山楂黄酮（精选3篇）
山楂黄酮 篇1
高血压、高血脂等心脑血管疾病的增加已成为当今社会影响人类健康的一大难问题, 因此, 具有降压、降脂功效的药物研制一直受到人们的广泛重视;黄酮类化合物在这方面具有较好的疗效[l], 对它的研究也比较深入;黄酮类化合物的来源广泛存在于多种天然植物中, 现主要从银杏叶、山楂叶、葛根等天然植物中提取黄酮, 但其含量较低, 提取效率受到限制。
山楂果实中黄酮类化合物含量较高[2,3], 并含有其它有机酸等多种生物活性物质, 具有很高的综合利用价值。
据统计1995年全国山楂种植面积近达500余万亩, 总产量50余万吨, 但国内市场山楂鲜食和药用量总共尚不到产量的10%, 如何提高山楂利用率是山楂加工业发展必须解决的问题, 利用山楂果实提取黄酮和生理活性物质, 并对剩余物综合利用, 是解决问题的一个很好途径。
本实验采用单因素和正交实验法方法研究了乙醇回流提取和超声波辅助提取工艺条件对山楂黄酮提取效率的影响, 利用比色法测定含量, 得出最佳浸提工艺及相关工艺参数。
1 材料与方法
1.1 原料及试剂
山楂经哈尔滨商业大学药学院中药鉴定室鉴定为北山楂。
芦丁标准品 (中国药品生物制品鉴定所) 。
甲醇、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、Na OH均为国产分析纯试剂反渗透水为哈尔滨商业大学食品学院制备。
1.2 仪器及设备
722紫外分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司) ;索氏提取器 (上海第三分析仪器厂) ;DWF-100植物粉碎机 (河北省黄骅市科研器械厂) ;LXJ-64-01离心机 (北京医疗仪器修理厂) ;MALLO电子天平 (上海第二天平仪器厂) 。
1.3 方法
1.3.1 原料预处理:将干山楂果, 粉碎过20目筛, 105℃干燥2h, 备用。
1.3.2 芦丁标准液。精密称取芦丁15.0mg, 加甲醇溶解并定容至100 ml, 配制成150μg/ml的芦丁标准溶液, 作为对照品溶液。
1.3.3 标准曲线。分别精密吸取芦丁标准液0.00, 1.00, 2.00, 3.00, 4.00, 5.00ml相当于含芦丁0、150、300、450、600、750μg, 置于12.5ml比色管中, 加30%的乙醇补至5ml, 各加入5%亚硝酸钠溶液0.30ml, 摇匀后放置5min, 加入10%硝酸铝溶液0.3ml摇匀后放置6min, 加1.0mol/L Na OH溶液2.00ml, 用30%乙醇定容至刻度, 摇匀, 放置15 min, 以零管为空白。摇匀后用1cm的比色杯, 在510nm处波长处测定吸光度, 测3次取平均值, 经回归处理, 得标准曲线的回归方程和相关系数, Y=7.19×10-4×-3.31×10-2, 得出r=0.9879。绘制芦丁含量 (μg) 与吸光度的标准曲线, 结果表明, 芦丁浓度在150~750μg/ml范围内具良好的线性关系。
2 结果与讨论
2.1 乙醇回流提取单因素试验[l][2]
条件:将干山楂果, 粉碎过20目筛, 105℃干燥2h, 取山楂粉末1g, 置于回流提取器中, 回流提取3次, 合并提取液, 回收乙醇, 得山楂黄酮提取液, 定容至100ml, 测吸光度。
分别改变提取温度、乙醇浓度、料液比和提取时间进行单因素实验。
2.1.1 提取温度。
温度高低, 体现出分子无规则热运动的激烈程度, 随温度提高, 黄酮类化合物在乙醇溶液中的溶解度增加, 提取率提高, 但是温度过高时, 则杂质的溶出也会增加, 影响提取效率。
2.1.2 乙醇浓度。
随乙醇浓度的增加, 黄酮的提取率提高, 并呈现先急后缓的趋势。浓度也并非越大越好, 而有一个最佳值。在浓度为70%时, 提取最佳, 超过此值, 提取率增加不明显, 且增加成本。
2.1.3 料液比。
随料液比的增加, 提取率增加, 但当料液比 (质量:体积) >1:9时, 提取率增加缓慢, 增加液料比提取率变化不大, 这时黄酮类化合物的提取已经比较充分了。
2.1.4 提取时间。
在其它条件相同的前提下, 增加提取时间, 黄酮的提取率并不是一直增高, 当时间超过2h后, 提取率甚至有下降趋势, 这可能是黄酮提取物受氧化所致。因此将实验时间确定2.0h为最佳。
2.2 超声振荡法单因素试验[l][2]
条件:将干山楂果, 粉碎过20目筛, 105℃干燥2h, 取山楂粉末1g, 置于提取器中, 超声波辅助提取3次, 合并提取液, 回收乙醇, 得山楂黄酮提取液, 定容至100ml, 测吸光度。
分别改变超声波频率、作用时间、乙醇浓度和料液比进行单因素实验。
2.2.1 超声波频率。超声波频率增大, 作用增强, 提取率增加, 但并非一直增加, 其最佳值为40KHz。
2.2.2 超声波作用时间。随提取时间的增加, 黄酮的提取率呈正态分布, 时间超过15min后, 提取率有下降趋势。因为提取时间延长黄酮提取物也可能被氧化。最佳时间确定为15min。
2.2.3乙醇浓度。随乙醇浓度的增加, 黄酮的提取率也呈正态分布, 在浓度超过70%时, 提取率增加不明显, 确定乙纯浓度为70%。
2.2.4料液比。一般来讲, 料液比愈大提取率愈大。但当料液比超过40时, 提取率趋于稳定, 即一定比例的溶剂已将有效成分基本全部溶出。
2.3 正交实验的设计
正交法方法确定过程是在以上单因素实验的基础上, 设计了L9 (34) (表1) 的正交实验。四个因素为:超声波频率、乙醇质量分数、浸提时间、料液比。 (表2)
由正交实验结果可知, 山楂果肉粉末 (105℃干燥2h) 利用超声振荡辅助提取山楂黄酮的最佳提取条件A2B3C1D2为:
用体积是40倍于其重量的70%乙醇浸泡, 在频率为40 KHz的超声波下作用下提取15min, 为最佳提取工艺。
对以上数据进行方差分析 (置信度=95%) , 结果如下:
影响超声波辅助提取的诸因素中, 对提取效果的影响大小依次是:乙醇浓度>超声波频率>超声波作用时间>料液比。
2.4 验证试验
为进一步证实乙醇回流提取和超声波辅助提取山楂黄酮的可靠性和合理性, 我们对所优选的工艺条件作了验证试验。重复3次。考虑到生产成本, 确定乙醇回流提取的条件为, 乙醇浓度70%, 温度70℃, 作用时间2h, 料液比1:40;超声波辅助提取的正交试验的验证结果为, 4.203%, 4.312%, 4.410%, 平均为4.308%, 可见本试验所选择的工艺条件是适宜的。
3 结论
山楂黄酮的提取提供优选工艺参考如下:提取方法:乙醇浸提, 辅助超声波震荡。
工艺流程:山楂去核→干燥→粉碎→加乙醇溶液→超声震荡→过滤→浓缩→提纯。
取干燥山楂果粉2.5g, 加70%乙醇100ml超声3次, 每次15min, 间隔15min, 合并提取液, 回收乙醇, 得山楂黄酮提取液, 定容至100ml, 测吸光度。
工艺参数:溶剂:70%乙醇, 超声波频率:40KHz声波作用时间:15min。料液比:40倍。
超声波提取方法有操作简单、提取时间短、提取效率高, 纯度高、无需加热, 剩余物无有害残留, 可以综合利用等优点。
另外, 采用乙醇超声提取方法, 简便易行, 节约有机溶剂, 所用试剂对人体较为安全, 因此适于大规模生产, 剩余物以糖、果胶、蛋白质和纤维素等, 可以作为食品原料加以综合利用。
摘要：对山楂总黄酮含量的提取, 不同工艺影响很大。本文采用单因素和正交实验法方法研究不同工艺条件对山楂黄酮提取效率的影响, 得出最佳浸提工艺及相关工艺参数。
关键词：山楂黄酮,黄酮提取,超声波,乙醇
参考文献
[l]Zhang Y, Li H W, Zhang Y C, et al.Study on extraction meth-ods of flavonoida from hawhorn fruits and their deyermination[J].JOURNAL OF HAREIN MEDICAL UNIVERSITY (哈尔滨医科大学学报) 2001, 35 (3) :183-184.
[2]Zhou Q X, Gu M, Wang W X, et al.Deyermination on Com-paring of Flavones Extraction the different Mothods to Extract fromChinese Hawthorn Leaf[J]SUZHOU UNIVERSITY JOURNAL OFMEDICAL SCIENCE (苏州医学院学报) , 2002, 22 (2) , 164
[3]Sun L L.Deter mi nation of Flavonoids in Fructus Crataegiby Colormetry[J].Chinese Traditional Patent Medicine (中成药) 2001, 23 (10) :748-750.
山楂黄酮 篇2
关键词：广山楂,总黄酮,可见分光光度法,含量测定
广山楂又叫乌婵子、古蝉子, 为蔷薇科苹果属植物台湾林檎Malus doumeri (Bois) Chev.和光萼林檎Malus leiocalyca S.Z.Huang的干燥成熟果实。广山楂含有丰富的黄酮类化合物, 其主要成分为芦丁、金丝桃苷、牡荆素等, 此外还含有有机酸类、三萜类等多种成分[1], 是健脾开胃、消食化滞、活血化痰的良药, 也具有降血脂血压、强心、抗心律不齐等作用, 对胸膈脾满、疝气、血淤、闭经等症有很好的疗效[2]。
广山楂在广西作为药用山楂历史悠久, 果大色淡, 与市场上北山楂区别较大, 国内目前主要集中在北山楂生药学、药理药效及复方制剂等的研究[3,4,5]。本实验采用可见分光光度法, 对广西不同产地广山楂果实中总黄酮含量进行测定, 以期为广山楂的质控方法提供借鉴。
1 仪器与试药
仪器:TU-1810PC可见紫外分光光度计 (北京普析通用有限公司) ;梅特勒AL204电子天平 (梅特勒-托利多仪器上海有限公司) ;KQ-400DB型数控超声器 (昆山市超声仪器有限公司) ;BS2202S分析天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司) 。
试药:芦丁对照品 (批号:100080-201407) 购自中国食品药品检定研究院;甲醇为分析纯;实验用纯净水;其他试剂均为分析纯。广山楂药材为蔷薇科植物台湾林檎Malus doumeri (Bois) Chev.的干燥成熟果实。药材分别采自广西柳城、广西平南、广西贺州、广西凭祥、广西百色等地。
2 方法与结果
2.1 提取方法考察
本实验考察回流提取、超声提取2种不同提取方法, 实验结果表明, 超声提取法得到的总黄酮含量较高, 所以采用超声法提取广山楂。
2.2 测定方法确定
精密吸取供试品溶液0.5mL, 置10mL容量瓶中, 先加入水0.3mL, 加入5% 亚硝酸钠溶液0.3mL, 摇匀, 放置6min。加入10%硝酸铝溶液0.3mL, 摇匀, 放置6min, 再加入4% 氢氧化钠溶液4mL, 最后加水至刻度, 摇匀, 放置10min, 待测。结果表明, 此方法在505nm处有吸收, 故采用NaNO2-Al (NO3) 3-NaOH法测定广山楂中总黄酮含量。
2.3 提取工艺研究
经过预实验考察, 确定超声次数为1 次, 选择料液比 (A) 、甲醇浓度 (B) 、超声时间 (C) 为考察因素, 每个因素选择3个水平, 采用L9 (34) 正交实验设计, 以总黄酮含量为考察指标, 优选广山楂总黄酮的最佳提取工艺, 试验安排及结果见表1、表2。
注:F0.05 (2, 2) =19。
从实验结果可知:各因素对提取效果的影响大小顺序为:A (料液比) >C (超声时间) >B (甲醇浓度) , 直观分析得提取工艺为A2B3C3。即甲醇浓度为90%, 料液比 (g/mL) 1∶20, 超声时间30min。A因素影响有显著性差异 (P<0.05) , B因素与C因素影响差异不显著。
2.4 验证试验
根据上述试验所确定的最佳工艺A2B3C3, 准确称取广山楂3份各1g, 以确定的最佳工艺提取, 同时测定其总黄酮的含量, 分别为0.073%、0.068%、0.075%, 平均含量为0.072%。结果表明该工艺较稳定。
2.5 溶液制备
2.5.1对照品溶液制备精密称取芦丁对照品约10.25mg, 加甲醇定容至50mL容量瓶中, 得0.205mg/mL芦丁对照品溶液。
2.5.2 供试品溶液制备精密称取广山楂药材1g, 加入90%甲醇20mL, 超声30min后, 补足缺失的重量, 过滤, 即得。
2.6 方法学考察
2.6.1 线性关系考察分别精密吸取2、3、4、6、7、8mL芦丁对照品溶液于25mL容量瓶中, 按照 “2.2 NaNO2-Al (NO3) 3-NaOH法”方法添加显色剂, 以相应试剂为空白进行测定, 在505nm波长处测定吸光度, 以浓度 (mg/mL) 为横坐标, 吸光度为纵坐标, 得回归方程Y=11.819X+0.0304 (r=0.999 5) 。结果表明芦丁浓度在0.016 4~0.065 6mg/mL范围内呈良好线性关系。
2.6.2 精密度试验取同一对照品溶液, 连续测定6次, RSD为0.3%, 表明本法精密度良好。
2.6.3 稳定性试验取供试品溶液1份, 每隔10min测定吸光度, 连续测定6次, RSD为1.2%。表明供试品溶液在60min内较稳定。
2.6.4 重复性试验取同一批药材粉末, 按“2.5.2”供试品溶液的制备方法平行制备供试品溶液6份, 测定吸光度, RSD为1.5% (n=6) 。表明该方法重复性良好。
2.6.5 加样回收率试验取已知含量的药材粉末, 加入一定量的芦丁对照品, 按“2.5.2”下供试品溶液制备方法平行制备样品溶液6份, 并按照“2.6”项下最大吸收波长进行检测, 计算平均回收率为98.53%, RSD为1.39% (n=6) 。
2.7 样品测定
精密称取5个产地的广山楂药材, 按“2.5.2”下供试品溶液制备方法制备样品溶液, 测定吸光度并计算其总黄酮含量。结果见表4。
3讨论
广山楂含多种黄酮类化合物, 其在预实验阶段考察纯水、乙醇、甲醇作为提取溶媒以及考察不同提取方法, 发现甲醇超声提取时, 所测得药材中总黄酮含量最高, 进而选定甲醇超声提取。
在实验过程中发现, 显色反应会随着显色温度和显色时间的变化而变化, 60min内变化缓慢, 较稳定, 60min后其吸光度值会下降, 因此实验过程中应严格控制条件, 尽量排除干扰。
从样品的含量来看, 广西贺州广山楂总黄酮含量最高, 广西凭祥广山楂总黄酮含量最低。初步判断, 广山楂总黄酮含量高低与产地、生长期、采收期均有关系。
参考文献
[1]陈勇, 甄汉深, 陆雪梅.广山楂主要化学成分的定量研究[J].中药研究与信息, 2000, 2 (11) :18.
[2]李贵海, 孙敬勇, 张希林, 等.山楂降血脂有效成分的实验研究[J].中草药, 2002, 33 (1) 50-52.
[3]广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准[M].南宁:广西科学技术出版社, 1992, 21 (22) :139-141.
[4]聂伟明, 王永刚.山楂与广山楂的鉴别[J].时珍国医国药, 2006, 17 (11) :2146.
山楂黄酮 篇3
1 材料与方法
1.1 实验药物
山楂总黄酮（洛阳华新制药有限公司，批号990306），含量83.9%；华佗再造丸（广州奇星药业有限公司，批号011129），规格80 g/瓶；尼莫地平（山东新华制药股份有限公司，批号0309118），规格20 mg/片。
1.2 动物和饲料
雄性小鼠，昆明种，体重18～20 g（豫医动字第410115号）。鼠全价营养饲料（豫医动字第410101号），均由河南医学动物实验中心提供。
1.3 试剂
地塞米松磷酸钠注射液（Dexamethasone,DX）（江苏涟水制药，批号0302273），规格5 mg/支；肝素钠（上海生物化学试剂公司，批号20020509），规格1 g/瓶。
1.4 仪器
LBY-N6A型旋转式血液黏度计（北京普利生集团）。
1.5 方法
1.5.1 血瘀模型的复制方法
取雄性小鼠80只，昆明种，随机分为8组，分别灌服大、中、小剂量的HFs(0.40、0.20、0.10 g/kg，配成浓度为20、10、5 mg/ml的溶液），尼莫地平（0.02 g/kg，配成浓度为1 mg/ml的溶液），华佗再造丸（1.33 g/kg，配成浓度为66.5 mg/ml的溶液）及同体积的生理盐水（灌胃体积均为0.2 ml/10 g，为3组：空白组、手术组、假手术组），每天给药1次，同时每天后腿肌肉注射地塞米松0.8 mg/kg（空白组注射生理盐水），连续给药15 d。
1.5.2 脑缺血-再灌注损伤模型复制方法
于第16天给药后1 h、禁食后10 h造脑缺血-再灌注模型。给予4%水合氯醛溶液0.1 ml/10 g腹腔注射麻醉，小鼠板固定后，做颈部正中切口，分离并结扎双侧颈总动脉30 min，再灌注20 min（其中假手术组只分离颈总动脉而不结扎），然后摘眼球取血，肝素抗凝，测全血黏度；取脑测脑水肿做病理切片等。
1.6 统计学方法
数据以均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 10.0统计软件进行分析，P<0.05表示有显著性差异。
2 结果
2.1 HFs对血瘀合并脑缺血-再灌注模型小鼠血液黏度的影响（表1)
与空白组比较,△△P<0.01;与手术组比较,*P<0.05,**P<0.01;与假手术组比较,☆P<0.05,☆☆P<0.01
从表1可以看出，与空白组比较，手术组和假手术组全血黏度值的改变有非常显著性差异（P<0.01），表明造模成功；与手术组和假手术组比较，HFs大、中剂量组、尼莫地平组和华佗再造丸组全血黏度值的改变有显著性差异（P<0.01或P<0.05），表明HFs对血瘀合并脑缺血-再灌注模型小鼠的血液黏度有改善作用。
2.2 HFs对血瘀合并脑缺血-再灌注模型小鼠脑含水量和Ca2+的影响（表2)
与手术组比较,*P<0.05,**P<0.01
从表2可以看出，与手术组比较，假手术组的脑含水量和细胞内Ca2+含量的变化有非常显著性差异（P<0.01）；与手术组比较，HFs大、中剂量组、尼莫地平组和华佗再造丸组的脑含水量和细胞内Ca2+含量的变化有显著性差异（P<0.01或P<0.05），表明HFs有预防血瘀合并脑缺血-再灌注模型小鼠发生脑水肿和细胞内Ca2+超载的作用。
2.3 HFs对血瘀合并脑缺血-再灌注模型小鼠脑组织显微结构的影响（表3)
手术组的动物脑神经细胞的损伤表现为细胞结构上的自溶，其病理特征为：树突、轴突及细胞核模糊不清，与正常小鼠有着明显的差异，而神经胶质细胞也明显减少，证明造模成功；假手术组细胞体积未见增大、结构正常，未见异常变化，细胞数量的减少可能与部位有关；HFs对小鼠血瘀性脑缺血-再灌注模型损伤具有显著的拮抗作用，从大、中、小剂量上观察，其病理改变随剂量增加而作用增强。
3 讨论
《医学衷中参西录》中记载：“山楂，味至酸微甘，性平。皮肉红黄，故善入血分，为化瘀血之要药……且兼入气分以开气郁痰结，疗人腹疼痛。若以甘药佐之，化瘀血而不伤新血，开郁气而不伤正气，其性尤以和平也”。《日用本草》中有山楂“消血痞气块”的记载。同样《食鉴本草》中也有山楂“化血块、气块，活血”的记载。由此可见，山楂应有较好的活血化瘀、抗血栓形成的作用。现代研究也表明HFs对脑缺血损伤有保护作用。
《医学纲目》把脑卒中的发病机制概括为“中风皆因脉道不利，血气闭塞”。当血瘀形成后，不仅会导致新血不生，脑髓失养失用，还会发生一系列变化，一方面，瘀血阻滞、气血津液不得畅行而外渗，稀者为故，浊者为痰，形成脑水肿；另一方面，瘀血阻滞郁而化痰生火，出现气机升降逆乱，产生脑卒中的症状。由此可见，缺血性脑卒中的发生和发展，与瘀血的形成及由此产生的一系列病理变化有密切关系。从现代医学角度讲，血液流变学是测定血液黏滞性和聚集性的重要检查指标，血液流变学指标增高可导致脑血流速度减慢和血红蛋白携氧能力下降，脑的有效血流量减少，从而产生眩晕诸症。实验表明，HFs能改善小鼠血瘀性脑缺血-再灌注模型的全血黏度，改善血液流变性，增加脑部的血流量，改善脑部的血氧供应。
脑缺血损害的病理生理研究表明，脑缺血时存在严重的Ca2+平衡失调，大量Ca2+蓄积在神经组织内产生严重的毒性作用，诱发一系列的病理反应，加剧继发性脑缺血损害，使神经细胞变性坏死，引起脑能量代谢障碍，造成细胞内酸中毒和高渗透压，导致脑细胞水肿，引发兴奋性氨基酸和谷氨酸累积，最终导致脑水肿的发生。Ca2+超载还可导致细胞内环境破坏，产生的游离脂肪酸、溶血磷脂可引起细胞毒性，导致细胞损伤的不可逆转化，向细胞核扩散，造成DNA裂解。线粒体中的Ca2+超载可导致ATP生成受到抑制，促进自由基生成，促进低氧性酸中毒。实验表明，HFs可减少小鼠血瘀性脑缺血-再灌注模型的Ca2+蓄积，减轻Ca2+超载的程度，从而减轻脑细胞水肿的程度。
据报道，脑体积的一半是由神经胶质细胞构成的。正常生理条件下，胶质细胞向神经元提供支持、隔离、营养、清洁和防御作用，是维持脑组织离子环境稳定的重要因素。缺血性损伤后，胶质细胞通过与神经元之间或胶质细胞之间的相互作用影响缺血的发展，通过观察发现，缺血所造成动物脑神经细胞的损伤，除神经细胞表现为退行性改变外，神经胶质细胞的损伤表现更为突出，主要是细胞数量的减少。实验表明，HFs对血瘀性脑缺血-再灌注模型小鼠脑组织病理改变有明显的拮抗作用，并呈正相关的量效关系。
本研究表明，HFs可改善血液黏度，改善血液流变性，减轻Ca2+超载的程度，从而减轻脑细胞水肿，拮抗缺血引起的脑组织病理性改变，减轻缺血低氧对脑组织的损伤，从而对血瘀性脑缺血-再灌注模型小鼠产生保护作用。
摘要：目的:观察山楂总黄酮对小鼠血瘀性脑缺血-再灌注模型全血黏度、脑含水量及脑组织损伤的影响。方法:用地塞米松复制小鼠血瘀模型;结扎双侧颈总动脉30min,再灌20min复制脑缺血-再灌注模型;通过测定该模型小鼠全血黏度、脑水肿、Ca2+和观察脑组织病理学的情况,探讨山楂总黄酮对小鼠血瘀性脑缺血-再灌注模型血液流变性、脑含水量、Ca2+和脑组织的影响。结果:山楂总黄酮能明显改善血瘀性脑缺血-再灌注小鼠的全血黏度(P<0.05),能显著或明显减轻脑组织Ca2+的超载程度(P<0.01或P<0.05),明显减轻脑水肿程度(P<0.05),对脑神经细胞和胶质细胞损伤有明显的拮抗作用。结论:山楂总黄酮能改善小鼠血瘀性脑缺血-再灌注模型血液流变性,预防脑水肿的发生和Ca2+超载,改善脑组织的病理情况,具有保护脑缺血-再灌注损伤的作用。