体外抗氧化活性

体外抗氧化活性（精选10篇）

体外抗氧化活性 篇1

摘要：目的 研究青蒿水提取物抗氧化活性及物质基础, 为天然抗氧化剂开发利用提供理论依据。方法 采用传统加热回流提取法, 用水作为提取溶剂对青蒿中抗氧化成分进行提取, 并利用溶剂萃取、D101大孔树脂等分离手段对水提取物进行组分划分, 进行DPPH自由基清除活性评价及铁离子还原能力、亚铁离子螯合能力、总酚酸和总黄酮的测定。结果 从青蒿水提取物中制备得到11个组分, 且70%乙醇洗脱液 (S10) 、乙酸乙酯萃取物 (S6) 、大孔树脂20%乙醇洗脱液 (S9) 的抗氧化活性较高, 与其所含的总酚酸和总黄酮密切相关。结论 本研究明确了青蒿中大孔树脂70%乙醇洗脱液 (S10) 、乙酸乙酯萃取物 (S6) 、大孔树脂20%乙醇洗脱液 (S9) 为青蒿水提取物抗氧化活性物质基础, 为今后青蒿资源在天然抗氧化剂的开发和应用奠定基础。

关键词：青蒿,抗氧化活性,DPPH法,总黄酮,总酚酸

随着自由基生物学深入发展, 人们逐渐认识到, 自由基会对人体的产生一定的负面影响, 而适当补充外源性抗氧化剂或给予能促使机体内源性抗氧化物质恢复到一定水平的药物, 可以改善这一状况[1]。抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物 (蛋白质、脂质、糖和DNA) 氧化的物质[2]。目前抗氧化剂依据其来源可分为两大类:化学合成抗氧化剂和天然抗氧化剂。现代研究表明化学合成的抗氧化剂, 如二丁基羟基甲苯 (BHT) 、丁基羟基茴香醚 (BHA) 、没食子酸丙酯 (PG) 和特丁基对苯二酚 (TBHQ) 具有一定的毒性和致癌作用, 其应用范围受到一定的限制, 而天然抗氧化剂因其具有无毒副作用、无残留、无污染、稳定、安全等优点, 符合人们对健康、安全新需求, 而越来越受到人们的关注。天然抗氧化剂的研究在医药学、保健与功能食品、美容养颜护肤等领域均有非常重要的意义[3]。

现代研究表明某些中药具有明显的抗氧化活性, 并与其所含各种各样的天然产物, 如酚酸、黄酮类化合物和丹宁酸等密切相关。近年来, 中药的抗氧化活性受到研究者的关注, 取得了许多研究成果[4,5,6]。因此, 中药资源可作为高效的天然抗氧化剂筛选的一个重要来源。

青蒿 (黄花蒿, Artemisia annua L.) 为菊科蒿属 (Arte misia) 一年生草本植物[7]。味苦, 性寒而芳香, 入肝、胆经。本品苦寒以清热, 芳香而透散, 长于清泄肝胆和血分之热, 可使阴分伏热由阴分透出阳分。常用治暑邪发热、温邪伤阴发热、疟疾寒热、骨蒸劳热以及血分有热的风疹瘙痒等症[8]。

目前对青蒿中抗氧化活性的研究不多, 仅有少量文献对青蒿中水提取物、黄酮类化合物的抗氧化进行报道, 而有关青蒿中的抗氧化活性物质基础的未见报道。本研究拟根据青蒿的传统提取方法, 利用溶剂萃取、D101大孔树脂等分离手段对水提取物进行组分划分, 并进行DPPH自由基清除活性评价, 明确青蒿抗氧化活性组分, 拟为从青蒿筛选天然抗氧化剂提供实验参考依据, 为今后青蒿资源在天然抗氧化剂的开发和应用奠定基础。

1材料与方法

1.1仪器与材料

1.1.1仪器

RE-5205/RE-52A旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂) ;TDL-5-B型台式低速离心机 (湖南星科科学仪器有限公司) ;电热真空干燥箱 (天津市天宇实验仪器有限公司) ;BP121S万分之一天平 (德国赛托利斯公司) ;XW-80A微型漩涡混合仪 (上海沪西仪器厂有限公司) ;KQ-250E型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ;MODEL2-16A高速离心机 (TOMOS) ;202-0型台式干燥箱 (北京市永光明医疗仪器厂) ;多功能微孔板分析仪 (美国Molecular Devices公司) 。

1.1.2 试剂与药材

1.1.2.1试剂

D101型大孔吸附树脂 (天津市海光化工有限公司) ;甲醇, 乙腈为色谱纯 (天津康科德有限公司) ;芦丁, 没食子酸 (中国药品生物制品检定所) ;DPPH (Sigma-aldrich) ;甲酸 (TEDIA Company, USA) 水为超纯水 (Millipone) , 其余试剂均为分析纯。

1.1.2.2药材

青蒿 (江苏康源股份有限公司青蒿基地) 。

1.2 实验方法

1.2.1 青蒿组分的制备

称取青蒿饮片0.5 kg, 置于10 L圆底烧瓶中, 加6 L蒸馏水, 浸泡12 h, 加热回流2 h, 滤过, 剩余残渣加入4 L蒸馏水, 加热回流2 h, 滤过, 合并滤液, 60℃减压浓缩至700 m L, 取50 m L母液作为S1, 剩余母液70%醇沉, 静置12 h。醇沉溶液14 000 r/min, 离心10 min, 得沉淀S2和上清液, 上清液于60℃减压浓缩至400 m L, 取50 m L作为S3。剩余溶液用等体积石油醚萃取, 得石油醚萃取物S4, 取剩余溶液50 m L作为S5, 然后剩余溶液用等体积乙酸乙酯萃取, 得乙酸乙酯萃取物S6, 取剩余溶液50 m L作为S6。过D101大孔树脂, 分别用两个柱体积的蒸馏水, 20%乙醇, 70%乙醇, 95%乙醇进行洗脱, 得S8~S11。将S8~S11置于水浴锅上挥干, 然后放入60℃真空干燥箱中干燥约8 h, 至恒重取出, 称量。5, 然后剩余溶液用等体积乙酸

1.2.2 青蒿组分清除DPPH自由基活性研究

二苯基苦味肼基自由基[DPPH·]是一种稳定的以氮为中心的自由基, 在517 nm波长处有最大吸收。[DPPH·]醇溶液呈紫色, 其浓度与吸光度呈线性关系。在[DPPH·]乙醇溶液中加入样品后, 样品可以与[DPPH·]结合或发生替代, 使[DPPH·]数量减少, 溶液颜色变浅, 表现为:其在517 nm波长处的吸光度不断减小, 直至达到稳定[9]。清除率计算公式为:K=[1- (A1-A2) /Ao]×100%, 其中Ao为空白对照液的吸光度, A1为加入待测液后的吸光度, A2为待测液的本底吸收值。抗氧化剂清除自由基能力采用清除DPPH的半清除率 (IC50值) 表示[10,11]。所需浓度越低, 表明半清除率越高, 抗氧化剂的自由基清除能力越强。本实验用比色法测定青蒿各组分的总体抗氧化能力, 以VC、VE为阳性对照药物, 平行测定3次, 取平均值。

称取适量青蒿组分S1~S11和VC、VE用适宜溶剂溶解配制成1 mg/mL后, 按一定浓度配制后, 分别取400μL放于eppendorf管中, 加入400μL的100μg/mLDPPH, 涡旋30 s, 在室温下放置30 min后, 吸取200μL于96孔板。每个浓度平行制备3份, 于微型多功能酶标仪517 nm下测定, VC和VE作为阳性对照[12], 并以VC、VE的浓度 (X) 为横坐标, 抑制率 (Y) 为纵坐标, 绘制VC、VE的标准曲线, 计算回归方程, 利用回归方程求出供试品溶液中折合VC、VE的浓度 (总抗氧化活性) , 并计算青蒿组分中总抗氧化活性的含量。每个样品平行制备3份, 每次平行测定3个复孔, 取平均值。其中总抗氧化活性的含量包括相对总抗氧化活性的含量和绝对总抗氧化活性的含量。

青蒿组分抗氧化剂含量 (mg/g) =CD/W, 其中W为青蒿组分S1~S11的重量 (g) , C为供试品溶液中折合VC、VE的浓度 (mg/m L) , D为稀释因素。青蒿组分等价于原药材的抗氧化剂总量 (mg/kg) =CDE/W, 其中W为青蒿组分S1~S11的重量 (kg) , C为供试品溶液中折合VC、VE的浓度 (mg/m L) , D为稀释因素, E为产率。

1.2.3 青蒿组分铁离子还原能力评价

精密称取各样品1 mg, 加入甲醇和水混合溶剂溶解, 分别取0.2 m L样品溶液, 加入1 m L磷酸盐缓冲液 (0.2 mol/L, p H 6.6) , 和1 m L铁氰化钾 (1%, W/V) , 混合均匀后在50℃水浴放置20 min, 加入1 m L三氯乙酸 (10%, W/V) 混合后, 取上清液1 m L加入1 m L水, 加入0.2 m L的氯化铁溶液 (0.1%, W/V) , 30 min后, 在700 nm下紫外检测, 以没食子酸值计算。

1.2.4 青蒿组分亚铁离子螯合能力评价

1 m L Fe SO4 (0.025 mmol/L) 加入不同稀释倍数的样品溶液1 m L, 接着加入1 m L Ferrozine (0.25 mmol/L) , 10 min后在562 nm下紫外检测, 以甲醇-水溶剂代替样品为对照。螯合效率= (1-Asample/Acontrol) ×100, 以EC50 (CEC50) 表达。

1.2.5 青蒿提取物总酚酸和总黄酮的含量测定

1.2.5.1青蒿提取物总酚酸的含量测定

分别精密吸取不同体积的没食子酸对照品溶液, 用甲醇稀释到200、100、50、20、10、5、1μg/mL, 分别取对照品溶液100μL加入500μL FCR (1∶10, V/V) , 涡旋30 s, 加入400μL的Na2CO3 (7.5%, M/V) , 30℃反应90 min后, 吸取200μL于96孔板中。每个浓度平行制备3份, 于微型多功能酶标仪765 nm下测定, 以待测液的本底溶液为空白对照[13]。以对照品的浓度 (X) 为横坐标, 吸光度 (Y) 为纵坐标, 绘制没食子酸的标准曲线, 计算回归方程。

分别取100μL供试品溶液加入500μL FCR (1℃10, V/V) , 涡旋30 s, 接着加入400μL Na2CO3 (7.5%, M/V) , 30℃反应90 min后, 吸取200μL于96孔板中, 每个样品平行制备3份, 每次平行测定3个复孔, 取平均值。按没食子酸标准曲线制作方法测定其吸光度, 利用回归方程求出供试品溶液中折合没食子酸的浓度 (总酚酸) , 并计算青蒿组分中总酚酸的含量。计算公式:总酚酸含量 (%) =CD/W×100%, 其中W为青蒿组分S1~S11的重量 (g) , C为供试品溶液中折合没食子酸的浓度 (mg/mL) , D为稀释因素。

1.2.5.2青蒿提取物总黄酮的含量测定

分别精密吸取不同体积的芦丁对照品溶液, 用甲醇稀释成80、70、60、50、40、30、20、10、5μg/mL。分别取1 mL于eppendorf管中, 加入100μL的NaNO2 (5%) , 静置6 min后, 加入100μL的AlCl3 (10%) , 静置6 min, 然后加入1 L的NaOH (5%) , 混合均匀, 吸取200μL于96孔板中, 每个浓度平行制备3份。用微型多功能酶标仪全波长扫描, 于415 nm下测定, 以待测液的本底溶液为空白对照[14]。以对照品的浓度 (X) 为横坐标, 吸光度 (Y) 为纵坐标, 绘制芦丁的标准曲线, 计算回归方程。

精密称取青蒿组分S1~S11, 用适宜溶剂溶解配制成1 mg/m L (S4, S6组分样品用甲醇溶解, 其余组分样品用40%甲醇溶解) , 作为供试品溶液。分别取500μL, 加入50μL的Na NO2 (5%) , 静置6 min后, 加入50μL的Al Cl3 (10%) , 静置6 min, 然后加入500μL的Na OH (5%) , 混合均匀, 吸取200μL于96孔板中, 每个样品平行制备3份, 每次平行测定3个复孔, 取平均值。按芦丁标准曲线制作方法测定其吸光度, 利用回归方程求出供试品溶液中折合芦丁的浓度 (总黄酮) , 并计算青蒿组分中总黄酮的含量。计算公式:总黄酮含量 (%) =CD/W×100%, 其中W为青蒿组分S1~S11的重量 (g) , C为供试品溶液中折合黄酮的浓度 (mg/m L) , D为稀释因素。

2 结果

2.1 青蒿组分的得率

通过提取分离所得的S1~S11 个组分的产率分别为20.16% 、4.12% 、15.33% 、0.14% 、14.00% 、1.25%, 12.29%、8.51% 1.02%、1.96%和0.02%。

2.2 青蒿组分抗氧化活性比较研究

2.2.1 青蒿组分清除DPPH自由基的能力比较研究

采用DPPH法对青蒿不同组分进行了测定, 结果显示各组分均具有一定的抗氧化作用。以VC和VE作为阳性对照, IC50为指标, 对不同青蒿组分的抗氧化活性进行比较研究 (表1) 。结果发现:11个组分清除DPPH自由基能力排序为:S10>S6>S9>S1>S3>S2>S11>S7>S5>S8>S4;当以IC50≤100μg/m L为临界值, 所制备的组分S6[ (72.40±1.11) μg/m L]、S9[ (84.85±0.50) μg/m L]和S10[ (58.37±0.85) μg/m L]具有较强的抗氧化活性, 但均低于阳性对照物VC、VE。

注:IC50:半数抑制浓度

2.2.2 青蒿组分抗氧化活性物质含量比较研究

本研究以VC、VE为阳性对照药物, 建立了量效关系曲线, 结果发现在1~13μg/m L、15~45μg/m L范围, VC、VE的浓度与各自抑制率呈良好的线性关系, 回归方程分别为Y=4.525X-6.299 (r=0.996) , Y=1.500X-0.137 (r=0.999) 。根据各组分的抑制率, 以等价的VC、VE的量为指标, 对其所含抗氧化剂含量进行了测定结果见表2。从表2可知1 g S6、S9和S10提取物分别等价于 (144.92±2.60) 、 (111.32±0.33) 、 (163.91±4.20) mg的VC, 相当于 (515.19±7.83) 、 (389.44±1.00) 和 (580.27±12.70) mg的VE, 因此青蒿组分S6、S9和S10具有较好的抗氧化活性, 可用于进一步天然抗氧化剂筛选。

2.3 青蒿组分铁离子还原能力的评价

不同浓度的青蒿组分铁离子还原能力评价结果见表3, S10、S9 和S6 具有较强的还原能力, 其中组分S10 和S6 的活性优于人工合成的抗氧化剂二丁基羟基甲苯 (BHT) 的活性。

2.4 青蒿组分亚铁离子螯合能力

以VC作为阳性对照, IC50为指标, 对不同青蒿组分的亚铁离子螯合能力进行比较研究 (表4) 。 表4 发现:10 个组分亚铁离子螯合能力排序为:S2>S8>S1>S7>S9>S4>S3>S10>S5>S6>S4;当以IC50≤1000 μg/m L为临界值, 所制备的组分S2、S1 和S8 具有较强的亚铁离子螯合能力, 但均高于阳性对照物Vc。

注:IC50:半数抑制浓度

2.5 青蒿组分抗氧化活性相关物质研究

近年来的研究表明, 植物抗氧化活性与植物中所含酚酸类和黄酮类化合物密切相关, 为了阐明青蒿发挥抗氧化活性物质基础, 本研究选用福林试剂法测定总酚酸含量, 三氯化铝比色法测定总黄酮含量。

2.5.1 总酚酸含量测定

本研究以没食子酸为阳性对照, 建立了没食子酸的标准曲线, 结果表明在1~200 μg/m L范围内与吸光度呈良好的线性关系, 回归方程为y=0.0016x-0.0005 (r=0.999) 。

利用福林试剂法对S1~S11的总酚酸含量进行了测定 (表5) , 结果表明11个组分中中均含有一定量的酚酸, 其中S10[ (90.51±0.02) mg/g]、S6[ (83.47±0.60) mg/g]和S9[ (81.81±0.80) mg/g]的酚酸含量最高, 与其抗氧化活性IC50具有较好的相关性。

2.5.2 总黄酮测定

本研究以芦丁为阳性对照, 建立了芦丁的标准曲线, 结果表明在1~80 μg/m L范围内与吸光度呈良好的线性关系, 回归方程为y=0.0062x-0.0108 (r=0.999) 。 利用三氯化铝比色法对S1~S11 的总黄酮含量进行了测定 (表5) , 结果表明11 个组分中中均含有一定量的黄酮, 其中S10[ (73.72±0.77) mg/g]、S6 [ (53.85 ±0.30) mg/g] 和S9 [ (69.76 ±1.13) mg/g] 的总黄酮含量最高, 并与其抗氧化活性IC50具有较好的相关性。

上述研究表明, 青蒿各组分具有抗氧化活性, 其中组分S10、S6 和S9 抗氧化活性最强, 其发挥抗氧化的物质基础可能是其酚酸和黄酮类化合物。

3 讨论

从青蒿水提取物中制备得到11 个组分, 利用DPPH法、还原能力法与亚铁离子螯合法对青蒿组分的抗氧化活性进行测定, 且使用福林试剂法与三氯化铝比色法对其总酚酸和总黄酮进行了定量研究, 发现了青蒿中70%乙醇大孔树脂洗脱液 (S10) 、乙酸乙酯萃取物 (S6) 、20%乙醇大孔树脂洗脱液 (S9) 具有较强的抗氧化活性。 青蒿不同组分抗氧化能力的强弱与总酚酸和总黄酮的含量有明显相关性, 说明酚酸和黄酮可能是主要的活性物质;青蒿水溶液 (S1) , 青蒿多糖组分 (S2) 和大孔树脂水洗脱物 (S8) 具有较强的亚铁离子螯合能力, 在亚铁离子的螯合能力方面却显著高于其他组分。 本研究制备了青蒿不同标准组分, 结合此多种方法对青蒿组分的抗氧化活性进行了较为全面的评价, 初步阐明了各组分的抗氧化活性, 为青蒿作为天然抗氧化剂资源开发利用提供科学依据。

体外抗氧化活性 篇2

以米渣为原料,通过蛋白酶酶解,并进行膜分离,得到米蛋白短肽.通过对样品蛋白分子量及短肽含量测定可知:米蛋白短肽分子量大部分集中在1 ku下,短肽含量为77.87%;并对米蛋白短肽抗氧化活性测定,结果显示:样品对样品对DPPH・、・O2-及・OH 3种自由基均具有一定清除能力,当米蛋白短肽浓度为10 mg/mL时,清除率分别为62.36%、82.07%、35.41%.

作 者：陈升军 熊华 周侃 黄军 齐金峰 李薇 CHEN Sheng-jun XIONG Hua ZHOU Kan HUANG Jun QI Jin-feng LI Wei 作者单位：陈升军,熊华,黄军,齐金峰,李薇,CHEN Sheng-jun,XIONG Hua,HUANG Jun,QI Jin-feng,LI Wei(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌,330047)

周侃,ZHOU Kan(南昌大学生命科学学院,南昌,330031)

体外抗氧化活性 篇3

摘要：采用水提醇沉法及溶剂萃取法提取山荆子叶，测定不同提取物的总黄酮含量。通过对DPPH自由基、ABTS自由基和超氧阴离子清除作用研究了山荆子叶体外抗氧化活性。结果显示，山荆子叶水提取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水萃取物中的总黄酮含量分别为0.98%、1.62%、4.23%、1.46%和0.313%。体外抗氧化实验结果表明，山荆子叶乙酸乙酯萃取物具有较强的DPPH自由基、ABTS自由基活性以及超氧阴离子清除能力。山荆子叶可以作为天然抗氧化剂，为山荆子的综合利用与开发奠定基础。

关键词：总黄酮；山荆子；抗氧化；DPPH；ABTS

基金项目：吉林化工学院博士科研启动基金（批准号：2016007）

中图分类号： R284.2；R285.5 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.22.033

山荆子（Malus baccata （Linn） Borkh），为蔷薇科（Rosaceae）苹果属多年生木本植物，主要分布于我国东北、华北和西南地区，在蒙古、朝鲜、俄罗斯西伯利亚等地也有分布[1]，吉林省内大部分山区都有分布。随着绿色食品的快速发展，其果实在食品工业中是酿酒和调制纯绿色饮品的原料，多用于加工果脯、蜜饯和清凉饮料等[2]。其叶在我国很多地区可以煮茶用来减肥[3]。目前，国内针对山荆子果实和叶的化学成分及药理作用研究还鲜有报道，其果实中的主要化学成分包括萜类、酯类、烯烃类、多酚类以及黄酮类化合物，同时还含有锰、硒和锌等微量元素[4， 5]。而叶中的主要成分为多酚类和黄酮类化合物[6]。与此同时，现代药理作用研究表明，山荆子果实中的多酚类成分具有对辐射诱导的机体氧化损伤的保护作用[7]，山荆子不同溶剂提取物具有明显的抗氧化活性，且其中乙酸乙酯提取物和丙酮提取物分别对人类子宫癌HeLa细胞和肝癌HepG2细胞增殖具有抑制作用[8]。另外，山荆子叶提取物对脂肪酸合酶具有抑制作用，显示其可能应用于减肥[3]。叶提取物还能够明显的改善糖尿病小鼠血糖和血脂的紊乱[6]，并对CCl4诱导的小鼠肝损伤具有较好的保护作用[9]。本研究对山荆子叶不同溶剂萃取物的总黄酮含量进行测定，对提取物的体外抗氧化活性进行比较，并初步探讨其黄酮含量与体外抗氧化活性的关系，为开发和利用山荆子资源提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

山荆子叶于2015年10月采于长春市郊，经长春中医药大学药学院教授李勇鉴定为蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus）植物山荆子的干燥叶。芦丁标准品：中国药品生物制品鉴定所；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），ABTS 购自美国sigma公司；Vitamin C 中国医药集团上海化学试剂公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、焦性没食子酸、过硫酸钾、硫酸亚铁等药品均为分析纯试剂购自国药集团化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SpectraMax Plus384型酶标仪。美国Molecular Devices公司；RE-3000型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；KQ-118型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHB-ⅢA型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；FA2004N型分析天平，上海精密科学股份有限公司；HH-S型恒温水浴锅，江苏省金坛市正基仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1提取阶段 精确称取50克干燥后山荆子阴干叶，剪碎，置于1000 毫升圆底烧瓶中，加入500毫升蒸馏水，浸泡过夜，加热回流2次，每次2小时。提取液减压浓缩至400毫升。加入95%乙醇至醇浓度为80%，静置过夜，抽滤，上清液减压浓缩至体积为400毫升，然后依次将提取液分次用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取各萃取2次，不同溶剂萃取液减压浓缩，干燥后得浸膏，浸膏质量分别为：氯仿部分376.24毫克，乙酸乙酯部分34.31毫克，正丁醇437.79毫克，水提液1232.37毫克。

1.3.2 总黄酮含量测定 总黄酮含量测定方法参照胡卫成等的方法制作芦丁标准曲线。精密配制0.2 毫克/毫升对照品芦丁的标准液，精密吸取芦丁对照品溶液0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0毫升分别置于10毫升容量瓶中，然后加入5% NaNO2溶液0.3毫升，摇匀，放置6分钟，加入10 %Al（NO3）3溶液0.3毫升，摇匀，放置6分钟，加入4 % NaOH溶液4.0 毫升，最后加入80 %乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15分钟。以80%乙醇溶液为空白对照，用紫外分光光度法于515纳米波长处测定上述标准溶液吸光度，制作标准曲线。计算总黄酮含量。山荆子叶提取液和不同溶剂萃取物按上述方法进行实验，与515纳米波长处测定吸光度，计算总黄酮含量。

1.3.3抗氧化活性的测定

1.3.3.1 清除DPPH自由基活性实验 DPPH用甲醇溶解配制成0.16毫摩尔/升DPPH甲醇溶液。取不同浓度的样品甲醇溶液和Vc甲醇溶液100微升分别加入96孔板并加入100微升的DPPH溶液，空白用甲醇代替样品溶液。于波长517纳米下测定其吸光度。每份样品平行操作3次。

清除率（%）=[A空白-A样品]/A空白×100

提取物的半数抑制率用IC50值表示

1.3.3.2清除ABTS自由基活性的测定ABTS阳离子自由基的产生是通过ABTS原液与过硫酸钾在室温黑暗中反应12～16 小时完成，在供氢抗氧化剂存在的情况下，ABTS+自由基会减少。将5毫升，7 毫摩尔/升ABTS+和88 微升140 毫摩尔/升的过硫酸钾（终浓度）混合，在室温避光条件下静止过夜，将生成的ABTS+工作液用水稀释20～40倍，使其在734 微升波长下的吸光度为0.7±0.02，即得到ABTS+工作液。取不同浓度的山荆子样品溶液和Vc甲醇溶液10 微升放入96孔板，并加入190 微升的ABTS+工作液，空白用甲醇代替样品溶液。室温避光放置6分钟，于波长734纳米下测定其吸光度。每份样品平行操作3次。

计算公式为清除率（%）=[A空白-A样品]/A空白×100

提取物半数抑制浓度用IC50值表示

1.3.3.3超氧阴离子清除实验 稍作超氧阴离子清除实验反应体系包括：200微升的50 毫摩尔/升Tris-HCl缓冲溶液，20 微升不同浓度的山荆子样品溶液或Vc溶液，20 微升的25 毫摩尔/升邻苯三酚溶液，混合后立即放入酶标仪中，连续测定4分钟，以吸光度变化率计算样品对超氧阴离子的清除率。

2结果与讨论

2.1总黄酮含量

以吸光度A为纵坐标，芦丁对照品溶液的浓度C为横坐标，进行直线回归，制备标准曲线，回归方程为A=13.07C-0.0075，R2=0.9993，结果表明芦丁在0.0103～0.0824毫克/毫升浓度范围内呈良好的线性关系。山荆子的总水提取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物的总黄酮含量分别为生药材的0.98%、1.62%、4.23%、1.46%和0.31%。实验结果表明，山荆子乙酸乙酯萃取物的总黄酮含量最高，其次是氯仿提取物。

2.2山荆子叶的不同提取物对DPPH自由基的清除能力

由图1可知，山荆子叶不同提取物在测试浓度范围内对DPPH自由基均具有一定的清除作用，且其清除作用与浓度呈现剂量依赖关系，其中乙酸乙酯萃取物对DPPH自由基清除作用最强，在浓度为0.1毫克/毫升和0.2毫克/毫升时，对DPPH自由基的清除率分别为76.2%和83.6%。其次为正丁醇萃取物，其DPPH清除作用仅次于乙酸乙酯提取物。而其他提取物也显示了不同程度的DPPH清除活性。结果证明，山荆子叶具有较强的DPPH自由基清除作用。

2.3山荆子叶的不同提取物对ABTS自由基的清除能力

山荆子叶不同提取物对ABTS清除作用如图2所示，在实验浓度范围内，山荆子叶不同提取物都显示了一定的ABTS清除作用，且其清除作用随着样品浓度增大而增加。其中以乙酸乙酯萃取物的ABTS自由基清除率最高，当其浓度达到0.200毫克/毫升时，ABTS自由基清除率达到最高，最高值为77.1 %，表明ABTS自由基基本被清除。而在此浓度下，正丁醇层的ABTS清除率仅次于乙酸乙酯层，清除率为72.7%。结果证明，总黄酮含量较高的乙酸乙酯萃取物能够较好的清除ABTS。

2.4山荆子叶不同提取物对超氧阴离子自由基清除能力

由图3可知，山荆子叶不同提取物对超氧阴离子自由基的清除能力呈浓度依赖关系，而其中乙酸乙酯萃取物对超氧阴离子自由基的清除能力明显高于其他提取物，当浓度为2.4 毫克/毫升时，其清除率达到40.3%，相同浓度下，其他提取物的清除率均低于25%。

3 结论

黄酮类化合物是广泛存在于植物界中的一类天然多酚类成分，具有广谱的药理作用，近年来已经成为国内外植物药的开发热点。本实验采用水提醇沉法提取了山荆子阴干叶，并进一步用不同溶剂进行萃取，其中各萃取物总黄酮含量测定结果显示乙酸乙酯萃取物的总黄酮含量最高，其次为氯仿提取物和正丁醇萃取物，而水提取物和水萃取物含量最低。

山荆子叶不同提取物抗氧化活性研究表明，乙酸乙酯萃取物对DPPH、ABTS和超氧阴离子的清除作用明显高于其他提取物，结合其含量测定结果，其抗氧活作用与黄酮类物质含量相关。与此同时，正丁醇萃取物的抗氧化活性较氯仿萃取物和水萃取物的作用强，可能由于山荆子叶中还含有其他多酚类物质，而多酚类物质同样是具有抗氧化活性，因此正丁醇萃取物的抗氧化活性可能与多酚类物质有关。本研究结果表明，山荆子叶是一种潜在的天然抗氧化剂，具有广阔的开发和利用前景。

参考文献

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作者简介：杨秀东，博士，吉林化工学院化学与制药工程学院，讲师，研究方向：天然产物及其生物活性研究。

柳树乙醇提取物体外抗氧化活性 篇4

关键词：柳树,羟基自由基,超氧阴离子自由基,抗氧化

柳树系杨柳科,全世界约有350种。我国约有200种,分布在各省,作为绿化树木在我国广泛栽培。在我国中药学理论中,其性寒、味苦、无毒,具有清热、透疹、利尿解毒功能。据《神农本草经》介绍,其叶、枝、花、絮、根等均可入药,民间广泛用于治疗疮毒、脚气以及其他炎症性疾病。

国内外对柳树在医药等方面的作用进行了大量研究,并从中分离出了黄酮、萜类、甾醇、水杨苷、碘、鞣质、邻苯二酚等化学物质[1],证明它具有降血脂[2]、降血糖[3]、抗氧化[4]、抗菌和抑制肿瘤细胞等作用。本研究以柳树为实验材料,采用化学模型观察它对羟基自由基和超氧自由基的清除作用,为进一步合理开发柳树抗氧化保健品提供理论依据。

1 材料与仪器

材料:柳树茎和叶采自河南科技学院校园内。实验试剂:95%乙醇、FeSO4·7H2O2、水杨酸、H2O2、邻苯三酚、盐酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等均为国产分析纯。实验仪器:F160型植物粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)、22PC可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)、752N紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、VIC—212电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、 SHZ—C型循环水式多用真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)、RE—52旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

2 实验方法

2.1 柳树乙醇提取物的制备

分别取粉碎后的柳树茎和柳树叶干粉各5g,用150ml的95%乙醇室温冷浸提取12h,重复3次,合并提取液,旋转蒸发浓缩后得乙醇总提取物;再用95%乙醇配成浓度分别为3.125 mg/ml、6.25 mg/ml、12.5 mg/ml、25 mg/ml、50 mg/ml的乙醇提取液,置于4℃冰箱中保藏备用。

2.2 超氧自由基(O2·-)清除率测定

采用邻苯三酚自氧化法测定[5,6,7]。取50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2)4.5ml,样品管加入0.5ml不同浓度的样品溶液,对照管不加样液,置25 ℃水浴中保温20min;再加入0.1ml的6mmol/L邻苯三酚溶液,用双蒸水补足体积,反应3min,在325nm处每隔30s记录一次吸光度,测量时间5min,每个试样做3个平行,取平均值,按下式计算O2·-清除率。

清除率(%)=[(△A对照/△t对照-△A样品/△t样品) /(△A对照/△t对照)]×100。式中,△A对照/△t对照为邻苯三酚自氧化反应速率,△A样品/△t样品为加入样品溶液后的邻苯三酚自氧化反应速率。

2.3 羟基自由基(·OH)清除率测定[8,9,10]

利用H2O2与Fe2+混合产生·OH,在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质,该物质在510nm下有最大吸收。反应体系中分别含6mmol/L的FeSO41ml、6mmol/L的水杨酸—乙醇溶液1ml、不同浓度的样品溶液1ml,最后加0.1%的H2O21ml启动反应,37 ℃反应0.5h,以蒸馏水作为参比,510nm下测定吸光度。每个试样做3个平行,取平均值,按下式计算清除率。

清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100。式中,A0为空白对照液吸光度,Ax为样品溶液吸光度,Ax0为不加显色剂H2O2样品溶液本底的吸光度。

3 结果与分析

3.1 柳树乙醇提取物对O2·-的抑制作用

从图1可见,柳树茎、叶乙醇提取物在3.125—50 mg/ml浓度范围内,随着浓度升高其清除作用增大;当浓度达到50mg/ml时,柳树茎提取物的清除率为75.62%,柳叶提取物的清除率为88.53%。说明柳树乙醇提取物对体外具有清除自由基的作用。总的来说,柳叶提取物清除自由基的效果好于柳茎提取物。

3.2 柳树乙醇提取物对·OH的清除作用

从图2可见,柳茎提取物清除羟基自由基的能力随着其浓度的增加而逐渐增强。当浓度为25mg/ml时,其清除率为60.63%;而柳叶提取物在浓度为3.125—25 mg/ml间的变化梯度不明显,没有表现出很好的清除效果。当浓度超过25mg/ml时,其清除效果增加非常明显;当浓度达到50mg/ml时,对羟基自由基的清除率为50.49%,说明柳树乙醇提取物对体外具有清除羟基自由基的作用。

4 结论

本研究应用化学模拟体系研究了柳树乙醇提取物对羟基自由基的清除作用和对邻苯三酚自氧化产生的活性氧自由基的抑制作用。结果表明,柳树茎、叶乙醇提取物在3.125—50mg/ml浓度范围内具有清除超氧自由基的作用。随着浓度升高,其清除作用增大,同时对羟基自由基也具有良好的抑制作用。只是柳叶提取物在低浓度范围内的清除活性不明显,表明柳树乙醇提取物体对外具有良好的抗氧化作用。本研究为柳树抗氧化药物的开发提供了一定的理论依据。

参考文献

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体外抗氧化活性 篇5

关键词：瘦柄红石蕊；Biruloquinone；BACE抑制活性

中图分类号：R96 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-06-28-1

瘦柄红石蕊（Cladonia macilenta Hoffm.）是地衣门（Lichenes）、子囊衣纲（Ascolichens）、石蕊科（Cladoniaceae）、石蕊属（Cladonia）的一种朽木生地衣。据报道，罗姮[1]等首次从C. Macilenta中分离出一种自然界罕见的菲醌化合物biruloquinone。该类化合物已被发现具有多种重要的活性，如丙肝肝炎病毒（HCV）蛋白酶抑制剂活性、CD45抑制剂活性等[2]，但对其BACE抑制剂活性研究未见报道。在阿尔茨海默病（AD）的发病机制中，β分泌酶（BACE1）是产生淀粉样β蛋白（Aβ）的关键分子[3]，BACE1抑制剂的研发在AD治疗方面已成为社会及医药工业界关注的热点之一[4]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试菌株：瘦柄红石蕊采集于云南省，地衣标本存放于昆明植物研究所标本馆（CH050136），地衣体经内生真菌分离得到的紫色C.macilenta LFF保存于韩国地衣资源银行（KOLABIC），国立顺天大学。

试剂药品：β-分泌酶（BACE）抑制剂筛选分析试剂盒（欣博盛生物科技有限公司），其余化学试剂均为国产分析纯。

主要仪器：旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂），Synergy HT多功能微孔板酶标检测仪（美国Bio Tek公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 Biruloquinone的提取和分离 将地衣型真菌瘦柄红石蕊的菌丝体接种于PDB培养基中（5瓶×300毫升/1000毫升三角瓶），15℃、150转/分避光培养30天（发酵液呈深紫色），将全部1.5L发酵液，用乙酸乙酯等体积萃取24小时。将有机层通过Whatman No.1定性滤纸除去菌丝体。重复两次该过程，并将提取液合并，40℃真空浓缩至500毫升。将浓缩的提取物过硅胶柱（230～400目，3.5×80厘米）纯化，用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（90∶20∶2，v/v，4升）洗脱，得到暗紫色组分（980毫升），将该组分集中在真空30℃浓缩，获得110mg biruloquinone固体粗提物。然后将粗提物用氯仿-甲醇重结晶法纯化（1：1，v/v），得到35mg暗紫色的biruloquinone晶体。

1.2.2 Biruloquinone的体外BACE抑制实验 样品准备：将biruloquinone配成6.25，12.5，25，50，75，100微克/毫升的质量浓度。BACE酶抑制率的测定：（1）向背景值检测孔加95微升检测缓冲液和2.5微升 80%乙醇溶液；（2）向空白对照孔加92.5微升检测缓冲液，2.5微升 80%乙醇和2.5微升 BACE；（3）向样品检测孔分别加95微升检测缓冲液，2.5微升不同浓度的biruloquinone和2.5微升 BACE；（4）向所有检测孔加2.5微升酶作用底物（10微米），轻轻震荡混匀，室温孵育40 分；（5）使用酶标仪以激发光（excitation，ex）340nm-发射光（emission，em）500nm检测荧光强度；（6）每个检测孔3个重复，根据以下公式计算平均抑制率：

抑制率I（%）=[（A2-A3）/A3-A1]×100%

其中：A1为缓冲液背景值；A2为抑制前酶活性；A3为抑制后剩余酶活性。

2 结果与讨论

Biruloquinone体外BACE抑制活性：本实验采用重组人BACE-1，荧光底物含有一个强荧光7-甲氧基香豆素基团，BACE能切割荧光基团和猝灭基团之间的肽酶活性，使荧光增强。因此可以根据荧光的变化值来判断样品对BACE的抑制活性。从图1可知，biruloquinone对BACE的抑制与浓度正相关，抑制率随浓度增加而迅速提高，对酶活抑制50%的浓度（IC50）为62.3微克/毫升（191微米）。在最大浓度为100微克/毫升时，抑制率达68.36%，由此可知，biruloquinone具有较强的BACE抑制活性。

图1 Biruloquinone对BACE抑制作用曲线

3 结语

Biruloquinone具有较强的BACE抑制剂活性，在最大浓度为100微克/毫升时，清除率可达68.36%（IC50=62.3微克/毫升）。由此可见，biruloquinone具有一定的治疗AD的能力，这种特性为将瘦柄红石蕊的次生代谢产物biruloquinone开发成为多靶点的抗AD的天然药物提供科学依据。

参考文献

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体外抗氧化活性 篇6

目前,进行抗氧化活性筛选的方法有多种,主要有三类方法:体外抗氧化模型、细胞损伤模型和体内抗氧化模型。体外抗氧化模型相对简单易操作,测定体外抗氧化活性的方法有很多,但Frankel等[3]指出,采用一种方法来评价具有多种功能的食品药品或生物抗氧化剂的抗氧化活性是不合理的,他们认为理想的测定方案应该包括:①选择合适的反应底物;②测定不同的氧化条件;③检测起始阶段以及二次氧化产品;④比较同一摩尔浓度活性物质的抗氧化能力;⑤在氧化反应诱导期开始定量计算百分抑制率,或者氢化氧化物形成率或降解率,或者IC50(获得50%的抑制率时的抗氧化浓度)。依照上诉原则选择适合实验样品的体外抗氧化活性分析方法是必要的,本文主要阐述体外抗氧化模型分析方法及研究进展。

1 清除自由基法

1.1 DPPH法

二苯代苦味酰基自由基DPPH·是一种在有机溶剂中较稳定的有机氮自由基,其结构中含有3个苯环,1个氮原子上有1个孤对电子,深紫色,在517 nm有强吸收[4]。有自由基清除剂存在时,DPPH·的单电子被配对而使其颜色变成浅黄色,电子自旋共振法和分光光度法可用来定量分析该变化。在最大吸收波长处的吸光度最小,而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学剂量关系。因此,在此波长处的吸收可用于检测自由基的清除情况,从而评价实验样品的抗氧化能力。

DPPH法简单、快捷,操作简便,重现性好,是检测植物样品抗氧化活性时使用最广泛的分析方法之一。李丽等[5]采用DPPH法测定车前草80%乙醇提取物以及从中分离得到的3个苯乙醇苷单体化合物,根据EC50大小判断清除自由基的能力大小,结果表明清除自由基能力:麦角甾苷>异麦角甾苷>Plantamajoside>车前草粗提物;胡博路等[6]采用DPPH法测定30种中草药乙醇提取液中的抗氧化活性,结果表明五倍子、诃子、大黄、槐花米等9种中药具有很强的抗氧化活性;庞明等[7]采用DPPH法对丹参须根乙醇提取物各萃取物进行自由基清除实验,结果根据丹参中酚性成分含量与清除自由基IC50值的相关性分析抗氧化性的来源物质是酚性成分,为寻找新型高效抗氧化剂提供了实验支持。虽然DPPH自由基只溶于有机溶剂,不过彭长连等[8]用DPPH法评价植物样品的抗氧化能力,实验证明DPPH法是一种快速、简便、灵敏的评估植物抗氧化能力的可行方法。

1.2 ABTs法

2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid),即2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)法[9]又叫TEAC法,主要应用于生物样品、食品和植物样品的抗氧化活性检测。ABTS与过硫酸钾反应生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS·+,向其中加入被测物质,如果该物质中存在抗氧化成分,则该物质会与ABTS·+发生反应而使反应体系褪色,然后在ABTS·+这种自由基的最大吸光波长下(在650 nm、734 nm、820 nm处有最大吸收) 检测吸光度的变化来反映物质的抗氧化能力。

ABTS法是总抗氧化能力体外测定法,与其他评估总抗氧化性的方法比较,此法快速、简便、与抗氧化剂的生物活性相关性强[10]。不过ABTS法本质上是用TEAC值来表征被测物质清除ABTS·+这种自由基的能力,并不是直接反映被测物质的活力,所以想全面的评估一种物质的抗氧化能力需要结合其他方法进行全方面的测定。袁王俊等[11]用ABTS法对黄连植物不同部位的有机溶剂提取部分进行了抗氧化评价,实验结果表明黄连不同部位的提取物清除自由基的能力随浓度增大而增大;同时采用DPPH、FRAP法对黄连植物不同部位进行抗氧化评价,结果三种方法直接有很好的相关性。

1.3 羟自由基(·OH)清除法

产生羟自由基(·OH)的体系有Fe2+-EDTA-抗坏血酸-H2O2体系、Fe2+-EDTA-H2O2体系、黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-H2O2体系及紫外光照H2O2,光解产生·OH等[12]。

邻二氮菲一Fe2+是一种氧化还原指示剂,其显色变化可反映溶液中氧化还原状态的改变。Fenton体系利用H2O2与Fe2+混合产生-OH,可以使邻二氮菲-Fe2+水溶液氧化为邻二氮菲-Fe3+,从而使邻二氮菲-Fe2+在536 nm处的最大吸收峰消失,据此可以推知系统中-OH数量的变化。李翠芳等[13]就采用这个Fenton体系测定了新疆紫草毛状根提取物的抗氧化活性;吴丹[14]对富硒香菇多糖和富硒平菇多糖进行了羟自由基(·OH)清除实验,实验结果表明在50~250 μg/mL内富硒香菇多糖和富硒平菇多糖均具有一定清除·OH的能力。羟自由基(·OH)清除法也是评价植物样品体外抗氧化活性比较常用的方法。

1.4 清除超氧阴离子自由基法

超氧阴离子自由基是机体内寿命最长的自由基,通常作为自由基链式反应的引发剂,可以经过一系列反应产生其它自由基,进一步对机体造成危害[15]。因此,通常将样品对其的清除能力作为评价抗氧化活性的重要指标。超氧阴离子自由基(O-2·)不能直接诱导生物和食品体系中脂类氧化,它会在金属离子催化下发生Fenton反应产生具有高活性的·OH,因此常用生物和植物样品对超氧阴离子自由基(O-2·)的清除能力来反映其抗氧化活性[16]。

很多植物样品的抗氧化活性评价都用此方法作为其中一个评价方法。但飞君等[17]测定了红毛七中红毛七多糖对O-2·的清除能力,结果红毛七多糖对O-2·的清除率达78.1%。惠和平等[18]研究了红芪中的红芪多糖对超氧阴离子的清除能力,在0.05~5.00 mg/mL浓度范围内对超氧阴离子最大清除率是55.92%。

1.5 TRAP法

TRAP法(Total Peroxyl Radical-trapping Antioxidant Parameter Assay)[19]是总自由基清除法。本方法用Trolox当量(TEAC)来表示。此法采用2,2-偶氮(2-脒基丙烷)盐酸(ABAP)产生过氧化物自由基与血浆中抗氧化剂反应,以测定样品抗氧化能力[16]。

Wayner等[20]将此法进行改进,在ABAP氧化产生自由基前先加入亚油酸,然后再来测定样品抗氧化活性,实验结果:抗坏血酸(维生素C)>硫醇>胆红素>c生育酚(维生素E)。由于ABAP是水溶性人工合成的化合物,脂溶性样品的抗氧化能力检测有一定的误差,使TRAP法的使用存在一定局限性。

1.6 PCL法

PCL方法测定原理是由光化学法生成自由基,并利用化学发光法检测自由基。在试验中使用具有光化学激发作用的光敏剂激发反应分子,使之在紫外灯的作用下以比正常条件下快1 000倍的速度发生氧化反应,迅速产生自由基. 发光氨是一种光致化学发光物质,通过测量反应所生成的光强度来测量自由基的瞬间含量(光强与自由基含量成正比)[21]。” 李丽等[5]采用PCL法测定车前草80%乙醇提取物以及从中分离的到的3个苯乙醇苷单体化合物。实验结果表明:麦角甾苷表现出强抗氧化活性,其次为异麦角甾苷、Plantamajoside和车前草80%乙醇提取物。

1.7 ORAC法

即氧自由基清除能力法,采用藻红蛋白(phycoe-rythrin,PE)作为指示蛋白,Trolox作为标准参照物,以2,2-偶氮(2-脒基丙烷)二盐酸盐、Cu-H2O2体系产生的Fenton反应或者过度金属离子Cu2+分别作为脂过氧化自由基(LOO·)、羟自由基(·OH)和过渡金属离子的发生源,PE在自由基的攻击下,一定波长下的荧光度不断衰减,而具有自由基清除能力的样品可以保护它免受攻击,根据PE荧光强度衰减曲线下的面积变化计算出被测样品的自由基清除能力。采用不同自由基发生物,可以测试样品对不同自由基的清除能力[22]。包华芳等[23]用ORAC法对酶解制备的褐藻胶寡糖的抗氧化活性进行测定,结果显示褐藻胶寡糖具有较强的抗氧化能力。

2 氧化还原法

2.1 FRAP(ferric reducing/antioxidant power assay)法

FRAP用于评价总抗氧化能力的方法。原理[24]实质是基于氧化还原反应的比色法。非酶抗氧化剂可被看成还原剂,把氧化物质还原,从而起到抗氧化的作用。在低pH值的溶液中,Fe3+-三吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine,TPTZ,Sigma) 可被样品中还原物质还原为二价铁形式,呈现出蓝色,并于593 nm处有最大吸收。根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱。凡是氧化还原电位低于Fe3+/Fe2+-TPTZ的半反应均可还原Fe3+-TPTZ,如维生素C、α-生育酚、尿酸、胆红素、清蛋白。

吴青等[25]采用Folin-Ciocalteu方法测定15种中草药不同提取物总酚含量;用DPPH和FRAP法评估了不同提取物的抗氧化活性。结果表明大花紫薇叶的抗氧化活性最高,其甲醇提取物中酚类物质的含量最高。章英等[26]采用液-液萃取法按极性大小对甘薯叶提取物进行萃取分离后用FRAP法检测其总抗氧化活性,实验结果表明不同极性部位显示了差异显著的抗氧化活性。

3 讨 论

植物样品中抗氧化成分在体内外的作用非常复杂,尽管一种抗氧化成分在某一种抗氧化体系中抗氧化效果好,但是在另一种抗氧化体系中效果不一定好,所有应该建立多套方案评估植物样品中抗氧化能力的大小。大多数植物样品的抗氧化活性评价常用方法有DPPH法、羟自由基(·OH)清除法、清除超氧阴离子自由基法、ABTs法和FRAP法等。由于每种体外抗氧化活性评价方法都有一定的局限性和缺点,所以在评价样品体外抗氧化能力时应该尽量多采用合适样品性质和多种方法进行抗氧化性评价,使实验结果更有科学利用价值。因此关于植物样品中体外抗氧化活性的评价研究还有大量工作要进行。

摘要：综述了植物样品中成分的体外抗氧化活性评价方法,采用一种方法来评价具有多种功能多种类型的植物样品的抗氧化活性是不全面的,文中重点介绍了DPPH法、ABTs法、羟自由基(.OH)清除法、清除超氧阴离子自由基法和FRAP法等方法及采用这些方法取得的研究成果,以期为更好评价样品抗氧化活性提供理论依据。

体外抗氧化活性 篇7

地黄 (Rehmanniae Radix) 来源于玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的块根, 是临床最常用中药之一, 临床常以生地、熟地等不同炮制品分开入药。当前地黄的质量标准主要是测定指标性成分毛蕊花糖苷和梓醇的含量, 而地黄的化学成分较为复杂, 地黄苷、地黄多糖、麦角甾苷等等都是它的有效成分, 其指标性成分作为质量控制指标, 难以与药效相关联。由此, 可以体现地黄功效特点的质量控制方法有待建立。DPPH*分光光度法是较为经典的体外抗氧化实验方法之一, 具有简便易行、灵敏可靠、重现性好等特点。本文经条件筛查, 探索采用DPPH*分光光度法测定与评价地黄及其炮制品的抗氧化活性, 并进行了较为系统的方法学考察, 为建立基于生物活性检测的地黄及其炮制品的品质评价与质量控制新方法奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

BS210S型分析天平 (北京赛多丽斯天平有限公司) ;KQ-100型超声仪 (昆山市超声仪器有限公司) ;离心机 (巩义市英峪予华仪器厂, 型号80-2) ;UV1000紫外-可见分光光度计 (上海天美科学仪器有限公司) 。

1.2 试剂与药材

DPPH* (美国Sigma公司) ;无水乙醇 (天津市凯通化学试剂有限公司, 分析纯) ;双蒸水 (新鲜, 自制) ;阳性对照物 (维生素E胶丸, 天然型, 青岛双鲸药业有限公司, 国药准字H20043134批号:001008) ;生地黄, 熟地黄购自郑州市本草国药馆, 经河南中医学院陈随清教授鉴定为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根。

2 方法

2.1 实验原理

DPPH*:分子式:C18H12N5O6, 化学结构为1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2, 2-Diphenyl-1- (2, 4, 6-trinitrophenyl) hydrazyl) 。DPPH*法的测定药物抗氧化活性原理是, DPPH*有单电子, 在517nm处有强吸收, 其乙醇溶液呈深紫色, 当有自由基清除剂存在时, 由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失, 其褪色程度与其接受的电子数成定量关系, 因而可用紫外-可见分光光度计进行快速的定量分析, 用以评价被测药物 (有清除自由基活性) 的抗氧化能力。结果用清除率来表示, 清除率越大抗氧化能力越强[3]。1958年, Blois将其应用于抗氧化剂的筛选研究。之后, 国内外又有很多应用此法研究清除自由基物质的报道[4]。

2.2 DPPH*溶液的制备

精密称取40mg DPPH*, 溶解于480m L无水乙醇, 用500m L量瓶定容。所得DPPH*溶液的浓度为20mmol/m L, 避光保存 (0℃-4℃) 。

2.3 阳性对照药维生素E乙醇溶液的制备

取维生素E胶丸一粒, 剪破胶丸壳, 加入5m L无水乙醇溶解, 所得溶液即为维生素E溶液。

2.4 供试品溶液的制备

2.4.1 生地的提取与配制

精密称取生地黄粉末4g, 共三份, 置于不同的锥形瓶内, 依次加入双蒸水、75%乙醇、无水乙醇。超声提取30min, 用布氏漏斗滤过, 在水浴锅上挥干, 称重, 计算产率。再用相应的溶媒溶解, 配制成溶液置烧杯中, 封口备用。

2.4.2 熟地的提取与配制

精密称取熟地黄3g, 共三份。余下步骤同生地黄溶液的制备。

2.4.3 供试品溶液的配制

将上述配制的生地黄、熟地黄溶液浓度作为原浓度C0, 经预实验, 选择清除率在90%稍偏上的浓度作为最大浓度, 按0.7倍梯度稀释法, 分别配制9个梯度浓度的溶液。

2.5 加样与检测

按表1的加样方法进行加样, 置于具塞试管中, 充分混匀, 阴暗处放置30 min, 用紫外可见分光光度计测定517nm波长处的吸光度.根据下列公式计算对DPPH*的清除率 (P) , 清除率越高抗氧化性越强[5]。

公式 (1) P/%=[1- (Ai-Aj) /Ac]×100%

2.6 数据处理与分析

药物量效关系线性范围的寻找, 用SPSS13.0 for windows软件包, 采用直线回归法求得;样品清除自由基的半数有效剂量值ED50采用Reed Muench法计算。

3 结果

3.1 提取溶媒的选择

将不同溶媒提取物按2.4项下方法配制成多个浓度梯度供试品溶液, 按2.5方法加样与检测, 得到不同浓度样品对DPPH*清除率的结果。由图1可知, 生地水提取液与75%乙醇提取液的抗氧化能力相当, 且强于生地无水乙醇提取液的抗氧化能力。

由图2可知, 熟地黄的水提取液与75%乙醇提取液的抗氧化能力相当, 且二者比无水乙醇提取液抗氧化能力强。

上述分析可知:生地黄、熟地黄的三种提取液的抗氧化能力次序均依次为:水提取液≥75%提取液>维生素E溶液>无水乙醇提取液。

对于提取用溶媒的选择除了考虑对DPPH*有较强的清除率之外, 还要综合考虑反应体系的稳定性及干扰因素如颜色、杂质等, 具体如下: (1) 水提取液的抗氧化能力虽然很强, 但是提取液颜色较深, 用紫外可见分光光度计测定分光度时, 会很可能产生烦扰, 引起误差。且DPPH*溶于乙醇, 不溶于水, 加样时由于溶媒不统一, 可能会出现沉淀, 致使反应体系不稳定而引起误差, 因此水不适合做抗氧化实验的溶媒。 (2) 无水乙醇提取液的颜色虽然最浅, 但是其收率过小, 与水和75%乙醇相比相差10~20倍, 而且其抗氧化能力比较中无水乙醇的抗氧化能力也过小。故次无水乙醇也不是本实验的溶媒的最佳选择。 (3) 75%乙醇提取液的溶液颜色较浅, 而且其抗氧化能力也较高, 与水提取液相当。故75%乙醇为本实验供试品制备优选溶媒。

3.2 线性范围考察

依2.4.3所列方法配制生地黄和熟地黄75%乙醇提取物溶液以及阳性对照药VE溶液, 分别测定其对DPPH*的清除活性, 计算清除率, 绘制量—效关系曲线, 进行线性回归, 确定线性较好的浓度范围作为本实验样品配制浓度范围, 见图3、4、5, 表2。

3.3 通过量效关系曲线比较生地黄、熟地黄的抗氧化活性

75%乙醇为溶媒, 提取生地、熟地后依2.4.3方法配制成一系列梯度浓度溶液, 检测其抗氧化能力并绘制量效关系曲线 (图6) 。

由上图可以直观的比较出:熟地黄的抗氧化能力比生地黄强。

3.4 通过清除自由基半数有效量 (ED50) 比较生地、熟地的抗氧化能力

依据上述测得线性范围内各样品的浓度与清除率对应关系, 采用Reed Muench法计算各自ED50 (表3) , 由结果可知, 其活性次序是:熟地黄75%提取液>生地黄75%提取液>维生素E溶液 (ED50越小表明抗氧化活性越高) 。

3.5 方法重复性考查

按生地黄、熟地黄溶液的制备方法, 同时分别制备五组浓度为2.5mg/m L的75%乙醇生地黄溶液和浓度为1.9mg/m L的75%乙醇熟地黄溶液测定吸光度, 求其清除率, 由表4结果可见, 多次测得结果值变异较小 (RSD<5.0%) , 表明所建立方法有较好的重复性。

4 讨论

现代研究认为, 氧化应激破坏了抗氧化系统, 引起氧化和抗氧化因素的失衡而导致氧化损伤, 氧化应激涉及一系列疾病的病理过程, 可以用抗氧化剂以及多种植物 (或中药) 多糖、不饱和脂肪酸、皂苷等进行预防或干预。从中医角度看一些疾病以及机体的衰老的进程中往往呈现出肾虚症状, 同时这些生理、病理过程又与现代认为的机体氧化损伤亦有密切关系[6,7]。地黄是常用滋阴、补肾中药可用地黄尤其是熟地黄来治疗这些疾病, 因此抗氧化可能是地黄“补益”作用机制之一。

药理研究表明地黄具有体内外抗氧化活性, 但现有测定方法往往涉及实验动物及较复杂的生化检测, 具有步骤繁琐、重复性差、试验成本高等特点, 因此将其用于地黄及其炮制品的品质评价尚有较大局限性。本文用DPPH*法对地黄进行了体外抗氧化活性测定, 测定结果表明, 本法适合于地黄的体外抗氧化活性测定, 所建立方法的重复性较好。采用本法测定熟地的抗氧化活性强于生地, 与传统熟地滋补作用强于生地的认识相一致[8]。相对于指标性化学成分的测定, 抗氧化活性测定结果可直接反应地黄主要功效。可以在本研究基础上, 探讨建立基于生物活性测定的地黄及炮制品的品质评价与质量控制方法。

参考文献

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[7]王学美, 富宏, 刘庚信.肾虚衰老与线粒体DNA氧化损伤关系的研究[J].中医杂志, 2002, 13 (4) :294-296.

陈醋体外抗栓及溶栓活性的研究 篇8

关键词：陈醋,抗栓,溶栓,醋酸活性

醋在我国饮食文化中占有重要地位,它既是传统食品调味品,同时又药食同用。在古代就有很多关于醋的生理功能记载,《本草纲目》中记载:醋能“消肿痛,散水气,杀邪毒,理诸药”;清代王士雄《随息居饮食谱》较深刻地归纳食醋的保健功效是“开胃、养肝、强筋、暖骨、醒酒、消食、下气、辟邪、解鱼蟹鳞介诸毒”。现代研究认为,醋可清除自由基、降血压、防癌、预防骨质疏松,抑菌、杀菌,并对心肌梗塞、动脉硬化、高血压等疾病有良好的疗效。

血栓及相关疾病如脑缺血、高血压、冠心病及动脉粥样硬化等已成为危害人类健康的第一杀手。现在人们普遍认为,膳食中的功能性成分对于人体健康有重要作用。最新研究表明,醋能改善血液的流变性,具有很好的生物调节功能。但是关于醋对于血栓形成的防治作用还没有被人们认识到。

陈醋是我国四大名醋之一,在我国北方非常流行。小杂粮是传统的保健食品,近年来发现小杂粮具有丰富的功能性成分,陈醋主要是以高粱为主的小杂粮为原料经特殊工艺酿造而成的。笔者评价了陈醋的体外抗栓及溶栓活性,并对其中的生理活性物质进行了初步探索。

1 材料与试剂

1.1 试验材料

陈醋(黑苦荞醋、黑燕麦醋、黑高粱醋、黑小麦醋、黑小米醋,山西汾阳紫苑微生物开发利用研究所生产)、牛纤维蛋白原(中国药品生物制品检定所生产,98mg可凝蛋白/支)、凝血酶原(中国药品生物制品检定所生产,每支210Bp)、琼脂糖(电泳用,10g,浙江温州洞头县蓝鸟海藻生物制品厂生产)、圆片超滤平膜(截留分子量为5 000和30 000,上海摩速科学器材有限公司生产)。

1.2 试验仪器

pH计(ZD-2型自动电位滴定仪,上海精密科学仪器有限公司出品)、紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司出品)、FD-1真空冷冻干燥机(北京德天佑科技发展有限公司出品)、TDL-5型离心机(上海安亭科学仪器厂出品)。

2 试验方法

2.1 醋样酸度的测定

参照GB/T 5009.41-1996滴定法:食醋中酸的主要成分是乙酸,含有少量其他有机酸,用NaOH标准溶液[C(NaOH)=0.05moL/L]滴定,以酸度计测定,pH值为8.2时为滴定终点,结果以乙酸含量表示。

2.2 醋样的超滤

将原醋样置于3 000rpm的离心机中,离心25min,取上清液,使其依次通过截留分子量为5 000和30 000孔径的超滤膜,将醋样分为分子量小于5 000、5 000~30 000、大于30 000三部分。分离后的这些样品真空冷冻干燥48h,即得干燥醋样。

2.3 抗栓活性的测定

(1)原醋抗栓活性测定。取醋样5mL(空白对照中不加)于小型试管中,依次加入10U/mL的凝血酶原20mL、Tris-HC缓冲液0.66mL(空白对照中加0.67mL)、0.2%的牛纤维蛋白原溶液0.3mL,迅速摇匀,静置,开始计时。每隔2~3s缓慢倾斜试管1次,记录试管中混合液完全凝固,即液面不动所需的时间。每个醋样做10个重复。用相应酸度的醋酸和经NaOH中和后的醋样重复上述操作。结果用混合液完全凝固所需的时间表示。

(2)超滤醋样不同片段抗栓活性的测定。将不同分子量段(小于5 000、5 000~30 000、大于30 000)的3种干燥醋样(黑燕麦醋、黑苦荞醋、黑高粱醋)加蒸馏水配制成浓度为0.15g/mL的溶液。以20mL配好的醋样代替5mL原醋样重复上述操作。

2.4 纤溶活性的测定

制作纤溶平板:称取适量琼脂糖,加蒸馏水配成0.8%的溶液。将配好的溶液置于80℃水浴锅中加热溶解。完全溶解后,将其冷却至55℃左右,量取16mL倒入直径为9cm的培养皿中,迅速加入81mg/11.6mL牛纤维蛋白原0.8mL,120U/19.2mL凝血酶原0.53mL,摇匀,置于4℃冰箱中放置20min后取出,即制得纤溶平板。

取2个纤溶平板,每个平板中间隔90°打孔,分别加具有与黑小麦醋相同酸度的醋酸(后简称醋酸)和另外3种原醋(空白对照中加经NaOH中和后的醋样)各2mL,置于37℃恒温培养箱中16h后取出,观察是否出现溶纤圈。结果用最大溶纤圈半径表示。

另取2个纤溶平板,置于80℃烘箱,30min后取出,使其自然冷却,重复上述操作,观察能否出现溶纤圈。

3 结果与分析

3.1 醋的酸度

醋样酸度的测定结果见图1。由图1可知,各醋样的酸度依次为黑小麦醋>黑苦荞醋>黑高粱醋>黑燕麦醋>黑小米醋>米醋,其中,酸度最强的是黑小麦醋,其酸度为7.25;米醋作为对照,酸度最弱,为3.7;黑苦荞醋、黑高粱醋、黑燕麦醋和黑小米醋的酸度分别为7.01、6.67、5.21和4.22。可见,陈醋中有机酸含量明显高于一般米醋。

3.2 抗栓活性

原醋抗栓活性的测定结果见图2。由图2可知:试验中所用的所有醋样均能明显地延长凝块形成时间,黑小麦醋作用最强,在10.7min时混合液才完全凝固;米醋作为对照醋样,其作用最弱,需4.4min;空白对照需1.8min;黑苦荞醋、黑高粱醋、黑燕麦醋和黑小米醋中形成凝块所需的时间分别为9.7min、9.2min、8.3min和7.6min。当用相应酸度的醋酸作对照时,其凝固所需的时间与原醋样大致相同;而当用中和后的醋样作对照时,其凝固时间与空白大致相同。

超滤醋样不同片段的抗栓活性测定结果见图3。由图3可知,陈醋中除醋酸外的其他成分亦能明显地延长凝块形成时间,其中,黑苦荞醋由大到小的3个分子量段的醋样完全凝固所需的时间依次为50.8min、31.7min、17.9min;黑高粱醋依次为42.4min、26.7min、15.7min;黑燕麦醋依次为34.0min、21.7min、13.9min;空白完全凝固所需的时间为1.8min。由此可知,对于同种醋样,分子量越大,作用效果越明显;对于同分子量段的不同种醋样,其作用强弱依次为黑苦荞醋>黑高粱醋>黑燕麦醋。

由原醋抗栓活性的测定结果可知,陈醋的抗栓作用明显优于对照米醋;本研究所用的所有醋样的抗栓作用与其酸度顺序一致,统计分析发现,二者之间具有显著相关性(r=0.915 0,P<0.05),考虑到中和后醋样的测定结果,笔者认为,醋酸是陈醋中主要抗栓物质,醋酸的作用可能在于其对凝血酶的抑制活性;而通过干燥醋样的抗栓试验,能很明显地看到除醋酸外,陈醋中还有其他成分有很强的抗栓作用。

3.3 纤溶活性

原醋纤溶活性的测定结果见图4。由图4可知,陈醋有很强的纤溶活性,其中黑小麦醋作用最强,其最大溶纤圈的半径为2.5cm;米醋作为对照醋样,最大溶纤圈的半径为1.5cm;醋酸(即与黑小麦醋相同酸度的醋酸)的最大溶纤圈半径仅为1.0cm;黑苦荞醋、黑高粱醋、黑燕麦醋和黑小米醋的最大溶纤圈半径分别为2.4cm、2.1cm、1.9cm和1.8cm;陈醋所形成的溶纤圈的半径大小依次为黑小麦醋>黑苦荞醋>黑高粱醋>黑燕麦醋>黑小米醋>米醋>醋酸,其作用强度分别相当于0.243U、0.229U、0.187U、0.167U、0.154U、0.114U、0.053U的标准尿激酶活性;中和后的醋样周围均未观察到溶纤圈,同时在加热过的平板中,每种醋样周围亦未出现溶纤圈。

由原醋纤溶活性的测定结果可知,陈醋的纤溶活性明显优于对照米醋;参照原醋样酸度的测定结果可知,陈醋的溶纤活性与其酸度顺序一致,统计分析发现,二者之间亦具有显著相关性(r=0.959 2,P<0.01);对比黑小麦醋和经NaOH调节的与黑小麦醋有相同酸度的醋酸测定结果表明,陈醋中还有其他物质有溶纤活性;根据中和后醋样的对照结果可知,陈醋中起溶纤作用的物质主要是醋酸;根据加热平板的对照结果可进一步推测,醋酸能激活纤溶酶原,进而使其发挥纤溶作用。

4 讨论

机体血管内血栓形成是引发高血压、心肌梗死、脑缺血、动脉粥样硬化等诸多疾病的主要病理因素。无论是氧自由基等化学诱因,还是缺氧等物理诱因,内皮细胞损伤及其凝血与溶栓机能失调是血栓形成的主要机制。血液凝固涉及到一系列复杂的生物化学过程,这一过程有2个主要环节:一是血浆中凝血酶原受到血浆和血小板中一些因子的激活而形成凝血酶;二是血浆中的纤维蛋白原肽A(FA)和B(FB)形成单位(αβγ)2后自发聚合成不稳定的纤维蛋白多聚体,不稳定的纤维蛋白多聚体在Ca2+等的作用下交联成稳定纤维蛋白多聚体,这就是血栓的主要基质。在人类血液纤溶系统中,起中心作用的是纤溶酶及其酶原分子。

香椿皮及臭椿皮体外抑菌活性测定 篇9

1 材料

1.1 椿皮

香椿皮为楝科香椿的茎皮,产地四川眉山;臭椿皮为苦木科臭椿的茎皮,产地四川彭山。均购自成都某中药饮片有限公司。

1.2 菌株

产肠毒素大肠杆菌C83902(O8∶K87,K88)、猪副伤寒沙门氏菌C500、葡萄球菌CAU0183,购自中国兽医药品监察所;大肠杆菌K88分离株由本实验室分离鉴定保存。

1.3 培养基

普通营养肉汤培养基购于青岛高科园某生物技术有限公司,按说明书配制肉汤和琼脂平板,121℃高压灭菌后备用。

2 方法

2.1 椿皮药液制备

称取干燥的香椿皮和臭椿皮各200 g,分别加入10倍水,煮沸提取两次,第1次2 h,第2次1 h,合并煮沸液,离心过滤,取上清液减压浓缩至200 m L(浓度为1 g/mL原药材),各分成两份,每份100 mL。一份于121℃高压灭菌后备用;另一份加入乙醇除去鞣质,加入的乙醇量为80%以上,冷藏,离心,滤除沉淀,再用40%NaOH溶液调pH至8.0,再次放置滤除沉淀,取上清于121℃高压灭菌后备用。

2.2 菌液制备

从保存菌种的斜面上挑取少量接种于10 mL普通营养肉汤中,37℃、150 r/min振荡培养过夜,用灭菌生理盐水稀释,再用麦氏比浊法稀释成浓度为106 CFU/mL备用。

2.3 药敏纸片制备

用打孔器将滤纸打成6 mm的圆形纸片,取适量放入清洁干燥的青霉素空瓶中,经121℃高压灭菌后,放在37℃温箱中干燥备用。将香椿及臭椿药液用无菌生理盐水稀释成1、0.5、0.25、0.125 g·mL-1等浓度梯度,阳性对照为恩诺沙星(将其稀释成100μg·mL-1于灭菌青霉素瓶中),阴性对照为灭菌生理盐水。最后将干燥后的纸片置于各组药液中浸泡4 h,37℃干燥1 h后备用。

2.4 抑菌活性测定

将稀释好的各组菌液用微量加样器加入平板中,每个平板200μL,用U形玻璃管涂布均匀,放置5~10 min。取已制好的干燥药敏片分别贴到平板培养基表面,椿皮做2个重复,标明各种药敏片的名称,于37℃温箱中培养12~24 h。培养完成后观察各组药物的抑菌效果,用游标卡尺测定抑菌圈直径,臭椿皮及香椿皮抑菌圈直径取2片重复药敏纸片的平均值。

3 试验结果

香椿皮水煎液及乙醇处理后的水煎液对大肠杆菌C83902、大肠杆菌K88分离株、沙门氏菌C500、葡萄球菌CAU0183等都有不同程度的抑菌作用,对大肠杆菌C83902、沙门氏菌C500、葡萄球菌CAU0183的最小抑菌浓度为0.125 g·mL-1,对大肠杆菌K88分离株的最小抑菌浓度为0.25 g·mL-1;臭椿皮水煎液及乙醇处理后的水煎液对大肠杆菌C83902、大肠杆菌K88分离株、沙门氏菌C500无抑菌作用,对葡萄球菌CAUO183有一定的抑制作用,最小抑菌浓度为0.25 g·m L-1。详见表1。

4 讨论

据文献报道,臭椿具有抗烟草花叶病毒和抗肿瘤的活性。朱育凤等研究表明,臭椿在体外对绿脓杆菌、大肠杆菌无抑杀作用,对金黄色葡萄球菌只有微弱的抑杀作用,这与本试验的研究结果较一致。香椿根皮含川楝索和洋椿苦素等,其煎剂对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、伤寒杆菌和大肠杆菌等有抑制作用,本试验也证实了香椿皮水煎液对大肠杆菌C83902、大肠杆菌分离株、沙门氏菌及葡萄球菌的广泛抑制作用。而香椿皮水煎液在加入乙醇去除鞣质后的抑菌作用强于未去除鞣质组,原因可能为去除鞣质后其有效成分的纯度和含量增高,增强了抑菌作用。本试验结果表明香椿皮水煎液对大肠杆菌、沙门氏菌和葡萄球菌的体外抑菌效果优于臭椿皮水煎液,因此,香椿皮提取物可以考虑开发为中兽药类抗菌产品。

摘要：采用药敏纸片法分别对香椿皮水煎液及乙醇处理后的水煎液、臭椿皮水煎液及乙醇处理后的水煎液进行了体外抑菌试验,结果显示:香椿皮水煎液及乙醇处理后的水煎液对大肠杆菌C83902、沙门氏菌C500、葡萄球菌CAU0183的最小抑菌浓度为0.125g.mL-1,对大肠杆菌K88分离株的最小抑菌浓度为0.25g.mL-1;臭椿皮水煎液及乙醇处理后的水煎液对大肠杆菌C83902、大肠杆菌K88分离株、沙门氏菌C500无抑菌作用,对葡萄球菌CAU0183有一定的抑制作用,最小抑菌浓度为0.25g.mL-1。

关键词：香椿皮,臭椿皮,体外抑菌,大肠杆菌,沙门氏菌,葡萄球菌

参考文献

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体外抗氧化活性 篇10

复方土槿皮霜剂是由四川畜牧科学研究院养兔研究所根据多年的临床实际工作经验总结出来的, 处方主要由君药土槿皮和臣药黄柏等按照一定配比制成, 本试验从科学角度验证该药物的体外抑菌情况, 为开发动物皮肤外用抗真菌霜剂提供试验依据。

1 材料

1.1 菌种

须癣毛癣菌、红色毛癣菌标准株, 均购自中国药品生物制品检定所。

1.2 培养基

液体沙式培养基 (液体SDA) 、固体沙式培养基 (固体SDA) , 自配。

1.3 药品

复方土槿皮霜剂, 由四川畜牧科学研究院养兔研究所提供。

1.4 主要仪器

隔水式恒温培养箱, 上海妖进医疗器械厂生产;超净工作台 (型号为SW-CJ-IF) , 苏州泰安空气技术有限公司生产; 高压湿热灭菌锅 (型号为mlS-3020) , SANYO (三洋) 公司生产;振荡培养箱 (型号为HZQ-F16) , 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司生产。

2 方法

2.1 培养基的制备

2.1.1 液体沙式培养基的配制

用电子天平称取蛋白胨5 g、麦芽糖20 g, 放入500 mL锥形容量瓶中;用量筒取一定量 (约占总量的1/2) 纯化水倒入容量瓶中, 放在有石棉网的电炉上小火加热, 并用玻璃棒搅拌, 以防液体溢出;待各种药品完全溶解后停止加热, 补足水分;用5%NaOH或5%HCl溶液将培养基的pH值调至5.4;调好pH值后加棉塞或试管帽, 再包上1层防潮纸, 用棉绳系好, 115 ℃高压灭菌20 min;倒入经过灭菌的锥形瓶中, 在标签纸上标明培养基名称、制备组别、姓名、日期等, 备用。

2.1.2 固体沙式培养基的配制

在液体沙式培养基的基础上加1.5%～2.0%琼脂粉即得到固体沙式培养基, 放入高压蒸气灭菌锅中, 115 ℃灭菌20 min, 在标签纸上标明培养基名称、制备组别、姓名、日期等, 备用。

2.2 菌液的准备

在超净工作台上, 将液体沙式培养基分装入小试管中, 用烧灼过的接种环将2种菌分别转接到对应的液体沙式培养基中;做好标记, 置于35 ℃培养箱中振荡培养3～7 d, 确认接种成功后用液体沙式培养基作一定的稀释, 备用。

菌液浓度的测定:采用麦氏比浊法测定菌液浓度, 用0.25%氯化钡0.2 mL, 1%硫酸9.8 mL配制成麦氏单位为0.5的标准溶液;轻摇标准试管, 以无菌操作技术将待测定的液体培养物加到与标准管相同直径 (大小) 的无菌试管中;以无菌操作技术向待测定试管中加入无菌生理盐水, 直到浊度与标准试管的浊度相同。

2.3 复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌和红色毛癣菌的体外抑菌试验

2.3.1 复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌最小抑菌浓度 (MIC) 和最小杀菌浓度 (MBC) 的测定

采用二倍稀释法, 取灭菌的试管 (每种药物11支) , 编号排列在试管架上;每支试管中先加入相应的无菌液体沙式培养基2.0 mL, 然后向第1号管加入灭菌的复方土槿皮霜剂溶液2.0 mL, 混匀后取出2.0 mL放入第2支试管中, 依次类推, 直到第9号管取出2.0 mL弃去, 使药液稀释度为1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32, 1∶64, 1∶128, 1∶256, 1∶512, 将复方土槿皮霜剂溶液稀释成6.25, 3.125, 1.562 5, 0.781, 0.391, 0.195, 0.098, 0.049, 0.024 5 mg/mL, 共9个浓度梯度;第10号管不加药物作为阳性对照管, 以便观察培养基是否适合细菌的生长;第11号管加受试药液2.0 mL, 取出2.0 mL而弃去, 不加真菌以便观察受试药物是否被污染, 作为阴性对照管;取准备好的菌液0.1 mL加入1～10号管中, 第11号管不加, 混匀后将11支试管一起放入35 ℃恒温培养箱中培养72 h, 观察结果, 重复3次试验。结果判定, 试管内有絮状物生长, 则表示有细菌生长, 透明则表示无细菌生长, 以3次重复试验无细菌生长的最小药液浓度的平均值作为该药的最小抑菌浓度, 具体操作方法见表1。将未见絮状生长的试管混匀, 用棉签沾取试管内液体, 涂抹于固体沙式培养基上, 抹匀后放于35 ℃恒温培养箱中培养72 h, 观察是否有菌落生长, 重复3次试验, 以3次重复试验无菌落生长的最小药物浓度的平均值为该药物的最小杀菌浓度。

2.3.2 复方土槿皮霜剂对红色毛癣菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

方法同2.3.1, 但是复方土槿皮霜剂溶液的浓度依次为105, 52.5, 26.25, 13.125, 6.563 , 3.281 , 1.641, 0.82 , 0.41 mg/mL (依次对应1～9号管) 。

3 结果与分析

3.1 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定结果

3.1.1 对须癣毛癣菌最小抑菌浓度及最小杀菌浓度的测定

结果见表2。

注:“+”表示有细菌生长, “-”表示无细菌生长。

由表2可以看出, 复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌的最小抑菌浓度为第5号管的浓度, 由试验方案浓度可知第5号管的浓度为0.391 mg/mL。同样可得, 复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌的最小杀菌浓度为第3号管的浓度, 由试验方案浓度可知第3号管的浓度为1.562 5 mg/mL。由试验结果可知, 复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌有显著的抑制作用。

3.1.2 对红色毛癣菌最小抑菌浓度及最小杀菌浓度的测定

结果见表3。

注:“+”表示有细菌生长, “-”表示无细菌生长。

由表3可以看出, 复方土槿皮霜剂对红色毛癣菌的最小抑菌浓度为第7号管的浓度, 由试验方案浓度可知第7号管的浓度为1.641 mg/mL。同样可得, 复方土槿皮霜剂对红色毛癣菌的最小杀菌浓度为第5号管的浓度, 由试验方案浓度可知第5号管的浓度为6.563 mg/mL。由试验结果可知, 复方土槿皮霜剂对红色毛癣菌有显著的抑制作用。

4 讨论

随着人们生活水平的不断提高, 各种经济动物的皮张制品已进入人们的日常生活当中, 人类健康需求意识、药品安全性、人畜共患疾病等问题也受到普遍关注, 无公害优质的畜产品生产已成为畜牧业发展的必然趋势[3]。近年来, 毛用动物皮肤真菌病的发病率日渐上升, 严重制约了毛皮生产的发展, 而且目前在临床工作中由于抗生素的不合理使用, 临床耐药菌株不断增加, 使细菌的耐药性成为治疗的棘手问题[4]。药品在使用中产生的残留、抗性和微生物再猖獗的问题, 引起人们对其高度重视和重新评价。面对这一严峻现状, 我国是中药大国, 提取中药中的有效成分应用于临床治疗感染病菌有着极大的应用前景, 有研究表明, 单一的中药抑菌作用较弱, 与复方中药的协同作用相比, 复方中药表现出较强抑菌作用[5]。因此, 提取中药中有效的抑菌成分, 并利用与药物的协同作用来增强抗菌效果充分显示其独特的优势, 不失为中药制剂领域中的一个重要分支[6]。

动物皮肤真菌病传播快, 病情顽固且复杂, 难以根治, 并可传染给人, 引起人类发病。饶静等[7]用6种常用抗真菌的西药治疗由石膏样毛癣菌和红色毛癣菌引起的兔皮肤真菌病, 其效果都不理想, 主要问题是用药周期长、治疗成本高、临床疗效缓慢, 且所用药物只能缓解基本症状, 停药后容易复发和难以根治等多种情况。传统治疗为西药治疗, 常用西药有灰黄霉素、特比萘芬和阿莫罗芬等, 西药存在较大的不良反应, 并且容易产生耐药性, 而中药表现出不良反应小、来源广、价格低、较少出现耐药性等优势, 近年来抗皮肤真菌中药的研发越来越受到广大学者的关注。因此, 开发价格适中、临床使用方便、安全性高和符合我国畜牧业发展实际需要的抗皮肤真菌病的新药具有良好的发展前景。

应用体外抑菌试验可以很直接地表现药物对病原菌的抑制作用。本试验采用二倍稀释法定量评价复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌和红色毛癣菌的抑制作用, 其结果重复性好, 准确性高。本试验结果显示:复方土槿皮霜剂对须癣毛癣菌和红色毛癣菌都有明显的抑制作用, 该制剂对须癣毛癣菌的抑菌效果显著, 其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为0.391 mg/mL和1.562 5 mg/mL;对红色毛癣菌的抑菌效果相对较弱, 其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为1.641 mg/mL和6.563 mg/mL。

参考文献

[1]邢兰君.兔毛癣菌病的诊治[J].北方牧业, 2006, 17 (2) :23.

[2]李德昊, 杨光友, 赖松家, 等.四川地区兔脱毛癣病的病原学研究[J].中国预防兽医学报, 2006, 28 (6) :622-624.

[3]张振兴, 李玉峰.毛皮兽养殖发展与疾病防治技术解答[J].中国动物保健品, 2006 (6) :14-17.

[4]何明, 张永跟.中药抑菌作用研究现状[J].北京中医药大学学报:中医临床版, 2007, 14 (6) :44.

[5]张志清, 刘剑, 李娟.中药抑菌作用研究进展[J].中药材, 2002, 25 (9) :688-690.

[6]李海燕, 杨学智.喷雾剂剂型与药效研究进展及存在问题探析[J].中华中医药杂志, 2005, 20 (6) :363-365.