髁突软骨细胞

髁突软骨细胞（精选3篇）

髁突软骨细胞 篇1

从目前来看,软骨细胞会受到应力的两种影响,分别是后继效应和即时效应。虽然这两种效应与力值大小、应力性质之间的关系已被国内外学者进行了一定程度的研究,但是对于力值的影响还存在着较大的争议。本文就不同静压力对新生SD大鼠髁突软骨细胞增殖与凋亡的影响进行探讨,现报道如下。

1材料和方法

1.1主要仪器和试剂

可控气液压细胞加载装置、流式细胞仪、碘化丙啶染液、2.5g/L胰蛋白酶、RNA酶。

1.2细胞培养及传代

基于李松等[1]方法来开展大鼠髁突软骨细胞体外原代及传代培养工作。

1.3压力加载方法

加载压力分别为36k Pa、24k Pa、12k Pa、0k Pa,持续静压1h,在加力后立即(0h)收集细胞进行检测,细胞悬液用1.2的方法来获得,计数后立即接种在六孔培养板上(数量为4块),分别将2m L细胞悬液加在培养板的孔内。当细胞发展到对数生长期,并且贴壁之后,应该在加载装置内放置培养板(内含有接种细胞)。在对其密闭性进行检查后,装置内用加压气囊来予以充气,直至达到预设的压强刻度之后,应该尽快在细胞培养箱中移入装置,并开始予以计时。

1.4流式细胞术检测

6孔细胞分别在加力后用2.5g/L胰蛋白酶来予以消化,待细胞完全脱落之后,对各孔内细胞悬液进行收集,后离心,将上清离心出来之后再漂洗2次,直至形成单细胞悬液,再加入700μL纯酒精(温度为4℃、浓度为700m L/L)固定保存18h,离心弃固定液,细胞周期和细胞DNA含量用流式细胞仪来进行检测。AI(细胞凋亡指数)和PI(细胞增殖指数)基于细胞周期来进行计算。

1.5统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示;两组计量资料的差别比较采用t检验,计数资料差别比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

由表1可以看出,当加载压力分别为36k Pa、12k Pa时,与0k Pa相比,髁突软骨细胞的各个增殖、凋亡指数都呈现出明显的下降趋势,具有统计学意义(P<0.05)。当加载压力为12k Pa时,细胞凋亡指数减幅最大;当加载压力为36k Pa时,细胞增殖指数减幅最大。增殖与凋亡的比较如图1所示。

3讨论

软骨细胞在改建髁突软骨的过程中,既会出现凋亡,又会出现增殖,且较易受到其他因素的影响,其中最为主要的因素是应力[2]。髁突软骨细胞增殖与凋亡与应力之间的关系,一直以来都是国内外医学界的研究重点,但是众说纷纭[3],没有形成一个统一的结论,本文研究结果表明:当加载压力分别为36k Pa、12 k Pa时,与0 k Pa相比,髁突软骨细胞的各个增殖、凋亡指数都呈现出明显的下降趋势,具有统计学意义(P<0.05)。当加载压力为12k Pa时,细胞凋亡指数减幅最大;当加载压力为36k Pa时,细胞增殖指数减幅最大。总之,不同静压力对新生SD大鼠髁突软骨细胞增殖与凋亡有一定的影响,但并非线性关系,值得深入研究。

摘要：目的:就不同静压力对新生SD大鼠髁突软骨细胞增殖与凋亡的影响进行探讨。方法:加载压力分别为36k Pa、24k Pa、12k Pa、0k Pa,持续静压1h,在加力后立即(0h)收集细胞进行检测,并且开展流式细胞术检测。结果:当加载压力分别为36k Pa、12k Pa时,与0k Pa相比,髁突软骨细胞的各个增殖、凋亡指数都呈现出明显的下降趋势,具有统计学意义(P<0.05)。当加载压力为12k Pa时,细胞凋亡指数减幅最大;当加载压力为36k Pa时,细胞增殖指数减幅最大。结论:不同静压力对新生SD大鼠髁突软骨细胞增殖与凋亡有一定的影响,但并非线性关系,值得深入研究。

关键词：静压力,新生SD大鼠,髁突软骨,细胞增殖,凋亡

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髁突软骨细胞 篇2

由于体内、体外2种实验都存在一定局限, 寻找一种研究方法能兼顾2种实验手段的优点就成了学者们关注的问题。方泽强、马绪臣[4]构建大鼠的TMJ骨关节炎 (OA) 动物模型, 进一步培养OA软骨细胞和正常髁突软骨细胞, 至第3代后进行一系列的比较研究;国外学者Cucchiarini[5]体外三维培养人正常和OA的软骨细胞, 然后观察到转录因子SOX9过表达后对它们细胞外基质的影响有明显不同。OA和正常软骨细胞的区别在于它们所处的局部环境不同而造成的细胞功能和蛋白表达上的变化, 而研究体内OA的改变意义远大于研究体外通过炎性因子如IL-1刺激所造成的OA模型。在我们前期的实验中[6], 体内压应力加载后大鼠髁突软骨厚度出现明显的变薄和软骨细胞的减少, 透射电镜结果也发现增殖层细胞出现顺应力场方向的改变。我们认为可以将大鼠髁突软骨在体内进行Ⅲ类矫形力加载, 然后体外培养压应力刺激下的髁突软骨细胞, 对其生物学特性进行研究, 这是研究细胞在不同力学条件下各种蛋白质表达变化的一种新模式。

本研究采用已建立的下颌向后牵引的动物模型[6], 采用目前常用的髁突软骨细胞分离培养方法, 探讨体内压应力刺激后大鼠髁突软骨的细胞形态、生物活性以及蛋白质水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂、器材

60 d SD大鼠36只, 雌雄不限, 体重 (180±14) g (由南京医科大学动物实验中心提供) 。DMEM培养基、胰蛋白酶 (Sigma, USA) , Ⅱ型胶原酶 (Gibco, USA) , 胎牛血清 (Hyclone, USA) , CO2细胞培养箱 (Sanyo, Japan) , 倒置相差显微镜照相系统。

1.2 髁突软骨力学加载模型

按文献[6]的III类矫形力方法进行, 加力2周后取材进行大体形态学和组织学观察, 并分离细胞进行培养。

1.3 体外髁突软骨细胞的分离培养

常规培养对照组和加力组SD大鼠的髁突软骨细胞。将大鼠断颈处死, 由一人完成取材的工作, 按以下分界线切取半透明状的髁突软骨 (图1) 放于培养皿中, 称重。然后以锐利小剪刀将其剪碎成1 mm3大小, 放于小青霉素瓶中。先用0.25%胰蛋白酶消化30min, 再加入0.2%Ⅱ型胶原酶消化120 min;再用高糖的DMEM培养液 (含20%胎牛血清) 将细胞悬浮。离心收集细胞, 苔盼蓝染色, 计数, 按相同的密度接种于25 cm2的细胞培养瓶, 于5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱内培养, 观察髁突软骨细胞的贴壁和生长情况。72 h细胞贴壁后, 每2 d换液1次。

1.4 体外髁突软骨细胞的生物活性检测

倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况;计算软骨组织的细胞收获率;计数体外培养软骨细胞数和活细胞比例:将细胞悬液90μl和1μl 0.4%台盼蓝液混匀后, 3 min内进行观察, 活细胞不被染色, 为透亮表现, 受损细胞或死细胞则被染成蓝色, 为阳性。计数300个细胞和其中的阳性细胞数, 计算活细胞比例。

1.5 正常组和加力组细胞蛋白组学研究

将正常组和加力组的原代髁突软骨细胞裂解, 按BIO-RAD标准说明书进行蛋白的定量, 先行总蛋白双向电泳, 结果重复3次。染色后的双向电泳凝胶用GS-800 (BIO-RAD) 吸光度仪扫描, 光学分辨率600ppi (pixel per inch) , 数字化图像文件运用Image Master5.0软件分析。

1.6 差异蛋白质斑点的质谱鉴定

选取2D-E胶上的目的差异蛋白斑点, 用解剖刀片沿染色边缘切下放于小离心管中。用100 mmol/L碳酸氢氨∶乙腈 (1∶1) 的溶液脱色;再加50μl乙腈使胶脱水, 完全干燥。在50 mmol/L包含测序级胰酶 (Promaga) 的碳酸氢氨溶液中再水化, 37℃孵育1 h, 室温下过夜。新鲜配制10 mg/ml的a-氰基-4-羟基肉桂酸 (CHCA) 。点约1μl基质和样品混合液于靶上, 让靶自然干燥, 最后将靶装入质谱仪。使用ABI的Voyager DE Pro质谱仪进行分析, 仪器相应的参数为反射模式、氮激光337 nm, 3 ns的脉冲宽度 (ns pulse width) , 3 Hz的重复率 (Hz repetition rate) , 离子延迟提取100 ns, 栅极电压 (Grid voltage) 68%, 真空度为4×10-8Torr (1托=1/760大气压, 约等于5.33×10-6Pa) , 质谱信号的单次扫描累加150次, 正离子谱测定。用胰酶自解蜂842.51、2 211.104 6作为内部标准校正。获得的混合物肽片段质量数据通过Mascot搜索引擎进行检索。

2 结果

2.1 压应力刺激后大鼠髁突软骨的组织形态学观察

实验组于动物体内取出软骨后可见软骨组织表面欠光滑, 略显粗糙, 折光性差, 与正常软骨组织有明显可见的差别, 组织学形态证实加力组髁突软骨与对照组相比有明显的变薄 (图1) 。

A:对照组;B:加力组A:Control group;B:Experimental group

2.2 压应力刺激后髁突软骨细胞的分离培养

对照组和加力组髁突软骨细胞接种后24 h, 只有少量细胞贴壁, 72 h后大多数细胞均已贴壁, 部分细胞向外伸展, 呈椭圆形或多角形。原代细胞约10~12d长满瓶底, 呈铺路石样 (图2) 。细胞贴壁后, 倒置显微镜下观察正常髁突软骨细胞呈多角型, 成簇聚集, 胞内充满分泌颗粒;加力组细胞形态更为狭长。加力组由于髁突软骨的重量下降, 消化后获得的细胞数目减少, 细胞的存活率有下降。细胞计数的结果表明, 加力组髁突软骨细胞增殖活性明显减慢, 出现平台期即对数生长期的时间要滞后于正常组 (表1) 。

2.3 正常组和加力组双向电泳图

2组双向电泳图如图3。采用Image Master 5.0软件进行图像分析, 发现加力后有32个蛋白点下降, 21个蛋白点上升, 差异有显著性。选取差异蛋白进行质谱鉴定 (表2) 。

3 讨论

大鼠髁突关节软骨细胞外基质以致密的Ⅱ型胶原网络支架为基础, 细胞比例相对较少, 故分离培养困难。成年动物且存在机械性损伤的关节软骨细胞的增殖、合成、分化功能比幼年来源的软骨细胞差[7], 所以可用于分离培养细胞的软骨总量也较幼年动物少。因此, 如何从有限的受损软骨中分离得到尽可能多的可用的软骨细胞是进一步研究的基础。本研究中先使用胰蛋白酶预消化, 以去除软骨组织取材时可能带入的滑膜细胞;再采用带胎牛血清的培养基配制的0.2%Ⅱ型胶原酶消化2 h。在最终获得的软骨细胞数量上看, 对照组平均为2×105个, 加力组平均为6×104个, 使后续的实验有了保证。

A、C:对照组;B、D:加力组A, C:Control group;B, D:Experimental group

(±s) (±s)

A:对照组;B:实验组A:Control group;B:Experimental group

本研究结果表明在外力刺激下, 大鼠髁突软骨层明显变薄, 失去弹性, 体外培养的髁突软骨细胞加力组数量明显要比对照组少, 细胞形态出现变化, 活细胞的比例也有所下降, 这些结果提示力学刺激后的大鼠髁突软骨发生了明显的生物学变化, 这种变化不仅体现在组织学水平, 在细胞水平同样出现了变化。可见, 关节软骨的机械损伤对软骨细胞的生物学活性具有一定影响,

蛋白质组学的结果也进一步表明了力学刺激可以导致蛋白水平的变化。我们可以看出在体内压应力刺激下, 大鼠髁突软骨细胞出现了应激性的变化, 主要表现为蛋白二硫键异构酶PDI和超氧化物歧化酶SOD的上调, 这提示体内错误折叠蛋白的增加, 氧自由基增加, 内质网应激可能随之诱导发生来帮助机体应对外界的刺激;同时, 细胞骨架蛋白Tropomyosin在压应力刺激下可能发生解聚或降解, 细胞代谢相关蛋白如肽基脯氨酸顺反异构酶Pin-1、丙酮酸激酶PKM2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH均表达下降, 这和组织学上观察到的大鼠髁突软骨变薄的现象是一致的。在此基础上, 细胞信号传导蛋白如膜联蛋白Anxa1可能活化, Anxa1与表皮生长因子受体激酶、蛋白酶C以及钙离子通道多条信号转导通路相关, 能调控细胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用等。因此, 压应力刺激下大鼠髁突软骨的变化可能与细胞外基质中自分泌或旁分泌的炎性细胞因子增加、活性氧应激增加、激发软骨细胞凋亡等因素有关[8]。

本实验采用的是体内压应力加载后原代培养髁突软骨细胞的方法, 不管是形态学和蛋白组学水平都有明显的变化, 因此是研究力学刺激后大鼠髁突软骨细胞应答反应的一种良好的实验模式。

参考文献

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髁突软骨细胞 篇3

1 材料和方法

1.1 实验动物

9 周龄雌性SD大鼠75 只,体重(250±20) g。根据随机原则将实验动物分为3 组,每组25 只,其中2 组为实验组。动物饲养在同济大学分子生物学实验室。实验组动物戴用统一规格的自制咬合前导矫治器,分别戴用12 h和全天。自制的上颌斜面导板式功能矫治器由金属斜面导板、塑料基托及辅助固位装置组成。斜面导板与上颌平面呈约25°角,大鼠闭合时,下切牙咬在金属斜面导板上,引导下颌前伸。

1.2 组织处理

3 组动物分别在实验后3、7、14、21、30 d处死,充分暴露颧弓,整块取出下颌骨;常规石蜡包埋,包埋时注意调整下颌支与蜡块底面平行,沿髁突中份矢状向进行连续切取至少3 张切片,切片厚5 μm。

1.3 免疫组织化学分析

特异性一抗:兔抗X型胶原抗体(Rabbit Anti- COL10A1)1∶100、EnVision试剂(HRP) 即用型(博士德生物科技公司)。操作流程:切片脱蜡后,在H2O2中浸泡20 min,然后在羊血清中孵育30 min。在37 ℃水浴中与一抗孵育2 h,PBS洗净后与EnVision试剂作用30 min。DAB显色后,镜下观察。

1.4 X型胶原mRNA原位杂交

X型胶原探针序列:采用博士德生物科技公司提供的针对X型胶原的经地高辛标记的寡核苷酸探针。操作程序:切片脱蜡后,梯度乙醇脱水。DEPC水洗,4%PFA固定后用梯度乙醇脱水。在37 ℃湿箱中,与预杂交液孵育2 h,不洗。之后,用原位杂交专用盖玻片覆盖标本,放入湿盒,42 ℃杂交过夜。经系列冲洗后,依次滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC及生物素化过氧化物酶。DAB显色,充分水洗后,乙醇梯度脱水,封片,显微镜观察。

1.5 图像分析

使用Nikon TE2000- S型光学显微镜下用NIS- Elemnts F 2.20图像分析系统采图,各组切片选取TMJ髁突顶部区域40 倍镜下进行观察,使用Image- Pro Plus 6.0图像分析软件进行图像分析。以髁突顶部髁突软骨内阳性信号强度即黄染区累积吸光度(integrated optical density, IOD)为参数进行半定量测量。

1.6 统计分析

使用SPSS 13.0统计软件,用t检验分别对12 h实验组、 24 h实验组与对照组之间进行两两比较,每组各时间点的组内比较用单因素方差分析,P<0.05表示有统计学意义。

2 结 果

2.1 X型胶原蛋白表达

低倍镜下观察X型胶原阳性染色为软骨细胞胞质和胞膜着色,DAB显色为棕黄色,主要表达于髁突软骨成熟层及增殖层。高倍镜下观察阳性染色细胞胞质内有棕色颗粒。各实验组在成熟层及增殖层可见明显的X型胶原蛋白表达,表现为棕黄色的条带。24 h实验组在21 d表达最明显(图 1a),而12 h实验组在30 d时表达最显著(图 1b)。对照组相应区域染色面积小,染色程度浅(图 1c、d)。阴性对照(除不加第一抗体外,其余试剂与实验组相同) 动物髁突未见着色。

IOD均值结果显示:第14 天, 24 h组与对照组间

a: 21 d 24 h实验组; b: 30 d 12 h实验组; c: 21 d对照组; d: 30 d对照组

差异具有显著性(P<0.01)。第21 天,24 h实验组的IOD均值在各时间点中最高,与对照组及12 h实验组间差异具有显著性(P<0.01)。同时,对照组与12 h实验组间差异具有显著性(P<0.01)。第30天,24 h实验组的IOD均值与12 h实验组差异无显著性。

组内比较发现,对照组中X型胶原蛋白表达随着观测时间点向后推移,IOD均值持续下降(P<0.05)。在实验组中,12 h实验组的IOD均值在实验时间内一直上升(P<0.05),而24 h实验组的IOD均值在21 d时达到高峰(图 2)。

2.2 X型胶原纤维的mRNA表达

低倍镜下观察X型胶原mRNA阳性表达为软骨细胞胞质和胞膜着色,DAB显色为棕黄色,主要表达于髁突软骨成熟层及增殖层。高倍镜下观察阳性染色细胞胞质内有棕色颗粒。与蛋白表达结果类似,24 h实验组在21 d时mRNA阳性表达最明显(图 3a),而12 h实验组在30 d时表达最显著(图 3b)。对照组相应区域染色面积小,染色程度浅(图 3c、d)。阴性对照组(除不加探针外,其余试剂与实验组相同)其髁突未见着色。

IOD均值结果与蛋白的表达结果类似,详见图 4。

a: 21 d 24 h实验组; b: 30 d 12 h实验组; c: 21 d对照组; d: 30 d对照组

3 讨 论

临床上经常会遇到下颌发育不足的年轻成人患者,但是固定类功能矫治器是否也可应用于年轻成人一直存在争论。McNamara[3]认为功能矫治器并不能明显的增加成人下颌骨的长度。Ruf[4]则认为功能矫治器能够导致成人的髁突发生改建。Tagliaro等[5]通过扫描电镜技术及组织学的方法,来评价下颌骨髁突的改形变化,发现在成年鼠有髁突软骨再生。

本实验选择9 周龄雌性SD 大鼠,能够代表临床上年轻成人患者的年龄段(18~22 岁)[6]。髁突软骨细胞中的增殖细胞核抗原表达,亦即软骨细胞的增殖活性,存在明显的昼夜节律性[7]。大鼠髁突软骨细胞的增殖活动白天比夜晚明显活跃[8]。故本实验12 h实验组的大鼠戴用矫治器的时间选择在上午8 点到晚上8 点。这个时间段可以代表人类的晚上8 点到早上8 点。

X型胶原与一般的胶原纤维不同,不以纤维的形式存在,而是以液态均相的形式分布于细胞外基质内,是细胞外基质的重要组成成分。Rabie[2]发现X型胶原通常只存在于生长发育期的软骨内,由肥大软骨细胞合成,分布在即将骨化的软骨内,并启动软骨骨化[4]。Shen[7]发现凡是软骨内骨化活跃的部位就有X型胶原分布,如生长期的长骨生长板内,生长期的椎骨、胸骨、颅面骨的软骨内,以及骨折愈合过程中的软骨骨痂内,都有X型胶原的分布。因此可以认为X型胶原是反映髁突软骨成骨活跃程度的敏感标志。

本研究通过免疫组化及原位杂交技术,从分子水平考察成年大鼠下颌前伸后髁突改建的变化。本实验结果显示:通过对5 个时间点对照组X型胶原蛋白和mRNA表达情况的比较发现,X型胶原表达量呈现出逐渐减少的趋势,这可能是由于大鼠由生长期过渡到成年期这一过程中大鼠髁突组织生长速度减缓而分泌活动减弱所造成的,即髁突软骨到骨转化这一过程进程减慢。而2 实验组X型胶原表达量均增加,表明下颌前伸后关节盘受到牵拉,软骨细胞周围机械力发生变化引起细胞反应增强,进而导致软骨细胞增加X型胶原的表达。

2 实验组X型胶原蛋白表达在14 d时与对照组相比有显著差异,但mRNA表达在7 d时就表现出差异,这表明X型胶原蛋白和基因表达基本一致,但基因表达较蛋白表达早。12 h实验组X型胶原表达量在实验期间持续增加,在实验的14、21 d,其蛋白和基因表达均低于24 h实验组。24 h实验组在21 d时表达量最高,且为各实验组中最高的。这表明,12 h间歇性加力方式同样能诱导髁突软骨改建,但与24 h持续性加力方式相比,12 h间歇性加力方式的功能刺激强度较低,引起髁突软骨发生反应时间慢且表达量少。

摘要：目的:建立年轻成年大鼠下颌前伸动物模型,以X型胶原为检测指标,观察髁突软骨内成骨及其与下颌前伸持续时间的关系。方法:9周龄雌性大鼠75只,分为3组,其中2组为实验组,另一组为对照组,实验组动物戴用统一规格自制的咬合前导矫治器,分别戴用12h和24h。3组动物分别在实验后3、7、14、21、30d处死后取双侧髁突组织,使用免疫组化和原位杂交方法从蛋白水平和基因水平检测髁突软骨组织切片中X型胶原的表达情况。结果:免疫组化结果显示,24h实验组X型胶原表达量在21d时最高,且高于其他实验组;而12h实验组峰值出现在30d。原位杂交结果与免疫组化结果基本吻合。结论:功能矫治下颌前伸均能诱导年轻成年大鼠髁突软骨发生改建,但与12h间歇性加力方式相比,24h持续加力方式作用效果明显,且见效快。

关键词：安氏Ⅱ类错畸形,下颌前伸,髁突软骨,功能矫治器,Ⅹ型胶原

参考文献

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