关节软骨退变（精选5篇）
关节软骨退变 篇1
摘要：目研究对象包括膝骨关节炎患者软骨退变Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级的病例数分别为16、11、15,正常人32例,应用ELISA测定IL-32、NO和IL-1在关节滑液中的表达程度。结果 KOAⅡ、Ⅲ、Ⅳ组中关节滑液的IL-32表达均明显高于正常人,有统计学意义(P<0.01),其中关节滑液中IL-32与IL-1和NO的关系呈正相关(r=0.45,P<0.05;r=0.56,P<0.05)。KOA患者不同程度软骨退变(KOAⅡ、Ⅲ、Ⅳ组)各组敏感度均超过80%,其中以KOAⅢ组最高为90.90%。在一定程度上IL-32可以作为诊断早期软骨退变性骨关节炎(KOAⅢ级)的良好指标。
关键词：膝骨关节炎,软骨退变,白介素-32,关节滑液
随着人们老龄化,体重的增加,可逐渐出现关节软骨退变,软骨细胞凋亡、衰退及程序性死亡增多,进而导致骨关节炎(OA)。软骨退变导致的KOA在早期X线检查中病变相对较轻,甚至表现完全正常,临床对此误诊、漏诊相当高,更有病变轻微病例的诊断难于定夺,更多的是以对症治疗处理之。白介素-32(IL￣32)是近几年新发现的白细胞介素成员之一,是NK细胞、T淋巴细胞、上皮细胞及单核细胞在IL￣2或者IFN￣γ的刺激下产生的一种细胞因子,其主要的生物学作用与炎症有关[1]。本实验研究通过抽取患者关节液检测IL￣2、NO、IL￣1的表达情况,通过各级骨关节炎患者的对比,探讨IL￣32与NO和IL￣1的相关性及其与KOA软骨退变程度的相关性。
1 资料与方法
1.1 病例选择
研究对象均来自2010年8月~2013年1月容县人民医院。试验组膝关节KOA患者42例,女20例,男22例,年龄42~81(平均64)岁。软骨退变Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级的病例数分别为16、11、15。对照组为我院健康体检者32例,无KOA病史,膝关节透视检查正常,行关节穿刺前与其签署知情同意书,女13例,男19例,年龄25~45(平均33)岁。KOA临床诊断参考1986年美国风湿协会所制订标准,X线诊断参考Kellgren￣Lawrence(K￣L)分级标准。
1.2 方法
两组的滑液均在行膝关节腔穿刺时留取,其中KOA患者42例,对照组32例。留取的关节滑液标本均1500转/分离心10min后取上清,置于-20℃冰箱保存备用。
1.2.1 主要仪器
普通冰箱(中国海尔),HH￣W电热恒温水浴箱(金坛市医疗器械厂),ELX800酶标分析仪(美国Bio￣ec公司)。
1.2.2 主要试剂
IL￣32抗体ELISA检测试剂盒,编号:KT1270;IL￣1受体2抗体ELISA检测试剂盒,编号:hy032595;人NO合成酶ELISA检测试剂盒,编号:HE1526;以上试剂均购自上海华壹生物科技有限公司。
1.2.3 试验方法
ELISA法检测关节滑液中IL￣32、IL￣1和NO水平,操作方法按照说明书操作。
1.3 统计学处理
试验组与对照组间用Dunnett分析,试验组不同关节软骨退变程度的组间用LST分析,所有数据均输入计算机以SPSS 19.0版本软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示,以P<0.05确定为差异有统计学意义。
2 结果
结果显示ELISA是一种有效的定量检测KOA关节滑液IL￣32、IL￣1和NO水平的方法。IL￣2因子在正常人关节液中表达很低,平均仅为90.21pg/ml,而IL￣1和NO分别为320.54pg/ml和909.78pg/ml。KOAⅡ、Ⅲ、Ⅳ组中关节滑液的IL￣32表达均明显高于正常人,有统计学意义(P<0.01),其中关节滑液中IL￣32与IL￣1和NO的关系呈正相关(r=0.45,P<0.05;r=0.56,P<0.05)。
正常对照组关节液IL￣32表达含量为38.79~141.63pg/ml,如果以141.63pg/ml作为阴性,KOA患者不同程度软骨退变(KOAⅡ、Ⅲ、Ⅳ组)各组检测的阴性样品数及敏感性见表2。各组敏感度均超过80%,其中以KOAⅢ组最高为90.90%。
注:*:与对照组比较有统计学意义(P<0.01)
3 讨论
关节内软骨的退变是导致KOA的重要原因之一,有研究表明软骨的发育及各种转化成软骨的过程均与内环境因子有关,其中各种炎性因子对于该过程起重要的作用。本实验研究中对比IL￣32与IL￣1和NO的关系,更有力的说明了IL￣32在炎症环境中的关系。IL￣32在KOA关节滑液中的表达程度是否与各级别的软骨退变程度相关,IL￣32在KOA关节滑液中的表达程度是否可以作为KOA关节软骨早期退变的筛查指标,目前还没有肯定的答案,以下将对上面两个问题展开讨论。
IL￣32最初在类风湿性关节炎的滑膜组织中检测到,而后有研究发现在类风湿性关节炎的关节滑液中发现其对类风湿性关节炎的发病有负调节的作用,其可能是通过促进成纤维细胞的形成有关[2]。有实验证明在胚胎期小鼠的软骨形成与发育过程中,直接加入IL￣32和质粒转染后高表达IL￣32均可对增生活跃的软骨细胞发生抑制作用,其机制可能是通过抑制TGF￣β信号途径,进而抑制软骨细胞分化增生甚至钙化[3]。在骨组织工程的研究中发现骨髓干细胞定向分化成软骨细胞这一过程中发现随着转化过程的进展IL￣32的表达减少,若直接加入IL￣32或者质粒转染IL￣32高表达后,骨髓干细胞定向分化成软骨这一过程减缓,甚至停止,一旦去除IL￣32可发现其逐渐恢复转化过程[4]。本实验研究表明KOAⅡ、Ⅲ、Ⅳ各组中关节滑液IL￣32表达均明显高于正常组,其作用机制可能是IL￣32抑制了软骨细胞的TGF￣β信号途径,从而使得软骨基质蛋白的进一步降解进而使得KOA演进[5],而其各病变演进组间的对比无统计学意义(P>0.05)。关节滑液中IL￣32与IL￣1和NO的关系呈正相关(r=0.45,P<0.05;r=0.56,P<0.05),表明IL￣32可能与IL￣1和NO一样可作为KOA的炎症因子之一。说明了IL￣32在KOA各分级的关节滑液中表达增高与软骨退变有关,但与软骨退变的程度递增无关,其与IL￣1和NO在KOA关节滑液中的表达呈正相关。
本研究是通过正常对照组获得以<141.63pg/ml作为阴性而得出KOAⅡ、Ⅲ、Ⅳ组的阳性与阴性,从而得到各组敏感度分别为81.25%、90.90%、86.67%,可以看出随着关节软骨退变程度加重,与敏感度的变化无关系,而IL￣32表达量的离散度越来越大,其中以软骨退变KOAⅢ级的敏感度最高。IL￣32是由KOA关节滑膜中的各类炎症细胞分泌的[6],IL￣32的敏感度在KOAⅡ和Ⅳ组略低的原因可能是由于炎症环境在KOAⅢ级中相对稳定,炎症细胞分泌液就相对稳定,进而影响分泌IL￣32的稳定性。
综上所述,IL￣32对早期软骨退变(KOAⅢ级)诊断的敏感度在90%以上,特别是诊断KOA患者KOAⅢ级软骨退变的敏感度最高,可达90.90%以上。说明在一定程度上IL￣32可以作为诊断早期软骨退变性骨关节炎(KOAⅢ级)的良好指标。
参考文献
[1]Keswani A,Kern RC,Schleimer RP,et al.Role of interleukin-32 in chronic rhinosinusitis[J].Curr Opin Allergy Clin Immunol,2013,13(1):113-118.
[2]Jeong HJ,Nam SY,Oh HA,et al.Interleukin-32-induced thymic stromal lymphopoietin plays a critical role in macrophage differentiation through the activation of caspase-1 in vitro[J].Arthritis Res Ther,2012,14(6):259-264.
[3]Bae S,Kim YG,Choi J,et al.Elevated interleukin-32 expression in granulomatosis with polyangiitis[J].Rheumatology(Oxford),2012,51(11):1979-1988.
[4]Ciccia F,Rizzo A,Accardo-Palumbo A,et al.Increased expression of interleukin-32 in the inflamed ileum of ankylosing spondylitis patients[J].Rheumatology(Oxford),2012,51(11):1966-1972.
[5]Schenk M,Krutzik SR,Sieling PA,et al.NOD2 triggers an interleukin-32-dependent human dendritic cell program in leprosy[J].Nat Med,2012,18(4):555-563.
[6]Bae S,Kang D,Hong J,et al.Characterizing antiviral mechanism of interleukin-32 and a circulating soluble isoform in viral infection[J].Cytokine,2012,58(1):79-86.
关节软骨退变 篇2
【关键词】 骨关节炎；生物力学；软骨退变；关节软骨；学术探讨
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2014.09.015
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是在力学和生物学因素相互作用下，使软骨细胞、软骨基质及软骨下骨三者合成耦联和降解动态失衡所致的慢性骨关节疾病。关节的结构和功能决定了其力学特性；而力学特性反过来也能调节关节的结构和功能，使它发生适应性的改变[1]。当膝关节周围软组织发生积累性损伤引起韧带、肌腱等粘连、瘢痕和挛缩时，膝关节内部的力学平衡破坏而诱发OA。目前，力学信号在软骨和软骨下骨中的传导途径，以及软骨和软骨下骨对力学信号的感受方式尚不清楚。本文旨在探讨生物力学因素调节软骨细胞、软骨基质、软骨下骨三者合成耦联和降解的可能作用机制，为OA诊断及治疗提供新的研究思路。
1 OA生物力学改变
关节周围软组织发生病变，引起关节内应力集中导致关节软骨的受损，进而影响软骨细胞内的内质网、高尔基体等细胞器对生物因子的合成，由此产生的软骨继发性损害进一步加重了关节力学关系的紊乱。生物力学研究即是应用力学原理和方法对生物体结构功能变化进行的分析，目前在OA研究中被广泛应用。
1.1 OA软骨细胞的生物力学改变 关节软骨能够降低关节面的摩擦系数，分散关节面的压力负荷，是运动系统的重要组成部分[2]。在OA的发生发展过程中，软骨表层的胶原纤维变性退化，与中层及深层组织的弹性模量均呈现逐渐下降的趋势，而退变的软骨细胞内所含的大量细胞内丝状物和溶酶体在外力作用下又会加速关节软骨的退变[3-4]。
1.2 OA软骨基质的生物力学改变 软骨基质主要由胶原和蛋白多糖组成，含水量大，使关节软骨能够负荷较大应力，同时利用水流而促进营养物质的输送以润滑关节。在OA的发生发展过程中，软骨细胞退变而发生代谢异常，从而打破软骨基质降解和修复的动态平衡，导致其通透性增大、弹性模量及负载能力降低，进而引起关节软骨退变。
1.3 OA软骨下骨的生物力学改变 软骨下骨的主要生物力学功能是吸收应力、缓冲震荡和维持关节形态。在OA的发生发展过程中，软骨下骨不断重塑、增厚、弹性模量降低，改变其应力特性及缓冲震荡作用，使得反作用于关节软骨的应力增大，同时释放细胞因子；这些细胞因子通过潮线处的裂缝或通道被转运到覆盖其上的软骨，影响软骨细胞的代谢，从而导致关节软骨的退变[5]。
2 生物力学影响OA软骨退变的作用机制
OA的发生可能是由于关节短时间内负重骤增或长期的高负荷导致机械应力分布失衡，引起软骨磨损或软骨细胞代谢异常，损伤的软骨细胞继而释放多种酶类，破坏胶原蛋白，使蛋白聚糖降解，最终软骨的物理、化学性质均发生改变所致[6]。
2.1 生物力学影响软骨细胞功能的作用機制 软骨细胞受到应力刺激后，局部出现高应力点，镜下可见细胞核、细胞骨架发生变形，力学刺激通过细胞的变形激活信息传导通路，细胞通过对应力的应答，引起其代谢的改变。
2.1.1 生物力学调节软骨细胞凋亡的作用机制 细胞凋亡是细胞对环境的生理性、病理性刺激信号以及对环境条件变化的应答有序变化的生理性死亡过程。前期研究表明，一氧化氮（NO）作为信号分子和效应分子，能够抑制多种与线粒体信号传递有关酶的作用，从而抑制线粒体呼吸，引起细胞凋亡[7]。目前计算机控制系统通过对软骨细胞加载不同大小及方向负压证明可诱导其发生凋亡[8]。正常关节软骨在一定时间内可承受适当强度的应力，一旦超过其承受能力后，软骨细胞上的纤毛、鞭毛等作为生物力学理论中的弹性系统，传递力学信号至软骨细胞内的作用位点，激活靶分子以刺激软骨细胞的生物活性，诱导其释放白细胞介素-1（IL-1）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），激活NO信号通路使线粒体外膜通透性增高，干扰细胞的正常代谢功能，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）驱动，促使NO水平升高，引起细胞凋亡。
2.1.2 生物力学调节软骨细胞增殖的作用机制 细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，受众多因素调控。其中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路是细胞外信
号引起细胞核内反应的主要通道之一，参与细胞的形成、运动、凋亡、分化及生长增殖等多种生理过程[9-10]，
其基本组成是一种三级激酶模式，包括MAPK
激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK。细胞外信号调节蛋白激酶1/2（extracellular signal-regulated kinasel/2，ERK1/2）作为MAPK亚族之一，是细胞对外界作用信号感知的上游关键位点。MAPK-ERK1/2信号通路作为不同促增殖因子调控的共同通路，将细胞外信号传导至核内并调控基因表达，在细胞的增殖过程中具有正、负反馈调节[11]。在对大鼠软骨细胞加载间歇循环机械张力的过程中发现，施加一定的循环张力刺激可促进软骨细胞增殖，且随着刺激的增大先逐渐增强而后减弱[12-14]。
软骨细胞表面可能具有压力感受器，能够感受力学环境的变化，调整细胞基质的新陈代谢，对适当的应力刺激可能使胞质内的靶蛋白磷酸化，调节底物蛋白的活性及相关基因的转录，促进细胞在信号通路中不断增殖。当超过软骨细胞表面所能承受的压力时，底物蛋白活性降低，促细胞增殖作用则可能减弱。
nlc202309031247
2.2 生物力学调节软骨基质合成的作用机制 力学刺激激活信号通路调节软骨基质合成来影响关节及代谢，力学刺激如应力类型、频率、时间和强度均可影响软骨细胞代谢。对软骨细胞施加间歇循环机械张力可促进软骨基质胶原合成，使软骨细胞获得营养而维持软骨的正常结构和功能的完整性；当持续的力学加载超过软骨细胞的承载能力，可阻止基质金属蛋白酶合成，抑制胶原的合成能力[15-16]。研究表明，整合素与胞外基质蛋白之间的动态和特异性反应，在细胞的信号通路中，起着重要功能性作用。力学刺激导致的细胞变形可通过软骨基质和整合素共同作用，重组细胞骨架成分，激活信号通路，以整合张力的形式将力学信号转换到细胞核内，激活磷酸脂酶C。磷脂酸酶C又可激活蛋白激酶C通路，后者产生第二信使三磷酸肌醇和甘油二脂，进而促使钙离子从细胞中释放，提高钙离子浓度，间接或直接影响细胞因子如TNF、IL-1等蛋白的表达，最终影响软骨基质的合成[17]。
2.3 生物力学调节软骨下骨重建的作用机制 异常的生物力学环境可造成不同程度骨小梁微骨折；若未能及时修复，将会发生软骨下骨硬化及囊性改變等，导致其血液循环减少，进一步损伤深层关节软骨和软骨下骨，启动骨重塑过程[18]。细胞膜上的纤毛或鞭毛受到应力刺激后，通过细胞变形作为信息传递形式，激活信号通路；通过细胞间的突触传递生物学及力学信息，刺激骨形成；软骨下骨密度及硬度增高，损害其吸收应力震荡的作用，使关节软骨丧失保护功能，可能引起继发性关节软骨退变而导致OA[19-21]。在信号传导过程中，细胞外基质-整合素-细胞骨架复合体相互作用，骨细胞将力学信号整合加工，并通过缝隙连接和旁分泌的形式，将相应的电、化学信号传给成骨细胞和/或破骨细胞，当成骨细胞和破骨细胞被骨细胞传导的信号激活后，进行相应的骨形成或骨吸收活动。
3 讨 论
综上所述，细胞表面可能存在压力感受器，对不同的压力可以激活不同的信号通路。应力刺激软骨细胞，通过细胞膜作为载体，压力感受器对传导的力学信号进行分析，激活不同信号通路，作用于不同的效应点，刺激软骨细胞释放不同的细胞因子，从而影响软骨细胞生长代谢、基质合成的改变。应力类型、频率、时间和强度也可影响软骨细胞代谢。前期生物力学研究多为动物实验，动态疏密波通过调节应力刺激强度、频率及时间也已证实可抑制软骨细胞凋亡，延缓其退变过程。但是，人体作为复杂的个体，肌肉力量的变化、体重的增加、下肢力线的异常等因素均能影响生物力学的改变，在生物学或力学因素作用下，如何使药物或物理治疗靶向作用于发病早期效应点以防治OA是我们后期研究的方向。同时，随着高分辨率的CT及MRI等设备和有限元分析软件处理能力的不断强大，后期研究可利用影像数据模拟关节三维有限元模型，研究人体在不同体位的力学分布，进一步探寻最佳应力强度、频率及时间组合，以指导临床治疗OA。
4 参考文献
[1]戴尅戎.力学生物学在骨与软骨研究中的应用[J].中华骨科杂志，2006，26（6）：429-431.
[2]Ruiz-Romero C，Lopez-Armada MJ，Blanco FJ.Mitochondrial proteomic characterization of human normal articular chondrocytes[J].Osteoarth cartil，2006，14（6）：507-518.
[3]St?ve J，Gremmes C，Günther KP，et al.Metabolic activity and gene expression of osteoarthritic chondrocytes in correlation with radiological and histological characteristics[J].Biomed Pharmacother，2006，60（10）：
644-647.
[4]牛海军，刘诚睿，李昂，等.关节软骨三相力学特性与骨关节炎等级关系研究[J].中国科学：生命科学，2012，42（7）：572-578.
[5]Amin AK，Huntley JS，Simpson A，et al.Chondrocyte survival in articular cartilage：the influence of subchondral bone in a bovine model[J].J Bone Sur Br，2009，91（5）：691-699.
[6]李文庆，廉春光，王定，等.骨性关节炎的基础研究进展[J].中医正骨，2009，21（5）：67-71.
[7]刘献祥，林燕萍.中西医结合治疗骨性关节炎[M].北京：人民卫生出版社，2009：1-283.
[8]俞超，杨飞，戴尅戎，等.周期性张应变通过活性氧生成促进膝关节骨关节炎患者的软骨细胞发生凋
亡[J].医用生物力学，2013，28（3）：350-356.
[9]Iwaki M，Ito S，Morioka M，et al.Mechanical stretch enhances IL-8 production in pulmonary microvascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，389（3）：531-536.
[10]Takebe K，Nishiyama T，Hayashi S，et al.Regulation of p38 MAPK phosphorylation inhibits chondrocyte apoptosis in response to heat stress or mechanical stress[J].Int J Mol Med，2011，27（3）：329-335.
nlc202309031247
[11]刘新宗，杜远立.应力作用下软骨细胞信号传导的研究进展[J].现代生物医学进展，2011，23（23）：
4595-4597.
[12]Moukoko D，Pourquier D，Pithioux M，et al.Influence of cyclic bending loading on in vivo skeletal tissue regeneration from periosteal origin[J].Orthop TraumatolSur Res，2010，96（8）：833-839.
[13]Xu HG，Zhang XH，Wang H，et al.Intermittent cyclic mechanical tension-induced calcification and downregulation of ankh gene expression of end plate chondro-
cytes[J].Spine，2012，37（14）：1192-1197.
[14]孫晓雷，赵斌，马信龙，等.循环牵张应力对人骨关节炎软骨细胞增殖的影响[J].天津医药，2013，41（11）：1073-1075.
[15]Thomopoulos S，Das R，Birman V，et al.Fibrocartilage tissue engineering：the role of the stress environment on cell morphology and matrix expression[J].Tissue Eng Part A，2011，17（7-8）：1039-1053.
（下转第65页）
（上接第56页）
[16]Baker BM，Shah RP，Huang AH，et al.Dynamic tensile loading improves the functional properties of mesenchymal stem cell-laden nanofiber-based fibrocarti-
lage[J].Tissue Eng Part A，2011，17（9-10）：1445-
1455.
[17]王媛，刘锡仪.力学刺激与骨代谢[J].中华医学研究杂志，2005，5（3）：225-225.
[18]McErlain DD，Appleton CT，Litchfield RB，et al.Study of subchondral bone adaptations in a rodent surgical model of OA using in vivo micro-computed tomography[J].Osteoarth Cartil，2008，16（4）：458-469.
[19]Adachi T，Aonuma Y，Tanaka M，et al.Calcium response in single osteocytes to locally applied mechanical stimulus：differences in cell process and cell body[J].J Biomech，2009，42（12）：1989-1995.
[20]Xiao Z，Zhang S，Mahlios J，et al.Cilia-like structures and polycystin-1 in osteoblasts/osteocytes and
associated abnormalities in skeletogenesis and
Runx2 expression[J].J Bio Chem，2006，281（41）：
30884-30895.
[21]Malone AM，Anderson CT，Tummala P，et al.Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism[J].Pro Natl Acad Sci USA，2007，104（33）：13325-13330.
收稿日期：2014-07-21；修回日期：2014-08-13
椎间盘退变与椎间盘软骨终板退变 篇3
椎间盘占据脊柱的前中柱, 是脊柱承重的重要部分。故椎间盘退变在脊柱退行性疾病中扮演了生要角色。对于它的病因研究也引起了人们的极大兴趣。下面将近年来有关椎间盘病因研究的进展作一综述。
椎间盘退变的发生是多种因素综合作用的结果, 包括遗传因素、力学因素、环境因素、年龄和性别因素等。近来对椎间盘疾病的大规模流行病学调查和脊柱的生物力学研究显示, 异常生物力学因素是促进椎间盘退变的主要因素之一, 椎间盘疾病的发生与人类脊柱长时间处于异常应力环境有关[5]。生物力学研究认为, 过度应力负荷或是过度的活动, 可引起椎间盘结构的机械损伤, 包括纤维结构破坏、分层、纤维环撕裂以及蛋白多聚糖丢失[6];细胞水平信号改变将引起基质重塑, 包括改变基因表达、酶的活性、椎间盘组织构成和结构等;由于椎间盘细胞修复能力有限, 对于基质重塑只能进行不完全的愈合修复, 最终形成退变[7];Lotz等[8]用鼠尾加压模型进行动物体内研究。结果显示随着压力的增大, 内层和中层纤维环排列紊乱程度增加, 凋亡细胞比例增高;停止加压1个月后, 椎间盘组织结构没有完全恢复。Handa等[9]研究静态水压对人椎间盘细胞基质合成和基质金属蛋白酶 (ma-trixmetalloproteinase, MMP) 产生的影响, 发现较低压力 (0.3MPa) 使髓核细胞和内层纤维环蛋白多糖合成增加, 而高压力 (3MPa) 明显地抑制了内层纤维环蛋白多糖的合成, 且明显刺激髓核MMP-3的产生。其他学者的体外研究也观察到相似的结果, 这些结果表明适当的压力水平能促进合成代谢, 而较高的压力明显促进分解代谢, 增加细胞凋亡, 加速椎间盘退变[10]。Maclean等[11]利用鼠尾加压模型研究动态压力对椎间盘组织的作用。结果显示在高强度 (1MPa) 压力下, 无论是高频还是低频加载时纤维环组织分解基因都明显上调。Neidlinger等[12]研究不同强度动态水压对椎间盘细胞基因表达的影响, 结果显示较低压力增加了人椎间盘细胞I型胶原和聚集蛋白聚糖的表达, 对MMP没有影响;较高压力降低所有合成蛋白基因表达, 其中聚集蛋白聚糖降低明显, 并且增加人椎间盘细胞MMP-1、3、13表达。通过以上几项研究可以发现压力的大小影响椎间盘组织的代谢和结构, 合适强度的动态压力可诱导合成代谢, 防止椎间盘退变。
异常力学环境致使PG丢失和胶原断裂、软骨细胞功能减退及椎间盘独特的营养生理因素改变是导致其退变的主要原因[13].Alon等[14]发现, 椎间盘细胞凋亡的数目与所受应力负荷的大小和时间呈正比。过高或过低的应力不但可使细胞化生、代谢障碍甚至死亡, 还可诱导基质溶解酶类如金属蛋白酶和NO等细胞因子的产生, 它们可作用于蛋白多糖和胶原, 促进基质的降解[15]。
在导致椎间盘退变的各种原因中, 软骨终板的退变及其与椎间盘退变的关系越来越受到了人们的重视。软骨终板是位于椎间盘和椎体之间的一薄层软骨, 由透明软骨构成, 平均厚度约为1mm, 其上有许多微孔, 是髓核水分、营养成分及代谢产物进出的通道。是椎间盘结构和功能的重要组成部分。对于维持脊柱生物力学传导、应力重新分布的过程起着至关重要的作用, 与椎间盘一起共同维持着脊柱的正常形态和生理功能, 对于维持脊柱生物力学传导、应力重新分布的过程起着至关重要的作用。
目前大量研究表明, 软骨终板退变和椎间盘退变密切相关, 且软骨终板退变早于椎间盘退变[16]。软骨终板的生物化学成份包括蛋白多糖 (PG) 、胶原和水。软骨终板的退变是多种因素相互作用的结果。各种因素通过某种机制引起软骨终板基质成分的减少, 进而引起水分的丢失软骨终板发生硬化。研究证明, 软骨终板硬化在椎间盘退变中扮演了非常重要的角色[17]。软骨终板的退变早于椎间盘的退变, 且在正常青壮年时期就已经开始退变。软骨终板的退变虽然是一个自然老化的过程, 但又可因为炎症、异常应力及细胞过多凋亡而加重, 加速其退变的过程。有证据显示椎间盘的退行性变是从软骨终板开始的, 因此, 软骨终板的异常变化在椎间盘的病理过程中起到重要作用。Bernick S[18]等发现伴随着年龄的增长, 软骨终板出现钙化, 逐渐为骨组织取代。随着病变发展, 软骨终板可能出现结构的紊乱和细微的裂纹[19]。如果软骨终板因破裂、钙化等因素而引起营养通路受阻, 将不仅会直接导致椎间盘因营养供给不足而出现退化、钙化, 而且会使代谢产物积聚于椎间盘内, 激活椎间盘内的酶类物质, 导致基质破坏, 细胞代谢障碍、死亡。
目前基础研究结果显示, 力学环境对椎间盘代谢和形态结构有明显的影响, 合适的条件可以防止甚至逆转间盘的退变, 临床应用中也观察到动态固定抑止椎间盘退变的征象, 这些发现为椎间盘退变及其相关疾病的治疗提供了有意义的线索[20]。但对于椎间盘的认识还需进一步的发展, 尤其是对软骨终板退化的研究将有助于揭示椎间盘退变的发病机理, 寻找在椎间盘退变发生早期进行修复治疗的途径等许多问题仍有待进一步解决。
关节软骨退变 篇4
【关键词】 骨关节炎；独活寄生汤；含药血清；软骨细胞；细胞凋亡；大鼠
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2014.12.008
Effects of Serum Medicated with Duhuo Jisheng Decoction on the Expression of the Degenerated Cartilage Cells Bcl-2 and Bax in Rats
PAN Cai-bin，WANG Wu-lian，WU Guang-wen，FU Chang-long，WENG Mei-rong，LIU Xian-xiang
【ABSTRACT】Objective：To observe the effects of serum medicated with Duhuo Jisheng Decoction on the expression of the degenerated cartilage cells Bcl-2 and Bax in rats.Methods：The degenerated cartilage cell models in vitro were established，which were intervened by the serum medicated with Duhuo Jisheng Decoction（the medicated serum group）and the blank serum （the blank serum group）for 24 h，48 h and 72 h，collecting chondrocytes.The RT-PCR method was used to detect the expression of degenerated cartilage cells Bcl-2 and Bax mRNA after serum intervention.The Western Blot method was used to detect the expression of degenerated cartilage cells Bcl-2 and Bax protein after serum intervention.Results：The effects of the serum medicated with Duhuo Jisheng Decoction on the expression of Bcl-2 and Bax protein had the same tendency as on the expression of Bcl-2 and Bax mRNA，.along with the extension of time，the positive expression rate of Bcl-2 protein in the two groups gradually increased，the medicated serum group being more significant than the blank serum group；while the positive expression rate of Bax protein in the two groups gradually decreased，the medicated serum group being more significant.The difference between each time point was statistically significant（P < 0.01）.Conclusion：Duhuo Jisheng Decoction can inhibit the activation of the mitochondrial apoptosis pathway by up-regulating the expression of rat osteoarthritis cartilage cells Bcl-2 and down-regulating the expression of Bax，thus effectively inhibiting chondrocyte apoptosis.
【Keywords】osteoarthritis；Duhuo Jisheng Decoction；medicated serum；
chondrocyte；apoptosis；rat
骨关节炎（osteoarthritis，OA）又称退行性关节炎、增生性关节炎、肥大性关节炎等，是老年常见的骨关节疾病。随着社会老龄化的加剧，OA患者逐渐增多，已严重影响到人们的健康和生活。目前，普遍认为OA是在力学和生物学等多种因素共同作用下导致软骨细胞、软骨细胞外基质、软骨下骨三者降解与合成耦联失衡的结果[1]，其中软骨细胞破坏及软骨基质降解是其主要病理过程。换言之，延缓软骨细胞及软骨基质降解是OA的主要治疗目的和方法之一。独活寄生汤出自《备急千金要方》，为治疗久痹而致肝肾两虚、气血不足证之验方，临床应用日益广泛，并获得良好疗效[2]，但其确切作用机制尚未完全明了。本实验通过独活寄生汤含药血清对大鼠退变软骨细胞Bcl-2、Bax影响的研究，探讨本方延缓OA软骨退变的可能机制，为临床应用提供实验依据。
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1 实验材料
1.1 实验药物 独活寄生汤由独活、桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防风、肉桂、细辛、川芎、当归、芍药、干地黄、人参、茯苓、甘草组成，由福建中医药大学附属第二人民医院药剂科提供。
1.2 实验动物 健康2月龄清洁级SD大鼠36只（雌雄各半），健康4周龄清洁级SD大鼠20只（雌雄不限），由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物合格证号：SCXK（沪）2007-0011。福建中医药大学实验动物中心提供清洁级医学实验动物环境设施，许可证号：SYXK（闽）2009-0001。
1.3 主要试剂 DMEM培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（GIBCO公司）；质量分数0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司）；TRIZOL试剂（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（Fermentas公司）；引物合成（上海生工生物工程公司）；Bax，Bcl-2和β-actin一抗（美国Santa Cruz Biotechnology公司）、二抗（美国Cell Signaling Technology公司）。
1.4 主要仪器 二氧化碳培养箱（Thermo公司）；荧光倒置相差显微镜（徕卡仪器公司）；PCR仪，蛋白核酸分析仪（美国Beckman Coulter公司）；化学发光成像系统ChemiDocXRS +（Bio-Rad公司）。
2 方 法
2.1 独活寄生汤含药血清的制备 健康2月龄清洁级SD大鼠36只，随机分为独活寄生汤组（含药血清组）27只和生理盐水对照组（空白血清组）9只。根据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表”换算[3]，含药血清组给予独活寄生汤
9.3 g·kg-1·d-1，空白血清组给予质量分数0.9%生理盐水10 mL·kg-1·d-1；连续灌胃7 d，在麻醉下行腹主动脉采血，经离心获取含药血清，并经56 ℃水浴灭活30 min及过滤除菌后，-20 ℃保存。
2.2 退变软骨细胞模型的建立及干预 采用酶消化法从4周龄清洁级SD大鼠的膝关节软骨中分离得到软骨细胞[4]，进行细胞培养至第3代软骨细
胞；再予10 ng·mL-1 IL-1β诱导获得退变软骨细胞[5-6]；分别给予独活寄生汤含药血清或空白血清干预，并分别于24 h、48 h、72 h后检测相应指标。
2.3 RT-PCR法检测血清干预后退变软骨细胞Bcl-2、
Bax mRNA表达 血清干预退变软骨细胞结束后，弃掉培养液，用PBS轻轻漂洗后，加1 mL Trizol进行裂解，提取总RNA，逆转录反应合成cDNA，
进行目的基因的扩增。将24 h、48 h、72 h 3个时点的PCR产物一起进行琼脂糖凝胶电泳、拍照、结果分析。目的基因引物序列见表1。
2.4 Western Blot法检测血清干预后退变软骨细胞Bcl-2、Bax蛋白表达 血清干预结束后，退变软骨细胞中总蛋白的提取，BCA法测定蛋白含量，Western Blot 法检测蛋白表达，抗体稀释倍数如下：Bax 1∶500；Bcl-2 1∶500。
2.5 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验；多组数据间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 血清对退变软骨细胞Bcl-2、Bax mRNA表达的影响 随着干预时间的延长，空白血清组和含药血清组Bcl-2 mRNA的表达量均逐渐升高，Bax mRNA逐渐降低，具有时间依赖性，且各时点之间比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。含药血清组24 h Bcl-2 mRNA表达量比空白血清组24 h高，差异有统计学意义（P < 0.05）；Bax mRNA表达量比空白血清组24 h低，差异有统计学意义（P < 0.01）。
含药血清组48 h Bcl-2 mRNA表达量比空白血清组48 h高，差异有统计学意义（P < 0.05）；
Bax mRNA表达量比空白血清组48 h低，差异有统计学意义（P < 0.01）。含药血清组72 h Bcl-2 mRNA表达量比空白血清组72 h高，差异有统计学意义（P < 0.05）；Bax mRNA表达量比空白血清组72 h低，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图1。
3.2 血清对退变软骨细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 独活寄生汤含药血清对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响与其对Bcl-2和Bax mRNA的影响具有相同的趋势，随着干预时间的延长，空白血清组和含药血清组Bcl-2蛋白表达量均逐渐升高，Bax蛋白表达量逐渐降低，具有时间依赖性，且各时点之间比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。含药血清组24 h Bcl-2蛋白表达量比空白血清组24 h
高，Bax蛋白表达量比空白血清组24 h低，差异均有统计学意义（P < 0.01）。含药血清组48 h Bcl-2蛋白表达量比空白血清48 h高，而Bax蛋白表达量比空白血清组48 h低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。含药血清组72 h Bcl-2蛋白表达量比空白血清组72 h高，但Bax蛋白表达量比空白血清组72 h低，差异均有统计学意义（P < 0.01）。
4 讨 论
OA属中医学“痿证”“痹证”“骨痹”范畴，气血营卫内虚是致病的内在因素，风寒湿邪外袭是致病的外在因素，经络气血阻滞则是痹证的主要病机。独活寄生汤以独活为君药，祛下焦与筋骨间的风寒湿邪。臣以细辛散阴经风寒，搜筋骨风湿，通络止痛；秦艽除风湿舒筋；肉桂心温里祛寒，通利血脉。佐以桑寄生、牛膝、杜仲补肝肾，壮筋骨，祛风湿；当归、川芎、地黄、芍药养血活血；人参、茯苓、甘草补气健脾，扶助正气。甘草调和诸药，为使药。诸药合用，祛邪扶正，标本兼顾，达到祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功效[7-8]。纵观全方，以祛风寒湿邪为主，辅以补肝肾、益气血之品，邪正兼顾，祛邪而不伤正，扶正而不留邪，正与OA的病机相契合，从而发挥治疗作用[9-10]。
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“线粒体凋亡途径”是脊椎动物最常见的凋亡通路。IL-1β诱导软骨细胞复制软骨细胞退变模型，是目前较为经典的退变软骨细胞造模方法[11-12]。本研究选用IL-1β做诱导剂，并参照相关文献[13]，选取10 ng·mL-1作为IL-1β的诱导含量，干预第3代软骨细胞。Bcl-2蛋白家族是线粒体凋亡途径的关键调节因子，包括以Bcl-2为代表的抗凋亡成员和以Bax为代表的促凋亡成员。在凋亡因子刺激下，活化的促凋亡蛋白Bax插入线粒体外膜并明显增高线粒体外膜的通透性，释放Cytochrome c
等促凋亡因子；释放到胞浆的Cytochrome c能与凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1以及pro-caspase-9、ATP/
dATP形成凋亡复合体。pro-caspase-9在凋亡复合体中被剪切形成有活性的caspase-9；活化的caspase-9
激活caspase-3等成员，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。本实验研究发现，独活寄生汤能上调大鼠OA软骨细胞抑制凋亡因子Bcl-2表达，下调促凋亡因子Bax表达，从而抑制线粒体凋亡通路的激活，有效抑制软骨细胞凋亡，这或许是其治疗OA的可能机制之一。
5 参考文献
[1]Roush JK，Cross AR，Renberg WC，et al.Evaluation of the effects of dietary supplementation with fish oil
omega-3 fatty acids on weight bearing in dogs with
osteoarthritis[J].J Am Vet Med Assoc，2010，236（1）：67-73.
[2]吴广文，褚剑锋，许惠凤，等.独活寄生汤的药理作用及其在治疗骨性关节炎中的应用[J].中医正骨，2012，24（1）：37-39.
[3]Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors[J].Cancer，2000，89（12）：2637-2645.
[4]Ryu JH，Chun JS.Opposing roles of WNT-5A and WNT-11
in interleukin-1 beta regulation of typeⅡ collagen expression in articular chondrocytes[J].J Bilo Chem，2006，281（31）：22039-22047.
[5]唐芳，马武开，姚血明.Wnt/β-catenin信号通路与骨关节炎[J].风湿病与关节炎，2014，3（2）：70-73.
[6]Park K，Hoffmeister B，Han DK.Therapeutic ultrasound effects on interleukin-1β timulated cartilage construct in vitro[J].Ultrasound Med Biol，2007，33（2）：286-295.
[7]周肃陵，刘肖瑜，王正.独活寄生汤在骨伤科的临床应用[J].中医正骨，2006，18（12）：67-69.
[8]李西海，陈文列，刘献祥.补肾柔肝法防治骨性关节炎作用机制探讨[J].福建中医药大学学报，2011，21（2）：66-69.
[9]潘彩彬，冯阳，刘献祥.独活寄生汤的内涵与外延探讨[J].风湿病与关节炎，2013，2（6）：39-41.
[10]顾程泷，朱艳伟，孙玉明.独活寄生汤在骨伤科的运用[J].河南中医，2013，33（4）：605-607.
[11]彭程，肖涛，罗远明，等.IGF-1对IL-1诱导的兔关节软骨细胞NO和PGE2的影响[J].中南大学学报：医学版，2008，33（3）：197-203.
[12]Sanchez C，Mathy-Hartert M，Deberg MA，et al.Effects of rhein on human Articular Chondrocytes in alginate beads[J].Biochem Pharmacol，2003，65（3）：377-388.
[13]Wu SQ，Otero M，Unger FM，et al.Anti-inflammatory activity of an ethanolic Caesalpinia sappan extract in human chondrocytes and macrophages[J].J Ethnopharmacol，2011，138（2）：364-372.
收稿日期：2014-09-09；修回日期：2014-09-30
关节软骨退变 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料：
选取我院2011年1月至12月患者60例，男性34例，女性26例，年龄29～85岁，平均45.2岁。病程1 d至18年，均有下腰痛史，多为隐痛，35例合并椎间盘突出，占58%。初次就诊时大多被诊断为椎间盘突出或坐骨神经痛、梨状肌综合征等。
1.2 仪器及应用：
扫描用飞利浦MX-4000S扫描机，矩阵为320×320，扫描条件为120 kV、170 mA，层厚、间隔均为3～5mm，患者仰卧、腿屈曲，做靶CT成像扫描，所有患者均用软组织窗及骨窗进行观察。
2 结果
2.1 发病部位：
腰1/2椎间关节33例，腰2/3椎间关节34例，腰3/4椎间关节42例，腰4/5椎间关节55例，腰5/骶1椎间关节58例。50例多个椎间关节同时受累，单一关节侵犯较少见，病变两侧常不对称，上关节突较下关节突明显，下位椎间关节较上位椎间关节严重。
2.2 关节面不对称：
即一侧关节面方向偏冠状位，而另一侧关节面偏矢状位(图1)，共31例，占52%，当一侧上下关节突失去正常咬合关系时形成半脱位。
2.3 关节突增生、肥大、骨赘形成：
58例，占97%，表现为关节突喙状增生肥大、骨皮质致密增白(图2)，甚至在关节突边缘形成高密度的小丘状或不规则状骨样赘生物(图3)，增生明显的上下关节突可以相互包绕形成“杵臼征”。可导致侧隐窝狭窄、椎间孔狭窄、椎管狭窄,对相邻神经根产生压迫。
2.4 椎间关节病变：
45例，占75%，表现为关节间隙不对称、狭窄甚至消失，关节面不平整，骨皮质和骨髓质分界不清，软骨下骨硬化或骨质疏松、囊性变，还可出现关节软骨下骨糜烂，呈小的穿通样破坏，大小不等(图4)。
2.5 关节真空现象：
11例，占18%，小关节间隙内可见异常透亮影，CT值为负值，软组织窗显示清楚(图5)。
2.6 关节囊及关节周围钙化：
12例，占20%，表现为点状、弧形及斑块状高密度影(图6)，与关节囊附着处相一致，CT值在100～150 Hu，部分患者作过钙磷代谢检查无异常。
3 讨论
腰椎间盘和椎间关节构成三联协同装置，它们的退变是脊柱功能单位(SFU)退变的基础。腰脊柱运动是多方向活动的耦合或共轭，椎间关节的生物力学功能主要是承受压缩、牵拉、剪切等不同类型的载荷，为腰椎提供一定范围的生理活动，又通过关节的方位、关节囊及辅助韧带限制脊椎的运动方向和范围。腰椎间关节承受的压缩载荷占腰椎总载荷的18%，承受的剪切载荷占1/3，但由于椎间盘的粘弹特性，受载后发生蠕变与松弛，这样椎间关节所受的载荷越来越大。特别是当椎间盘退变变矮或者小关节角度异常时，引起共轭效应，腰椎应力分布不均，在此长期影响或累积性劳损下，应力集中区结构破坏，导致软骨损伤剥脱、骨质软化、表面凹凸不平，其缓冲作用下降，关节间隙变窄，软骨下骨质增生硬化甚至糜烂，非应力区骨质疏松或囊变，暴露的软骨下骨致气体进入，继而出现关节囊松弛、不稳和钙化[1]。
关节突的形态、大小和方向等异常是腰椎间关节退变的重要原因之一。不同应力环境下关节突关节的形态改变不同,关节增生变厚,软骨下骨折的重新塑形,最终导致关节面变形、关节走行方向异常、咬合失常,并且加重炎症。上关节突关节形态和关节突关节角的大小所起的机械阻挡作用,在下腰椎的稳定性和椎体运动中作用最大,所受的应力也最大。上下位关节突与正中矢状面的夹角大小不一，自上而下逐渐增大并转向额面位。多数学者认为，当双侧关节突关节角的差值>10°时可视为关节突关节角不对称，当关节不对称节段承受扭转时，轴向旋转总是更倾向于阻挡作用小的矢状位关节，使其受力较大，稳定性减弱，易发生关节退变且程度较重。另外，关节突关节角不对称尚与椎间盘退变及腰椎滑脱有密切的相关性[2]。
腰椎间关节退变的病因机制尚未完全明了，包括先天畸形、特发性侧凸、感染、创伤、解剖结构、年龄、椎间盘病变等因素，另外还可能与地区人种差异、职业、生活方式及遗传因素等有关。椎间关节囊内神经末梢丰富，除接受本节段后根支配，上接受下一节段返回支，当关节承载过大、局部炎症刺激，以及姿势不正、运动不协调或腰部扭转导致的滑膜嵌顿，都会引起腰部疼痛。其临床表现有：(1)下腰痛或突然出现腰椎关节嵌顿征，常放射至臀部或大腿，但多只波及膝关节以上。(2)活动后变换体位及姿势可缓解疼痛，前屈时疼痛减轻，后伸时疼痛加重，小关节区局部压痛。(3)属牵涉痛，与神经根刺激和受压无关，无下肢神经系统的病理特征。(4)用1%利多卡因小关节封闭疼痛缓解[3]。
腰椎间关节退变是腰椎退行性疾病的重要部分，可以单独存在，但更多地与椎间盘突出、椎管狭窄征及腰椎退变性侧凸等合并存在。普通X线检查密度分辨率差，加上椎间关节位置隐蔽，又是倾斜并且弯曲的，常规检查难以显示其细微改变，容易漏诊或误诊;磁共振成像(MRI)在检查腰椎间盘突出或软骨病变优势强于CT，但是在关节突增生方面却远不及CT;CT能对椎间关节退变作全面观察。对下腰痛患者，很有必要作CT检查以排除腰椎间关节退变[4]。
摘要：目的 加强对腰椎椎间关节退变的认识和重视。方法 总结60例腰椎椎间关节退变的CT表现,所有病例均行常规CT平扫,层厚、间隔均为3～5 mm。结果 CT扫描表现为:31例关节面不对称,58例关节突增生硬化、骨赘形成,45例关节间隙狭窄、糜烂、软骨下骨质改变,11例关节出现真空现象,12例关节囊及关节周围钙化(12例)。结论 CT能对椎间关节退变作全面观察,对下腰痛患者,很有必要做CT检查以排除腰椎间关节退变。
关键词：椎腰,关节,腰痛,体层摄影术,X线计算机,退行性变
参考文献
[1]贺瑞,尚希福,童元,等.腰椎不稳的临床特点与影像学表现观察.中国矫形外科杂志,2008,15(3):230-231.
[2]陈宏亮,丁文元,李宝俊.腰椎关节突关节退变的影像学改变及意义,2009,16(9):1482-1485.
[3]李松年,唐光健.现代全身CT诊断学.北京:中国医药科技出版社,2007:343.