RNA。测定相应时间点的空腹血清IL-18水平。同时测定对照组上述指标,与观察组治疗前指标进行比较研究。

1 . 4主要检测方法:所有入选者由专人进行一般生理指标测量并记录。实验中血清ALT、AST、UA、FPG、TG、TC、LDL-C、 HDL-C、CRP、 Cr、BUN的检测用全自动生化分析仪,IL-18的检测采用ELISA试剂盒。PBMCs中NLRP3、ASC及caspase-1 m RNA采用RT-PCR检测。血分析采用SYSMEX XT-2000i全自动血液分析仪检测。

1.5统计学处理:观察组与对照组NLRP3炎性体m RNA比较采用独立样本t检验,一般生理指标、血生化指标及全血分析白细胞数等用独立样本t检验,计数资料采用χ2检验。计量资料用(x-±s)表示。采用IBM SPSS 19.0软件包对所有数据进行统计学分析,以P <0.05为有统计学差异。

2结果

2.1一般临床资料及实验室检查指标比较:观察组与对照组比较,两组性别、Age、AST差异均无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,观察组BH、BW、BMI、SBP、DBP 、WC、HC、WHR、FPG、 UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、HDL-C、C-RP、WBC、 NEUT、NEUT%均明显升高,差异有统计学意义(P <0.05~0.01), 见表1。

注:*观察组与对照组相比(T vs C)P<0.01,#观察组与对照组相比(T vs C)P<0.05

2.2两组NLRP3 m RNA表达水平比较:观察组NLRP3 m RNA表达水平D0、D3及D7vs C显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),D14 vs C差异无统计学意义(P >0.05);观察组各阶段ASC m RNA表达水平与对照组相比显著升高,差异均有统计学意义,其中D0、D3及D7 vs C(P <0.01)、D14 vs C(P <0.05);观察组caspase-1 m RNA表达水平,D0及D3vs C显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),D7及D14 vs C差异无统计学意义(P >0.05)。见表2。

2.3两组IL-18水平比较:观察组D0、D3、D7、D14血清IL-18水平与对照组相比显著升高,差异有统计学意义(均为P<0.01)。见表3。

3讨论

痛风(Gout)是因嘌呤代谢障碍和(或)尿酸排泄减少、血UA持续升高而导致MSU晶体析出并沉积于组织或器官引起的一组临床症候群,属于代谢性风湿病[3]。报道显示,国内痛风的患病率目前在1%~3%,2009年山东沿海地区当地居民痛风患病率为1.96%,2007年~2008年美国痛风患病率上升至3.9%[4]。AGA可发生于任何年龄, 发病高峰年龄为40岁左右,且常伴有糖尿病、肥胖、心脑血管病、肾脏病等,患病率随年龄的增长有逐渐增高的趋势。本研究中,与对照组相比,观察组BH、BW、BMI、SBP、DBP 、WC、HC、WHR、 FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、HDL-C均明显升高(P<0.01)亦支持上述观点。AGA临床上以男性患者多见,女性约占5%[1],且多为绝经期后妇女。AGA发作时疼痛剧烈,患者异常痛苦,严重影响日常工作和生活。近年来研究发现单核/巨噬细胞系统在AGA启动、进展及缓解中均发挥了关键作用,发作涉及IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等多种炎性因子,其中IL-1β是MSU晶体诱导炎症的关键因子,IL-18作为一个重要的调节因子,促进及加速炎性反应。

NLRP3炎性体,即Nod样受体蛋白3 (nod-like receptor protein 3, NLRP3)炎性体是位于细胞内的一种蛋白质复合体,主要功能为活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)以间接调控IL- lβ、IL-18[5]、 和IL-33等的成熟和分泌,具有调控机体炎性反应的功能。NLRP3炎性体是由核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族成员NLRP3 (NLR family,pyrin domain containing 3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis- associated speck-like protein containing CARD,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteine-requiring aspartate protease-1,caspase-1) 组成的复合体,是内源性或外源性危险信号的胞质内感受器,是活化caspase-1的分子平台,调控IL-lβ和IL-18等促炎细胞因子的成熟和分泌。IL-lβ是一个经典的促炎性细胞因子,活化的IL-lβ与靶细胞上的IL-1受体结合,激活IL-1信号通路和髓样分化因子(myeloid differentiation factor,My D88)依赖的NF-κB通路,促进IL-1等促炎因子转录,诱导机体炎性反应。研究证实,IL-lβ是促进多种代谢性疾病发生发展的重要炎性因子,阻断其生物学效应能有效缓解代谢性疾病的进展。NLRP3是模式识别胞内受体Nod样受体蛋白家族的成员,广泛表达于树突细胞、单核细胞和巨噬细胞,具有识别病原体的功能。ASC是NLRP3炎性体的双重衔接蛋白,能够以某种桥梁的形式将NLRP3和caspase-1前体连接起来,最终形成具有酶活性的异二聚体caspase-1。caspase-1作为炎性体的效应蛋白,能够将无活性的IL-18和IL-1β前体剪切为成熟的IL-18和IL-1β,促进其成熟分泌。

目前研究认为,NLRP3炎性体是MSU导致痛风的核心机制。 Martinon等[6]研究显示,NLRP3介导MSU诱导痛风发生发展,其机制可能与MSU诱导K+外流有关,还可能与线粒体来源的活性氧(reactive oxygen species,ROS)释放有关,溶酶体破裂也可能是MSU激活NLRP3炎性小体的机制之一。本研究结果显示,AGA发病时及治疗后第3天, NLRP3 m RNA、ASC m RNA及caspase-1 m RNA表达水平均显著高于对照组(P<0.01),说明在炎症早期,NLRP3炎性体参与了疾病过程。 治疗后第7天,患者NLRP3 m RNA、ASC m RNA表达水平仍高于对照组(P<0.01),caspase-1 m RNA表达水平与对照组无明显差异,提示在炎症持续存在期间,NLRP3炎性体持续参与炎症过程,随病程进行, 炎症消退过程中,抑制炎症的调控因素可能逐渐出现。治疗第14天NLRP3 m RNA及caspase-1 m RNA表达水平与对照组无明显差异,ASC m RNA表达水平仍高于对照组(P <0.05),较前已明显降低,结果显示AGA炎症消退,趋于正常,ASC表达可能存在其他途径及意义。

AGA的前炎性介质来源于常驻的滑膜细胞和迁移的单核巨噬细胞,而NEUT的侵入和活化是最重要的环节。发病时关节滑液和滑膜中出现的大量NEUT甚至可与急性化脓性关节炎时相当[7]。本研究中,发病时的WBC、NEUT、NEUT%及CRP均显著高于对照组,提示AGA发病时WBC及NEUT在炎症初期就参与了反应。

IL-18是AGA炎性反应过程中的重要炎性因子,其可能主要来源于痛风性关节炎患者的软骨和滑膜细胞及内皮细胞[7]。IL-18发挥生物学效应的活性成分,由单核/巨噬细胞、树突状细胞和Kupffer细胞,以及一些成骨细胞和角质形成细胞分泌,是在NLRP3炎性体介导caspase-1的活化,水解激活IL-18的前体释放出来。作为AGA一个重要的调节因子,IL-18通过促进NEUT的聚集,促进炎性反应,具有促进T细胞增殖的作用,增强TH1细胞和NK细胞的细胞毒活性,是一种多效能炎性细胞因子[8]。IL-18最终作用是产生干扰素-γ,从而加速炎性反应,成熟IL-18对IFN-γ的产生过程和对促溶细胞性NK细胞的活性有重要影响。本研究中,观察组各阶段血清IL-18水平与对照组相比显著升高,差异有统计学意义(均为P<0.01),提示IL-18参与了AGA炎性反应的全过程,在AGA启动、进展及缓解中均发挥了重要作用。

总之,本研究结果表明,NLRP3炎性体及IL-18在AGA患者发病及治疗过程中水平异常,提示它们在AGA发病中参与了炎性反应过程,在炎症机制中可能发挥了重要作用。结果亦提示,NLRP3炎性体及IL-18在炎症过程存在与多种炎性因子的共同作用,相互影响,亦存在相关负向调节,它们在炎症发生、进展及缓解中的负面作用亦可能存在,需要在今后的研究中进一步探讨。

参考文献

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[2]Sidiropoulos PI,Goulielmos G,Voloudakis GK,et a1.Inf lammasomes and rheumatic diseases:evolving concepts[J].Ann Rheum Dis,2008,67(10):1382-1389.

[3]Riehette P,Bardin T.Gout[J].Lancet,2010,375(9711):318-328.

[4]Zhu Y,Pandya BJ,Choi HK.Prevalence of gout and hyperuricemia in the US general population:the National Health and Nutrition Examination Survey 2007-2008[J].Arthritis Rheum,2011,63(10):3136-3141.

[5]Akahoshi T.Pathologicalm echanisms of gouty arthritis[J].Nihon Rinsho,2008,66(4):705-710.

[6]Martinon F,Petrilli V,Mayor A,et al.Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome[J].Nature,2006,440(7081):237-241.

[7]伍沪生.痛风与晶体性关节病[M].北京:人民卫生出版社,2014:62.