醇溶蛋白（精选5篇）
醇溶蛋白 篇1
谷蛋白和醇溶蛋白为小麦贮藏蛋白, 是面筋的主要成分, 约占小麦籽粒蛋白的80%左右, 醇溶蛋白是其主要类型。醇溶蛋白是单体蛋白, 富含脯氨酸和谷氨酰胺, 具有高度的异质性和复杂性, 对面团物理特性有重要影响[1]。根据在A-PAGE上的迁移率可将其分为α-、γ-和ω-3种类型。α、γ-醇溶蛋白富含硫, 分子量30-45KD;ω-麦醇溶蛋白为不含硫氨基酸, 分子量为65-80KD。α-醇溶蛋白含量最丰富, 占种子储藏蛋白的15%~30%, 对小麦品质有重要影响。大多数低分子量谷蛋白亚基以及γ和ω-醇溶蛋白基因位于第1部分同源染色体臂上, 而α-醇溶蛋白基因由第6部分同源染色体短臂上的Gli-2位点编码[2]。Metakovsky等[3]的研究显示, 面团强度在Gli-B1、Gli-B2和Gli-A2位点存在显著差异, 其中等位基因Gli-B1b、Gli-B2c和Gli-A2b与高面筋强度相关显著, 这说明Gli-2位点可能对品质有重要作用。
由α-醇溶蛋白基因序列推导的氨基酸一级结构有比较明显的特征:首先是由19/20个氨基酸残基组成的信号肽, 之后分别是N端重复区、多聚谷氨酰胺Ⅰ区、特征区Ⅰ、多聚谷氨酰胺Ⅱ区和特征区Ⅱ。不同基因的差异主要集中在重复区和多聚谷氨酰胺区。6个保守的半胱氨酸残基 (Cys) 分布于特征区, 两两之间形成分子内二硫键[4]。
密穗小麦 (Triticum compactum Host.) 为古老的六倍体 (AABBDD) 裸粒栽培种, 是普通小麦 (T.aestivum) 的一级基因源[5]。本研究利用特异性引物, 采用PCR克隆的方法对密穗小麦α-醇溶蛋白基因序列进行分析, 以期丰富α-醇溶蛋白基因信息, 同时也为深入了解密穗小麦醇溶蛋白基因的遗传变异和作用机理奠定基础。
一、材料和方法
1. 材料
供试材料为5份密穗小麦PI566594、PI269250、PI191874、PI159101和PI352302, 均由美国种质资源库 (GRIN) Dr.Bockelman惠赠, 分别来自美国、意大利、葡萄牙、南非和奥地利。
2. 方法
(1) DNA提取
植物总DNA的提取采用CTAB法[6]。
(2) PCR引物设计和扩增基因组DNA
根据已报道的α-醇溶蛋白基因序列设计引物:F1:GGTGGAATGATAG TGCA ACAA;F2GTCCGAGAATACACTTGTAAGTA;F3:CCACACAAGATTACGAA CTAAG;F4:AGGCAGTCTAGAATAGTGTTTG;R:GGATGTAGACAT TGCACATTG。PCR反应总体积为25μL, 其中含10×buffer 2.5μL, 1.5mmol/L Mg Cl2, 4种d NTP各100μmol/L, 引物各6pmol, 1U Taq plus DNA polymerase (高保真) , 100ng基因组DNA。PCR反应程序为:94℃预变性4min;然后94℃变性1min, 55℃退火1min, 72℃延伸1min30s, 共35个循环;最后72℃延伸10min。
(3) PCR产物回收纯化、T-载体克隆与阳性克隆筛选
PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上检测, 将目的片断回收纯化后连接到载体p MD18-T上, 并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。对白色菌落进行PCR扩增, 确认阳性克隆。
(4) 序列测定与比较分析
随机选取阳性克隆进行测序, 序列测定由商业公司完成。序列分析采用NCBI网站的blast (http://www.ncbi.nlm.nib gov/BLAST/) 程序, 以及DNAMAN5.2.2和MEGA3.0软件进行。
二、结果与分析
1. α-醇溶蛋白基因的分离
引物F1、F2、F3和F4分别与R组合 (分别用字母A、B、C、D表示) , 其PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 结果显示在1200bp左右有一条目的条带。将目的条带分别回收、纯化并连接到p MD18-T载体, 然后将连接产物转入感受态细胞。筛选阳性克隆测序, 共获得41条序列。经序列相似性搜索确认为α-醇溶蛋白基因片段, 包含了部分编码区序列及5′侧翼序列 (序列具体信息见表1) 。其中有25条序列具有提前终止密码子, 推测为假基因。
2. 氨基酸结构分析
分析比较的α-醇溶蛋白基因氨基酸序列 (图1) , 发现所有序列的编码区内均无内含子, 并具有α-醇溶蛋白基因的基本结构特征。首先是由19个氨基酸组成的信号肽, 之后分别是N端重复区、多聚谷氨酰胺Ⅰ区、特征区Ⅰ、多聚谷氨酰胺Ⅱ区和特征区Ⅱ, 不同基因的差异主要集中在重复区和多聚谷氨酰胺区。
(1) N-端重复区
α-醇溶蛋白的重复区可划分为若干重复短肽。本研究中重复区均有一致的重复单元PQPQPFP和PQQPY。此外, 还分离出重复单元LPYPQPQ, 在序列PI35202-9-B中重复出现3次 (见表2) , 并且在PI159101-3-B等序列中出现2次。
L:亮氨酸;P:脯氨酸;Y:酪氨酸;Q:谷氨酰胺
(2) 多聚谷氨酰胺区及微卫星结构
两个多聚谷氨酰胺区是所有α-醇溶蛋白一级结构的主要特征, 其中几乎全为谷氨酰胺残基。本研究中两个多聚谷氨酰胺区氨基酸残基差异较大, 区Ⅰ含有的氨基酸残基个数变幅为7~35个, 区Ⅱ的变幅为4~22个, 同时还出现了其它氨基酸残基, 如丙氨酸 (A) 、组氨酸 (H) 、赖氨酸 (K) 、谷氨酸 (E) 、脯氨酸 (P) 、精氨酸 (R) 、亮氨酸 (L) 等。这些非谷氨酰胺残基的出现, 主要是单个碱基替代的结果, 如:CAA到GAA、CAA到CAT的突变。根据其核苷酸序列还可以看出, 编码谷氨酰胺的两个密码子CAG和CAA以串联重复形式出现, 形成类似微卫星结构 (表3) 。
.代表缺失密码子, ◆代表半胱氨酸残基
三、讨论
本研究分离的41个α-醇溶蛋白基因之间存在一些差异, 主要表现在: (1) 单碱基替换导致多聚谷氨酰胺区出现非谷氨酰胺残基; (2) 重复区结构同Anderson等[7]的研究相似, 由两个基本的重复单元POPOPFP和POOPY组成, 部分序列还出现了LPYPQPQ单元。
Du Pont等[8]推测α-醇溶蛋白基因大约有50%是假基因。主要原因是α-醇溶蛋白基因中C到T的碱基转换频率很高[9]。α-醇溶蛋白基因序列中含有丰富的谷氨酰胺密码子CAA和CAG, C到T的转换很容易导致提前终止密码子的出现。本研究中, 密穗小麦41条α-醇溶蛋白基因序列中, 有25条序列中出现了提前终止密码子, 占总数的61%, 据此可推测其终止密码子可能是由此转换造成的突变。
绝大多数α-醇溶蛋白有六个保守的半胱氨酸残基, 分布在两个特征区, 它们之间形成分子内二硫键。极少数α-醇溶蛋白包括奇数个半胱氨酸残基, 可能形成分子间二硫键而后参与形成谷蛋白聚合物[7]。本研究得到的α-醇溶蛋白基因序列中有少数出现了奇数个半胱氨酸残基, 且序列PI269250-6-B、PI352302-5-C、PI566594-7-B中没有出现提前终止密码子, 其多余的半胱氨酸, 能形成分子间二硫键, 可能对面粉品质有重要作用。对于半胱氨酸残基与面粉品质之间的关系还需要进一步的研究。并且在本研究发现多聚谷氨酰胺区有位点的谷氨酰胺突变为赖氨酸, 提高了赖氨酸的含量, 如能利用醇溶蛋白的突变大多是单碱基变化这种特征来改变某些氨基酸, 就有可能提高醇溶蛋白的营养价值。
参考文献
[1]Pomeranz Y.Composition and functionality of wheat flourcomponents.Pomeranz Y (ed) Wheat chemistry and technology, vol II[J].Am Assoc Cereal Chem Inc, St Paul, USA, pp, 1988, 97-158.
[2]Payne PI.Genetics of wheat storage proteins and the effectof allelic variation on bread-making quality[J].Annu RevGenet, 1987, 38:141-153.
[3]Metakovsky, E.V.et al.Relationship between gliadinalleles and dough strength in Italian bread wheat cultivars[J].Cereal Sci, 1997, 25:229-236.
[4]Müller S W and Wieser H.The location of disulphide bondsinα-type gliadins[J].Cereal Sci., 1995, 22:21～27.
[5]董玉琛.小麦的基因源[J].麦类作物学报, 2000, 20 (3) :78～81.
[6]Yan Zehong, Wan Yongfang, Liu Kunfan, Zheng Youliang, Wang Daowen.Identification of a novel HMW gulte-ninsubunit and comparison of its amino acid sequence with thoseof homologous subunits[J].Chinese Science Bulletin, 2002, 47 (3) :220-225.
[7]Anderson O D, Greene F C.Theα-gliadin gene family.II.DNA and protein sequence variation, subfamily structure, andorigins of pseudogenes[J].Theor.Appl.Genet., 1997b, 95:59-65.
[8]DuPont F.M, Vensel W, Encarnacao T, Chan R, Kasarda D.D.Similarities of omega gliadins from Triticum urartu to thoseencoded on chromosome 1A of hexaploid wheat and evidencefor their post-translational processing[J].Theor Appl Genet, 2004, 108:1299-1308.
[9]Anderson O D, Litts J C, Greene F C.Theα-gliadin genefamily.I.characterization of ten new wheatα-gliadin genomicclones, evidence for limited sequence conservaton of flankingDNA, and southern analysis of the gene fmily[J].Theor.Appl.Genet, 1997, 95:50-58.
醇溶蛋白 篇2
高效液相色谱 (HPLC) 是7O年代开始发展起来的分析蛋白质的一项新技术, 目前已广泛用于蛋白质化学领域。使用RP—HPLC能有效进行种子贮藏蛋白的分离, 它的原理是根据不同蛋白质组分的表面疏水性的差异将其分离开, 与蛋白质分子量及所带电荷数无关;而蛋白电泳技术是依据分子大小和电荷的不同来分离的, 因此, 二者的原理不同, 其蛋白分离图谱可以相互印证, 互为补充。[1,2]而超高效液相色谱 (UPLC) 与HPLC相比, 大幅度地改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度, 因而具有更高的效率和更强的分离能力。目前为止利用UPLC分析孜然芹种子醇溶蛋白的研究还未见报道。因此, 本试验借鉴HPLC的方法, 以新孜然1号为实验材料, 研究洗脱时间、色谱柱温度等对孜然芹醇溶蛋白超高效液相色谱分离的影响, 确立孜然芹种子醇溶蛋白超高效液相色谱法 (UPLC) 分离的最佳实验条件, 为孜然芹种子醇溶蛋白分离分析建立一种有效的方法;然后对比研究10个品种贮藏蛋白的色谱图, 评价使用这种方法作为品种鉴定手段的可能性。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料见表1。
1.2 种子蛋白提取
单粒种子研磨15 min, 加入0.5 mL的70% (v/v) 甲醇溶液浸泡2 h[3]。样品继续研磨10 min后, 12000 r/min离心10 min, 通过0.45μm孔径的滤膜后进样上柱分析。
1.3 反相高效液相色谱
色谱分析选用Waters Acquity Ultra performance LC分析系统, 溶剂输送选用Waters高压泵, 自动进样。Waters Acquity Ultra performance LC TUV紫外检测器210nm检测洗脱蛋白。
2 结果与分析
2.1 色谱分离条件选择:
用含0.10%的三氟乙酸的乙腈和0.05%的三氟乙酸水溶液作为溶剂A和溶剂B, 随时间改变溶剂A和B的浓度梯度变化, 来优化色谱分离条件。结果, 使用Waters Acquity UPLC BEH C18粒径1.7μm的反相色谱柱 (2.1×50 mm) , 溶剂A以10%～35%的流速梯度、0.30 mL/min的流速洗脱19 min, 孜然芹种子主要贮藏蛋白在此条件下能够得到分离。
2.2 色谱柱温度对分离结果的影响
由色谱理论可知, 在一定范围内, 随着温度的升高分离效率将逐渐提高, 但温度太高会缩短色谱柱寿命, 使蛋白质变性。为确立温度对UPLC分离孜然芹种子醇溶蛋白的影响, 本试验设计40℃、50℃、55℃三个对比温度, 测定结果见图1。
由图1可以看出, 随着温度的升高特征峰出现的越早, 但总的峰数没有随着温度的升高而发生变化。结合仪器的使用情况, 我们认为40℃柱温最好。
2.3 洗脱时间对分离效果的影响
洗脱时间是影响色谱分离的主要因素之一。前人研究HPLC所用的洗脱时间在40～60 min之间, 而超高效液相色谱 (UPLC) 较HPLC效率高, 为明确洗脱时间对色谱分离的影响, 本试验设计40 min进行试验。从试验结果 (见图2) 来看, 在20 min以后基本没有较明显的特征峰出现。经过重复试验, 我们选择20 min洗脱时间为试验的优选条件。
2.4 不同品种间UPLC色谱图
由图3可以看出, 10个孜然芹品种的醇溶蛋白蛋白洗脱峰顺序较相似, 无显著的特征峰, 只是在含量上有些差别, 不能说明孜然芹品种间的纯度的差异;但是, 小茴香的色谱图与孜然芹有很大差异, 可以很容易把它与孜然芹种子区分开来。
3 结果与讨论
(1) 孜然芹种子醇溶蛋白UPLC分析技术受孜然芹及近缘种测定对象的影响, UPLC分析孜然芹醇溶蛋白的标准方法必须根据实际情况进行反复试验才能确定。本研究结果表:明流速0.3 mL/min、柱温40℃下, 流动相A液在16 min内由10%升至35%, 通过210 nm波长检测紫外吸收为孜然种子醇溶蛋白UPLC分离的最佳条件。
(2) UPLC技术分析孜然芹种子醇溶蛋白与A-PAGE相比, 具有如下优点: (1) 试验速度快, 试验周期短, 一个样品只需20 min。 (2) 试验条件稳定, 易于控制重复性高。 (3) 图谱清晰, 数据分析准确可靠, 易于比较。 (4) 能实现自动化控制, 节省人力。UPLC技术的分辨率和定量性优于单向电泳, 这样就有可能对某些用单向电泳不能鉴定的育种系谱相近的品种进行鉴定。
(3) UPLC分析中, 温度是最重要的影响因素。不同色谱柱的性能指标有差异, 在实际应用中必须因地制宜, 结合蛋白质的特性确定最适温度。洗脱时间对实验效率有一定的影响, 根据孜然芹及近缘种的倍性及组成差异, 进行相应的改进, 从而缩短实验时间, 节省成本, 提高工作效率。
(4) 由于10个孜然芹品种的醇溶蛋白蛋白各组分疏水性相近, 在该方法中没有完全分开, 洗脱峰顺序较相似, 无显著的特征峰, 只是在含量上有些差别, 不能说明孜然芹品种间的差异。但是, 小茴香的色谱图与孜然芹有很大差异, 在今后研究中还应继续研究其他提取蛋白的色谱图, 找出品种间的有显著差异的洗脱峰。
摘要：本刊2011年第5期第28～33页刊登的《孜然芹种子醇溶蛋白超高压液相色谱分离方法初探》和《关于玉米制种籽粒灌浆成熟规律的研究》两篇论文, 因印刷厂制版时疏忽出现严重失误, 所有坐标图都漏印了变化曲线。待我部发现时, 凡在当地邮局订阅的杂志都已寄出, 无法更改, 现将上述两篇文章在本期第28～33页重新刊登, 以资弥补。在此深表歉意并敬请原谅!
参考文献
[1]晏月明, 刘保国, 杨长寿.反相高效液相色谱在作物品种鉴定中的应用[J].中国农学通报, 1993, (9) 3:41～44.
[2]赵龙刚, 宋希云, 史雪辉等.小麦胚乳醇溶蛋白反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 分离方法的建立[J].现代仪器, 2006, (06) :78～80.
醇溶蛋白 篇3
高效液相色谱 (HPLC) 是7O年代开始发展起来的分析蛋白质的一项新技术, 目前已广泛用于蛋白质化学领域。使用RP—HPLC能有效进行种子贮藏蛋白的分离, 它的原理是根据不同蛋白质组分的表面疏水性的差异将其分离开, 与蛋白质分子量及所带电荷数无关;而蛋白电泳技术是依据分子大小和电荷的不同来分离的, 因此, 二者的原理不同, 其蛋白分离图谱可以相互印证, 互为补充。[1,2]而超高效液相色谱 (UPLC) 与HPLC相比, 大幅度地改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度, 因而具有更高的效率和更强的分离能力。目前为止利用UPLC分析孜然芹种子醇溶蛋白的研究还未见报道。因此, 本试验借鉴HPLC的方法, 以新孜然1号为实验材料, 研究洗脱时间、色谱柱温度等对孜然芹醇溶蛋白超高效液相色谱分离的影响, 确立孜然芹种子醇溶蛋白超高效液相色谱法 (UPLC) 分离的最佳实验条件, 为孜然芹种子醇溶蛋白分离分析建立一种有效的方法;然后对比研究10个品种贮藏蛋白的色谱图, 评价使用这种方法作为品种鉴定手段的可能性。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料见表1。
1.2 种子蛋白提取
单粒种子研磨15 min, 加入0.5 mL的70% (v/v) 甲醇溶液浸泡2 h[3]。样品继续研磨10 min后, 12000 r/min离心10 min, 通过0.45μm孔径的滤膜后进样上柱分析。
1.3 反相高效液相色谱
色谱分析选用Waters Acquity Ultra performance LC分析系统, 溶剂输送选用Waters高压泵, 自动进样。Waters Acquity Ultra performance LC TUV紫外检测器210nm检测洗脱蛋白。
2 结果与分析
2.1 色谱分离条件选择:
用含0.10%的三氟乙酸的乙腈和0.05%的三氟乙酸水溶液作为溶剂A和溶剂B, 随时间改变溶剂A和B的浓度梯度变化, 来优化色谱分离条件。结果, 使用Waters Acquity UPLC BEH C18粒径1.7μm的反相色谱柱 (2.1×50 mm) , 溶剂A以10%～35%的流速梯度、0.30 mL/min的流速洗脱19 min, 孜然芹种子主要贮藏蛋白在此条件下能够得到分离。
2.2 色谱柱温度对分离结果的影响
由色谱理论可知, 在一定范围内, 随着温度的升高分离效率将逐渐提高, 但温度太高会缩短色谱柱寿命, 使蛋白质变性。为确立温度对UPLC分离孜然芹种子醇溶蛋白的影响, 本试验设计40℃、50℃、55℃三个对比温度, 测定结果见图1。
由图1可以看出, 随着温度的升高特征峰出现的越早, 但总的峰数没有随着温度的升高而发生变化。结合仪器的使用情况, 我们认为40℃柱温最好。
2.3 洗脱时间对分离效果的影响
洗脱时间是影响色谱分离的主要因素之一。前人研究HPLC所用的洗脱时间在40～60 min之间, 而超高效液相色谱 (UPLC) 较HPLC效率高, 为明确洗脱时间对色谱分离的影响, 本试验设计40 min进行试验。从试验结果 (见图2) 来看, 在20 min以后基本没有较明显的特征峰出现。经过重复试验, 我们选择20 min洗脱时间为试验的优选条件。
2.4 不同品种间UPLC色谱图
由图3可以看出, 10个孜然芹品种的醇溶蛋白蛋白洗脱峰顺序较相似, 无显著的特征峰, 只是在含量上有些差别, 不能说明孜然芹品种间的纯度的差异;但是, 小茴香的色谱图与孜然芹有很大差异, 可以很容易把它与孜然芹种子区分开来。
3 结果与讨论
(1) 孜然芹种子醇溶蛋白UPLC分析技术受孜然芹及近缘种测定对象的影响, UPLC分析孜然芹醇溶蛋白的标准方法必须根据实际情况进行反复试验才能确定。本研究结果表:明流速0.3 mL/min、柱温40℃下, 流动相A液在16 min内由10%升至35%, 通过210 nm波长检测紫外吸收为孜然种子醇溶蛋白UPLC分离的最佳条件。
(2) UPLC技术分析孜然芹种子醇溶蛋白与A-PAGE相比, 具有如下优点: (1) 试验速度快, 试验周期短, 一个样品只需20 min。 (2) 试验条件稳定, 易于控制重复性高。 (3) 图谱清晰, 数据分析准确可靠, 易于比较。 (4) 能实现自动化控制, 节省人力。UPLC技术的分辨率和定量性优于单向电泳, 这样就有可能对某些用单向电泳不能鉴定的育种系谱相近的品种进行鉴定。
(3) UPLC分析中, 温度是最重要的影响因素。不同色谱柱的性能指标有差异, 在实际应用中必须因地制宜, 结合蛋白质的特性确定最适温度。洗脱时间对实验效率有一定的影响, 根据孜然芹及近缘种的倍性及组成差异, 进行相应的改进, 从而缩短实验时间, 节省成本, 提高工作效率。
(4) 由于10个孜然芹品种的醇溶蛋白蛋白各组分疏水性相近, 在该方法中没有完全分开, 洗脱峰顺序较相似, 无显著的特征峰, 只是在含量上有些差别, 不能说明孜然芹品种间的差异。但是, 小茴香的色谱图与孜然芹有很大差异, 在今后研究中还应继续研究其他提取蛋白的色谱图, 找出品种间的有显著差异的洗脱峰。
参考文献
[1]晏月明, 刘保国, 杨长寿.反相高效液相色谱在作物品种鉴定中的应用[J].中国农学通报, 1993, (9) 3:41~44.
[2]赵龙刚, 宋希云, 史雪辉等.小麦胚乳醇溶蛋白反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 分离方法的建立[J].现代仪器, 2006, (06) :78～80.
醇溶蛋白 篇4
然而现有的溶解度法对麦醇溶蛋白提取条件的研究还不够完善,本试验利用响应面法,优化了提取参数和提取条件,提高了溶解度法提取麦醇溶蛋白的得率。
1 材料与方法
1.1 原料与主要试剂
谷朊粉:苏州海鸥淀粉制品有限公司;α-淀粉酶,北京奥博星生物技术有限责任公司;乙醇(分析纯),天津市天力化学试剂有限公司;异丙醇(分析纯),天津市瑞金特化学品有限公司。
1.2 主要仪器
UV-2000紫外可见分光光度计,尤尼科(上海)仪器有限公司;HJ-4四联恒温磁力搅拌器,金坛市华峰仪器有限公司;离心机5810R,德国eppendorf。
1.3 试验方法
1.3.1 谷朊粉基本成分分析
粗蛋白测定:微量凯氏定氮法(CB 5511-1985),谷朊粉的粗蛋白含量约为68%。
1.3.2 溶解度法分离谷朊粉中醇溶蛋白的工艺
谷脱粉→加入醇溶剂→磁力搅拌→4 000r/min离心20min→上清液旋转蒸发→冷冻干燥→醇溶蛋白
2 结果与讨论
2.1 梯度试验
以35%乙醇+35%异丙醇的混合醇溶液20ml为溶剂,分别加入0.5g、1g、2g、3g和4g的谷朊粉,15℃下,磁力搅拌5h后,4 000r/min离心20min测定上清液蛋白质(醇溶蛋白)浓度,结果如图1所示。
由图1可知:随着谷朊粉添加量的升高,提取的醇溶蛋白浓度有显著提高。在谷朊粉添加量为3g之后,提取的醇溶蛋白浓度基本不变,所以选择料水比为3:20应该最合适。
2.2 提取时间与醇溶蛋白溶解度的关系
分别以乙醇和异丙醇为溶剂,料水比3:20,20℃下,磁力搅拌1、2、3、4、5、6和7h后,4 000r/min离心20min测定上清液蛋白质(醇溶蛋白)浓度,结果如图2所示。
由图2可知:在前3h内,随着提取时间的增加,提取的醇溶蛋白浓度有显著提高。当溶剂为乙醇时,在提取3h后醇溶蛋白浓度基本不变,当溶剂为异丙醇时,在提取4h后醇溶蛋白浓度基本不变。
2.3 提取温度与醇溶蛋白溶解度的关系
分别以乙醇和异丙醇为溶剂,料水比3:20,在20、40和60℃下,磁力搅拌5h后,4 000r/min离心20min测定上清液蛋白质(醇溶蛋白)浓度,结果如图3所示。
由图3可知:随着提取温度的增加,提取的醇溶蛋白浓度有显著提高。
2.4 不同溶剂与醇溶蛋白溶解度的关系
分别以乙醇、异丙醇和乙醇+异丙醇(配比为1:1)为溶剂,料水比3:20,20℃下,磁力搅拌5h后,4 000r/min离心20min测定上清液蛋白质(醇溶蛋白)浓度,结果如图4所示。
由图4可知:随着谷朊粉添加量的升高,提取的醇溶蛋白浓度有显著提高。当溶剂中醇浓度为70%时,提取的醇溶蛋白浓度最高,为55.82g/L。
2.5 不同溶剂配比分醇溶蛋白溶解度的关系
料水比3:20,以乙醇+异丙醇为溶剂,固定溶剂中醇含量为70%,在不同溶剂配比下,60℃磁力搅拌5h后,4 000r/min离心20min测定上清液蛋白质(醇溶蛋白)浓度,结果如图5所示。
由图5可知:当溶剂中醇浓度为70%,乙醇/异丙醇配比为115/25左右时,提取的醇溶蛋白浓度最高。
2.6 响应面试验
在单因素试验的基础上,确定Box-Behnken设计的自变量,以提取的醇溶蛋白的浓度为响应值,进行响应面分析,对提取条件进行优化。响应面试验结果见表1。
对试验数据进行多项式拟合回归,以提取的醇溶蛋白浓度的量Y为因变量,以乙醇含量(A)、温度(B)和搅拌时间(C)为自变量建立回归方程如下:
对回归方程进行方差分析和显著性检验,结果见表2。
由表2可知:A (乙醇含量)、B (温度)和C (搅拌时间)对Y (提取的醇溶蛋白含量)的影响为B>C>A,其中B的P值<0.0001,因此温度的影响是非常显著的;各交互项的P值均大于0.01,因此交互项作用影响不显著,故交互项可以省略,也可以看出各具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系;判定系数r2=0.9577,非常接近1,说明因变量与3个自变量之间的线性关系显著。
图6～图8直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。比较3图可知:提取温度比提取时间和溶剂中乙醇含量对醇溶蛋白的提取量影响更为显著。
2.7 试验复证
在温度为60℃,搅拌时间3.79h,溶剂中乙醇含量为600mL/L、异丙醇含量为100mL/L的条件下,进行验证试验。试验结果为46.541 02±0.8g/L,由此表明试验中所设模型与实际情况相符,回归模型可靠。
3 结论
本试验通过单因素试验、Plackett-Burrman设计及响应面法对溶解度法分离谷朊粉中醇溶蛋白的条件进行优化。分析确定最佳提取条件为温度为60℃,搅拌时间3.79h,溶剂中乙醇含量为600mL/L、异丙醇含量为100mL/L。
摘要：通过单因素试验及响应面法对溶解度法分离谷朊粉中醇溶蛋白的条件进行优化。确定最适温度为60℃,最佳搅拌时间为3.79h,溶剂中乙醇含量为600mL/L、异丙醇含量为100mL/L。在此条件下,提取的醇溶蛋白含量可达47.2588g/L。
关键词：醇溶蛋白,谷朊粉,响应面法
参考文献
[1]河南莲花集团技术开发公司.小麦醇溶蛋白的制备方法及其在黏合??剂中的应用[P].C09J 189/00,02151555,2002.
[2]王昶光.小麦醇溶蛋白载体材料及其肝靶向给药系统的研究[D]. CNKI,2007.
[3]北京大学.小麦醇溶蛋白的蛋白分子微胶囊制备方法[P]. B01J13/06,94100552,1994.
[4]宋义虎,孙少敏,张其斌,等.小麦醇溶蛋白膜拉伸性能研究[A].2005年全国高分子学术论文报告会,2005.
醇溶性、水性油墨,安全环保 篇5
为糖果、乳品、啤酒等
食品类包装提供醇溶性油墨
我国食品软包装种类繁多, 主要以复合包装为主。长期以来, 我国复合包装袋印刷油墨多以苯溶性凹版复合塑料薄膜油墨为主, 在凹印油墨中使用的溶剂一般有丁酮、二甲苯、甲苯、丁醇等, 特别是丁酮, 残留的气味很浓, 由于大量的甲苯释放或残留, 无论对生产环境还是对人体健康都会造成一定的潜在危害。近年来, 随着人们环保安全意识的不断增强, 以及食品包装要求的日益提高, 用户除了对复合包装袋产品的物理机械性能、阻隔性等基本性能提出要求外, 对溶剂残留量的质量控制要求也越来越严格, 部分用户对气味也提出了很高要求。针对这些要求, 英科·卡乐开发了unitek通用型复合油墨, 可适用于复合包装所涉及的各种承印材料 (PETOPPNYLON) , 总残留量可控制在5毫克以下。该产品通过了FDA物质许可认证, 安全性也得到认可。
除此之外, 英科·卡乐针对啤酒领域, 从2004年开始便着力开发醇溶性铝箔包装和身标的印刷油墨以取代国内惯用的苯类油墨, 并取得了突破性进展, 研发出“可完全碱溶铝箔油墨”等多种高技术含量油墨, 为啤酒包装企业解决了多项技术难题, 产品赢得了众多啤酒包装企业的好评。
针对乳品行业, 英科·卡乐研发了GC系列油墨。GC系列油墨是单组分醇溶性PE表印油墨, 符合乳品等液体灌装的高温灭菌 (UHT) 要求, 适合凹版印刷, 具有优良的溶剂释放性, 低溶剂残留, 拥有优异的抗双氧水、抗化学腐蚀性能。GC系列产品是国内最早研发成功的醇溶性油墨, 可广泛用于牛奶等PE膜表面印刷。目前, 伊利、蒙牛等国内著名乳品企业的产品包装均使用了英科·卡乐的GC型油墨产品。
推出水性油墨
广泛用于食品包装
如今水性油墨在国外应用已非常广泛。国外的水性油墨除了具有优良环保性外, 其本身性能也非常优越:墨色稳定、亮度高、着色力强、不腐蚀版材, 印后附着力强, 四色套印及专色印刷均可使用。
国内水性油墨主要应用于柔版纸张印刷, 存在干燥慢、光泽差、不耐水、印不实等缺点, 现在已得到了明显的改善, 产品也逐渐成熟;但目前国内水性油墨在塑料材质上依然没有得到更好的应用。之所以出现这种状况, 我们认为主要是观念上的认知差别, 国外首要要求的是油墨的安全性, 而国内首要追求的是价格低廉。当然, 随着国内消费者对食品安全的日益关注, 印刷油墨的环保安全问题将得到更多印刷企业、食品企业的重视。随着终端客户在包装上的不断创新, 大量新材料的采用, 以及客户对包装特殊需求的增多, 水性油墨定将得到更广泛的应用。
英科·卡乐在水性油墨方面的开发应用已经有20多年的历史, 有着丰富的研发经验积累及客户应用经验。英科·卡乐主要集中力量开发中高档柔版印刷水性油墨。英科·卡乐开发的ICB纸张系列水性油墨被成功应用于“麦当劳”等与食品密切接触的产品外包装;同时, 还为“利乐包”“屋顶包”专门开发了ICF系列水性油墨, 该产品经过功能延伸, 目前又成功应用于PE、OPP等塑料材质的表面印刷, 在性能方面甚至优于溶剂型油墨。同时, GC系列及其他水性油墨的应用领域也在逐步扩大, 目前已经成功应用于不同塑杯、纸杯盖等包装材料。
如今, 英科·卡乐已成为食品包装的重要油墨供应商, 同时还是中国大陆“麦当劳”指定油墨供应商, 负责供应其在中国大陆、香港、澳门等地的印刷产品。
不同的客户要求各不相同, 但是作为国际、国内的知名企业, 他们都有一个共同的需求就是在油墨的使用上坚决使用符合环保要求、满足食品安全要求的印刷油墨。英科·卡乐将有针对性的进行一些在水性油墨性能上的开发调整, 以满足不同客户的个性化需求, 适应国内市场的需要。
注重研发
致力为食品包装提供环保油墨
环保和食品安全是英科·卡乐一直坚持并将继续坚持的企业理念。多年来, 英科·卡乐秉承“遵从环境保护、人身健康和安全第一”的原则, 致力于提供符合国内、国际标准的安全、环保产品的研发和推广。英科·卡乐非常重视在产品创新研发方面的投入, 2008年集团公司共投入500万美元经费, 用于高新技术及其产品的研究、开发, 此项投入占到公司主营业务销售收入的3%, 2009年集团研发经费达到600万美元, 占据销售总收入的4%, 比上年增加1个百分点。自2005年起, 公司已累计申请并得到授权的专利18项。近三年中, 公司用于知识产权的费用已达100多万美元。