猪呼吸道冠状病毒

猪呼吸道冠状病毒（共8篇）

猪呼吸道冠状病毒 篇1

近期, 美国国家动物健康实验室网络 (NAHLN) 开始收集猪德尔塔冠状病毒 (SDCv) 的检测数据。SDCv与引起猪流行性腹泻 (PED) 的病毒类似, 发病症状类似但相对较轻。

据美国猪兽医协会 (AASV) 本周最新报告, 最近一周报告有215例病例。新增25例SDCv阳性报告, 累计报告阳性病例50例。目前为止共检测319例, 13%的检测样本为阳性。迄今为止, 美国已有10个州的农场报告出现SDCv阳性病例。

猪呼吸道冠状病毒 篇2

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)和伪狂犬病(pseudorabies,PR)是两种严重危害养猪业的重要病毒性的.传染病.而引发PR的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是构建基因工程疫苗优良的活病毒载体[1].已有报道将表达猪瘟病毒(hog cholera virus, HCV)囊膜蛋白E1基因的重组PRV(rPRV)二价基因工程疫苗免疫猪后, 能同时抵抗HCV和PRV的强毒攻击[2],显示了PRV作为活病毒载体的可行性和“一针防两病”的独特优点.由ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)最主要的免疫保护性抗原蛋白[3].

作 者： 赵武 肖少波 方六荣 江云波 宋云峰 严琳 余晓岚 陈焕春 ZHAO Wu XIAO Shao-bo FANG Liu-rong JIANG Yun-bo SONG Yun-feng

刊 名： 病毒学报  ISTIC PKU 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY 年，卷(期)： 2006 22(1) 分类号： Q786 关键词： 牛疱疹病毒1型VP22   猪繁殖与呼吸综合征病毒   ORF5M基因   重组伪狂犬病毒

★ 母猪产后泌乳障碍综合征的防制

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★ 写作技巧与方法

猪呼吸道冠状病毒 篇3

关键词：猪场传染性胃肠炎,呼吸道冠状病毒病,血清,调查

近年来, 猪场传染性胃肠炎 (TGE) 给三明市规模化养殖场造成了严重经济损失。TGE是由猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 引起的一种以2周龄以内仔猪呕吐、严重腹泻、脱水和高死亡率为主要特征的高度接触性肠道传染病[1,2]。病原为冠状病毒科冠状病毒属的单股正链RNA病毒, 只有一个血清型, 与猪呼吸道冠状病毒 (PRCV) 有一定的抗原相关性。后者被认为是TGEV的一个基因缺失变异株, 不表现临床症状或临床症状比较温和, 给猪传染性胃肠炎实验室血清学诊断带来一定干扰[3,4]。同时, 猪呼吸道冠状病毒病 (PRC) 在国外的流行和传播证据表明, 该病在猪场的传播和隐性存在, 对TGE的感染和发病有一定的影响。这也是在开展猪传染性胃肠炎血清学监测的同时, 引入PRC监测的原因。2012年通过监测三明地区21个规模猪场传染性胃肠炎和呼吸道冠状病毒病的血清学情况, 从而掌握两种疫病在三明市的流行状况, 为规模猪场的疫病防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 猪血清样品

2012年共采集21个规模猪场的血清样263份。

1.1.2 诊断试剂盒

猪传染性胃肠炎和呼吸道冠状病毒病抗体检测试剂盒 (Svanova, 批号44000-6084) 。

1.1.3 仪器设备

Eppendorf单道移液器、Transferpette 8道移液器、Sunrise Remote酶标仪、Tecan自动酶标洗板机。

1.2 方法

1.2.1 操作过程

所有试剂在使用前一律恢复至室温 (18~25℃) , 轻轻摇动或旋转, 使试剂混合均匀。PBS原液20倍稀释, HRP酶结合物稀释根据说明书操作。未加入样品前, 用PBS-Tween溶液洗板3次, 每次让洗液在板中停留1 min, 最后1次将板拍干。按照说明书分别加入100 u L阳性对照、阴性对照, 样品孔双孔, 每孔分别加入50 u L PBS-Tween和50 u L血清, 轻微震荡反应板, 密封, 于37℃温箱中孵育2 h, 洗涤3次, 拍干。分别加入100 u L antitgev溶液至样品第一孔, 加100 u L anti-tgev/prcv溶液至样品第二孔, 室温孵育30 min, 洗涤3次, 拍干。每孔加入100 u L酶结合物, 室温孵育30 min, 洗涤3次, 拍干。加100 u L底物, 室温孵育30 min, 加50 u L终止液, 混匀, 15 min内在450 nm波长 (或双波长450 nm和620 nm) 测定和记录样品以及对照的吸光值。

1.2.2 计算结果

在阴性、阳性对照成立的基础上, 根据试剂说明书对结果进行判断。

2 结果分析及讨论

从表1中可以看出, PRC抗体含量高的场, TGE抗体含量明显偏低, 这是由于猪只感染PRCV后所产生的抗体可中和TGEV, 产生交叉保护。

PRCV的感染呈亚临床型, 所引起的临床症状及严重程度取决于毒株的差异, 临床症状比较温和或不表现症状, 与TGE完全不同[3,4]。仔猪人工感染PRCV后出现短暂发热, 肺部啰音, 生长受阻;母猪人工感染后, 部分猪只出现咳嗽及繁殖障碍。仔猪通过吮乳获得保护, 并可抵抗TGEV感染。PRCV可通过空气或相互接触而感染所有年龄的猪只。

从表2的结果可以看出, 三明地区完全没有感染的场较少, 仅有3个场, 占14.3%。

加强饲养管理是控制该病的关键。TGEV极易传入猪场, 因此, 猪场应坚持自繁自养, 如确实需要引进种猪, 则应避免从疫区或发病猪场引进, 并对引进的种猪严格检疫, 在隔离场隔离观察1个月以上, 经检测确实无该病时方可合群。同时, 禁止外来人员及车辆进入猪场范围内。实施“全进全出”的生产模式, 分娩舍应做好保温工作, 特别是冬春季节, 日夜温差较大, 应注意防寒保暖, 保持猪舍干燥、清洁卫生, 尽早使初生仔猪吃足初乳[5]。

参考文献

[1]许世清.猪传染性胃肠炎[J].中国畜牧兽医文摘, 2011 (6) :160-161.

[2]彭旺兴.试论猪传染性胃肠炎[J].现代农业科学, 2009 (4) :207-208.

[3]李焕荣, 张春叶, 林祥梅, 等.猪呼吸道冠状病毒及实验室诊断方法研究进展[J].北京农学院学报, 2007 (2) :78-80.

[4]房红莹, 窦守强, 罗满林.猪呼吸道冠状病毒研究进展[J].中国兽药杂志, 2007 (5) :40-43.

猪呼吸道冠状病毒 篇4

猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员。有囊膜, 单股正链RNA。PRRSV有欧洲型和美洲型两个基因型, 二者的基因组和抗原性差异很大, 但引起相似的症状。我国分离株为美洲株, 其中引起高致病性蓝耳病的的毒株为基因变异株。本研究对疑似蓝耳病的病料进行病毒的分离, 经RT-PCR、病毒培养特征免疫荧光技术等检测, 证实为猪繁殖与呼吸综合征病毒。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本2011 年学院动物医院病例。患猪体重30-50Kg, 厌食, 精神沉郁, 体温高、眼睛流泪, 眼脸水肿、咳嗽、气喘, 有的猪只腹部皮肤发红, 耳朵发绀。剖检淋巴结肿大, 棕褐色, 肺脏红褐色花斑状。

1.1.2 试剂及仪器Marc145细胞由山东农业大学赠送, 本实验室保存;PRRSV N蛋白单克隆抗体由山东省农业科学院畜牧所猪病室赠送;羊抗小鼠Ig G-FITC、胰蛋白酶、DMSO为Invitrogen产品;新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司, RT-PCR试剂盒购自青岛立德生物有限公司, 磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾等为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 病料采集和处理剖检疑似PRRS病例, 无菌采集病猪的气管和肺脏组织。病料剪碎, 按1:5加入灭菌生理盐水, 匀浆, 冻融3次, 4℃10000r/min离心20min, 收取上清液, 过滤除菌, 作为RT-PCR检测和病毒分离培养用样品。

1.2.2 电泳、观察反转录PRC (RT-PCR) 提取核酸, 42℃反转录40min (RT buffer Mix 14.5Ul, M-MLV 1μl, Primer1.5μl, 模板核酸3μl) , 为c DNA;然后进行PCR扩增 (PCR buffer Mix 26.5μl , Taq DNA聚合酶0.5μl , 模板2μl , primer 1μl) 94℃预变性5min ;变性20s , 55℃退火40s , 72℃延伸40s, 30个循环, 72℃终延伸5min。取PCR产物8ul在2%琼脂糖凝胶上电泳, 用凝胶成像仪观察结果。

1.2.3 病毒的分离鉴定在6孔细胞板上用含10%新生牛血清的EMEM将Marc145细胞培养至单层, 将细胞培养液置换成维持液, RT-PCR检测阳性的样品过滤除菌后0.1ml接种于Marc145细胞单层, 于37℃、5%CO2条件下培养, 观察CPE。出现PRRSV典型CPE (细胞变圆、皱缩、聚堆、折光性增强) 的样品, 以RT-PCR验证。将第6代细胞分离毒在96孔细胞培养板上进行病毒滴度测定, 根据Reed—Munch法计算分离毒TCID50。

1.2.4 免疫荧光检测 (IFA) (1) 将Marc145细胞在12孔板上进行爬片培养, 形成细胞单层后换成维持液, 并接种0.1MOI PRRSV, 病毒接种后30h, 吸弃细胞培养液, 用PBS小心冲洗3次, 加入甲醇/丙酮液固定。将爬片取出, 进行免疫荧光检测。 (2) 方法:加PRRSV N蛋白单克隆抗体, 37℃作用1~2h, PBS洗涤5次;滴加羊抗小鼠Ig GFITC, 37℃避光作用1~2h, PBS洗涤5次;用OLYMPUS倒置荧光显微镜观察。

2 结果

(1) 病料处理后的样品, 经RT-PCR扩增, 紫外检测, 观察到目的条带, 见图1。 (2) 对PCR阳性的病料用Marc145细胞进行培养, 培养至第二代出现典型CPE, 见图2。并以RT-PCR进行重复验证。 (3) 以PRRS N蛋白单克隆抗体为一抗, 以羊抗小鼠Ig G-FITC为二抗进行染色, 在荧光显微镜下, 样品接种组观察到细胞中明显的荧光, 对照组没有观察到荧光。见图3。

3 小结与讨论

病料RT-PCR检测结果、Marc145细胞上形成的CPE、免疫荧光检测结果证实所分离的病毒为PRRSV, 命名为SD16株。猪繁殖与呼吸综合征在猪场广泛存在, 猪只发病导致直接经济损失巨大, 而免疫抑制和持续感染状态的存在也给免疫和净化带来很大困难。在综合防控方案中, 对于疑似病例的及时准确的诊断十分重要。PCR检测是目前较快速的诊断方法之一, 在对临床病例的诊断中, 结合临诊症状、病例变化可做成较为准确的判断。但因PCR操作环境可能受气溶胶污染等因素的影响, 也需考虑PCR结果的特异性问题。因此, 在临床诊断的基础上, PCR检测、细胞培养和IFA检测相结合, 可从病毒生长、免疫、基因等不同特征对分离的病毒进行鉴定, 为猪场PRRS的长期防控方案提供更准确有力的数据支持。

参考文献

[1]Deendayal Patel, Yuchen Nan, Meiyan Shen, et al.Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Inhibits Type I Interferon Signaling by Blocking STAT1/STAT2 Nuclear Translocation, Journal of Virology, 2010, 84 (21) :11045–11055.

[2]Yuchen Nan, Rong Wang, Meiyan Shen, et al.aI nduction of type I interferons by a novel porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate, Virology, Virology, 2011, 85 (11) :5705.

[3]Yanjin Zhang, Rameshwer D.Sharma1, Prem S.Paul, Monoclonal antibodies against conformationally dependent epitopes on porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Veterinary Microbiology1998, 63:125-136.

[4]蔡家利, 姜平, 蔡宝祥.应用RT2PCR检测流产胎儿组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒[J].中国病毒学, 2000, 15 (3) :272-276.

猪呼吸道冠状病毒 篇5

目前, PRRSV主要是转瓶细胞培养的传统培养方式。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢而且生产过程中无法提供最佳的培养条件, 造成该方法自动化程度低, 劳动强度大, 产量低等问题。进而我们进行了用细胞工厂培养PRRSV的试验研究。

1 材料

1.1 毒株

PRRSV (Hu N4-F112株) , 购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 主要试剂

DMEM培养基购自Gibco公司, 进口胎牛血清购自Hyclone, 胰酶购自Washington公司, Nunc Easy Fill细胞工厂 (10层, 培养面积6320cm2, 工作容量2000m L) 购自Thermo Fisher。

1.3 细胞及传代培养

细胞:Marc-145细胞购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 在本实验室已扩增冻存, 目前在本实验室传至75代, 已经适应在本实验室的培养基中生长。

2 方法

2.1 细胞传代的方法

首先复苏所选择的种细胞Marc-145到T75的细胞瓶中, 生长48h左右, 按照1:4的比例进行传代;然后把6个长满细胞的T75细胞瓶中的细胞传到1个10L转瓶进行培养;48h左右按照1:3的比例进行细胞传代培养;该过程中使用的培养基为DMEM, 血清为胎牛血清, 使用量为10%。

收获转瓶中的细胞:将转瓶中所得细胞用PBS洗涤2次, 然后加入浓度为0.25%胰酶-EDTA溶液125m L消化, 收集细胞。

收获得细胞经计数后, 采用Thermo Scientific Nunc细胞工厂 (10层, 培养面积6320cm2, 工作容量2000m L) 对Marc-145细胞进行培养;所用的培养基是DMEM培养基。所用其它试剂包括牛血清、TPCK-胰酶等。细胞接种后在12h、24h、48h取样观察细胞在细胞工厂上的生长状况。

2.2 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒在细胞工厂中增殖条件优化

分别研究了细胞密度、病毒感染复数 (MOI) 、维持液中血清浓度和病毒吸附时间4个因素对蓝耳病病毒 (PRRSV) 增殖的影响, 比较PRRSV病毒在不同增殖条件下TCID50的差异。

2.2.1 细胞密度对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒增殖的影响

在不同细胞密度 (表1) , 按MOI=0.2接种病毒, 37℃培养, CPE达80%左右收获病毒, 比较PRRS病毒TCID50, 结果见表1。

从表1中可以看出, 细胞密度为0.8×105细胞/m L时, PRRSV的病毒滴度达到了108.15;优于其它处理。因此, 本发明利用细胞工厂增殖PRRS病毒的细胞密度确定为0.8×105细胞/m L。

2.2.2 病毒感染复数 (MOI) 对PRRS病毒增殖的影响

在细胞密度为0.8×105细胞/m L, 按MOI=0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.5分别接种PRRS病毒, 37℃培养, CPE达80%左右收获病毒。比较PRRS病毒TCID50, 结果见表2。

从表2中可以看出, 病毒感染复数MOI为0.8时, PRRS病毒滴度达到了108.41;优于另外几种处理。病毒感染量过低使增值速度降低, 无法达到较高的病毒滴度。因此, 本发明利用细胞工厂增殖PRRS病毒的病毒感染复数MOI为0.8, 病毒增值速度较快, 且达到较高的TCID50。

2.2.3 血清浓度对PRRS病毒增殖的影响

在细胞密度为0.8×105细胞/m L, 按MOI=0.8接种PRRS病毒, 血清浓度分别为1%、2%、3%、4%和5%, 37℃培养, CPE达80%左右收获病毒, 测定TCID50, 结果见表3。

从表3中可以看出, 当维持液中血清浓度在1%~3%之间, 病毒的病毒滴度变化不明显且滴度很高, 所以维持的浓度保持在1%~3%之间即可。

2.2.4 病毒吸附时间对PRRS病毒增殖的影响

在细胞密度为0.8×105细胞/m L, 按MOI=0.8接种PRRS病毒, 病毒维持液中血清浓度为2%, 37℃培养, CPE达到80左右收获病毒, 比较PRRS病毒滴度, 结果见表4。

实验结果表明, 在静止接毒过程中, PRRSV吸附时间不宜过长也不宜过短, 这样都会早产病毒滴度降低。时间短, 病毒还没有吸附到细胞中去, 时间长, 细胞由于长时间吸收不到营养, 对细胞的生长造成影响, 从而间接影响到病毒在细胞中的复制, 从而影响了病毒滴度。

3 结果

3.1 PRRSV在细胞工厂中增殖条件的优化结果

综上, 确定PRRS病毒在细胞工厂中增殖的最佳条件为:细胞密度0.8×105细胞/m L;按MOI=0.8接种PRRS病毒;病毒维持液中血清浓度为1%~3%;病毒吸附时间为1h, 37℃培养。

3.2 病毒含量测定结果

利用TCID50方法进行病毒含量的测定。病毒TCID50测定时, 以MEM培养液将培养得到的PRRSV液作连续10倍稀释, 即10-1、10-2……10-8, 每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板的孔中, 随后加入经胰蛋白酶-EDTA消化分散的Marc-145细胞悬液, 每孔100μL (细胞含量以3×105/m L左右为宜) , 每个稀释度作8个重复, 并设正常细胞培养对照, 置5%CO2培养箱中, 37℃培养, 逐日观察细胞病变和对照, 共观察2~5d, 并记录细胞病变的孔数, 按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。同时以相同的方法对用转瓶培养的PRRS病毒液进行TCID50测定。以此作为对照组。

实验结果见表5, 由结果表明, 利用又细胞工厂培养的PRRSV液病毒含量高于转瓶培养的PRRSV液病毒含量。

4 讨论

猪呼吸道冠状病毒 篇6

1 PRRSV的特异性免疫应答

1.1 体液免疫

1.1.1 PRRSV体液反应动力学及ADE现象

健康猪感染PRRSV后可引发机体产生全身性的体液免疫应答。体液免疫由胸腺依赖性抗原和非胸腺依赖性抗原 (TI) 诱发[1]。一些猪在感染PRRSV 5~7 d就可检测到抗体, 到14 d时, 所有猪的血清发生转阳[2]。特异性Ig M抗体在14 d时达到高峰, 然后下降, 到42 d时基本检测不到。特异性Ig G抗体在感染后21~49 d达到高峰[3]。但是, 这些感染早期快速产生的Ig M、Ig G并没有中和作用, 其主要作用对象是GP5和N蛋白[4,5], 结合在病毒粒子表面, 可促进病毒粒子进入巨噬细胞。能迅速增强PRRSV在巨噬细胞中复制的能力, 即所谓的抗体依赖性增强作用 (Antibody-Dependent En hancement, ADE) 现象[4,6]。在肺泡巨噬细胞培养物中, 加入一定效价的PRRSV抗体, 可使PRRSV产量明显增加, 甚至会提高10~100倍。通过母源抗体获得被动免疫的仔猪, 一旦母源抗体水平下降至保护水平以下, PRRSV就会表现ADE现象, 从而增加了仔猪的易感性。所以, 亚中和水平的体液抗体反而能促进PRRSV的感染。

Nelson等 (1994) 研究了猪抗PRRSV美洲株的体液反应动力学, 结果显示:最早检测到的抗体是抗N蛋白抗体, 接着是抗M蛋白抗体, 然后是抗GP5蛋白抗体[7]。另有研究显示:非结构蛋白2 (Nsp2) 包含一组非中和的B表位, 可能是PRRSV的免疫活性蛋白[8,9]。目前大多数诊断检测方法主要是针对N蛋白诱导产生的抗体, 这些抗体出现在感染后第1周并持续几个月, 但抗体的滴度与保护力不相关。

1.1.2 PRRSV的中和抗体及其保护意义

中和抗体在抗PRRSV的保护性免疫反应中起重要的作用。有人进行了血清输入实验, 证实单独使用中和抗体可以完全防止PRRSV感染妊娠母猪。另外, 无论是仔猪还是母猪, 被动输入的中和抗体可消除病毒血症, 对感染猪输入中和抗体后, 病毒分离和RT-PCR等方法不能从这些猪的淋巴器官中检测到病毒。同样, 中和抗体对幼猪也有保护作用, 能够100%保护易感动物抵抗PRRSV病毒血症的最低抗体滴度是1:8[10]。但由于PRRSV感染后中和抗体的产生比较慢而且不规则, 所以中和抗体在保护机体免受PRRSV感染中所起的作用也是有限的[11,12]。

通过被动免疫产生的中和抗体可以使易感动物受到暂时的保护[13]。在感染后一个月内, 用常规病毒中和试验检测不到中和抗体。添加新鲜的补体或延长病毒与血清的作用时间可以增加中和试验的敏感性, 可在感染后9~12 d检测到中和抗体[14]。另有研究显示, 补体可使中和试验提高一个滴度[12,15]。但是即使采用改良的病毒中和试验, 感染后42 d中和抗体滴度依然很低, 仅为1:32~1:64。欧洲株和美洲株产生的中和抗体, 都可在感染28 d后检测到。

有报道显示M、GP2a、GP3、GP4和GP5上都有病毒的中和表位[5,16,17,18,19,20]。但在诱导中和抗体产生方面GP5更加重要。用PRRSV GP5接种免疫猪后可诱导产生中等水平的中和抗体, 尽管如此, 当用同种 (或同源) 毒株攻毒时, 猪可被保护, 仅表现轻微发热, 用MARC-145细胞只能从肺和纵膈淋巴结回收到病毒, 攻毒2周后, 中和抗体滴度增加到1:128[21,22]。

无论是母猪还是仔猪, 中和抗体在血清中的滴度与对猪抗PRRSV感染的免疫保护作用呈正相关。向怀孕母猪体内输入1:8或更高滴度的抗体, 可阻止仔猪病毒血症的出现;输入1:16滴度的抗体, 可保护母猪免于繁殖障碍和胎盘感染;当滴度达到1:32时, 则可清除病毒感染[23]。这些结果表明, 如果疫苗能够诱导产生1:32的抗体滴度, 则能有效地预防疾病, 并且可在清除PRRSV中成为有力的手段。

1.2 细胞免疫

细胞免疫对于预防PRRSV感染具有十分重要的作用。Molitor等 (1997) 报道, PRRSV感染后不仅产生针对病毒多肽的以各种特异性抗体为特征的体液疫, 而且还产生CD4+细胞增殖和迟发型变态反应为特征的细胞免疫[24]。一般在外周血循环中CD4+T细胞的百分比与感染猪发病的严重程度有直接关系, CD4+比例愈小, 感染猪越有可能发生严重症状。由此看出, 猪感染疾病的临床诊断在一定程度上建立于CD4+水平上。

PRRSV感染后第4周左右出现抗原特异性淋巴细胞的增生, 第7周左右达到高峰, 第11周左右开始下降, 最多可以持续3个月[25]。此增殖性反应可被由抗CD4+和MHC-Ⅱ类抗原产生的抗体所抑制, 说明这种反应是依赖CD4+和T淋巴细胞的[26]。

在自然感染PRRSV的猪体内淋巴细胞亚群会发生变化, 外周血中的CD4+/CD8+细胞的比例会显著降低。但是PRRSV并非总是诱导这样的变化, 由于毒株的来源及毒力的差异, 有的甚至会产生相反的结果[27]。Bruin等 (2000) 通过淋巴细胞增生试验和病毒特异性干扰素产生的细胞试验比较了PRRSV野毒接种猪、伪狂犬病病毒 (PRV) 疫苗接种猪及PRRSV疫苗接种猪的细胞免疫反应情况, 结果发现, PRRSV野毒接种猪可产生长期而强烈的细胞免疫反应, 与PRV疫苗接种猪的细胞免疫反应相当。而PRRSV减毒活疫苗接种猪的细胞免疫反应与保护性极好的PRV疫苗诱导的细胞免疫反应效果相差甚远[28]。

PRRSV的GP2a、GP3、GP4、GP5、M、N蛋白都能刺激T淋巴细胞的增生[29]。但是, N蛋白的作用最弱, M蛋白的作用最强。各种蛋白的诱导作用和该蛋白的浓度呈正相关。这表明M蛋白在细胞免疫中居主要地位。

2 PRRSV的免疫调节与免疫逃避

2.1 干扰素

PRRSV可以引起继发感染, 通过阻断一种抗病毒蛋白的激活或抑制猪体内α干扰素 (IFN-α) 的活性是PRRSV免疫逃避的防御机制之一。Albina等 (1998) 发现PRRSV在肺泡巨噬细胞中复制, 而巨噬细胞和PBMC都不产生IFN-α[30]。Gómez-Laguna等 (2010) 发现PRRSV可诱导产生少量IFN-α, 但它在血清中的出现较晚, 与病毒血症的消退相吻合[31]。PRRSV感染可能干扰维甲酸诱导基因-Ⅰ (RIG-Ⅰ) 、Toll样受体3 (TLR3) 和IPS-1 (IFN-β启动刺激因子1) 信号转导来抑制IFN-β启动子活性及IFN-β产生, 减少IFN-α表达量, 从而减弱固有免疫应答, 继而影响获得性免疫应答 (包括延缓产生IFN-γ和中和抗体) , 并最终引起病毒血症和持续性感染[32,33,34]。

另有体外的研究结果表明IFN-α和IFN-β在净化PRRSV中起重要作用。重组猪IFN-α (rp IFN-α) 可以抑制PRRSV在巨噬细胞中的复制并诱导其他抗PRRSV介质因子的转录[30,34,35]。用含有猪IFN-β (sw IFN-β) 表达的细胞上清液孵育Marc-145细胞后再接种PRRSV, 结果未出现细胞病变。而用不含sw IFN-β的细胞培养液孵育Marc-145细胞, 则在病毒感染后出现细胞病变。此外用sw IFN-β培养液孵育分离于PRRSV阴性猪的支气管肺泡灌肺泡巨噬细胞后再接种PRRSV, 用Realtime RT-PCR测定发现病毒RNA载量显著减少;这些研究结果充分表明, Ⅰ型IFN在干预PRRSV感染方面有很大潜力。

2.2 细胞因子

IFN-γ是Th1类细胞因子的典型代表, 并且是促进细胞免疫应答的效应因子, 可抑制PRRSV在巨噬细胞中的复制, 其作用机制是能阻断病毒蛋白的正常合成, 还能增强巨噬细胞产生超氧负离子的能力。提示IFN-γ可以抑制PRRSV对巨噬细胞的感染。但是, 低水平的IFN-γ不能消除PRRSV[36], 且在病毒感染期间影响机体免疫系统[37], 可以说, PRRSV持续性感染与机体有效细胞免疫应答低下有关。

IL-1是致炎性细胞因子, 参与免疫防御抗感染。Van Reeth等 (2000) 研究发现接种PRRSV后第3~10 d, 感染猪肺脏产生高水平的IL-1[38]。GómezLaguna等 (2010) 发现感染PRRSV后, 猪肺脏损伤程度、巨噬细胞数量与IL-1α表达量显著相关[31]。Labarque等 (2003) 发现在感染后第9 d IL-1产量达到峰值, 而未感染PRRSV的细胞凋亡数量急剧上升[39]。因此, IL-1可能介导PRRSV感染后的病理发生。

IL-2是调节细胞介导免疫应答的主要细胞因子之一。Rompato等 (2006) 用IL-2表达质粒作为PRRSV ORF7DNA疫苗佐剂给猪免疫, 经过二免后攻毒发现, IL-2能明显提高T细胞增殖[40]。Xue等 (2004) 用IL-2作为PRRSV ORF5和ORF7疫苗的佐剂一起免疫猪, 然后用同型PRRSV攻毒, 发现猪血清、PAM和淋巴组织中病毒载量明显减少[41]。可见, 应用IL-2作为PRRSV疫苗佐剂有非常不错的前景。

IL-6与猪的细胞免疫可能有关。Liu等 (2009) 发现8周龄的猪感染PRRSV后第7 d, 猪肺泡巨噬细胞产生大量IL-6[42]。Albina等 (1998) 报道, 8周龄的猪感染PRRSV后第3周, CD8+T细胞和Ig M显著增多[30]。CD8+T细胞能杀伤表达抗原的靶细胞, 它是抗病毒感染的重要效应细胞。IL-6诱导CD8+细胞大量增殖, 对于清除PRRSV感染有潜在作用。

IL-8是病毒急性感染后免疫防御机制的一部分。Aasted等 (2002) 发现经子宫感染PRRSV的小母猪在2~6周时, 血液中检测不到IL-8, 且巨噬细胞减少;这可能是由于PRRSV复制导致巨噬细胞功能受损, 使生成IL-8水平降低。因而血液循环中的IL-8水平可能反映巨噬细胞的功能状态[43]。Ait-Ali等 (2007) 研究发现感染PRRSV 2 h后, 长白猪和皮特兰猪的肺泡巨噬细胞中IL-8水平急剧升高, 随后IL-8水平稳步升高。进一步研究发现, 累积高水平IL-8能使PRRSV减少或延迟复制[44]。由此可见, IL-8参与猪机体抵御PRRSV感染过程。

IL-10对PRRSV的免疫应答调节起很重要的作用。不论是感染PRRSV欧洲株还是美洲株, 猪外周血单核细胞 (PBMCs) 中IL-10的m RNA水平均得到了提高, 且支气管肺泡灌洗液中IL-10的浓度也增加了[45]。某些欧洲株能够在阴性猪的PBMCs中诱导产生强烈的IL-10反应, 表明这是一种非记忆特性的[15]。接种IL-10诱导型毒株的猪, 其特异性IFN-γ的分泌频率要低于接种非IL-10诱导型毒株的猪, 这表明IL-10的产生可能是PRRSV感染后体液免疫受到一定抑制的原因之一[46]。给PRRSV血清阴性猪接种PRRSV之前转染IL-10 m RNA, PBMCs内IL-10和IL-12 m RNA显著减少, 而IFN-γm RNA升高, TNF-α和IL-4 m RNA没有变化。这表明外源的IL-10 m RNA可以干扰PRRSV感染后IL-10 m RNA的表达[47]。

PRRSV感染后对IL-12表达的影响, 目前相关文献的研究结果并不一致。有研究结果指出, PRRSV能刺激机体产生少量IL-12, 但表达水平很弱[48,49,50,51]。

体外研究结果也发现, 不论在m RNA还是在蛋白水平, PBMCs感染PRRSV后表达的IL-12量也非常少[52]。但PRRSV感染猪的树突状细胞 (DCs) 中IL-12水平增高[53], 感染PRRSV后第48 h, 猪DCs中IL-12的浓度大约是紫外线灭活PRRSV处理的DCs中IL-12浓度的2.7倍, 提示PRRSV对不同组织细胞内的IL-12的影响不同。

IL-18能在免疫活性细胞中诱导IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-1等细胞因子, 其中以刺激产生IFN-γ的能力最为显著, 它和IL-12共同协调刺激释放IFN-γ。近来的研究结果发现, IL-18有潜在促进PRRSV免疫的作用。Shen等 (2007) 给小猪接种r FPV-IL-18后攻击PRRSV, 接种r FPV-IL-18的小猪产生的中和抗体水平、IFN-γ量和T淋巴细胞免疫增殖反应高于对照组, 这表明IL-18在某种程度上能有效提高机体产生PRRSV特异的体液免疫和细胞免疫[54];但目前没有内源性IL-18参与PRRS免疫调节的研究结论。

GM-CSF可促进DCs、中性白细胞和巨噬细胞成熟, 活化成熟粒细胞和单核吞噬细胞, 调节单核细胞衍生的DCs、郎格罕氏细胞和抗原递呈细胞。Wang等 (2009) 构建出融合表达PRRSV GP3及GP5与GM-CSF的重组腺病毒, 给猪免疫r AdGF35 (含GM-CSF) 后所产生的PRRSV GP3/GP5的特异抗体水平明显高于无GM-CSF组对照猪, PBM-Cs中PRRSV增殖指数明显高于对照组[48]。提示GM-CSF能明显增强猪体针对PRRSV的体液免疫和细胞免疫。

TNF-α是活化的巨噬细胞、DC和T细胞早期分泌产生的细胞因子, 可协同IFN-γ抵抗病毒感染细胞, 但它在PRRSV感染后处于受抑制状态。Murtaugh等 (2002) 发现感染PRRSV后, 猪肺脏中TNF-α表达受抑制或表达量明显减少, 并且抑制病毒复制的能力减弱, 导致宿主针对PRRSV的免疫应答减弱, 使呼吸道出现PRRS亚临床症状, 还能引起机体持续感染PRRSV[33]。Subramaniam等 (2010) 研究发现, 在体外感染PRRSV后, PBMCs的TNF-α转录被抑制, 细胞内也未测到TNF-α蛋白[55]。TNF-α的表达与病毒复制呈明显的负相关, 感染后12h病毒复制达到高峰, 而TNF-α水平最低。TNF-α表达水平低可能是PRRSV逃逸宿主免疫应答的机制之一[31], 因此, 促进内源性TNF-α的表达有助于猪体抗PRRSV感染。

TNF-β的表达水平可能与PRRSV致病力有一定相关性。有报道指出, 猪接种PRRSV美洲株2周后PBMCs中TNF-β和IL-10基因表达提高[52], 而猪感染PRRSV欧洲株后, PBMC中TNF-β水平无显著变化, 但是IL-10水平提高[12]。同样, 在感染PRRSV欧洲株的DCs中未能检测到TNF-β, 而感染美洲株的DCs中TNF-βm RNA表达提高[56]。由于美洲型PRRSV株的致病力一般高于欧洲型毒株, 上述2个研究小组的发现, 提示TNF-β与PRRSV病理发生有一定的相关性, PRRSV的致病力对TNF-β的影响仍待进一步深入研究。

2.3 抗原提呈

PRRSV可能会干扰正确的抗原提呈和T淋巴细胞的活化。PRRSV能下调树突细胞 (DCs) 中主要组织相容性复合体MHC-Ⅰ的表达, 不过这与混合型白细胞反应中增值反应的减弱无关[35]。当PRRSV感染激活单核细胞衍生的树突细胞时, CD11b/c、CD14、CD80/86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达均下调[57,58], 用灭活的PRRSV时则没有下调。同时, 当受感染的树突细胞与同源的或同种异体的淋巴细胞配套使用时, 增值反应减弱, 由此表明受感染的树突细胞抗原提呈能力下降[58]。PRRSV能够通过改变树突状细胞和巨噬细胞的细胞因子类型, 以及通过改变参与抗原提呈的分子的表达, 从而减弱获得性免疫应答。

2.4 GP5的诱骗表位和糖基化位点

GP5蛋白胞外结构域氨基端高度糖基化, 并与M蛋白形成异原二聚体[59,60], 用反向免疫法和其他涉及重叠蛋白的研究证实GP5主要中和位点与中和抗体的活动相关, 这个位点的最小抗原区域在33~47位氨基酸, 已被确认是中和表位的核心区域[13,61,62,63], 这个核心区域被称做B位点, 此中和位点在糖基化位点的侧面。GP5的另一个优势显性表位A位点, 位于GP5氨基末端的胞外域 (第27~31位氨基酸处) , 具有诱骗表位的特性, 与人HIV-1中的Decoy相似[13]。Decoy位点是导致中和位点免疫反应性降低的毗邻于中和位点的位点。抗位点A的抗体在PRRSV感染早期被诱导产生, 而在感染后前30 d不能检测到抗B位点的抗体[63,64]。

因此, 认为A位点与中和B位点的同时出现将抑制对中和位点B的反应。抗中和位点B的抗体的延迟产生可以解释早期研究者所描述的无中和抗体产生的原因, 因此, 中和抗体延缓产生是PRRSV逃逸免疫监视的主要机制, 也是PRRSV感染的主要特征。

猪呼吸道冠状病毒 篇7

1 发病情况

信阳某发酵床猪场存栏母猪300多头, 自繁自养。2011年3月份, 该猪场饲养在发酵床上的300多头体重50～70 kg左右的育肥猪发生以呼吸困难、采食量下降、皮肤发绀、急性死亡等为主要特征的传染性疾病。发病猪集中在3栋育肥舍内, 发病率约30%, 病死率为10%。

2 临床症状

病猪表现精神沉郁, 食欲不振或废绝, 体温升高到41～42℃, 呼吸困难, 腹式呼吸明显, 喘气, 严重者呈犬坐式, 随着病程发展, 部分猪只皮肤变紫, 耳、臀、腹部、四肢发绀。

3 病理变化

剖检可见肺脏膨满、充血、瘀血, 呈暗红色, 肺脏间质增宽呈水肿样, 肺脏表面有大量出血斑点和大片红色肝变样病灶, 切面湿润, 从支气管断端流出较多的泡沫样液体。气管充斥着黄色黏液, 肠系膜淋巴结索样肿大, 其他各处淋巴结有不同程度的出血和坏死变化;脾脏显著肿大;脾头卷曲, 表面可见暗红色质地较硬的出血性梗死。见图1、图2。

4 实验室诊断

4.1 涂片镜检

无菌取心血、肝脏、肺脏涂片, 革兰染色, 均可见革兰阴性小杆菌。

4.2 病原分离培养

无菌取病 (死) 猪心血、肝脏、脾脏、肺脏 (病变区与正常组织交界处) 、肾脏、胸腔积液接种于巧克力琼脂、鲜血琼脂、普通琼脂培养基上, 37℃烛缸培养24 h。巧克力琼脂培养基上长出圆形、边缘整齐、直径约0.5 mm的菌落, 鲜血琼脂培养基上长出圆形、β型溶血、针尖大小菌落, 普通琼脂培养基无菌落生长。

4.3 CAMP试验 (卫星试验)

在兔鲜血琼脂培养基上用金黄色葡萄球菌划一直线, 将纯化菌与金黄色葡萄球菌作垂直划线但不接触, 37℃培养24 h, 可见金黄色葡萄球菌周围出现加强的溶血带, 呈典型的CAMP现象。

4.4 V因子依赖试验

将纯化菌分别接种于普通琼脂培养基和含0.01%NAD的普通琼脂培养基, 37℃培养24 h, 含NAD的普通琼脂培养基上长出灰白色、半透明、边缘整齐、直径约0.5 mm的菌落, 不含NAD的普通培养基上无菌落生长。

4.5 生化试验

分离菌发酵葡萄糖、麦芽糖、鼠李糖、蔗糖、木糖, 产酸, 不发酵乳糖、阿拉伯糖、棉籽糖、海藻糖、甘露醇、卫矛醇、山梨醇、肌醇, 触酶、尿素酶、丙二酸盐、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶阳性, 氧化酶、硫化氢、七叶苷、水杨素、侧金盏花醇、枸橼酸盐利用、硝酸盐还原, MR试验、VP试验、靛基质试验阴性, 具有胸膜肺炎放线杆菌的生化特性, 说明分离菌是胸膜肺炎放线杆菌。

4.6 药敏试验

分离菌对丁胺卡那霉素敏感, 对环丙沙星、诺氟沙星、复达欣中敏, 对头孢噻呋、庆大霉素、恩诺沙星、卡那霉素、复方新诺明、氨苄青霉素、羧苄青霉素、先锋霉素V、强力霉素等不敏感。

4.7 分子生物学诊断

无菌采集病死猪的肺脏、脾脏、淋巴结组织, 用RT-PCR检测猪瘟病毒 (诊断试剂盒购于北京世纪元亨公司) 、猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株 (引物序列和具体检测方法见2007年周海范的方法) , 结果见图3。由图3见, 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株为阳性, 猪瘟病毒为阴性。

采集呼吸道症状较为典型猪只的血清10份, 采用间接酶联免疫 (ELISA) 检测方法, 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体值 (OD630) , 结果全为阳性。

5 防治

(1) 将发病猪转移至隔离舍, 采用地圈饲喂, 带猪消毒可用1∶1 200卫康。原发酵床进行消毒, 疫情平息后, 重新添加新鲜发酵床菌种。

(2) 使用丁胺卡那霉素, 按每千克体重6～8 mg肌肉注射, 每日2次, 连用3～5 d。

(3) 用清开灵粉1 000～1 500 g、抗菌肽200 g, 拌入1 t饲料中, 连续饲喂12 d。

(4) 维生素C, 按每千克体重3～5 mg肌肉注射, 每日2次, 连用5 d。

经过上述治疗, 同时加强饲养管理, 7 d后猪群发病率、病死率降低, 病情得到较好控制。

6 讨论与分析

(1) 因为该场未进行猪繁殖与呼吸综合征疫苗的免疫, 其抗体阳性率很高, 结合实验室病原检测可以初步确定引起本次猪只发病死亡的主要病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒, 并存在猪传染性胸膜肺炎的混合感染。

(2) 该猪场大群发病前3 d, 本地区适逢天气降温, 房舍保温和通风条件一般。因该场采用发酵床饲养肥猪技术, 据笔者观察, 猪只习惯用鼻吻拱发酵床地面, 可以清晰地看到鼻孔处粘带有许多锯末, 诱发猪只咳嗽现象明显。因该技术不适合消毒, 所以发病期间猪圈并未消毒, 加速了病原的蓄积与扩散。

(3) 本猪场分离菌对丁胺卡那霉素敏感, 对头孢噻呋不敏感, 因此最开始使用头孢曲松钠治疗是不对症的。治疗时要通过药敏试验筛选敏感药物, 从而为疫病的预防和治疗提供依据。

(4) PRRSV可使猪免疫功能受损, 易引发一些细菌继发感染, 猪繁殖与呼吸综合征病毒和胸膜肺炎放线杆菌混合感染时, 病情会难以控制且病程较长, 从而给治疗增加难度。

猪呼吸道冠状病毒 篇8

Rowland和依阿华州立大学的Jack Dekkers以及美国农业部农业研究局的Joan Lunney发现了一个与猪繁殖和呼吸综合征 (PRRS) 病毒易感性有关的遗传标记。此次发现是控制并根除该病毒的第一步。这项研究发表在最近一期的《Journal of Animal Science》杂志上。猪繁殖和呼吸综合征病毒每年使美国猪业损失超过6亿美元。

Rowland说, “这项发现可以称之为首次之首次。”“对于猪繁殖和呼吸综合征是首次, 对于其它大型食用动物传染病来说也是首次。”这个项目始于堪萨斯州立大学, 它也是未来研究的主体。

堪萨斯州立大学的大型动物研究中心自2007年该项研究开始以来, 从2 000多头猪中采集了总计约100 000个标本, 并运至农业研究局进行基因组DNA制备, 坚定了60 000多基因中的差异。随后, 该数据被送至依阿华州立大学进行遗传分析, 最终发现了这个数量性状位点。

依阿华州立大学的合作者们建立了一个公共数据库, 这样在项目研究期间所收集的全部数据就可以在今后的数十年里为许多地区的研究人员和育种从业者所利用。