展示性教学（共3篇）
展示性教学 篇1
摘要：目的 应用噬菌体展示技术,构建天然人源抗肺癌噬菌体抗体组合文库,筛选能与肺癌细胞特异结合的抗体。方法 用RNA提取试剂盒提取淋巴细胞RNA,以Oligo DT为引物反转录合成cDNA,以半套式PCR扩增轻链和重链可变区抗体基因并重组到原核表达载体中,通过噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,形成噬菌体抗体组合文库。结果 电泳显示扩增的mRNA有清晰的28s、18s和5.8s的条带,600700bp片段者为重组克隆;噬菌体展示抗体库大小在108107之间;优化电转化条件,最终得到库容为1.2×108cfu,双链重组率为41%的抗体库。结论 成功构建人源抗肺癌噬菌体展示文库,为下一步筛选具有肺癌细胞特异亲和力的人源性单克隆抗体奠定了基础。
关键词：噬菌体展示,肺癌,抗体
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,也是危害人类健康与生命最大的恶性肿瘤,其重要性与日剧增。据世界卫生组织2000年报告:1997年全世界死于肺癌人数占恶性肿瘤死亡的19%,居恶性肿瘤死因的第一位。目前,肺癌的五年存活率不到15%,其主要原因之一是临床确诊的肺癌患者往往已经处于病程中晚期或发生了癌细胞的远端转移,因此,实现早期诊断、早期治疗是治疗肺癌的首选策略。在血清学检验中,由于肺癌肿瘤标志物其敏感性和特异性仍不十分令人满意[1],肿瘤标志物在肺癌早期诊断中的应用价值受限。目前常用的Cyfra21-1、NSE等,对肺癌的特异性均不理想。
近年来,人类肿瘤学研究发现肿瘤患者血清中也存在有各种类型的抗细胞自身抗原的抗体。目前肿瘤研究中自身抗体作为肿瘤早期诊断的标志物也已成为肿瘤早期诊断领域的研究热点,倍受重视[2]。
噬菌体展示抗体库技术被誉为抗体技术的第三次革命,本文通过噬菌体展示技术,构建天然人源噬菌体组合文库,从而可以从文库筛选到对肺癌细胞具有特异性亲和力的单抗,进一步解决肺癌早期诊断的问题。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌XL1-BLUE、VCSM13和噬菌粒pcomb3H由广州医学院分子生物学实验室保存,限制性内切酶、T4DNA连接酶均购自New England Biolabs公司,抗体扩增引物由上海生工生物工程公司合成,反转录试剂盒为美国GIBCO BRL公司产品,重组噬菌体鉴定试剂盒购自Amersham phamacia公司。
1.2 方法
(1)m RNA的来源和抗体片段c DNA的合成:分别抽取12例肺鳞癌患者、10例肺腺癌患者及8例小细胞肺癌患者外周血5m L。按总RNA提取试剂盒提取肺癌患者外周血淋巴细胞的总RNA,以Oligo DT为引物用反转录试剂盒合成c DNA。(2)噬菌体抗体库的构建:按照Barbas[3]所报道的方法进行。从淋巴细胞群中抽取RNA,以免疫球蛋白信号肽序列引物和家族特异性免疫球蛋白可变区基因作为引物,进行半套式PCR扩增人抗肺癌的轻链和重链可变区抗体基因,重组到原核表达载体中,并通过噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,把单克隆抗体的Fab段表达在噬菌体表面,形成噬菌体抗体组合文库。
2 结果
2.1 m RNA的提取
通过提取总RNA来获得m RNA,结果如图1,m RNA的提取质量通过电泳来进行鉴定,可以看到清晰的28s、18s和5.8s的条带。
注:下划线处为酶切位点
2.2 半套式PCR扩增
分别采用肺癌患者c DNA为模板,用前导肽引物与3′端引物配对进行第一次PCR扩增,见表1。
2.3
取上述制备的PCR产物为模板进行第二次PCR反应,见表2。
2.4 噬菌体抗体库的构建和库容的测定
随机从文库中各抽取24个克隆PCR扩增插入片断,通过电泳结果鉴定扩增出600~700bp片段者为重组克隆。噬菌体展示抗体库大小在108~107之间,并通过优化电转化条件来增加库容量,最终得到了库容为1.2×108cfu,双链重组率为41%的抗体库。
3 讨论
19世纪70年代德国学者Kohler和英国学者Milstein利用细胞融合技术首次成功地制备了杂交瘤抗体[4],这一技术是生物技术发展的一个里程碑。然而,由于异源蛋白易引起人抗小鼠抗体反应而影响人体内应有的疗效,因此人们开始了人杂交瘤技术的研究。但这项技术至今未获真正的突破。
抗体库特别是噬菌体表面展示技术的创建,被誉为又一次革命性进展。这项技术用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体,不经细胞,甚至不经免疫,制备针对任何抗原的单克隆抗体,为人单抗的制备提供了一条非常有效的办法。这一技术将表型和基因型联系在一起,将抗体识别可抗原的能力和噬菌体扩增的能力结合在一起,是一项极为高效的表达、筛选体系,在生物技术领域极具应用前景。
本文利用噬菌体展示文库技术,从肺癌患者血液中获取抗体基因,来制备具有诊断价值的人源单克隆抗体。抗体库的多样性(不同抗体基因的数目)和抗体库的大小(每个抗体基因的数量)是影响发现稀有抗体和高亲和力的抗体的概率的重要因素。如何保证天然抗体库中所有的表位都有机会被筛选是发现高亲和力抗肺癌单抗的关键。为了构建的抗体库能尽量反映体内的实际情况。要保证抗体的所有组分都能用PCR的方法扩增出来,以使得绝大多数抗原都能从抗体库筛选出相应的抗体,PCR引物的设计是至关重要的。引物的设计需按抗体可变区基因上下游DNA碱基的序列来进行,这需要了解尽量多的抗体基因序列。总的来说,所报导的引物设计可大致分为两类,一是前导肽序列引物或前导肽序列简并引物,利用该类引物已从人的杂交瘤和外周血细胞中扩增出VH基因;另一种是可变区基因5’末端互补引物。在本实验中,我们采用了半套式PCR法。先用Larrick等前导简并引物扩增出c DNA的可变区基因,加大模板量,其PCR产物再用Kang等的引物扩增,这样扩增率达到87%。这样的话,这种嵌套式PCR可以增加PCR产物的多样性,多少弥补由于转化效率不高而降低抗体库多样性的不足。
注:下划线处为酶切位点
其次,要使任何抗原都能从抗体库筛选出相应的抗体,就得保证抗体库中的抗体片段有足够的多样性,影响这一有效表位多样性的主要因素除了设计优良的PCR引物外还有细菌的转化效率。由于细菌转化率的原因,限制了噬菌体抗体库的容量,要构建有足够库容量的抗体库,常成为噬菌体抗体库的技术难点。要提高细菌的转化率,目前所用的转化方法首选的是电穿孔法,其转化效率高达1010个转化子/μg DNA。但如果在培养基中加入抗生素,其转化效率显著降低[5]。在制备电转化感受态细胞时,要加入氨苄青霉素或四环素,这两种抗生素正是对抗体库载体和大肠杆菌宿主进行抗性筛选时所需要的,因此就降低了电转化的转化效率。为了避免大肠杆菌性纤毛的丢失问题,我们采用了在过夜培养的时候,将四环素的浓度提高一倍,即20µg/m L,但在第二天以1∶100的比例接菌培养时,不加抗生素的方法。培养时间不能过长,一般以3~4小时细菌处于对数生长中期为适,否则老化的细胞太多,影响转化率的提高。
制备高质量的电转化细胞,优化电转化参数,能够提高转化效率,增加库容量。电转化参数包括电场强度、电脉冲的长度和DNA浓度。电压更高或电脉冲更长,转化效率会有所提高,但由于细胞生存率的降低,转化效率的提高将被抵消。一般来说,在各种文献的报道中,电转化参数的设置为:电压2.5KV,电容25µFD,电阻200~400Ω。但在本实验中,我们发现电压设为2KV和电阻设为200Ω时比电压为2.5KV和电阻为800或400Ω时,转化率更高。
本研究成功构建了人源抗肺癌噬菌体展示文库,为下一步筛选和鉴定具有肺癌细胞特异亲和力的人源性单克隆抗体奠定了基础。
参考文献
[1]廖美琳,赵家美,杨新法.肺癌[M].北京:中国医药科技出版社,2003.
[2]刘卫红,李志,王鹏,等.肿瘤相关抗原抗体联合检测在肺癌早期诊断中的价值评价[J].中国卫生检验杂志,2006,16(12):1412-1414.
[3]Barbas CF,Kang AS,Lemer RA,et al.Assembly of combinatorialantibody libraries on phage surfaces:the gene III site[J].Proc NatlAcad Sci USA,1991,88(18):7978-7982.
[4]Kohler G,Milstein C.Continuous culture of fused cells secretingantibody of predefined specificity[J].Nature,1975,256(5517):495-497.
[5]Steele C,Zhang S,Shillitoe EJ.Effect of different antibiotics onefficiency of transformation of bacteria by electroporation[J].BioTechniques,1994,17(2):360-365.
展示性教学 篇2
深圳市宝安区新湖中学席晓影
《语文月刊》2013.10
一、缘起
2012年11月我在广州生本教育中心郭思乐教授指导下开始尝试生本课堂。12月前往承德授课，当时上的是琦君的《春酒》。前一天给学生布置了作业：“阅读《春酒》。这篇文章哪些地方引发了你的思考或联想？请搜集与你的思考、联想有关的好作品，准备与大家交流。”
学生课堂上的交流内容让我大开眼界，比如“压岁钱”的“压祟”，“年”的来历，“万圣节”的“不给糖就捣蛋”，不仅带我熟悉了中外民俗（都可以写成一篇《“七夕”与“情人节”之比较》了），还打开了我的思路，引领我重新体味了鲁迅《社戏》、《五猖会》中的片段，更有位女同学以一段对“爸爸的手擀面”的深情描述，征服了所有听课师生的味蕾和情感。而这些还只是课堂的一部分。
课堂上，老师控制自己的“说”，给学生留出足够的空间，所激发的学生的潜能，所带来的快乐氛围引发了我深深的思考。
其实我也和学生一样完成了课前作业。平时的积累中，有不少作品与《春酒》带给我的思考相关，如琦君文集《爱与孤独》（《桂花雨》、《烟愁》等）、汪曾祺《端午的鸭蛋》、莫言《过去的年》、冯骥才《俗世奇人》、毛荣富《令人伤感的儿时美食》、刘慧勤《味蕾上的乡愁》、纪录片《舌尖上的中国》、费翔《故乡的云》、罗大佑《乡愁四韵》（歌曲）等，这些都可以作为课堂的养料，但我并没有忙着展示，我期待这些养料是有机的，若能不着痕迹地融入交流之中最好不过，否则，不必强求。听讲，是“学习金字塔”里非常低效的方式。在这种方式下，再好的养料都很容易化为飞灰，一丝不留痕。
这样以课文为原点进行发散性预习，课堂上进行展示的生本课堂是否成功？学生的精彩表现就是最好的回答。我也在实践中更深地体会到生本课堂的魅力。那么这种课堂到底有哪些成功的奥秘呢？
当宝安区初中语文教研员倪岗老师再次在教研会上大力推进阅读批注时，我豁然开朗。生本课堂中，不是蕴含着“阅读批注”的力量么？一篇文章，一般解决层次为读懂课文，搞 1
清字词——好读书，不求甚解。深度解决层次就应该是人人有点，点点有思，思思有文，文文可乐——每有会意便欣然忘食。（郭思乐语）
古老的“批注”方式在生本课堂上，正以一种新面貌呈现着闪亮风采。
二、操作
经过专家点拨、多次实践与提炼，形成了较为完整的“原点发散性预习及课堂展示”操作流程，并在各地授课中运用，获得听课教师的好评。
原点发散性预习，就是一种比较特殊的阅读批注——以文章为原点，进行批注，要求发散阅读，尽量把读到的好作品变成素材，纳入自己的批注之中，为批注插上有力的翅膀。
预习要求可参考具体课例：阅读《三颗枸杞豆》，说说这篇文章引发了你哪些关注、思考或联想。请搜集与你的思考、联想有关的古今中外的好作品（诗文书籍音乐影视时事热点皆可），准备与大家交流（抄写、复印、带书过来都可以，交流的内容要求能概括成文字）。如果是自己生活中的经历，可以写成一段文字，以自创作品的形式与大家交流。
至于课堂环节，就是小组交流、全班展示自己的阅读批注了。很多交流还能引发学生进一步的思考，进行二次批注。老师要鼓励学生互动，并适时点拨、过渡、小结。
“原点发散性预习及课堂展示”实践的课后作业布置，应引领学生将所交流的以及新生成的内容批注在文中，或整理成文字，一节课就是一个脚印，扎扎实实。课堂丰厚的，甚至能整理成一本书。这实在不是传统课堂可以匹敌的。
三、效果
“原点发散性预习及课堂展示”操作流程并不复杂，但细细品来，奥妙无穷。
首先，“原点发散性预习及课堂展示”实践以阅读为核心，为学生“听说读写思”等能力的发展搭建了很棒的平台。
课文是原点，是起点，预习作业要求寻找与对课文的思考或联想有关的作品，其间既借助作品的力量进行了思维训练，又对阅读提出了更高要求：平时的阅读面广，此时的思维才更活跃，调动起记忆中的库存后，因为要交流，可能还需要进行二次阅读、多次阅读。如果阅读面不广，至少也会加强阅读，带着思考去阅读。
课堂的交流，是对听、说很好的落实。传统课堂中，常是听讲，听老师讲，而“原点发散性预习及课堂展示”中听的内容，绝大部分是同学彼此的交流，参与度更高。同学在发言中，一开始会出现声音小、跑题、罗嗦、抓不住重点等情况，师生们的倾听和点评会反馈不
少信息，发言的人慢慢会做出调整，交流多了，讲话会慢慢变得简洁、清晰、流利，能抓住重点，还会适当地描述细节增强感染力，口语表达的技巧和能力在活动中得以提升。
课后作业对写作提出了要求，这是很重要的一步。写作形式可以更灵活，可以是批注，读后感，甚至是对课堂上大家发言的笔记进行整理。可以以班刊为平台，定期展示。一开始，养成写的习惯比写什么要重要。慢慢地，通过对所写内容的投票、评价，鼓励学生写出真实的感受，褒扬结合文本细节的表达，褒扬多角度的思考等等，用正能量不着痕迹地引导学生将读写与思考结合起来。
其次，“原点发散性预习及课堂展示”适应于初中生的实际阅读状况，能做到既不让孩子们畏难，又对他们有提升的助力。
带孩子阅读时，我们经常遇到一种尴尬，有些好作品，难了，学生不感兴趣；有些作品，孩子爱阅读，能理解，却停留在较低的阅读层次，无法提升。有时我们希望引领学生养成阅读批注的习惯以使阅读更深入，可偏偏学生的批注比较浅，或批注一些老生常谈的话。
在阅读以及批注习惯的初步养成阶段，“原点发散性预习及课堂展示”是很好的入门方法。因为我们的观点和想法是通过读到的“好作品”来交流的，我们的交流“站在巨人的肩膀上”，有强有力的后盾。这种对外力的借助方式，不但克服了学生最初独立组织语言表达自己思想（实质就是阅读批注）时无从下手的畏难情绪，还可避免进入缺少含金量的肤浅批注的误区。
第三，原点发散性预习及课堂展示淡化教材的精耕细作，让海量阅读成为可能。
学生从原点出发，发散性地主动搜寻阅读材料，比老师替代学生去组织阅读材料更有意义。一个人的推荐比不上一个班学生阅读的多元选择，学生的参与也比教师的参与更可贵。课堂上由一篇文章的学习变为海量阅读，在交流中还能激发学生的兴趣，促发生成，并进一步地推进课后的阅读。毕竟课堂上其他同学交流的作品是概括式的，不少精彩内容对自己来说可能是陌生的，要想充分消化或真正有所体会，还需要更亲密的接触。这样，“原点发散性预习及课堂展示”中的阅读就有了前身后世，为以后的常规批注打下扎实的基础，对读写的推进非常有力度。
原点发散性预习对海量阅读的推进还表现在，原点不一定是一篇文章，也可以是一类文章。这样整合课文，开展高效教学，又能给学生腾出更多的阅读时间，甚至将课外阅读课内化。
如学了老舍的《母鸡》之后，我将人教版七年级下册第六单元的《猫》、《斑羚飞渡》、《华南虎》整合在一起，布置了原点发散性预习，形成了以“与生灵共舞”为主题的读书交流会，共用两个课时进行了课堂展示交流。
同学们针对《母鸡》交流的内容有地震中为保护孩子而死的母亲留下的手机短信，有短文《藏羚羊的跪拜》，有电影《黑暗中的舞者》，有白居易的诗歌《母别子》等。老师从追问中发现，推荐《母别子》的同学并没有理解诗歌的内容，这就需要老师提出要求，用来交流的作品一定要自己领会了再讲给大家，为保障这个，最好脱稿。同学们关于《猫》、《斑羚飞渡》、《华南虎》的交流内容有电影《2012》、《少年派的奇幻漂流》中的精彩细节，有小说《狼王梦》、诺贝尔文学奖得主索尔·贝娄的短文《小画眉之死》等。
同学的交流还让老师想起了英国诗人劳伦斯的诗歌《蛇》、曹文轩的《第十一根红布条》以及沈石溪、椋鸠
十、西顿等作家的动物小说。也有同学想起了其他相关的内容，这就是一种互动、生成。
同学们精彩的交流常常让我感动，每次“原点发散性预习及课堂展示”实践的成功都让同学们更认真地准备下一次的交流。课堂还给了学生，学生更加积极主动，老师备课也更轻松高效了，备课时要做的，就是把自己当成学生，一起认真完成原点发散性预习。慢慢地，可将备课还原为自由阅读，不再专门为某一篇课文备课，上课时要依赖于平时阅读的素养与积淀，让“内功”发挥作用。语文老师能回到阅读中去备课，应该是幸福、快乐的吧。
当然这并不是对老师的要求降低了。面对未知，对老师的要求其实更高。老师既要有预设又不能拘泥于预设；在学生组内交流时，老师要敏锐，及时捕捉信息，分类整理以推进展示。能梳理出明晰思路，引领学生向更高层次发展的课堂需要老师机智的反应与合理的过渡。如“与生灵共舞”中，潜藏的思路有“动物与动物之间”、“人与动物之间”、“人与人之间”的关系等，每种思路还可以进一步分为积极的关系、消极的关系等，随着思维网络的细化、扩张，不断深入，可以交流的阅读库存被更充分地调动，这些都是教学的“真功夫”。老师不能完全不说，否则课堂很容易低效、肤浅，学生提升得少，兴趣热情就难以更好地激发，更别说敏于感受了；老师也不能说得太多占据学生的空间，而是要给学生更好的平台；一开始也不宜点拨得太深刻太精彩，“镇”住了学生会给学生压力，会影响学生的“说”，导致学生的“藏”，不妨通过巧妙的过渡或在小结时再梳理、提炼、启发，展示锦绣，给课堂留些“余味”。
真功夫打造的课堂，一定是思维的课堂、情感的课堂、活动的课堂。与人人参与的多元智能课堂相比，老师唱独角戏的“讲授”课，定会让人感受到什么叫无趣、乏味。
中班2013教学展示 篇3
班级:中班
幼儿园活动整合课程： 最棒的我: 1.音乐DOREMI《好朋友，行个礼》
2.生活小绝招《我长大了》
3.中华文化《脸谱会说话》
4.身体总动员《啦啦队》
5.自然放大镜《动物宝宝学本领》
6.儿歌《我的心》
7.创意小玩家《我的手指爱画画》
8.名画欣赏《我真棒》
9.社会万花筒《开心枕》
10.故事时间《小小熊》
妙妙鼻: 1.社会万花筒《为什么会哈啾》
2.生活小妙招《打喷嚏喽》
3.音乐DOREMI《合拢张开》
4.自然放大镜《其妙的鼻子》
5.科学爆米花《找水果》
6.身体总动员《大巨人打喷嚏》
7.儿歌《打蚊子》
8.创意小玩家《鼻子选美大会》
9.名画欣赏《大象》
伞花朵朵开: 1.故事时间《爱画画的公主》
2.儿歌《小雨伞》
3.科学爆米花《香香的香菇》
4.中华文化《油纸伞》
5.生活小绝招《我会用伞》
6.自然放大镜《像伞一样的蘑菇》
7.创意小玩家《伞王国》
8.身体总动员《大雨伞》
9.名画欣赏《遮太阳，挡风雨》
10.音乐DOREMI《下雨歌》
好忙的市场: 1.儿歌《大布袋》
2.故事时间《和妈妈上市场》
3.生活小绝招《走!逛超市去》
4.身体总动员《上菜啦》
5.创意小玩家《上菜市场》
6.自然放大镜《菜从哪里来》
7.科学爆米花《保存蔬果小妙方》
8.社会万花筒《好忙的便利店》
9.中华文化《秤》
10.名画欣赏《热闹的市场》
给你一封信: 1.故事时间《点点和多咪的信》
2.儿歌《小猫咪写信》
3．社会万花筒《寄信》
4.自然放大镜《鸽子信使》
5.创意小玩家《写封信寄给你》
6.音乐DOREMI:《谁是快递》
7.科学爆米花《神秘卡》
8.生活小绝招《寄包裹给外婆》
9.身体总动员《身体会说话》
10.中华文化《各式各样的邮票》
11.名画欣赏《写信的人》
12.玩具卡《小动物寄信》
我的数学: 1.认认读读
2.拼拼凑凑
3.形状王国
4.找影子
5.配成对
6.找出一样的
7.比一比
8.高矮排队
9.轻与重
10.谁钓的小鱼多
11.小猪请客
12.池塘边
13.小动物过桥
14.玩偶搭车
15.小动物一样多
16.谁多谁少
17.今天是星期几
18.串串排
19.8像麻花
20.从1排到10 蒙氏数学: 1.《物体的对应》
2.《按粗细排序》
3.《10以内的点数》
4.《目测数群》
5.《6,7的形成》
6.《数物结合6,7》
7.《8,9的形成》
8.《数物结合8,9》
9.《10的形成》
10.《数物结合》
11.《数字标记》
12.《描数字》
13.《序数１－５》
14.《１０以内倒着数》
15．《椭圆形》
16.《梯形》
字宝宝乐园：
１.猜一猜
２.小小的船 ３．静夜思
４.国旗红红的 ５.美丽的梦 ６.小蜡笔 ７.树医生
８.蚊子
９.打针
１０.猜一猜 １１.风儿在哪里１２.比耳朵
１３.比尾巴
１４.我做的事儿也不少 １５.好孩子