肾交感神经（精选3篇）
肾交感神经 篇1
神经母细胞瘤 (neuroblastoma, NB) 是一种起源于原始交感神经细胞的肿瘤, 也称成神经细胞瘤[1]。儿童发病率较高, 与肾母细胞瘤同为最常见的胚胎性母细胞瘤。成人发病率较低, 发生于肾脏者更为少见[2]。
1材料和方法
1.1 临床资料
收集1998-02～2006-06经手术病理证实的成人肾神经母细胞瘤9例, 其中男6例, 女3例。年龄19～62岁, 平均43岁。病程1～7个月。左侧腰痛4例, 右侧腰痛2例, 无痛性肉眼血尿伴腰部隐痛3例。发热3例, 贫血2例。VMA增高5例。
1.2 检查方法
9例均采用德国西门子公司SOMATOM AR-sp全身螺旋CT扫描仪, 取仰卧位, 扫描范围从膈顶至髂棘上缘连续轴位平扫, 层厚及层间距均为10mm, 3例行5mm薄层扫描。其中, 6例同时行CT增强扫描, 造影剂采用浓度30%碘海醇80～100ml肘静脉团注增强扫描, 注射速度2.5～3.0ml/s。
2结果
2.1 病变分布
本组9例中, 左侧5例, 右侧4例。其中病变中心位于肾脏中上部5例, 肾脏下部4例。腹膜后淋巴结转移2例, 3例术后0.5～1年内复发, 脊柱转移1例, 肝脏转移1例。
2.2 CT表现
(1) 肿瘤形态及大小: 肿瘤最大径线3.5～12cm, 平均7cm。表现为不规则肿块, 分叶大而浅7例, 呈类圆形肿块2例。 (2) 肿瘤密度: 肿块平均CT值22～48Hu, 平均35Hu。密度不均匀6例, 囊实性 (图1) ;增强扫描呈不均匀轻～中度增强 (图2) 。 (3) 淋巴结转移: 腹膜后淋巴结转移3例 (图3) 。 (4) 肿瘤与周围组织关系: 包绕腹主动脉及腹腔干4例, 大血管及胰腺被推移3例, 逾越中线2例。 (5) 钙化: 显示钙化6例, 呈散在斑点状钙化5例, 不规则形态钙化1例 (图4) 。
3讨论
NB是一种交感神经细胞外胚层肿瘤, 高度恶性, 常发生于交感神经组织[3]。早期转移, 以颅骨、眼眶及其他骨骼转移为多, 治疗效果差, 预后不佳。
3.1 病理组织学特征
NB是一种分化差, 恶性度高的肿瘤, 主要由未分化的神经母细胞构成。肿瘤无包膜并向邻近组织浸润。外观病理特点为结节状, 切面呈灰白色髓样组织, 常有出血、坏死、钙化。镜下特征是形成Homer Wright菊型团, 典型者为圆形、卵圆型淡染区, 其内有细丝和周围瘤细胞粘连。NB的细胞学形态特点为均匀一致的小细胞, 核圆而深染, 并有不同数量的核碎裂和核分裂细胞[3,4,5]。本组9例病理均符合上述病理学特点。
3.2 临床表现
NB早期主要临床表现是腹部无痛性肿块, 一般情况良好, 无明显阳性体征。肾脏NB的症状与肾癌相似, 早期无明显症状, 多以血尿就诊。本组9例中, 腰痛6例, 血尿3例。若肿瘤生长快, 肿瘤中间有坏死发生时, 可有发热。其他症状有体重下降, 腹泻、高血压、眶周瘀斑、眼球突出, 截瘫, 肌阵挛性脑病等症状。当肿瘤转移时, 按其转移部位而表现不同的症状和体征。本组9例中, 2例肝、骨转移。实验室检查NB患者最显著的特点为尿中儿茶酚胺代谢产物增高, 但极少数患者表现为正常。同时检查结果易出现假阴性, 造成漏诊。但此项检查对判断NB患者的治疗反应及复发具有一定的价值[3,4]。
3.3 CT表现
肾脏NB通常表现为肾区较大肿块, 呈分叶状或不规则形, 边缘清楚或不清楚, 密度多不均匀, 内有坏死、囊变或陈旧性出血所致的低密度区, 瘤内多可发现不规则形态钙化[6]。肾区大量点状钙化是神经母细胞瘤的重要特征[7], 如CT发现瘤体内含有高密度的钙化灶, 高度提示NB。本组6例显示钙化。肿瘤也可为软组织肿块, 既无钙化也无出血、坏死, 密度呈高、中、低表现。可有假包膜, 不均匀增强, 一般为轻度增强, 主要表现为云絮状或周边样增强, 增强程度与肿瘤分化程度有关。刘明娟等认为, 云絮状增强可能为放射状排列的菊形瘤巢, 边缘环形增强影为肿瘤周围的假包膜[8]。同时, 由于NB侵袭性强, 容易侵犯周围组织和脏器, 如肾周筋膜、腹膜后血管等, 特别是NB可浸润至腹主动脉旁和脊柱间生长, 从而包埋并向前推移腹主动脉, CT则可较好地显示被肿瘤包埋或压迫的血管。
3.4鉴别诊断
成人肾神经母细胞瘤需与肾癌、肾母细胞瘤及血管平滑肌脂肪瘤等相鉴别。 (1) 肾癌CT平扫时表现为肾实质性占位, 常使肾外形扩大或局限性隆起, 多数呈浸润性生长, 边界不清, 少数边界清楚。多数呈等密度或略低密度, 少数由于肿瘤内出血而密度增强, 或出现密度较低的坏死区, 中心或边缘可以有钙化, 以坏死改变较为常见。增强扫描后, 正常肾实质明显增强, 而肿瘤密度由于缺乏肾小管而增强较少, 中央坏死区不增强。尿儿茶酚胺代谢物NB为阳性, 肾癌为阴性。 (2) 肾母细胞瘤是儿童最常见的恶性肿瘤之一, 偶见于成年人。肿瘤内常有出血、坏死、囊性变和钙化, 一般有完整的假包膜, 容易早期血行转移, 最多见为肺转移, 较少有骨、肝转移。CT显示患侧肾轮廓不清, 往往被肿块占据, 呈巨大球形肿块, 肿块内密度不均, 可见低密度坏死区, 偶见钙化灶。因肿瘤供血不丰富, 增强扫描见肿块与相邻的正常肾实质密度差增大。 (3) 血管平滑肌脂肪瘤特征性表现即发现病灶内含有脂肪成分, 即可作出正确诊断。
总之CT可较好地评价肿瘤大小、位置、包埋的血管、淋巴结转移等, 结合临床表现和尿中儿茶酚胺代谢产物检查, 可较准确的诊断NB;同时还可用于NB的治疗效果评价及复发监测[9]。
参考文献
[1]Rha SE, Byun JY, Jung SE, et al.Neurogenic tumors in the abdomen:tumor types and imaging characteristics.Radiographics, 2003, 23 (1) :29
[2]白人驹, 吴恩惠, 刘望彭.医学影像诊断学.北京:人民卫生出版社, 2001, 794
[3]Lonergan GJ, Schwab CM, Suarez ES, et al.Neuroblastoma, gangli-oneuroblastoma, and ganglioneuroma:radiologic?pathologic correla-tion.Radiographics, 2002, 22 (4) :911
[4]Kushner BH.Neuroblastoma:a disease requiring a multitude of imaging studies.J Nucl Med, 2004, 45 (7) :1172
[5]Hiorns MP, Owens CM.Radiology of neuroblastoma in children.Eur Ra-diol, 2001, 11 (10) :2071
[6]Meyer JS, Harty MP, Khademian Z.Imaging of neuroblastoma and Wilms’tumor.Magn Reson Imaging Clin N Am, 2002, 10 (2) :275
[7]叶滨滨, 陈丽英, 范国光, 等.儿童腹膜后成神经细胞瘤影像学与病理的对照研究.中华放射学杂志, 2000, 34 (2) :114
[8]刘明娟, 黄兆民, 郭燕.儿童肾上腺神经母细胞瘤的影像诊断.中国医学影像学技术, 2001, 9 (5) :449
[9]Simon T, Hero B, Hunneman DH, et al.Tumour markers are poor pre-dictors for relapse or progression in neuroblastoma.Eur J Cancer, 2003, 39 (13) :1899
肾交感神经 篇2
据记者了解, 卢成志教授长期从事心血管内科临床教学和科研工作, 在冠心病、高血压病、心力衰竭、心律失常等疾病诊疗及研究方面具有极为丰富的临床经验。他在亚太地区最早开展了顽固性高血压皮肾交感神经去神经化治疗;他和他的团队在这一领域所取得的成就, 在国内外医学界颇有影响。针对这一话题, 本刊记者对卢成志教授做了深入采访。
高血压是一种“心血管综合征”
采访一开始, 卢成志教授首先介绍说, 高血压是我国人群脑卒中及心脏病发病及死亡的主要危险因素。控制高血压可遏制心脑血管病发病及死亡的增长态势。近年来, 我国人群高血压患病率一直处于增长态势, 每5个成人中就有2人患高血压;2002年发病人数即高达1.6亿, 估计目前全国高血压患者至少达到2亿人。但我国在高血压知晓率、治疗率和控制率方面却远远落后于发达国家。而且, 流行病学调查数据表明, 京津地区历来是我国高血压的高发区。鉴于京津地区的高血压患者数量众多, 不仅患者及其家庭的生活质量很差, 而且造成了巨大的社会经济负担。因此, 天津市第一中心医院非常重视高血压疾病的防治工作, 坚持跟踪国际上高血压治疗领域的最新进展, 不断总结实践经验, 努力提高临床治疗水平, 在我国率先运用经导管射频消融法去肾动脉交感神经治疗顽固性高血压, 并取得了良好的效果, 为患者解决了多年来的痛苦。
卢成志教授接着说:“多年的循证医学研究结果证实, 高血压是一种‘心血管综合征’, 需要根据心血管总危险因素决定治疗措施, 因此应关注多种危险因素的综合干预。同时, 高血压患者的风险之一是靶器官损害, 因此, 我们不仅要关注降压达标, 也需要关注预防心血管事件和靶器官损害的进展, 还要强调靶器官损害评估的必要性———心血管保护、减少心衰、脑卒中、肾衰等的发生, 降低死亡率是降压治疗的最终目标。”
“在临床实践中, 我们会经常遇到一些药物治疗无效的顽固性高血压患者。”卢成志教授继续介绍说, “顽固性高血压我们也称之为难治性高血压。这些患者由于血压长期得不到控制, 会出现靶器官的损害。对于这类患者, 目前急需要一些更有效的治疗手段进行处理, 而这些病人往往最终导致心脑血管事件, 所以一些新的方法的推出对于治疗顽固性高血压, 具有十分重要的意义和价值。”
卢成志教授接着介绍说:“顽固性高血压是我们的团队长期跟踪的临床课题。尽管各种剂型的高血压药物层出不穷, 但临床上仍能见到很多患者饱受煎熬。因为针对顽固性高血压, 目前并无标准的治疗方法。虽然能通过生活方式的改变和合理的药物联合治疗, 使一部分顽固性高血压得到控制, 但仍有10%左右的高血压患者在使用三种以上的降压药物之后, 仍不能达到目标血压。对于这类高血压患者, 亟待有更加有效的治疗手段。”
两年前开始的攻关研究终结硕果
介绍完顽固性高血压的相关情况后, 卢成志教授接着说:“在跟踪国际高血压病治疗最新进展的过程中我们注意到, 在2009年的美国ACC年会上, 公布了一项由澳大利亚墨尔本莫纳什大学心血管研究与治疗中心主任亨利·克拉姆Krum教授牵头完成的一项研究结果, 并在全世界引起广泛重视———运用连接射频发生器的导管, 经皮进入肾动脉阻断肾动脉周围交感神经, 可显著降低顽固性高血压病人的血压。该疗法使30%的药物治疗无效的高血压患者受益。”
卢成志教授说, 著名医学杂志《柳叶刀》和《新英格兰杂志》发表了这项研究结果:通过干扰肾脏周围神经来治疗严重高血压的疗法效果显著。一些接受这一疗法的病人血压逐渐正常, 甚至不需再服药。它运用微创的介入治疗方法, 对病人损伤很小。整个治疗过程不用开刀, 是将射频消融导管导入肾动脉, 发出射频能量阻断支配肾脏的交感神经。
“莫纳什大学血管研究与治疗中心的这项研究成果令人振奋!”卢成志教授接着介绍道, 根据这项研究成果, 天津市第一中心医院心血管中心组成了以卢成志教授为主导的科研团队, 从两年前开始进行经导管射频消融去肾动脉交感神经术攻关课题研究。他们在进行了充分的前期实验性动物研究之后, 利用治疗心律失常的射频消融导管, 于今年7月至9月间, 对5例顽固性高血压患者进行经皮导管肾动脉射频消融去肾脏交感神经治疗。全部5例手术均获得满意效果, 患者术后血压明显降低, 急性期及早期结果明显优于国外临床研究阶段的射频消融方法, 患者血压水平分别由术前的248/105mmHg, 221/116mmHg, 200/100mmHg, 190/90mmHg和170/105mmHg降到了术后的135/75mmHg, 155/95mmHg, 156/62mmHg, 148/82mmHg和140/90mmHg。其中1名合并鼾症的患者, 除血压控制良好外, 术后打鼾现象也基本消失;3名合并肾功能不全的患者, 术后肌酐水平也有所下降, 分别从术前的146.5mmol/L、391.4mmol/L和155.1mmol/L下降到122.1mmol/L、357.5mmol/L和135.2mmol/L, 且手术过程中没有发生任何操作相关的并发症, 术后患者恢复良好, 均好转出院;术后停用或服用较少的降压药物使血压维持在较理想水平。第一例患者3个月随访时血压为150/95mmHg。
上述5例顽固性高血压患者, 在卢成志教授主导下进行的经皮导管肾动脉射频消融去肾脏交感神经治疗后所取得的临床研究结果, 标志着我国心内科领域诞生了一个飞跃性的事实:天津市第一中心医院的心内科在我国率先运用经皮导管射频消融法去肾动脉交感神经治疗顽固性高血压, 已经在临床上取得良好效果!
曾经被忽略的外科手术
随后, 卢成志教授梳理了一下这项研究的“理论脉络”。他详细解释说:“在高血压当中, 交感神经升高是兴奋的因素, 当交感活性增高的时候, 就会引起心脏问题、代谢问题, 同样会引起肾脏的问题。那么, 肾脏的交感活性增加, 就会引起肾血管收缩, 也会引起肾素血管紧张素醛固酮系统激活, 这些都会导致肾脏的损害, 所以肾脏的交感活性过高时, 就会引起一系列血压增高的现象。在临床上我们看到, 原发性高血压患者的交感活性要比正常人明显上升, 这说明高血压病人有高交感神经激活现象, 那么肾脏交感神经去除之后会出现什么样的改变呢?”
卢成志教授接着介绍说, 在此之前, 国外有许多学者进行的诸多动物模型的实验, 都已经证明阻断肾交感神经不但能够使血压下降, 并且对交感神经过度激活的慢性器官特异性疾病产生影响。实验还证明阻断肾交感神经能改善左心室肥厚和胰岛素抵抗, 而后者则可能减少主要心血管事件的发生, 如中风和心肌梗塞。Boer PA等为研究肾神经在自发性高血压大鼠中肾钠吸收和排泄的作用, 观察了肾去神经术后自发性高血压大鼠尿钠排泄的变化, 结果发现肾去神经术后可消除自发性高血压大鼠的尿钠排泄下降。McBryde FD等则发现双侧肾交感神经切除后可延缓血管紧张素Ⅱ诱导的新西兰大白兔高血压的发生, 但不能阻止高血压的发展。Evans RG等发现急性肾去神经不改变肾血流动力学或肾排泄功能, 但能降低肾素活性溢出。Grisk O等研究发现自发性高血压大鼠进行新生鼠去交感神经肾移植术后对大鼠肾功能有慢性改变, 并导致平均动脉压下降。长期一侧肾去神经是研究肾交感神经对肾功能调节作用的一种好的方法, 但这种方法会否造成肾对儿茶酚胺的高反应, 则成为人们的困惑。Ramchandra R等的研究指出:和急性肾去神经或非去神经肾相比, 实验兔长期一侧肾去神经并不会增加肾对儿茶酚胺的反应。为研究慢性去神经对肾血管结构和功能的影响, Shweta A等对6周龄自发性高血压大鼠进行了一侧肾去神经术, 结果发现:一侧肾去神经对高血压的发展没有明显的影响, 仅可造成小叶间动脉腔的狭窄, 对小叶间动脉和弓状动脉壁没有影响, 而且对出球动脉和入球动脉腔直径也没有影响, 作者由此得出结论:虽然双侧肾去神经可延缓自发性高血压鼠的高血压的发展, 但一侧肾去神经则不能, 这提示一侧完整肾足可驱动自发性高血压鼠高血压的发展。Jacob F等的研究指出:虽然肾交感神经在高血压发展中有很重要的作用, 但其他因素的影响也不可忽略。
卢成志教授接着说:“基于这些理论基础和动物实验的结果, 澳大利亚墨尔本莫纳什大学心血管研究与治疗教育中心主任亨利·克拉姆教授将肾交感神经切除治疗高血压的想法在人类身上进行了尝试, 其实验结果在全世界引起了广泛的重视。”
谈到这里, 卢成志教授停顿了一下接着说:“由此我们可以看到, 交感神经去神经化的确可以达到一些好的效果:首先它可以降低全身交感神经活性, 降低身体的液体潴留, 改善肾功能, 降低动脉硬化, 降低心率、降低血压等等, 这些都是比较好的作用。实际上, 关于阻断交感神经可以降低血压的研究, 早在1952年国外就已经开始了, 当时主要在美国进行需要切开腹部的外科手术中阻断腰部的交感神经的。在那时, 这还是一个非常复杂的手术, 而且要求外科医生有非常高超的手术技术才能完成。但是, 这项治疗带来了很多副作用, 带来了包括一些膀胱和肠道和体位性低血压等很多问题。当时进行的这项研究中, 有1200个病人接受了这项治疗, 后来因为这些严重的副作用, 这项技术慢慢被忽略了, 不再做这项手术治疗了。过了几十年以后, 学界在重新分析高血压的发病机制时发现, 在肾动脉周围有很多交感神经, 通过阻断肾动脉周围的交感神经, 降低肾素等的分泌来降低血压的水平。”
随后, 卢成志教授谈到了他们这个团队进行的这方面的研究:“我们在两年前开始就开始了经导管做肾动脉消融治疗高血压的实验研究。目前, 除了欧洲和澳大利亚以外, 其他国家还没有进行这方面的临床试验。”
随后, 卢成志教授总结了他和他的团队所做的5例手术情况:“我们在做了大量的动物实验后, 从今年的7月份开始实施第一例手术, 到现在已经做了5例病人, 其中2例是男性, 3例是女性。5例患者的年龄是45到65岁, 患长期高血压10至30年, 均服用含利尿剂及其他4种以上的药物。针对这5名患者, 我们在排除了继发性高血压之后, 采取局部麻醉后实施手术。手术时间大概是40分钟到一个半小时, 没有术后并发症。”
提及手术效果, 卢成志教授兴奋地说:“其中的第一名患者, 原来有着15年的高血压病史, 术前两个多月无论服用什么药, 血压也降不下来, 病人住院以后血压始终是190/90mmHg, 在做了手术不到一分钟, 病人的血压已经降到120~130mmHg了, 降低的幅度非常大, 远远超过了我们对这个病人的预期水平!这使我们后期治疗的信心大增。在当时, 我们也没有想到这个治疗效果这么好。”
“随后又成功进行了另4例手术后, 我们做了一些总结。”卢成志教授继续说, “我们得出了一个结论:经导管去神经化可以显著降低血压的水平, 而且没有明显并发症发生, 至少目前对顽固性高血压治疗效果非常好!除此之外, 我们注意到国外有报道, 这种手术对糖尿病、心衰患者, 对夜间呼吸性暂停的患者也有疗效, 因此我们也期待这项治疗技术能给中国的高血压患者带来更多的益处。”
肾动脉射频消融的五大创新
据记者了解, 天津市第一中心医院的心内科发展非常迅速, 是天津市发展最快的心脏心血管内科, 其学科带头人就是卢成志教授。目前, 该院心血管内科依托学科综合优势, 多项诊疗技术已经达到国内领先、国际先进水平, 每年在冠脉影像技术领导下完成了大量复杂和高危冠脉疾病患者的介入治疗, 并成功举办了天津市第一、第二、两届冠脉影像新技术及复杂病变介入治疗研讨会。该院心血管内科在卢成志教授带领下, 长期跟踪国际上高血压治疗领域的最新信息, 不断地总结实践经验, 努力提高临床治疗水平。他们在国内率先开展的经皮导管去肾动脉交感神经法治疗顽固性高血压的疗效, 目前已经得到了国内心脏医学界的广泛确认。因而, 霍勇教授在评价这一科研成就时, 才中肯地宣称, 这“无疑是我国高血压诊疗水平提升的又一个新的里程碑!”
据了解, 目前这种治疗方法只有欧洲及澳大利亚的几个医疗中心开展, 亚太地区还处于起步阶段, 目前国内更是没有相关的报道。那么, 卢成志教授和他的团队已经完成的5例经导管肾动脉射频消融治疗, 既然验证了此技术的安全性和有效性, 相对而言, 还有哪些临床优势呢?
提及这个问题, 卢成志教授介绍说, 根据他们的研究和总结以及业内人士的评价, 这项手术可以说具有以下五大“创新点”———
一是在国际上首次利用普通的消融导管进行肾动脉交感神经去神经化治疗, 同样获得了良好的安全性及有效性。
二是在早期经验中, 血压下降的幅度要明显大于国外相关研究报道。国外发表的HTN1和HTN2研究结果, 随访期间血压最大下降了32/14mmHg。在他们的研究中, 血压最大下降幅度为113/30mmHg。
三是手术入路进行了创新。在他们所做的5例手术中, 有两名患者经右侧肱动脉途径行经导管肾动脉射频消融治疗, 更加适合肾血管的解剖特点, 减少了患者卧床时间, 无相关并发症。此方法此前未见报道, 为这种治疗提供了一种新血管入路选择。
四是5例手术中有3例合并肾功能不全的患者术后肌酐水平也有所下降, 对高血压肾病患者肾功能改善提供了一种有前途的治疗手段。
五是5例手术中有1例患者的夜间阵发性呼吸暂停症状得到改善。
提及这项手术的远期效果, 卢成志教授介绍说:“参照目前国际上发表的研究结果, 其中最长的患者是观察到了两年的时间, 18名患者已经随访观察两年, 血压的水平还是比最早治疗时要好, 而且是越来越好。由于我们进入临床研究和观察的时间还比较短, 因此我们希望后期的观察结果会更好一些。”
关于这项手术的适应症, 卢成志教授谈到:“这实际上是关乎施术对象的选择问题。目前我们选择进行这项治疗的病人, 是相对非常严格的。一定要病人住院并接受正规的几种降压药物治疗后, 血压还不能降低到正常或者理想水平的患者, 才考虑实施这项手术。另外根据国外的经验, 年轻患者相对, 比老年患者治疗效果会更好一些, 因为年轻人的交感神经活性比老年人更高一些, 因此总体的治疗趋势是, 年轻的顽固性高血压患者比老年的顽固性高血压患者, 手术效果要好得多。”同时卢成志教授还坦陈, “由于我们开展这项研究的时间还很短, 一些后期的病理规律还有待于更大规模的观察临床试验才能得到更多的资料和数据。”
肾交感神经 篇3
1材料与方法
1.1实验动物
成年健康昆明小鼠(体重25~30 g),购自中国医科大学实验动物中心,生产许可证:SCXK (辽) 2008-0005。
1.2实验试剂
GFRα1兔多克隆抗体(sc-10716)、RET兔多克隆抗体(sc-167)购自美国Santa公司,异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的羊抗兔免疫球蛋白Ig G购自武汉博士德生物工程有限公司,3- 磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phos- phate dehydrogease,GAPDH) 鼠单克隆抗体购自上海康成生物公司,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene flu- oride,PVDF) 膜、蛋白Marker购自NEB公司,ECL (enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒购自美国Pierce公司。
1.3实验方法
1.3.1标本制备小鼠按雌雄比例1∶1同窝饲养, 以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄(embry- onic days,E)0 d[7]。孕鼠分笼饲养,每天上午8∶00、 下午5∶00观察生产,以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后(neonatal days,N)0 d。分别取胚龄12、 14、16、18 d胎鼠和生后1、7、14、21和40 d仔鼠肾脏,每组8只,每只孕鼠最多取2只胎鼠或仔鼠。孕鼠经10%水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠,胚龄12 d全胚固定,胚龄14、16、18 d取其左肾固定。仔鼠经10%水合氯醛麻醉后,于腹后壁取出左肾,用排刀法沿横轴将肾脏切开,置于4%多聚甲醛固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡定向包埋,5μm连续切片。 各组小鼠取右肾,入液氮迅速冷冻,置入-80℃冰箱冷冻保存待用。
1.3.2免疫荧光技术切片常规脱蜡、水化,滴加5% 驴血清(normal donkey serum,NDS)室温孵育1 h,甩去多余液体,不洗;滴加GFRα1或RET兔多克隆抗体(工作液浓度1∶100)置入4℃孵化箱过夜,滴加FITC标记的荧光二抗室温孵育2 h,用防淬灭封片剂封片,共聚焦激光扫描显微镜(激发波长为488 nm)观察并采集图像[7]。以磷酸缓冲盐溶液(phos- phate buffer saline,PBS)代替一抗作阴性对照组。上述各步骤用0.01 mol/L PBS冲洗。
1.3.3蛋白印迹检测取冷冻待用右肾分别称质量,用小剪刀将组织块尽量剪碎(冰上操作),加入4倍体积的蛋白裂解液,超声粉碎,4℃过夜,冷冻离心机4℃、12 000 r/min离心30 min,去除细胞碎片, 取上清液,考马斯亮蓝法进行蛋白定量[7]。样品取50μg与6×十二烷基硫酸钠上样缓冲液混合, 100℃煮沸5 min,聚丙烯酰胺凝胶电泳,转硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h,一抗(GFRα1和RET工作液浓度为1∶700)置入4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的二抗(工作液浓度1∶5 000)室温孵育2 h,HRP-ECL蛋白检测发光鉴定,凝胶电泳图像分析仪进行采图。
1.4统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,用单因素方差分析, P <0.05有差异统计学意义。
2结果
2.1免疫荧光检测
胚龄12 d,GFRα1在输尿管芽上皮细胞及生后肾组织微弱表达;而RET在输尿管芽上皮细胞微弱表达,生后肾组织未见表达。随着肾小体发育,GFR α1在小泡体、逗号小体和S小体均有表达,表达逐渐增强;在毛细血管袢期肾小体及未成熟期肾小体表达减弱,在成熟肾小体未见表达。RET在各期发育阶段的肾小体未见阳性表达。随着早期髓质的出现, GFRα1在近端小管、远端小管和集合管有明显表达;RET在集合管有明显表达。在成熟肾脏中,GFR α1主要定位表达于近端小管、远端小管和集合管; RET主要定位表达于集合管。见图1、2。
2.2蛋白印迹检测
随着胚龄的增加,GFRα1和RET在肾脏表达量逐渐增加,生后1 d表达量最高,随后GFRα1和RET在肾脏表达量逐渐减少。见图3。
3讨论
哺乳动物肾脏发育是输尿管芽和生后肾组织相互诱导的结果。以小鼠为例,胚龄12 d输尿管芽及其分支出现,生后肾组织呈帽状围绕在输尿管芽及分支周围;胚龄14 d,输尿管芽分支周围出现小泡体、逗号小体、S小体,这部分皮质称为生肾区;胚龄16 d,大多数肾小体仍停留在逗号小体、S小体阶段, 可见到少量Ⅲ和Ⅳ期的髓旁肾小体,即第1代成熟肾小体出现;胚龄18 d,早期髓质出现,髓质由少量近直小管、远直小管、细段和集合管构成,其间散在大量间质,相当于成年后的髓质外带外区;生后1 d, 被膜下仍有生肾区,但相对面积减少,髓质外带内区出现;生后7 d,皮质生肾区消失,只有Ⅳ期肾小体存在,肾小体发育基本成熟,集合管不再分支,髓放线出现,可见近直小管,远直小管和集合管,肾乳头可见由远端小管直部、细段以及集合管构成的髓质外带内区;随后,皮质增厚,髓质可区分为髓质外带内外区;生后40 d,肾发育达到成年水平[8]。
有研究表明,GFRα1和RET参与肾脏发生、发育过程。1998年TOWERS等[9]发现,GFRα1和RET在肾脏表达,参与肾发生、发育过程。2003年CAM- ASSEI等[6]通过免疫组织化学检测肾胚细胞瘤中GFRα1和RET的阳性表达,证实GFRα1和RET参与诱导肾胚细胞瘤的细胞分化。2004年CHARLET- BERGUERAND等[10]报道GDNF家族复合受体GFRα1是RET信号转换的重要成分,与神经细胞和肾发育有关,其活性可被GDNF激活。2006年COS- TANTINI等[11]证实,GDNF/RET信号系统是肾脏发育中输尿管芽正常生长的必要条件,但GDNE/RET信号在肾分支形态学的作用机制仍不清楚。2008年SKINNER等[12]提出人类RET和GDNF突变可能导致肾发育异常。2009年LU等[13]发现在胚胎发育中, 缺乏Etv4和Etv5等位基因会导致肾发育不良,并推测Etv4和Etv5是RET的下游信号。JAIN[14]报道GFRα1或RET缺失将导致肾发育不全,引起围产期死亡,在人类先天性肾畸形中可检测出RET基因突变。