白介素-1受体拮抗剂

白介素-1受体拮抗剂（精选4篇）

白介素-1受体拮抗剂 篇1

在外伤、炎症、感染、酸碱烧伤等病理因素作用下, 抗血管生成因子和促血管生成因子组成的分子网络表达失衡, 导致角膜新生血管 (corneal neovas_ cularization, CNV) 形成, 丧失组织透明性。CNV是临床最常见的致盲原因之一。血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 可影响血管生成过程从而诱导血管新生。在新生血管形成位点, VEGF及其受体通常有过量表达[1,2]。白细胞介素-1 (interleukin 1, IL_1) 是早期角膜新生血管形成的关键介导因子, 其通过上调VEGF和碱性成纤维生长因子 (basic fiber growth factor, bFGF) 的表达, 促进新生血管形成, 同时作为炎症细胞因子能通过炎症反应加强新生血管化[3,4]。IL_1受体拮抗剂 (interleukin 1 receptor antagonist, IL_1ra) 抑制细胞间粘附分子1 (intercellular adhere molecule 1, ICAM_1) 的表达, 减轻白细胞浸润, 显著抑制IL_1介导的血管生成[5]。本研究通过建立鼠角膜缝线新生血管模型, 应用IL_1ra进行干预, 探讨CNV发生机制, 为CNV的临床防治提供理论依据。

1材料和方法

1.1主要仪器和试剂

逆转录酶M_MuLV (NEB) ;Taq DNA聚合酶 (Takara) ;dNTP (Takara) ;Trizol试剂 (Invitrogen) ;IL_1ra (Peprotech) ;PTC200PCR仪 (BIO_RAD) ;DU650型紫外光分光光度仪 (BECKMAN) 。

1.2实验方法

1.2.1CNV动物模型的建立

16只SD大鼠肌肉注射5% 盐酸氯胺酮注射液1.5 mL, 任意一眼中用1%盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉, 庆大霉素生理盐水冲洗结膜囊, 在手术显微镜下用10-0尼龙线铲针于角膜11、12、1点位穿过基质层间断缝合3针, 距角膜缘后2 mm处向瞳孔方向进针, 另眼同法处理。术后若有脱落则在原位或原进针点旁补缝。

1.2.2动物分组

模型大鼠随机分为2组, 每组8只:①单纯角膜缝线组:0.3%氧氟沙星滴眼液点眼, 4次/日;②IL_1ra组:球结膜下注射IL_1ra 50 μg, 1次/日;另8只SD大鼠设为正常对照, 0.3%氧氟沙星滴眼液点眼, 4次/ 日。共3组。

1.2.3实验动物的观察

缝线后2 d开始用裂隙灯显微镜观察各组角膜新生血管生长情况, 分别于3、5、7、10、14 d测定并记录从角巩缘长出的新生血管长度, 1w、2w时计算角膜新生血管面积并记录。角膜新生血管面积使用D'Amato血管面积公式进行计算, 公式如下:

其中C表示角膜血管网的圆周数, L表示血管丛角膜缘深入角膜的长度, r表示角膜半径。

1.2.4RT_PCR检测角膜血管内皮生长因子的表达水平

①角膜的取材和保存:缝线后7 d各组随机处死4只大鼠 (8只眼) , 剪取角膜, -70 ℃冻存;②RNA的提取及cDNA的合成:角膜组织粉碎研磨后按照Trizol试剂说明书的流程提取总RNA, 然后使用M-MuLV逆转录酶逆转录获得cDNA;③PCR扩增及产物检测:取1.0 μL cDNA为模板进行PCR, 检测其中VEGF和内参actin的表达水平, PCR引物见表1。 反应后取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测; 其余PCR产物于260 nm处测量吸光度值。

1.3统计学分析

采用SPSS17.0软件进行统计学处理, 均数间比较采用独立样本t检验。检验水准 α=0.05 。

2结果

2.1新生血管面积测量

于手术后1w和2w分别测量单纯缝线组和IL_ 1ra组的新生血管面积, 见表2。结果显示1w和2w时单纯缝线组的新生血管面积明显大于IL_ra组;统计学分析表明单纯缝线组与IL_1ra组之间差异有统计学意义 (t=14.563、13.787, p<0.01) 。

注:*表示单纯缝线组新生血管面积与IL_1ra组比较具有显著性差 ( p<0.01) Note:*indicates significant difference of CNV areas between CNV group and IL_1ra group (p<0.01)

2.2VEGFmRNA表达水平的检测

RT_PCR检测表明, 单纯缝线组中VEGF的表达量最高, IL_1ra组其次, 而正常对照组中VEGF的表达量较低, 如图1。测量PCR产物的吸光值, 发现单纯缝线组PCR产物的吸光度值最高, IL_1ra组其次, 而正常对照组的吸光度值最低 (表3) , 表明单纯缝线组中VEGF mRNA含量最高, IL_1ra组其次, 而正常对照组中VEGF mRNA最低;统计学分析表明, 单纯缝线组 与其他各 组差异均 有显著意 义 (t=30.183, 43.588, p<0.01) ;IL_1ra组与正常对照组之间差异有显著性意义 (t=8.597, p<0.01) 。

注:1:IL-1ra组;2:单纯缝线组;3:正常对照组Note:1:IL-1ra group;2:CNV group;3:normal control group

注：*表示单纯缝线组吸光度值与其他两组比较具有显著性差异（ p<0.01）；△表示IL_1ra组吸光度值与正常对照组比较具有显著性差异（ p<0.01）Note：*indicates significant difference of absorbance between CNVgroup and IL_1ra group or normal control group（p<0.01）；△indicatessignificant difference of absorbance between IL_1ra group and normalcontrol group（p<0.01）

3讨论

CNV是角膜外伤、炎症、感染、酸碱烧伤等疾病共同的病理性变化。CNV常导致组织瘢痕化和持续性炎症, 是最常见的致盲原因之一。一方面, CNV增强角膜的防御能力, 促进损伤修复;另一方面, CNV改变了角膜“相对免疫赦免 (relative immune privilege) ”的解剖生理特点, 常导致免疫性角膜病, 也是角膜移植排斥反应的主要原因。治疗CNV对角膜病的转归和挽救角膜盲意义重大。

VEGF是相对分子质量为34 000~45 000、以二硫键结合的二聚体糖蛋白, 对血管具有高度特异性。 已有研究表明[6], VEGF的生物学效应是通过内皮细胞表面的酪氨酸受体Flt_1和KDR来发挥作用的。 在角膜新生血管形成过程中, VEGF受体Flt_1和KDR均明显增加。角膜损伤时VEGF的超常表达使血管内皮细胞分裂、增殖和迁移, 毛细血管基底膜降解形成新的血管腔并出现毛细血管窗, 从而增强血管通透性[7]。研究表明, VEGF在血管生成的生理及病理过程中起中心调控作用。缺氧、其他生长因子、炎性介质均可上调VEGF的表达, 促进CNV形成[8~11]。

IL_1是感染初期重要的细胞因子, 主要由单核细胞和巨噬细胞产生。IL_1调节细胞外基质 (EMC) 的降解, 而EMC结构的改变是所有早期血管形成的关键步骤。另外IL_1能上调氮氧化物和其他反应性氧化中间产物, 这些产物可以促进由VEGF和bFGF介导的血管形成。研究证实IL_1是关键的CNV早期介导因子[12]。

实验表明, 单纯角膜缝线术后一般3 d左右角巩膜缘出现新生血管芽, 向角膜中央方向迅速生长, 1w可达缝线处, 2w左右达高峰, 生长旺盛呈袢状达角膜中央。实验结果显示:①单纯缝线组术后1w VEGF mRNA表达明显增强, 与IL_1ra组及对照组比较, 差异有极显著意义;CNV面积也明显大于IL_1ra组;② IL_1ra组术后1w, VEGF mRNA、CNV面积均明显低于单纯缝线组, 但仍高于正常对照组。两组缝线鼠角膜均有CNV生长, VEGF mRNA的表达均高于正常对照组, 说明角膜缝线导致角膜上皮、基底细胞损伤, 一方面造成角膜微环境缺氧, 触发VEGF的表达, 另一方面炎症细胞浸润产生大量促新生血管生长因子, 使VEGF高表达。CNV面积较小而角膜VEGF mRNA相应表达亦低, 说明VEGF是导致CNV的重要因子, 且和CNV生长密切相关。因此可以通过抑制VEGF的表达进而抑制CNV的生长。

IL_1ra组CNV面积、角膜组织VEGF mRNA的表达均显著低于单纯缝线组, 证明IL_1ra对CNV有抑制作用。IL_1参与机体的炎症反应, 刺激CNV形成, 而IL_1ra与IL_1结合可阻断其生物活性[13]。IL_1ra组角膜VEGF mRNA低表达、CNV生长抑制、IL_1ra抑制IL_1生物活性, 从而改善角膜缺氧状态, 减少炎症因子释放的结果。同时IL_1ra抑制细胞间粘附分子1 (ICAM_1) 的表达, 减少白细胞与内皮细胞的粘连, 均可下调VEGF的表达, 从而抑制CNV生长[14]。

摘要：为了探讨白介素-1受体拮抗剂 (interleukin 1 receptor antagonist, IL1ra) 对大鼠角膜新生血管 (corneal neovascularization, CNV) 中血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 表达的影响及其对CNV生长的作用, 采用角膜缝线法建立大鼠CNV模型, 分成正常对照组、单纯角膜缝线组和缝线加IL1ra结膜下注射组三组, 于术后1w、2w分别计算各组CNV面积, 观察CNV生长情况;术后1w各组随机处死4只大鼠, 取角膜组织采用RTPCR检测VEGF的表达。结果表明, 正常对照组无CNV生长, VEGF低表达;单纯缝线组CNV生长旺盛, VEGF高表达, CNV面积、VEGF mRNA相对吸光度值与其他两组相比有极显著差异 (p<0.01) ;IL1ra组CNV生长稀疏, VEGF表达较低, 但仍高于正常对照组, 差异有统计学意义 (p<0.01) 。

关键词：白介素-1受体拮抗剂,新生血管,角膜,血管内皮生长因子

白介素-1受体拮抗剂 篇2

关键词：椎间盘,退变,免疫组化,白细胞介素-1受体拮抗剂

因椎间盘退变引起的腰椎疾病是临床上的常见病,腰椎间盘突出症是中年劳动力丧失的主要原因。研究椎间盘退变的病因仍是目前国内外的热点之一,但其发病机制尚未明确。随着分子生物学、免疫学、分子病理学等学科的研究进展,对椎间盘退变机制的研究也不断深入。白细胞介素-1(IL-1)可通过多种途径促进椎间盘的退变[1],目前发现IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)是体内产生的唯一能阻断IL-1所有生物学效应的物质。李强等[2]预防性应用IL-1Ra于双后肢大鼠椎间盘退变模型,发现IL-1Ra有延缓大鼠椎间盘退变过程的作用。本实验通过对椎间盘已退变的大鼠腹腔注射IL-1Ra研究IL-1Ra对退变大鼠椎间盘的作用,为IL-1Ra临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

出生48～72 h的清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠共12窝计106只,雌雄不限,由东南大学医学院实验动物中心提供。重组IL-1Ra购自南京布克生物技术有限公司,兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒均购自武汉博士德公司,间苯三酚购自国药集团化学试剂有限公司,磨砂防脱玻片购自北京中杉生物工程有限公司,日本OLYMPUS光学显微镜。

1.2 实验动物模型的建立、分组与处理

双后肢大鼠模型的建立参考Cassidy等[3]方法,将新生SD大鼠低温麻醉10 min,无菌条件下自大鼠双前肢肱骨上端及鼠尾基部用丝线结扎并切除双前肢和尾部,严格止血,放置于37 ℃烤箱约10 min。待其苏醒后放回母鼠笼中母乳喂养,待断乳后随机选择36只,随机分为对照组和实验组,每组18只。雌雄分开喂养,逐渐增加食物和水的高度迫使大鼠必须依靠双后肢站立,并培养其直立行走的习惯。造模3个月后,大鼠椎间盘已有一定程度的退变[4]。实验组给予隔日腹腔注射重组IL-1Ra 150 ng·kg-1,对照组注射等量生理盐水。分别于造模后的第4、5、6个月(即给药后满1、2、3月)时各处死6只大鼠,取出腰椎,剔除椎间盘周围的肌肉及脂肪组织,沿L4、L5椎体的上下终板完整取下L4-5椎间盘组织,立即用蒸馏水冲洗3遍后置10%中性福尔马林缓冲液中固定24 h,常规EDTA脱钙、石蜡包埋,沿椎间盘正中向两侧按5 μm矢状面连续切片共8张,5张作Ⅱ型胶原免疫组化,3张作HE染色。按上述方法取出L5- 6椎间盘置于深低温冰箱中集中留作检测蛋白多糖。实验过程中各批标本分别集中取材,标本的处理及检测等各实验步骤均保持严格一致。

1.3 检测方法

1.3.1 免疫组化法测胶原含量

石蜡切片常规脱蜡至水,30%H2O21 ml加入蒸馏水10 ml,将混合液滴于组织块上,置于室温下10 min,蒸馏水冲洗3次,复合修复液修复10 min,蒸馏水洗3 次,滴加5% BSA室温封闭20 min,甩去多余液体,不洗,滴加浓度为1∶50 兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体4 ℃过夜,PBS冲洗后滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37 ℃放置20 min,滴加SABC置于37 ℃ 20 min,DAB 显色,肉眼观察组织显色为咖啡色时用蒸馏水冲洗,苏木素复染30 s后常规脱水、透明、封片。每组随机抽1张作阴性对照,即将一抗换为PBS,余步骤同前。所有免疫组化切片均在同一条件下由熟悉相关知识的非本课题组技术人员使用Simple PCI 图像分析软件对髓核中Ⅱ型胶原的含量进行分析。将灰度值阈值调为0～255,灰度值越高表明胶原的含量越低。灰度值为胶原的相对含量。

1.3.2 蛋白多糖测定

将深低温冰箱中保存的椎间盘组织取出置入离心管中,加入3% NaOH 0.5 ml置于恒温振荡器中振荡3 h,温度控制在40 ℃。加入HCl 约2 ml调整溶液pH值至8～9,加入100 mg·ml-1胰蛋白酶50 μl酶解2 h,间苯三酚法[5]测定溶液蛋白多糖含量,结果以mg·(100 mg)-1表示。

1.3.3 HE染色

标本脱蜡至水,苏木素染色液染色10 min,蒸馏水冲洗去多余的染色液,约10 min后蒸馏水再洗涤一遍,放入95%乙醇5 s。滴加伊红染色液染色2 min,脱水、透明后封固,留作镜下观察。

1.4 统计学处理

数据以undefined表示,将数据输入SPSS11.5统计软件包进行统计学处理。组间比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Ⅱ型胶原灰度值及蛋白多糖相对含量

第4、5、6月时实验组髓核中Ⅱ型胶原灰度值均低于对照组,蛋白多糖含量均高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

2.2 HE染色结果

HE染色可见第4个月时实验组和对照组大鼠椎间盘纤维环排列尚规整,呈典型的板层状排列(图1A、B)。第5个月时,实验组大鼠纤维环排列尚整齐,胶原纤维层间较少有连接(图2A);对照组大鼠椎间盘纤维环排列较紊乱,但可见胶原纤维增粗并有胶原纤维的断裂(图2B)。第6个月时实验组纤维环排列也较紊乱,但仍可见板层状排列,部分髓核结构断裂,但未见其明显纤维化(图3A);对照组髓核突入到破裂的纤维环间,髓核发生空泡状变性,部分髓核被纤维状物质取代,纤维环失去典型的板层状排列结构,融合成团块(图3B)。

与对照组同一时间点比较,*P<0.05

3 讨 论

本实验通过双后肢大鼠模型完成,因为两足鼠腰椎承受一定的重力,随着年龄增加腰椎退变加速,神经核脊索细胞在早期即被纤维软骨细胞替代,引起椎间盘退行性变。Cassidy等[3]用双后肢普通大鼠建立椎间盘退变动物模型,在实验中发现,正常老年大鼠髓核中脊索细胞随年龄的增长而逐渐发生退变,双后肢大鼠的退变更严重,髓核细胞的这种退变与人类椎间盘细胞的退变规律完全一致。

蛋白多糖是椎间盘细胞外基质的主要成分,它是一种由多肽为主链,以许多氨基多糖为侧链组成的大分子体。蛋白多糖单体(亚单位)由包埋于中央的核心蛋白和它两侧的糖胺聚糖链组成。糖胺聚糖链占蛋白多糖分子质量的90%以上,是蛋白多糖的主要功能基团,主要由透明质酸(hyaluronan,HA)、硫酸软骨素(chondroitinsulphate,CS)和硫酸角质素(keratansulphate,KS)组成,其中HA含量极低,而以CS和KS为主,由于蛋白多糖分子中CS和KS的每个双糖单位分别带有硫酸基和(或)羧基的负电荷,因此蛋白多糖不但使椎间盘总离子数大于血浆而形成盘内高渗透压,更能控制带电溶质在组织内的分布和转运。盘内高渗透压能够吸附大量的水分子,是椎间盘保持黏弹性、抵抗外来压力、吸收震荡等生物力学特征的生理基础,是维持椎间盘生物力学功能的基础[6]。可见蛋白多糖的丢失将会引起并加速椎间盘的退变。

IL-1基因家族定位于人类染色体 2q13-14上,全长约 430 kb,人体内的IL-1有IL-1α和IL-1β两种受体可与IL-1Ra结合。椎间盘中, IL-1β具有刺激体外培养的髓核、纤维环细胞产生 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9等金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs),从而减少蛋白多糖的产生,降低Ⅰ、Ⅱ型胶原和SOX6基因的表达等功能[7]。MMPs是椎间盘基质的主要降解酶,过量的MMPs可破坏椎间盘细胞外基质,抑制细胞合成蛋白多糖,从而使髓核中蛋白多糖减少、胶原强度降低,逐渐使椎间盘退变。SOX6基因是与椎间盘退变密切相关的因子,它能增加椎间盘基质中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成,理论上可延缓椎间盘退变的发展[8]。IL-1还可刺激椎间盘基质细胞产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、NO等。TNF-α促进MMPs的产生和分泌,引起软骨基质的降解,并可抑制软骨细胞合成具有透明软骨特性的蛋白多糖和Ⅱ型胶原,促进生成有纤维母细胞特性的I型胶原,从而使软骨细胞变性死亡,加快椎间盘的退变。NO通过和氧竞争与细胞色素氧化酶作用而抑制线粒体的呼吸,导致细胞内ATP水平的下降,从而引起椎间盘细胞凋亡,NO也参与IL-1 对椎间盘蛋白多糖及胶原合成的抑制作用。此外,IL-1是一种重要的炎症介质,可以协同IL-6等介导的无菌性炎症加速椎间盘的退变。可见阻断IL-1的生物学效应可延缓椎间盘的退变,目前发现IL-1Ra是体内产生唯一能阻断IL-1所有生物学效应的物质。

本实验结果显示,第4、5、6个月时实验组及对照组髓核中Ⅱ型胶原灰度值及蛋白多糖的含量的差异有统计学意义(P<0.05),提示IL-1Ra能有效地抑制已退变的椎间盘胶原及蛋白多糖的降解,对已退变椎间盘的退变有明显的延缓作用。

本实验从椎间盘基质代谢的角度说明IL-1Ra确实能有效地延缓退变椎间盘的退变。细胞因子作用周期短,因此本实验隔天即需予IL-1Ra腹腔注射1次。Le Maitre等[9]将IL-1Ra的基因导入腺病毒,再将转染的腺病毒注射到退变的椎间盘细胞中,通过检测发现IL-1Ra蛋白含量增加并能持续两周。国外已有将IL-1Ra应用于动物及人体治疗类风湿性关节炎和骨关节炎的报道,但将其应用于椎间盘退变的治疗尚未见报道。李强等[2]于造模后未等大鼠椎间盘退变即给予预防性用药,尚不能说明IL-1Ra能够治疗已退变的椎间盘。本实验造模后3个月,大鼠已站立行走2个多月,其椎间盘已退变,然后进行给药,结果证明IL-1Ra能够治疗已退变的椎间盘。但要将IL-1Ra应用于临床治疗椎间盘退变,其给药方式及剂量尚需进一步研究。

参考文献

[1]Omlor G W,Lorenz H,Engelleiter K,et al.Changes in gene ex-pression and protein distribution at different stages of mechani-cally induced disc degeneration:anin vivostudy on the NewZealand white rabbit[J].Orthop Res,2006,24(3):385-392.

[2]李强,王宸,吴小涛,等.白介素-1受体拮抗剂对椎间盘基质代谢的影响[J].中国脊柱脊髓杂志,2006,16(11):861-864.

[3]Cassidy J D,Yong-Hing K,Kirkaldy-Willis W H,et al.A studyof the effects of bipedism and upright posture on the lumbosa-cral spine and paravertebral muscles of the Wistar rat[J].Spine,1988,13(3):301-308.

[4]赵勇,王宸,吴小涛,等.白介素-1受体拮抗剂对双后肢大鼠椎间盘细胞凋亡的影响[J].中国脊柱脊髓杂志,2006,16(6):454-457.

[5]高华,刘坤,于兹东,等.间苯三酚分光光度法测定硫酸软骨素的研究[J].中国生化药物杂志,2000,21(5):247-248.

[6]Nq S C,Weiss J B,Quennel R,et al.Abnormal connective tis-sue degrading enzyme patterns in prolapsed intervertebral discs[J].Spine,1986,11(7):695-701.

[7]Le Maitre C L,Freemont AJ,Hoyland J A.The role of interleu-kin-1 in the pathogenesis of human intervertebral disc degener-ation[J].Arthritis Res Ther,2005,7(4):R732-745.

[8]Ikeda T,Kawaguchi H,Kamekura S,et al.Distinct roles ofSox5,Sox6 and Sox9 in different stages of chondrogenic differ-entiation[J].J Bone Miner Metab,2005,23(5):337-340.

白介素-1受体拮抗剂 篇3

人白细胞介素 - 36受体拮抗剂( interleukin - 36receptor antagonist,IL - 36Ra) 和IL - 36α、IL - 36β、IL - 36γ 统称为IL - 36细胞因子,同属于IL - 1家族 ( IL - 1F)[1]。与IL - 1F其它成员相比,IL -36Ra主要在角质细胞、支气管上皮细胞、脑组织和巨噬细胞中表达,在皮肤组织中呈现高表达[2,3,4]。IL - 36Ra只有在切除其N末端的蛋氨酸才具有完全拮抗活性,但负责切除的酶至今未确定[5,6]。编码人IL - 36Ra的基因与编码IL - 1F其他成员的基因一样位于2号染色体一段400 kb区域上[7]。IL -36Ra与IL - 1Ra有高达47% 的同源性,但二者的三维构像完全不同,且IL - 1Ra缺陷综合征与IL -36Ra缺陷综合征的发病机理并不相似,这表明IL -36Ra有其独特的生物学功能[8]。IL - 36Ra是IL -1F中IL - 36α、IL - 36β、IL - 36γ 的拮抗剂,抑制炎症的发生[9,10,11]。IL - 36细胞因子在银屑病、斑秃、关节炎、肺炎及其它炎症性疾病中的作用已陆续得到关注。刘丽娜[12]等学者提出,蛋白质的二级结构、亲水性、柔韧性与B细胞抗原表位的分布存在密切联系,本文基于人IL - 36Ra基因推导的氨基酸序列,首次应用生物信息技术和相关的生物学软件对IL - 36Ra蛋白的二级结构和B细胞表位进行预测与分析。旨在为今后深入研究人IL - 36Ra蛋白功能奠定基础,并为研制人IL - 36Ra单克隆抗体提供理论指导。

1材料与方法

1.1材料

人IL - 36Ra基因序列来源于Gen Bank ( 序列号: NM_012275. 2) ,人IL - 36Ra蛋白的氨基酸序列检索自NCBI的蛋白数据库,共有155个氨基酸残基,Gen Bank登录号为NP_775262. 1。

1.2方法

1.2.1氨基酸组成及理化性质分析

应用在线生物学信息学网络服务器expasy所提供的蛋白组学和序列分析工具对人IL - 36Ra的氨基酸组成及其理化性质 ( http: / /web. expasy. org /protparam / ) 进行分析[13]。

1.2.2二级结构的预测

人IL - 36Ra的二级结构采用expasy中ProtParam网上在线程序进行预测( https: / / npsa - prabi.ibcp. fr / cgi - bin / npsa_automat. pl? page = npsa_sopma. html)[14,15,16]。

1.2.3亲水性、柔韧性及可及性区域的预测

应用Prot Scale程序预测IL - 36Ra的亲水性、柔韧性 ( http: / /web. expasy. org /protscale /) 。 IL -36Ra的可及性则按Emini方案预测 ( www. imtech.res. in / raghava / bcepred / bcepred_)[17,18,19]。

1.2.4B细胞抗原表位的预测

采用Kolaskar方案分析其 抗原位点 ( http: / /www. imtech. res. in / cgibin / bcepred / bcepred. pl) 。对其氨基酸组成及理化性质,二级结构和亲水性、柔韧性及可及性区域的预测结果进行分析。取各预测结果重叠的肽段区域,即为IL - 36Ra蛋白可能的B细胞优势表位[20]。

2结果与分析

2.1人IL-36Ra蛋白的氨基酸序列

人IL - 36Ra蛋白基因编码产物为155个氨基酸,其理论分子质量为16. 96 k Da,理论等电点为: 5.08,其氨基酸序列如下:

2.2人IL-36Ra的组成及理化特性分析

用在线生物学信息学预测工具Prot Param程序对人IL - 36Ra基因编码产物氨基酸组成的分析结果见图1所示: 人IL - 36Ra蛋白由20种氨基酸组成,几种主要氨基酸的含量由高到低依次为: 12. 9%的Leu( 亮氨酸) 、9. 7% 的Gly( 甘氨酸) 、7. 7% 的Ser( 丝氨酸) 、7.1%的Val( 缬氨酸) 。同时,软件预测IL -36Ra蛋白的理论分子量为16. 96 k Da,理论等电点为5.08,半衰期为30 h,分子式为C761H1181N197O224S9。

2.3人IL-36Ra蛋白二级结构的预测

通过Expasy中的Prot Param预测人IL - 36Ra蛋白的二级结构,结果如图2所示: IL - 36Ra蛋白的二级结构 由无规则 卷曲 ( 44. 52% ) 、β 折叠( 30. 97% ) 、α - 螺旋 ( 18. 06% ) 和 β - 转角( 6. 45% ) 组成。其中无规则卷曲有15个,分别位于11、12、22、30 - 37、45 - 51、54 - 57、62 - 65、72 - 76、91 - 96、103 - 109、115、116、123 - 130、135 - 145、152氨基酸区域。11个 β 折叠区域,主要位于18 -21、26 - 29、42 - 44、57 - 61、66 - 71、77 - 80、97 -102、110 - 111、119 - 122、131 - 134、146 - 151区段上。α 螺旋有6个,分别位于1 - 11、14 - 17、38 -41、85 - 90、102、103氨基酸区段上。含量最少的 β- 转角有5个,主要位于23 - 24、52 - 53、114、117 -118、153 - 155区段上。

2.4IL-36Ra亲水性、柔韧性、可及性等单参数的预测

2.4.1亲水性

利用Hopp & Woods法预测人IL - 36Ra的亲水性区域,预测结果如图3所示: 人IL - 36Ra蛋白具有较高的亲水性,亲水性区域的分布也较均匀,主要集中在IL - 36Ra蛋白肽链的9 - 16、18 - 20、36 -44、77 - 79、90 - 100、105 - 108、125 - 132和134 -136位。

图2 IL - 36Ra 二级结构的预测结果 h: α - 螺旋; c: 无规则卷曲; e: β - 折叠; t: β - 转角。 Figure 2 The result of prediction for IL - 36Ra’s secondary structure h: α - helix; c: random coil; e: extended strand; t: β - turn.

2.4.2柔韧性

利用Average flexibility法预测人IL - 36Ra蛋白的柔韧性,结果如图4所示: IL - 36Ra蛋白的肽链中具有5个较高柔性区域,主要位于36 - 45、54 -80、91 - 100、105 - 110和126 - 144肽段上。蛋白肽段的柔韧性越大,越容易发生扭曲和折叠,容易与抗体嵌合,因此作为抗原表位的概率也就越高。

2.4.3可及性

采用Emini方案对IL - 36Ra的可及性进行预测,预测结果如图5所示: 位于11 - 15、22 - 25、37 -41、48 - 50、74 - 79、90 - 106和126 - 138区段的氨基酸可及性较高。

2.5IL-36Ra的B细胞抗原位点的预测

通过Prot Param、Prot Scale等在线程序中IL -36Ra蛋白的二级结构和氨基酸序列单参数预测的结果,兼顾各参数的分析结果[21],采用Kolaskar方案分析IL - 36Ra的抗原位点,预测36 - 37、72 - 79、91 - 96、103 - 110、126 - 130和134 - 138区段为抗原位点的可能性较大。蛋白质的B细胞表位的分布与蛋白质的二级结构有较大关系,在二级结构层面上,无规则卷曲和 β - 转角结构具备容易变形的特点,有利于抗原表位的形成[22]。典型的水溶性球蛋白的疏水集团一般包埋在蛋白质分子内部,亲水集团多位于蛋白表面,因此具有较高亲水性的蛋白区段作为抗原表位的概率也较高。具有较高表面可及性的蛋白区段可能位于IL - 36Ra蛋白分子表面,因此有可能形成抗原表位。较大的柔韧性容易发生扭曲和折叠,容易与抗体结合,因此形成B细胞抗原表位的可能性较大。根据不同参数预测的B细胞表位也不尽相同,综合各种参数的重叠部分得出下表:

3讨论

人IL - 36Ra蛋白质抗原表位的预测工作对探究IL - 36Ra生物学功能及研制其单克隆抗体具有重要的意义。与抗原抗体的结合类似,B细胞识别蛋白抗原是通过其表面的抗原受体( BCR) 与该抗原表位结合。目前为止,主要采用生物信息技术和相关的生物学软件预测B细胞表位。抗原表位的形成是一个在多因素共同作用下的结果,通常蛋白质的二级结构与蛋白质的包围分布有较大关系,所以可以从蛋白质的二级结构、柔韧性、表面可及性和亲水性等方面入手预测该蛋白B细胞抗原表位。在蛋白质结构中 α - 螺旋和 β - 折叠结构规则,有氢键维持很难与抗体嵌合,通常处于蛋白质内部作为骨架起主要的稳定作用,而无规则卷曲和 β - 转角易扭曲、盘旋并多分布于蛋白质表面的特点有利于抗原表位的形成[23]。蛋白质的柔韧性是指蛋白构象不是刚性不变的,而是在一定程度上具有活动性,这种活动性有利于抗原受体或抗体与抗原结合。抗原表位分析通常采用亲水性分析和二级结构预测相结合的方法[24]。本研究采用多种方法对多参数预测结果的综合分析,提高了对人IL - 36Ra的B细胞抗原表位预测的准确性和可靠性。

总之,近几年已经证实IL - 36细胞因子在炎症性疾病中发挥重要作用,特别是它们在皮肤炎症中扮演着重要的角色,但IL - 36Ra在炎症性疾病中的作用机制尚待探究,因此本文对人IL - 36Ra二级结构、亲水性、柔韧性、可及性和B细胞表位的探究对日后研制其单克隆抗体提供了重要的理论指导,同时也为研究人IL - 36Ra的生物学功能及其在炎症性疾病中的作用提供了新的思路。

摘要：[目的]预测人白细胞介素-36受体拮抗剂(interleukin-36 receptor antagonist,IL-36Ra)蛋白的特性及其B细胞抗原表位。[方法]以人IL-36Ra基因序列为基础,应用Expasy工具中Prot Param程序分析人IL-36Ra蛋白的氨基酸组成、理化性质和二级结构;采用Prot Scale网络服务器预测亲水性和柔韧性;采用Emini和Kolaskar方案分析其可及性。结合其二级结构的特性,进一步预测IL-36Ra的B细胞抗原表位。[结果]人IL-36Ra的二级结构主要由无规则卷曲(44.52%)、β折叠(30.97%)、α-螺旋(18.06%)和β-转角(6.45%)组成。IL-36Ra蛋白肽链的36-37、72-79、91-96、103-110、126-130和134-138区段为B细胞表位区域的可能性较大。[结论]该研究采用多参数方案综合预测人IL-36Ra蛋白的二级结构和B细胞表位,为深入鉴定IL-36Ra的抗原表位及试验方法探索其单克隆抗体奠定了理论基础。

白介素-1受体拮抗剂 篇4

1资料与方法

1.1一般资料选自笔者所在医院2015年5月~2015年10月就诊的哮喘患儿40例,年龄5~14(7.5±2.1)岁。所有哮喘患儿均符合2008年中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的儿童支气管哮喘防治指南的诊断标准[2]。并排除肺部感染、结核等其他原因所致的气喘或慢性咳嗽,均无异物吸入史,所有病例均为初诊者或确诊后未长期规范使用糖皮质激素或白三烯抑制剂治疗,治疗前1周以上未使用过糖皮质激素或白三烯抑制剂,按随机数字表法分为观察组20例、对照组20例,两组在年龄、性别、病程、病情严重程度等基本资料上比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性,另设健康组30例为笔者所在医院健康体检的儿童。本研究经本院伦理委员会批准通过,所有受试者家长均签署知情同意书。

1.2方法两组均予相同的雾化吸入、平喘、对症及必要的抗感染治疗,观察组另外加用口服孟鲁司特咀嚼片(杭州默沙东公司,规格:4mg×5片,生产批号:L1005135),每晚1次,1片/次,连服4周。观察两组治疗前后血清TGF-β1水平变化,并进行疗效评估及不良反应观察。

1.3疗效评价标准[3]临床疗效评估:显效:治疗后咳嗽、喘息、呼吸困难等症状完全缓解及双肺听诊哮鸣音完全消失,治疗期间病情无反复;好转:治疗后咳嗽、喘息、呼吸困难等症状及双肺听诊哮鸣音较前明显减少但病情仍有反复。无效:治疗后咳嗽、喘息、呼吸困难等症状无改善及哮鸣音较前无明显改善或加重。有效包括显效及好转。

1.4观察指标两组分别在治疗前及治疗4周后测定血清TGF-β1水平变化,观察其变化,试剂盒由北京东方华赞科技有限公司提供,标本采集:取早晨空腹静脉血3~5ml,离心10min,分离出血清,放置-70℃冰存。采用酶联免疫吸附法测定TGF-β1水平。

1.5统计学处理所有资料均采用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料以(±s)表示,采用t检验,计数资料以率(%)表示,采用x2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组经治疗4周后血清TGFβ1水平变化与治疗前对比,治疗4周后观察组与对照组血清TGF-β1水平(37±.10.33)ng/L,(54±11.36)ng/L均较治疗前(102.21±21.35)ng/L,(99.4±20.32)ng/L,明显降低,且观察组降低比对照组明显(P<0.05),两组血清TGF-β1水平高于健康组(20.74±.7.85)ng/L;观察组总临床有效率(95%)明显高于对照组(80%)(P<0.05)。见表1。

注:健康组血清TGF-β1水平(20.74±.7.85)ng/L

2.2两组临床疗效比较治疗4周后观察组总临床有效率(95%)明显高于对照组(80%),差异有统计学意义(P<0.05)。见表2

2.3不良反应观察两组治疗过程中均未发现明显不良反应。

3讨论

儿童哮喘是一种气道的慢性变态反应性炎症性疾病,发病机制十分复杂,诸多因素参与其中,其气道的慢性炎症与多种免疫细胞及其所产生的细胞因子有关。而气道重塑是支气管哮喘的病理生理特征之一,表现为气道基底膜和平滑肌增厚,腺体增生肥大和细胞外基质沉积,其结果是导致气道高反应性和不可逆性气道阻塞,其过程是不可逆转的,此乃支气管哮喘防治关键及难点[4]。TGF-β1是具有刺激成纤维细胞增生和促进成纤维细胞合成、分泌胶原蛋白作用的细胞因子,因此与哮喘气道重塑的关系较为密切。国内外诸多学者针对TGF-β1与支气管哮喘气道重塑的相关性进行了大量研究,已有许多证据表明TGF-β1是导致气道重塑的重要因子之一。

TGF-β1[5]是一种多效性、多功能的、具有双重效应的生长因子,对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。国内外诸多研究表明[6],TGF-β1在支气管哮喘的发病中可作为促炎因子作用于炎症细胞参与气道的炎症及免疫反应,能启动或扩气道免疫炎症反应,另一方面具有强烈的促纤维细胞增生作用,通过作为各种免疫应答通路信号因子等作用导致气道上皮纤维化,引起气道重塑及气道反应性增加,气道管壁增厚。所以,TGF-β1不但参与支气管哮喘气道炎症过程,还能诱发和加重气道重塑和气道高反应性,从而加重支气管哮喘患者的气道阻塞。因此,抑制TGF-β1生成对减轻气道慢性炎症和阻止或减轻气道重塑能起到一定的作用。

孟鲁司特是目前最强的白三烯受体拮抗剂,是一种能显著改善哮喘炎症指标的强效口服制剂。孟鲁司特钠对白三烯受体有高度的亲和性和选择性,能阻断白三烯介导的效应包括一系列的气道反应,如支气管收缩、粘液分泌、血管通透性增加及嗜酸性粒细胞聚集,使气道及周围血中嗜酸性粒细胞减少,从而减轻气道炎症。国内外大量的研究报告表明[7]血清TGF-β1水平与支气管哮喘的急性发作时的病情严重程度有正相关性。本研究发现,观察组经白三烯受体拮抗剂治疗4周后血清TGF-β1水平较对照组下降更明显,说明白三烯受体拮抗剂能降低支气管哮喘患者的血清TGF-β1水平,且观察组总有效率明显比对照组高,均未发现明显不良反应。本研究表明,白三烯受体拮抗剂在治疗儿童哮喘中有明显效果,且与降低哮喘患者血清TGF-β1水平相关。而白三烯受体拮抗剂能降低血清TGF-β1水平的具体机制目前尚不清楚,有研究表明可能与其抑制CD8+T细胞介导的炎症反应有关。

总之,本研究证实,白三烯受体拮抗剂能改善儿童哮喘血清转化生长因子β1表达从而发挥治疗作用,临床效果明显,且安全性良好。

参考文献

[1]Heijink IH,Marcel K P,van Oosterhout AJ,et al.Der p,IL-4,and TGF-beta cooperatively induce EGFR-dependent TARC expression in airway epitlelium[J].American Journalof Respiratory Cell Molecular Biology,2007,36(3):351-359.

[2]中华医学会儿科学分会呼吸学组,《中华儿科杂志》编委会.儿童支气管哮喘诊断与防治指南.中华儿科杂志.2008,46(10):745-753.

[3]Hackett TL,Wamer SM,Stefanowicz D,et al.Induction of epithelialmesenchymal transition in primary airway epithelial cells from patients with asthma by transforming growth factor-betal.American Journal Respiratory Critical Care Medical,2009,180(29):122-233.

[4]黄树红,乔秀荣,谭薇.支气管哮喘患者IL-17、TGF-β1表达水平的临床研究[J].潍坊医学院学报.2010,32(4):277-278.

[5]马香,丁明杰,韩玉玲,等.哮喘儿童血转化生长因子β1及尿白三烯E4水平的临床研究[J].临床儿科杂志.2010,28(2):1152-1154.

[6]洪建国,董文芳,周小建.生长因子β1对儿童哮喘的作用及孟鲁司特钠对其影响[J].中华儿科杂志2011,49(9):679-683.