细胞内钙论文

细胞内钙论文（共4篇）

细胞内钙论文 篇1

哮喘是一种常见的多发病,许多因素可以引起哮喘,如过敏、运动和情绪等,目前国际上认为哮喘是肥大细胞、T淋巴细胞等多种细胞参与的慢性气道炎症过程,它可以引起气道对多种刺激的高反应性,对组胺、IL-4等炎性介质刺激的气道反应性增高和气道炎症也可以同时存在[1]。随着研究的不断深入,人们逐渐认识到肥大细胞(mast cells,MCs)在哮喘的发病机制中起到了重要作用,它参与了哮喘发病的全过程。近年对天然药物滨蒿内酯(Soparone,Sco.)的平喘机制研究逐渐深入,得知其通过松弛气道平滑肌、清除气道氧自由基、抑制气道炎症的作用等多种途径起到抗炎平喘作用[2,3,4]。Sco是否对于MCs的活化的效应的影响尚未明确。为了进一步明确Sco的作用机制,本实验基于前期所做的研究工作,进一步探讨Sco对MCs脱颗粒及炎症介质的释放作用机制,为其在哮喘疾病乃至免疫系统疾病的临床治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器

Olympus倒置显微镜(日本Olympus公司),二氧化碳培养箱(Fisher Scientific Headquarters公司),低温高速离心机2-16K(美国Sigma公司),SW-CJ-IF净化工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司),荧光分光光度计(日本岛津公司),紫外分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司)。

1.1.2 主要试剂

磷酸二组胺(上海生化研究所),邻苯二甲醛(美国Sigma公司),类胰蛋白酶(美国Sigma公司),Percoll分离液(瑞典Pharmacia公司),1640培养液(美国Gibol公司),胎牛血清(天津市生化制品厂),BAPNA(美国Sigma公司),Fluo-3/AM(美国Sigma公司),Scoparone(德国Merck公司)

1.1.3 实验动物

健康豚鼠,体重200-250 g,雌雄兼用,由中国医科大学实验动物部提供。

1.1.4 试剂配制

PBS液:(1)分别精确称取NaCl8.00g、KCl 0.20 g、Na2HPO4·12H2O 3.49 g和KH3PO4,0.24 g于烧杯中,加蒸馏水约800 m L,用磁力搅拌器搅拌溶解,调整溶液pH值至7.2~7.4,加水定容至1L,分装于灭菌瓶中,高压灭菌20 min,冰箱保存;(2)Percoll分离液:将10×PBS与percoll贮存液按照1∶9的比例混合,制成100%percoll悬液。将1×PBS与100%percoll悬液分别按照7∶3和2∶8的比例混合,制成30%percoll分离液和80%percoll分离液。此使用液不宜长期储存,应现用现配;(3)胎盘蓝染液:称取胎盘蓝4 g,加少量蒸馏水研磨,再用去蒸馏水定容至100 m L,滤纸过滤得母液,4℃保存。使前以PBS液稀释10倍至0.4%;(4)甲苯胺蓝染色液:称取甲苯胺蓝1 g,硼砂1 g,加蒸馏水100m L,用搅拌器混匀,滤纸过滤,室温保存。

1.2 实验方法

1.2.1 豚鼠腹腔MCs的分离和培养

(1)豚鼠腹腔MCs的分离:将健康豚鼠击头处死,浸入75%乙醇中消毒,消毒后固定于超净台内消毒木板上,剔除胸腹部毛,用75%酒精棉球消毒腹部皮肤。腹腔注射预冷的RPMI1640培养液15 m L,轻轻按摩腹部2、3min,小心打开腹腔,吸取腹腔冲洗液置于干净的离心管中,用吸管吹打混匀;(2)豚鼠腹腔MCs的纯化4℃,1 500 r/min,离心5 min弃上清,将细胞悬液缓慢加入等体积比的30%∶80%的Percoll梯度分离液中,4℃,2 500 r/min离心15 min,将收集交界处的细胞置于干净的离心管中,吸管吹打混匀,PBS工作液洗两次4℃,1 500 r/min,离心5 min,镜下计数,调整细胞浓度至1×105个细胞/m L。台盼蓝染色,活力大于95%,甲苯胺蓝染色,纯度大于90%,置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中悬浮备用[5]。

1.2.2 豚鼠MCs的致敏

(1)致敏血清的制备[6,7]:取健康豚鼠10只,体重200~250 g,雌雄兼用。实验第1天以10%鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)生理盐水0.5 m L肌肉注射于豚鼠两后腿内侧,同时腹腔注射0.5 m L卵蛋白氢氧化铝(g/mL),第4天加强1次,第14天立即颈动脉取血收集血液,室温放置,4℃冰箱过夜,待血液充分析出后离心收集上清4℃,3 000r/min,10 min,过滤除菌后-70℃冰箱中保存备用;(2)体外致敏的MCs模型:将MCs悬液与含IgE血清按1∶1的比例混合,然后置入37℃,5%二氧化碳孵箱中孵育2 h,每管约含MCs 1×105个,用含1%FBS的PBS轻轻洗涤2次,去除未结合的血清。用PBS重悬后,Sco.组MCs分别加入1×10-5mol/LSco.、1×10-6mol/L Sco.和1×10-7mol/L Sco.,在培养箱中孵育10 min,10 min后加入OVA(0.2 mg/m L)反应8 min,然后置于冰浴中5 min以终止反应。哮喘组(asthma)即致敏MCs,在培养箱中孵育10 min后立即加入OVA(0.2 mg/m L)反应8 min,然后置于冰浴中5 min终止反应。空白对照组(control)即正常MCs,以生理盐水代替药物。显微镜下观察MCs激活后状态,并拍照。

1.2.3 豚鼠MCs脱颗粒

将各组MCs(表1)试管离心,4℃,400 g,10 min,于显微镜下观察,每组选择10个MCs相对集中的视野,镜下计算每100个MCs脱颗粒程度。

1.2.4 组胺的测定

(1)组胺标准液的制备[8]:将磷酸二组胺置棕色瓶中干燥3 h,称取2.763 mg溶于0.1N HCl稀释至100 m L,分装后冰箱保存,用前取0.1m L稀释至10 m L;(2)组胺测定:分别取各组细胞,加入HClO4(终浓度0.4 mol/L),离心(4℃,4 000 r/min,10 min),取上清。取上清液1.6 m L,置于已加1.5 g的NaCl的10 m L带塞试管中,加4.0 m L正丁醇和0.2 m L NaOH(2.5 mol/L),立即混匀,置振荡器中震荡5 min。然后取出3.6 m L正丁醇相加到已加1.2m L HCl(0.1 mol/L)和2 m L正庚烷的带塞试管中。震荡5 min,弃去有机相,取1 m L HCl相置入10m L带塞试管中。加入1 m L NaOH(0.4 mol/L),然后立即加入0.1%邻苯二甲醛(OPT)0.2 m L,振荡混匀,37℃孵育10 min,加入1.0 m L,0.5 mol/L的HCl终止反应。对应的细胞用PBS重悬后经细胞破碎仪彻底破碎,其他处理方式同上清处理。荧光分光光度计比色,检测组胺含量,激发波长330 nm,发射波长440 nm。根据制定的组胺标准曲线分别计算细胞上清中组胺含量和细胞中组胺含量,组胺释放率=上清组胺/(上清组胺+胞内组胺)×100%。

1.2.5 类胰蛋白酶活力的测定

酶活力的测定采用专用底物BAPNA(a-N-苯甲酰-D L-精氨酸-P-硝基苯胺)。BAPNA以20 mg/m L溶于二甲基亚砜,混匀后取40μL加入含待测液的0.1 mol/L反应缓冲液1.5 m L中,反应缓冲液为Tris-HCl(pH 7.4),30℃反应20 min后,加入0.5 m L 30%(v/v)乙酸终止反应,在405 nm测光吸收值。以反应缓冲液做参比调零[9]。

1.2.6 MCs[Ca2+]i的测定

(1)体外致敏的MCs模型:将MCs悬液与含lg E血清按1∶1的比例混合,然后置入37℃,5%二氧化碳孵箱中孵育2 h,每管约含MCs 1×105个,用含1%FBS的PBS轻轻洗涤2次,去除为未结合的血清。用PBS重悬后,加入OVA(0.2 mg/m L)反应8 min以激活MCs,然后置于冰浴中5 min以终止反应;(2)MCs[Ca2+]i的测定:将1mol/L Fluo-3/AM按1∶200体积比用无钙液液稀释为终浓度为5μmol/L,将悬浮培养的MCs加入已预先覆盖多聚赖氨酸的培养皿中负载。在37℃、通气(95%氧气和5%二氧化碳)的条件下避光负载45min,而后用PBS冲洗两次,稳定15 min,以确保Fluo-3/AM细胞内溶解为Fluo-3,再用倒置荧光显微镜采集细胞荧光图像,激发波长488 nm,发射波长528 nm。图像分辨率为640×480像素,每侦采集时间为1 s。在应用Metafluo分析软件进行图像处理时,采用套锁的方式选取细胞,对单个细胞进行分析;(3)[Ca2+]i的变化表示方法:[Ca2+]i的变化用ΔF/F0的比值来表示,F0为基础荧光密度值,F为给予不同工具药后细胞的荧光密度值,ΔF/F0=(F-F0)/F0代表给药后Ca2+的变化程度。

1.2.7 统计学处理

所有数据均以表示,应用SPSS16.0软件进行单因数方差分析和t检验,P<0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 MCs的激活

MCs染色用特异性染色剂甲苯胺蓝,可见胞浆内充满颗粒,颗粒形态比较清晰,见图1。部分细胞胞浆内呈空泡状,提示有部分颗粒自然脱出。致敏MCs经抗原激活可以看到细胞体积变大,表面有颗粒样凸起,见图2。

2.2 Sco.对豚鼠体外致敏的MCs脱颗粒的影响

注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与哮喘组比较,P<0.05;3)与哮喘组比较,P>0.05

哮喘组豚鼠腹腔MCs脱颗粒百分数与对照组相比差异显著(P<0.05)。1×10-5mol/L Sco.和1×10-6mol/L-1 Sco.组与哮喘组相比较,有抑制MCs脱颗粒的作用(P<0.05),其中1×10-5mol/L Sco.组抑制作用最明显;1×10-7mol/L Sco.组与哮喘组相比无明显差异(P>0.05)。

2.3 不同浓度Sco.对豚鼠MCs释放组胺和类胰蛋白酶的影响

豚鼠MCs经抗原激活后,哮喘组与对照组比较组胺和类胰蛋白酶释放量显著增加(P<0.05);1×10-5mol/L Sco.和1×10-6mol/L Sco.组与哮喘组相比较,组胺和类胰蛋白酶的释放得到了有效的抑制(P<0.05),其中1×10-5mol/L Sco.组最明显,1×10-7mol/L Sco.组与哮喘组相比无明显作用(P>0.05)。

注:1)与对照组比较,P<0.05,2)与哮喘组比较,P<0.05,3)与哮喘组比较,P>0.05

2.4 不同浓度Sco.对正常及致敏MCs[Ca2+]i的影响

[Ca2+]i改变用ΔF/F0表示,在无钙液中,应用不同浓度的Sco.(即10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L)作用于正常MCs,测定MCs[Ca2+]i的变化,变化的幅度分别为(-12.1±2.2)%、(-6.1±2.4)%和(-2.1±0.7)%;应用不同浓度的Sco.(即10-5、10-6和10-7mol/L)作用于致敏MCs,测定MCs内[Ca2+]i的变化,变化的幅度分别为(-75.6±2.2)%、(-33.9±2.5)%和(-4.0±0.02)%,可见[Ca2+]i下降的程度与Sco.呈剂量依赖性,Sco.各剂量组对致敏MCs[Ca2+]i的抑制均高于其相对应的正常MCs[Ca2+]i(P<0.05),其中10-5mol/L Sco.组对致敏MCs[Ca2+]i的抑制作用更加显著。见图3。

3 讨论

哮喘的发病机制十分复杂,可能与抑制炎症作用有关。目前认为哮喘发病机制主要为I型变态反应学说,而肥大细胞(mast cell)是引发变态反应的主要效应细胞之一,它所分泌的活性物质能引起气道平滑肌的增殖和收缩。MCs所引起变态反应主要由高亲性IgE受体FcεRI的交联所触发,它只有激活后才能起作用,如抗原、抗IgE抗体等等,激活后所释放的颗粒介质能够广泛地调节其他细胞及其功能[10]。机体接触到过敏原以后,过敏原被抗原提呈细胞(APC)所识别,首先诱导B细胞产生特异性抗体IgE,IgE通过与MCs表面的受体FcεRI结合而处于致敏状态。当过敏原再次进入机体时,APC细胞吞饮这些过敏原,激活信号转导系统并进行脱颗粒。MCs活化后以胞吐的方式释放预先形成的和新产生的炎症介质,参与平滑肌收缩、黏液的产生等过程,最终引起炎症反应[11]。炎症状态下的MCs能够高水平的表达FcεRI使其更多的结合抗体IgE。因此,抑制MCs脱颗粒的产生及增强MCs的稳定性,成为控制哮喘的关键环节之一。本研究证明Sco.可剂量依赖性抑制豚鼠MCs脱颗粒,且对致敏的MCs脱颗粒抑制作用更显著,这也提示Sco是否可更广泛应用于抗过敏的治疗。

细胞内钙离子(calcium,Ca2+)的参与在MCs脱颗粒的过程中是必不可少的,Ca2+作为细胞内重要的信号转导元件,在生物学上的重要性早在多年前就已被人们所认识到,它参与一些重要的生理过程,如肌细胞收缩、神经递质的释放、细胞存活、凋亡过程等。哮喘气道的病理过程与Ca2+改变密切相关。现在普遍认为Ca2+浓度升高主要有外钙内流和内钙释放两种方式。能够引起细胞内Ca2+浓度升高的除钙通道以外,还有内质网或肌浆网上的IP3和Raynodine受体,Ryanodine(RyRs),他们能被IP3或Ca2+直接激活而释放内钙[12]。本实验发现Sco.能够抑制豚鼠正常MCs以及致敏MCs[Ca2+]i释放并呈剂量依赖性,这与其在豚鼠平滑肌细胞的降钙作用相似[13],但Sco是否仅通过抑制MCs[Ca2+]i的释放而影响其脱颗粒作用还需要进一步研究证明。

总之,本实验比较对照组、哮喘组、不同剂量Sco.组豚鼠MCs所释放组胺和类胰蛋白酶的差异,证实了Sco.能够抑制MCs体外脱颗粒,进而减少了组胺和类胰蛋白酶的释放同时降低MCs[Ca2+]i并呈剂量依赖性,有效地减轻哮喘的炎症症状。

摘要：目的 滨蒿内酯(Soparone,Sco.)通过松弛气道平滑肌、清除气道氧自由基、抑制气道炎症等多种途径起到抗炎平喘作用,该实验基于前期所做的研究工作,进一步探讨了Sco对肥大细胞(mast cells,MCs)脱颗粒及其炎症介质的释放作用的影响及可能的调控途径。方法 不同浓度的Sco(10-5、10-6和10-7mol/L)分别作用于正常及致敏MCs,并设立正常及致敏MCs的溶剂对照组(control,asthma),比较各组MCs脱颗粒百分数、类胰蛋白酶活力、组胺释放率及MCs细胞内钙([Ca2+])i的变化。结果 1×10-5和1×10-6mol/L Sco.组MCs脱颗粒百分数分别为(39.10±2.81)%和(11.40±2.37)%,明显低于asthma组的(78.90±4.12)%(P<0.05),且以上Sco.组MCs的组胺和类胰蛋白酶释放亦较asthma组显著减少(P<0.05);在无细胞外钙条件下,不同浓度的Sco(10-5、10-6和10-7mol/L)对正常MCs[Ca2+]i的影响分别为(-12.1±2.2)%、(-6.1±2.4)%和(-2.1±0.7)%,对致敏MCs[Ca2+]i的影响分别为(-75.6±2.2)%、(-33.9±2.5)%和(-4.0±0.02)%,相同浓度Sco.对正常组和致敏组MCs[Ca2+]i的降低作用的组间差异有显著性(P<0.05)。结论 Sco.可剂量依赖性抑制豚鼠MCs脱颗粒从而抑制MCs组胺及类胰蛋白酶的释放;Sco.能够抑制豚鼠正常MCs以及致敏MCs[Ca2+]i水平。

关键词：哮喘,肥大细胞,脱颗粒,组胺,类胰蛋白酶,细胞内钙

细胞内钙论文 篇2

1 材料和方法

1.1 动物

健康豚鼠,体重150～200 g,全部雄性(由中国医科大学实验动物中心提供)。

1.2 仪器及试剂

CSW-1型超声雾化器(广东省汕头市光电医疗器械厂);XWT-204型台式平衡记录仪(上海大华仪表厂);倒置荧光显微镜(型号IX70,日本Olympus公司产品),生物荧光影像分析系统(美国Universal Imaging公司);Flou-3/AM,HEPES,DMSO,卵蛋白(美国Sigma chemical公司);滨蒿内酯(Sco)为中国医科大学药物与毒理研究室提取,经HPLC检测纯度达99%以上[11]。mouse antiα-smooth muscle actin,FITC labeled goat anti-mouse IgG(博士德公司),Hanks营养液成分(Hanks’buffer,HBSS,mmol/L):Na Cl 137,Na HCO34.2,glucose 10,Na2HPO43,KCl 5.4,KH2PO40.4,Ca Cl21.3,Mg Cl20.5,Mg SO40.8,和HEPES 5,p H 7.4;无钙Hanks营养液(Ca2+-free Hanks’buffer,D-HBSS):为上液中去掉Ca Cl2,Mg SO4,加入0.1 mmol/L的EGTA。KrebsHenseleit营养液组成如下(mmol/L):Na Cl 118.4,KCl 4.7,Ca Cl22.5,Na HCO325,KH2PO41.2,Mg SO4·7H2O 0.8,Glucose 10.1,pH 7.4。无钙Krebs-Henseleit营养液为上液中去掉Ca Cl2,加入0.1 mmol/L的EG-TA。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备及实验分组

适龄豚鼠随机分成空白对照组(非哮喘模型+生理盐水处理)、哮喘非治疗组(哮喘模型+生理盐水处理)、滨蒿内酯(Sco)治疗组(哮喘模型+Sco处理),每组10只;除空白对照组外其余各组豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理盐水溶液1 m L于第14天开始隔天超声雾化吸入1%卵蛋白激发7次,每次2 min,观察动物状态。动物逐渐出现呼吸加快,最后出现腹式呼吸等为阳性反应,提示造模成功。空白对照组采用生理盐水雾化吸入。Sco治疗组在引喘前1天及每次引喘前30min分别吸入10-3mol/L Sco,末次激发结束后24 h内取材。

1.3.2 离体豚鼠气管平滑肌环制备及张力测定

各组豚鼠击头处死,迅速取出其主气管约1～1.5 cm,置于冷的通有混合气体(95%O2,5%CO2)的KrebsHenseleit(K-H)营养液中,于其中剪除气管周围的结缔组织及脂肪组织,将气管剪成宽3～5 mm左右的气管环,悬挂于盛有10 m L K-H液的浴管中,保持温度(37.0±0.5)℃,并持续通入混合气体。气管环的张力变化可通过其上端相连的力-位移换能器记录在台式平衡记录仪上。标本初始负荷2 g,每15min换1次营养液,平衡2 h后向浴管中加入实验药物。一组药物实验完毕后,用新鲜Krebs-Henseleit液冲洗标本3次,平衡2 h后再给下一组药物。每个标本至多只完成两组药物实验。

1.3.3 豚鼠ASMCS分离培养

将豚鼠击头处死,取其全部主气管。冰浴条件下,在HBSS中冲洗并分离其外周结缔组织及脂肪组织,剪开其软骨面,用棉签轻轻刮除气管黏膜及黏膜下层后,分离两侧的软骨,将气管平滑肌条切成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块,在37℃、通气(95%O2和5%CO2)的条件下,用200 u/mL胶原酶消化,消化二,各40 min;而后经冲洗、稳定、吹打、过滤、离心,再经台盼蓝染色计数,活细胞数达95%以上,加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,将细胞数调整至1×105个/m L,接种于35 mm培养皿,每2～3天换液1次。一般在48 d可见到细胞附壁生长,1～2周出现致密的细胞层。取培养的第5～7天细胞进行内钙测定。

1.3.4 豚鼠ASMCS的鉴定

取原代分离培养5～7d用的ASMCS,在4℃用4%多聚甲醛固定后,1∶200稀释mouse antiα-smooth muscle actin即小鼠腹水单克隆抗体作为一抗,反复用HBSS冲洗3次后,加入二抗(FITC标记的羊抗鼠IgG),用荧光显微镜观察并采集图像。

1.3.5 [Ca2+]i的测定

Fluo-3/AM用D-Hanks稀释为终浓度5μmol/L的,加入贴壁培养ASMCS的培养皿中负载。在37℃、通气(95%O2和5%CO2)的条件下负载45 min,而后用PBS冲洗2次后,稳定15min,用倒置荧光显微镜及高灵敏度冷CCD数码摄像机采集细胞荧光图像,激发光波长为488 nm,发射波长为528 nm。图像分辨率为640×480像素每侦采集间隔时间为1 s。在应用Metafluo分析软件进行图像处理时,采用套锁的方式选取细胞,对单个细胞进行图像分析。

1.4 数据处理

[Ca2+]i的变化用ΔF/Fo的比值来表示,Fo为被刺激前细胞的基础荧光密度值,即基础荧光值比被套锁的细胞面,F为给予刺激因素后细胞的荧光密度值,ΔF/Fo=(F-Fo)/Fo代表给予刺激因素后[Ca2+]i的变化程度。采用SPSS for windows 11.5统计软件包进行单因素方差分析和t检验对数据进行统计分析,显著性标准为P<0.05。全部数据均表示为。

2 结果

2.1 各组豚鼠离体气道平滑肌对rya nodine反应性比较

分别用含钙和无钙K-H液平衡标本并加入终浓度为1μmol/L的新霉素(PLC抑制剂)预处理10min,加入5μmol/L ryanodine各组豚鼠ASM均出现收缩反应,其收缩幅度以Ryanodine诱导引起的收缩高度占60 mmol/L KCl引起同一标本的收缩高度的百分比表示。结果表明,在营养液含钙情况下各组豚鼠ASM收缩百分比分别为:(21.8±5.8)%、(38.4±13.5)%和(11.0±7.1)%。其中Sco治疗组、哮喘组与正常组豚鼠两两比较,ASM百分比均有明显差异(P<0.05,P<0.01);在营养液无钙条件下,各组豚鼠ASM收缩百分比分别为:(17.6±5.3)%、(20.3±12.6)%和(8.1±3.3)%。其中Sco治疗组与哮喘组和正常组豚鼠比较,ASM收缩百分比均有明显差异(P<0.05,P<0.01),见图1。

2.2 原代培养的豚鼠AS MCS的鉴定

取原代分离培养5～7 d用的ASMCS,免疫荧光染色,可见肌动蛋白形态,见图2。

2.3 体外给予不同浓度S co对原代培养的豚鼠AS MCS[Ca2+]i的影响

取原代分离培养第5～7天的ASMCS,工作液为HBSS,进行[Ca2+]i测定,[Ca2+]i的变化情况以ΔF/F0比值反映,每个细胞取其[Ca2+]i变化的谷值。结果显示10-6 mol/L、10-5 mol/L、10-4 mol/L Sco可明显降低对照组及哮喘组豚鼠原代培养ASMCS[Ca2+]i水平,并有一定剂量依赖性;与对照组比较,10-5mol/L、10-4mol/L Sco降低哮喘豚鼠原代分离培养第5～7天的ASMCS[Ca2+]i更为明显(P<0.01),见图3。

2.4 S co对rya nodine诱导的豚鼠AS MCS[Ca 2+]i的变化的影响

取原代分离培养第5～7天的ASMCS,工作液为D-HBSS,同时加入终浓度为10-4mol/L Sco和1μmol/L新霉素作用10 min,再分别加入1μmol/L、5μmol/L、25μmol/L ryanodine,测定[Ca2+]i变化。结果与未予10-4mol/L Sco处理的ASMCS的[Ca2+]i变化作比较,提示在细胞外钙缺乏的情况下,10-4mol/L Sco显著抑制5μmol/L ryanodine诱导的豚鼠ASMCS的[Ca2+]i升高(P<0.01),两组皆显示5μmol/L ryanodine诱发豚鼠ASMCS的[Ca2+]i升高最显著,见图4。

3 讨论

在以往的研究中发现:传统中药茵陈的主要有效成份之一的Sco,兼具有抗炎、抗过敏和舒张ASM及抗肿瘤等作用[3,4,5,6,7,12,13],其可能通过抑制细胞的内钙释放和经受体操控性钙通道(ROCC)的外钙内流,降低ASMCS的[Ca2+]i起作用。本教研室研究生赵蕴馥、李智等在大鼠离体主动脉和肺动脉上证实了Sco对内钙释放和经ROCC的外钙内流的均具抑制效应,且进一步提出其抑制内钙释放的效应有可能更强[9];李智、刘洪瑞等[8,9]观察到Sco可剂量依赖性舒张离体豚鼠气道管平滑肌并可剂量依赖性地显著延长Ach和His所致哮喘豚鼠的引喘潜伏期,证实Sco可降低分离的ASMCS的[Ca2+]i,然而Sco降低ASMCS的[Ca2+]i途径及作用靶点尚未明确。

[Ca2+]i的升高既可以来自于通过ROCC和/或电压依赖性钙通道(VOCC)的外钙内流,也可经肌浆网(SR)对细胞内钙的释放产生。SR上至少有两种Ca2+释放途径,一种为IP3受体介导(IP3-induced Ca2+-release,IICR),另一种为ryanodine受体(RyR)介导,也称为钙诱导的钙释放(Ca2+-induced Ca2+-release,CICR),有文献认为在ASMCS的[Ca2+]i调节中IICR则更为主要[14,15]。本试验用1μmol/L的新霉素(一种PLC抑制剂,从而抑制IP3的产生)抑制IICR途径后,应用5μmol/L ryanodine诱导的正常豚鼠及哮喘豚鼠ASM收缩差异显著(P<0.05),提示哮喘豚鼠ASMCS RyR敏感性提高,封瑞等[2,3]证实哮喘豚鼠ASMCS传代培养后依然对这一浓度ryanodine保持一定的高敏感性且哮喘豚鼠ryanodine 1型受体表达上调。但本实验在去除细胞外钙条件下,这种差异消失,说明这种敏感性的提高很大程度依赖外钙内流。此外,也证实了虽然IICR途径在ASMCS对[Ca2+]i调节更主要,但通过RyR介导CICR过程亦可独立引发ASM的收缩效应。无论细胞外有无Ca2+存在,预先给予10-3mol/L Sco雾化吸入的哮喘豚鼠ASMCS对5μmol/L ryanodine反应性较哮喘组明显下降甚至也低于对照组,在5μmol/L ryanodine诱导原代培养的豚鼠ASMCS[Ca2+]i升高实验中得到相似结果,说明Sco可明显抑制RyR介导CICR,但又无完全阻断作用。文献表明,低浓度Ryanodine(0.5μmol/L-5μmol/L)可引起人ASMCS对[Ca2+]i增加,其幅度随着Ryanodine浓度的增高而增大;高浓度Ryanodine(10μmol/L-200μmol/L)抑制RyR通道的开放从而抑制这个过程,Ryanodine的浓度与细胞内Ca2+释放的量效关系呈钟罩形曲线[15]。笔者采用1μmol/L、5μmol/L和25μmol/L 3个浓度的Ryanodine进行实验,结果发现豚鼠ASMCS对1μmol/L和25μmol/L Ryanodine的反应性皆不如5μmol/L浓度的Ryanodine明显,其量效关系与在人ASM上表现相似。

细胞内钙论文 篇3

1实验材料

β-细辛醚:本实验室提纯, 面积归一法, 含量为99.32%。ECV304细胞株:中山大学细胞库。RPMI-1640培养基:美国Gibco;胎牛血清:美国Gibco;低密度脂蛋白 (LDL) :美国Sigma产品;Rhodamine123 (Rh123) :Biochemicals产品;噻唑蓝 (MTT) :Amresco产品。钙离子荧光探针 (Fluo-3/AM) :Bio RAD产品;ALTRA型流式细胞仪:美国Beckman Coulter公司;配套EXPO32采集分析软件;550型酶标仪:BIO RAD公司。

2实验方法

2.1 ox-LDL的制备

LDL置于含10μmol/L CuSO4的PBS (pH7.2) 溶液中, 37℃温育24小时, 再将溶液置含200μmol/L乙二胺四乙酸二钠 (EDTA-Na2) 的PBS中, 在4℃中透析24小时过滤除菌后4℃保存备用。

2.2 细胞培养与实验分组处理

复苏ECV304细胞, 培养液为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI-1640培养液, 细胞置于37℃、5%CO2、95%空气的培养箱中培养至细胞生长融合80%～90%时, 分别将细胞以5×104个/ml和5×105个/ml细胞数接种入96孔和24孔培养板, 待细胞生长至稳定状态 (约24小时) , 根据细胞是否接受ox-LDL诱导及药物干预处理, 将ECV304细胞分为5组:模型组 (25μg/ml ox-LDL) 、β-细辛醚高剂量 (30μg/ml+25μg/ml ox-LDL) 、β-细辛醚中剂量 (15μg/ml+25μg/ml ox-LDL) 、β-细辛醚低剂量 (7.5μg/ml+25μg/ml ox-LDL) 、正常对照组 (加等量生理盐水) , 置于37℃、5%CO2、95%空气的培养箱培养24小时。

2.3 观察指标及测定

2.3.1 细胞活性检测

96孔板实验细胞每孔加入10g/L的MTT 10μl, 培养4小时, 弃去培养基, 每孔加入150μl DMSO, 置微量振荡器上振荡10分钟, 酶标仪 (波长570nm) 测定吸光值 (OD) 。

2.3.2 细胞内钙离子浓度检测

将24孔板中细胞培养液移去, 用PBS清洗2遍, 用2.5g/L, 胰蛋白酶和0.2g/L EDTA-Na2混合液消化细胞, 收集单细胞悬液, 加入终浓度为5μmol/L的Fluo-3/AM, 在37℃水浴45分钟, PBS洗细胞2次, 加0.5ml PBS重悬细胞, 每组均设空白对照 (消除本底荧光的影响) , FCM检测细胞内Ca2+平均荧光强度 (mean) 。

2.4 统计学处理

采用SPSS10.0统计软件进行t检验。

3实验结果 见表1。

与模型组比较△P<0.05, △△P<0.01

4讨论

钙离子作为信号传导系统中的第二信使, 在传递细胞信息、调控各种细胞效应和维持细胞正常生理功能等过程中起重要作用。正常情况下, 细胞内的钙离子浓度保持在一狭窄的范围内变动, 但是在某些情况下, 如钙内流增加、胞内钙大量释放以及钙外排机制障碍等可引起细胞内钙离子浓度升高而导致一系列的细胞生理活动异常, 钙离子超载是细胞损伤的重要标志。

戊二酰氧甲基脂 (Fluo-3) 是钙螯合剂EDTA的衍生物, 能与钙离子高度特异性地结合, 是一种新型的Ca2+荧光指示剂, 依赖脂溶性乙酰氧甲基 (AM) 酯化后就容易跨过质膜进入胞浆, 在胞浆内与游离钙离子结合, 结合后Fluo-3在488nm激光激发下发射526nm的荧光, 其荧光强度为末结合的40倍, 采用FCM测定细胞内荧光强度, 其荧光强度与胞内Ca2+浓度成正比, 故可通过测定其平均荧光强度来反映细胞内Ca2+浓度的变化。

ox-LDL具有很强细胞毒性和自由基作用, 是一种极强的致AS作用的脂蛋白, 不仅对血管内皮细胞 (vascular endothelial cell, VEC) 产生毒性作用, 促进VEC凋亡, 而且还通过多个信号传导通路改变内皮细胞的分泌活性, 导致VEC功能失调及损伤[5]。研究表明: ox-LDL可引起细胞内游离钙浓度升高, 认为细胞内Ca2+信号转导通路的激活是ox-LDL致内皮损伤的机制之一[6]。内皮细胞内Ca2+浓度的突然大幅度升高或达到一定的浓度, 可导致内皮细胞损伤及死亡[7]。

VEC结构和功能损伤是AS发生的始动因素[8], 保护VEC是防治AS的有效手段。β-细辛醚是石菖蒲主要有效成分, 实验发现β-细辛醚有明显抑制ox-LDL诱导损伤的内皮细胞黏附分子表达, 减少细胞凋亡[9]。本实验表明β-细辛醚能降低ox-LDL引起的内皮细胞Ca2+的升高, 增强细胞存活率。抑制ox-LDL引起的内皮细胞Ca2+的升高, 减少内皮细胞凋亡, 增强细胞存活率, 是β-细辛醚保护血管内皮的作用途径之一。

摘要：目的:观察石菖蒲主要有效成分β-细辛醚对氧化低密度脂蛋白诱导损伤的人脐静脉血管内皮细胞内钙离子 (Ca2+) 的影响。方法:将细胞分为正常组, 模型组, β-细辛醚高、中、低剂量组;采用流式细胞术 (flow cytometry, FCM) 测定ECV304细胞内Ca2+浓度;酶标仪检测细胞活性。结果:ox-LDL可致ECV304细胞内Ca2+明显增高, 细胞活力降低, 与正常对照组比较有显著差异 (P<0.001) ;β-细辛醚能够不同程度的降低ox-LDL致损伤的ECV304细胞内Ca2+浓度, 增强细胞活力, 与模型组比较差异有统计学差异 (P<0.05～0.01) 。结论:β-细辛醚能有效减轻ox-LDL对ECV304的损伤。

关键词：石菖蒲/药理学,β-细辛醚/药理学,钙/药物作用,体外研究

参考文献

[1]Poplawski J, Lozowicka B, Dubis AT, et al.Synthesis and hypolipi-demic and antiplatelet activities of alpha-asarone isomers in humans (in vitro) , mice (in vivo) and rats (in vivo) .J Med Chem, 2000, 43 (20) :3671.

[2]方永奇, 李翎, 吴启瑞, 等.β-细辛醚和冰片对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用.中国中医药科技, 2004, 11 (6) :353.

[3]吴启端, 方永奇, 陈奕芝, 等.石菖蒲挥发油及β-细辛醚对心血管的保护作用.中药新药与临床药理, 2005, 16 (4) :244.

[4]何玉萍, 陈奕芝, 方若鸣, 等.石菖蒲加冰片对高血脂大鼠血小板活化功能的影响.中国中医药科技, 2003, 10 (6) :337.

[5]Holvoet P.Endothelial dysfunction oxidation of LDLand cardiovascu-lar disease.Ther Apher, 1999, 3 (4) :287.

[6]Mabile L, Fitoussi G, Periquet B, et al.α-Tocophevo land trolox block the early intracellular events (TBARS and calciumrises) elicited by oxidized lowdensity lipoproteins in cultured endothelial cells.Free Radical Biology Medicine, 1995, 19 (2) :177.

[7]Bombelli T, Karsan A, Tait JF.Apoptotic vascular endothelial cells be-come rocoagulant.Blood, 1997, 89:2429.

[8]Glasser SP, Selwyn AP, Ganz P.Atherosclerosis:risk factors and the vascular endothelium.Am Heart J, 1996, 131:379.

细胞内钙论文 篇4

1 材料与方法

1.1 耳蜗外毛细胞的分离

将动物断头处死, 迅速解剖取出双侧听泡, 置于含无钙细胞外液的平皿中, 在解剖显微镜下打开听泡, 将其放入含有0.5%胰酶的缓冲液 (由无钙细胞外液配制) 中, 30℃消化15min后, 用无钙细胞外液冲洗3次以终止消化, 再将蜗轴移入含有有钙细胞外液的平皿中, 解剖显微镜下用不锈钢针将基底膜从蜗轴分离, 然后吹打制得的细胞悬液。将细胞悬液分装在24孔板上, 每孔约1mL的体积, 把24孔板放入细胞培养箱中静置10min , 使细胞贴壁。

1.2 Fluo-3的染色及钙成像

每孔加入用DMSO稀释好的Fluo-3/AM 0.5μL, 在细胞培养箱中37℃避光孵育30min, 孵育后用无钙细胞外液冲洗3次以终止孵育, 通过显微荧光测钙系统检测OHCs中的钙浓度变化及Fluo-3荧光强度变化。细胞内钙离子浓度的高低由细胞被激发出的荧光强弱表示, 越偏红表示细胞内游离钙离子浓度越高, 越蓝则越低。在倒置荧光显微镜下每孔选择活性良好的单离OHC进行实验。选择8个OHC通过显微荧光测钙系统检测静息状态下细胞内钙浓度的变化;再选择8个OHCs, 分别用微量加样器将7.8μmol谷氨酸滴加到每个孔所选用细胞上方, 加药后孔中药物的最终稀释浓度为7.8μmol/L, 观察钙浓度的变化;选择8个OHCs, 加入3g/L的ASS和7.8μmol/L的谷氨酸, 观察细胞内钙浓度的变化情况。

1.3 统计学分析

所有数值均以undefined表示, 用SPSS软件进行统计学处理, 用t检验进行统计学分析。

2 实验结果

由表1可知, 正常静息状态下OHCs的钙浓度保持稳定;加入终浓度为7.8μmol/L的Glu作用于OHCs后, 其细胞内的钙浓度迅速升高, 与静息状态下的OHCs钙浓度相比差异明显;在选定的OHCs上方加入终浓度为3g/L的ASS后, 细胞内的钙浓度有些下降, 但与静息状态下OHCs的钙浓度相比, 无明显差异;静息状态下在选定的OHCs上方同时加入终浓度为3g/L的ASS和7.8μmol/L的Glu后发现, 细胞内的钙浓度有所增加, 但增加的幅度与单独加入Glu所引起的细胞内钙浓度增加的幅度相比明显降低, 而与正常静息状态下的OHCs[Ca2+]i相比, 无显著性差异。

*P<0.001对照组;#P<0.001对ASS+Glu组

3 讨论

谷氨酸 (glutamate, Glu) 是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质, Glu也可能作为内耳传入性神经递质, 在内耳毛细胞和传入神经突触间介导快速的信号传导。但如果在缺血、缺氧、噪声、感染或某些药物等因素的作用下, 可引起谷氨酸在内耳的堆积及其类似物的过量释放又是内耳细胞损伤的关键因素。谷氨酸耳蜗毒性作用的确切机制虽未完全阐明, 目前普遍认为可能与下述作用有关:Glu激活AMPA/KA受体, 促进Na+内流, K+、Cl-外流, 造成细胞外电解质紊乱。启动电压依赖性Ca2+通道开放, 增加Ca2+内流及其从代谢库中的释放, 造成细胞内Ca2+超载。Glu不断增加还可过度激活NMDA受体, 使该受体控制的Ca2+通道病理性开放, 引起Ca2+大量内流。细胞内Ca2+增多, 可使膜磷脂降解, 释放出大量的花生四烯酸 (AA) 及其代谢产物白三烯 (IT) 等活性物质, 使血管收缩, 耳蜗供血减少, 血管通透性增强, 加重耳蜗损害。谷氨酸对耳蜗毒性作用的机制可能与其神经毒性作用的机制相同。我们的研究发现, 加入终浓度7.8μmol/L的Glu可引起分离的豚鼠外毛细胞内的钙浓度迅速升高, 而李兴启等[4]人应用终浓度为3.85μmol/L的Glu使分离的豚鼠内毛细胞内钙浓度升高, 说明外毛细胞比内毛细胞更能耐受谷氨酸的毒性作用而且谷氨酸对两者的损伤机制也可能不尽相同。

ASS在我国的应用已有悠久的历史, 与此同时国外也应用ASS治疗老年性功能障碍、脑损伤后遗症等, 疗效显著。刺五加具有较强的活血化瘀, 通经活络的作用, 能扩张血管, 改善心、脑、肾等实质性脏器的血流量, 增加组织对缺氧的耐受性, 能显著地清除活性氧自由基, 降低血小板凝集功能, 扩张冠状动脉, 改善心肌微循环。因此我们推测ASS能明显增加耳蜗的血流量, 增加对螺旋器的血氧供应, 还可作为自由基清除剂, 阻止细胞膜脂质氧化, 增强毛细胞对谷氨酸毒性应激作用的耐受性等。本实验中, ASS能明显减低由Glu引起的单离豚鼠耳蜗外毛细胞内的钙浓度增加, 其机制可能与ASS的上述药理作用有关。我们在实验过程中还发现, 单独加入终浓度为3g/L的ASS可引起外毛细胞内的钙浓度轻度降低, 推测ASS在一定范围内可能具有钙拮抗作用。此外, ASS是否还能通过直接改变电压依赖式Ca2+通道的通透性, 从而对抗兴奋毒性谷氨酸诱导的外毛细胞内Ca2+的超载, 还需进一步加以实验证实。

参考文献

[1]贾琳琳, 汤浩.刺五加注射液对豚鼠庆大霉素耳毒性拮抗作用的实验研究[J].中国应用生理学杂志, 2006, 22 (2) :246-249

[2]贾琳琳, 汤浩, 付纯芳, 等.刺五加注射液对豚鼠庆大霉素耳毒性拮抗作用的初步研究[J].中成药, 2008, 30 (5) :87-89

[3]周建波, 孔维佳.硝普钠对豚鼠耳蜗外毛细胞全细胞钙电流作用的实验研究[J].中华耳鼻咽喉科杂志, 2003, 38 (4) :259-262