禽流感灭活疫苗

禽流感灭活疫苗（精选9篇）

禽流感灭活疫苗 篇1

禽流感灭活疫苗 (H5N2, N28株) 和重组禽流感灭活疫苗 (H5N1, Re-1株) 各3批, 以重组禽流感灭活疫苗 (H5N1, Re-1株) 推荐的免疫程序和剂量分组免疫5周龄SPF鸡和5周龄SPF鸭。结果为: (1) 免疫后1周, 各免疫组均未测到HI抗体; (2) 鸡免疫后4~5周, HI抗体效价达到峰值1∶26.0~1∶27.0, 随后2周下降相对较快, 平均每周下降0.3~0.7个滴度, 之后HI抗体效价缓慢下降, 直到试验结束, 平均每周下降0.04~0.17个滴度; (3) 免疫后3周内, 两种疫苗刺激鸡产生的HI抗体效价均高于相应批次疫苗免疫鸭产生的HI抗体效价, 免疫后第2周相差1.9~2.3个滴度, 免疫第3周相差1.6~2.0个滴度; (4) 两种疫苗免疫鸡和鸭后, 各时期HI抗体效价t检验差异均不显著 (P>0.05) 。

禽流感灭活疫苗 篇2

【接种对象】在有森林脑炎发生地区居住的及进入该地区的8周岁以上人员。

【作用与用途】接种本疫苗后，可刺激机体产生抗森林脑炎病毒的免疫力，用于森林脑炎疾病的预防 【免疫程序剂量】（1）于上臂外侧三角肌内注射。

（2）基础免疫为2针，于0天（第一天，当天）、14天（第15天）各注射1剂疫苗：以后可在流行季节前加强免疫1剂。每剂1.0 ml.【不良反应】 常见不良反应：

（1）接种本疫苗后，注射部位可出现疼痛、发痒、轻微红肿。

（2）全身性反应可有轻度发热、不适、疲倦等，一般不需要处理可自行消退 罕见不良反应：

（1）过敏性皮疹：荨麻疹一般在接种疫苗后72小时内出现，出现反应时，应及时就诊，给予抗过敏治疗。（2）过敏性休克：一般在注射后1小时内发生。应及时注射肾上腺素等级抢救措施进行治疗。

（3）过敏性紫癜：出现过敏性紫癜反应时应及时就诊，应用皮质固醇类药物给予抗过敏治疗，治疗不当或不及时有可能并发紫癜性肾炎。（4）周围神经炎：应及时就诊。

【禁忌症】（1）对疫苗中有任何成分（包括辅料成分、甲醛、硫酸卡那霉素、牛血清等）过敏者。（2）患过敏性疾病或有生物制品过敏史者。

（3）患急性疾病、严重慢性疾病、慢性疾病的急性发作期和发热者。（4）患未控制的癫痫和其他进行神经系统疾病者。（5）妊娠及哺乳期妇女。

【其他注意事项】（1）以下情况者慎用：家族和个人有惊厥史者、患慢性疾病者、有癫痫史者。（2）使用时应充分摇匀，如出现摇不散的凝块、异物、疫苗瓶有裂纹、标签不清或失效者均不得使用。（3）疫苗瓶开启后应立即使用。

（4）注射免疫球蛋白者应至少间隔1个月以上接种本品，以免影响免疫效果。

（5）应备有肾上腺素等药物，以备偶有发生严重过敏反应时急救用。接受注射者在注射后应在现场观察至少30分钟。

本方已认真阅读并理解本知情同意书内容，愿意接种本产品。

禽流感灭活疫苗 篇3

关键词：兔出血症病毒杆状病毒；灭活疫苗；安全性试验；效力试验

中图分类号： S852.65；S858.291.53文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0272-03

收稿日期：2015-07-02

基金资助：现代农业产业技术体系建设兔体系病毒病预防与控制岗位（编号：CARS-44-C-1）；公益性行业（农业）科研专项（编号：201303046）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（14）4048]。

作者简介：范志宇（1982—），男，山西太谷人，博士，助理研究员，主要从事家兔疾病防治与兽医生物技术研究。Tel：（025）84390337；E-mail：fanzhiyu2007@163.com。

通信作者：王芳，博士，研究员，主要从事家兔重要疫病的病原学、快速诊断、流行病学、致病机理、疫苗研制、综合防控技术等方面的研究。Tel：（025）84390337；E-mail：rwangfang@126.com。兔出血症，又称兔瘟，是由兔出血症病毒（rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种以急性、高度传染性、大面积死亡为特征的兔传染病，主要临床特征为呼吸系统出血、肝变性、实质器官瘀血及出血性变化[1-3]。本病常呈暴发性流行，发病率和病死率极高，感染兔通常于48～72 h死亡，给养兔业造成极大的经济损失。该病自然感染只发生于兔，主要危害40日龄以上幼兔、育成兔和成年兔，40日龄以下幼兔和部分老龄兔不易感，哺乳仔兔不发病[2-4]。带毒兔及病死兔的内脏器官、肌肉、毛、血液、分泌物、排泄物是主要的传染源，带毒兔和被病毒污染的饲料、饮水、用具也是重要的传染源或传播媒介。目前该病的主要预防措施是使用组织灭活疫苗免疫，然而传统组织灭活苗的制备存在诸多的缺陷和不足，因此，需要探索新的生产疫苗的途径[5-6]。

RHDV是杯状病毒科成员，结构简单，仅有1个主要结构蛋白VP60，在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原，用杆状病毒系统表达RHDV的VP60能够自发地组装成病毒样粒子（VLPs），其在形态和抗原性上都与天然的病毒粒子无异但不包含病毒RNA基因组。研究发现RHDV VLPs在兔体内可以诱导机体产生很强的体液免疫应答、细胞免疫应答和黏膜免疫应答。此外，RHDV VLPs具有成本低、获取方便等优势，已经成为应用性预防治疗中可靠的分子工具[3-7]。在前期研究的基础上，于实验室用RHDV重组VP60制备了5批次疫苗，并对疫苗开展了系统的研究。

1材料与方法

1.1种毒

重组兔出血症病毒VP60杆状病毒，由江苏省农业科学院兽医研究所构建并保存[5]。攻毒用毒种为兔出血症病毒皖阜株肝毒。Sf9昆虫细胞，由江苏省农业科学院兽医研究所保存。

1.2试验兔

2～3月龄健康易感肉兔、獭兔、毛兔（兔出血症病毒抗体HI效价不高于1 ∶2），健康怀孕20～25 d母兔，20～30日龄未断奶仔兔、35日龄已断奶幼兔（未免疫兔出血症及相关疫苗），均由金陵种兔场提供。

1.3试剂

Sf-900TMⅡSFM 培养基，购自GIBCO公司。硫乙醇酸盐培养基（TG）、酪胨琼脂（GA）、葡萄糖蛋白胨培养基（GP）、氢氧化铝胶溶液由南京天邦生物科技有限公司制备并检验。

1.4抗原制备及红细胞凝集效价的测定

将重组兔出血症病毒VP60杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，于27～28 ℃培养，连续观察，待细胞病变达85%以上时，收获细胞培养物。将收获接种种毒的细胞培养物反复冻融3次，取50 μL于50孔板，用PBS作2倍比稀释，加入等体积1%人O型红细胞悬液，振荡均匀，置于2～8 ℃作用45 min，观察结果，检测表达蛋白的HA效价[8-9]。

1.5灭活及灭活检验[9]

向细胞培养物中加入甲醛溶液（终浓度为0.2%），37 ℃灭活24 h。取灭活细胞培养物，接种生长良好的Sf9细胞，于27～28 ℃条件下培养，同时设立未灭活的细胞培养物为阳性对照，按上述方法接种Sf9细胞，连续5 d观察细胞病变，收获细胞培养物，置-20 ℃以下反复冻融3次，接种生长良好的Sf9细胞盲传1代，培养5 d，观察细胞病变，并测定其血凝性。

1.6疫苗制备

将检验合格的细胞培养物和氢氧化铝胶按9 ∶1充分混匀振荡，定量分装，加盖密封，贴签。

1.7成品检验

1.7.1性状取疫苗瓶上下颠倒混匀，观察外观及颜色，然后将疫苗瓶于2～8 ℃静置24 h，再次观察外观及颜色。

1.7.2无菌检验按2010版《中国兽药典》附录进行检验。

1.7.3甲醛残留量测定按2010版《中国兽药典》附录进行检验。

1.8安全试验[10]

1.8.1单剂量安全试验

1.8.1.1单剂量安全试验实验室制备的5批次疫苗（批号：101、102、103、104、105）各用2～3月龄健康易感家兔5只，分别皮下注射1 mL/只，同时以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，观察家兔精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，连续观察14 d。

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1.8.1.2单剂量重复安全试验5批次疫苗各用2～3月龄健康易感家兔5只，分别皮下注射1 mL/只，14 d后，重复皮下注射相同剂量的灭活疫苗，以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，观察家兔精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，连续观察14 d。

1.8.2超剂量安全试验

1.8.2.1不同品种家兔安全试验实验室制备的5批次疫苗各用2～3月龄健康易感肉兔、獭兔、毛兔各5只，分别皮下注射2 mL/只，同时以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，观察家兔精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，连续观察60 d，并于30 d每组取2只、60 d每组取3只安乐死后进行剖检，观察疫苗注射部位局部组织疫苗吸收和炎症反应情况。

1.8.2.2怀孕母兔安全试验5批次疫苗各用怀孕20～25 d 母兔5只，分别皮下注射2 mL/只，以相同条件不接种疫苗家兔作为对照，观察精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，并观察怀孕母兔妊娠、分娩及胎儿健康状况，观察期14 d。

1.8.2.3其他日龄家兔安全试验5批次疫苗各用35日龄断奶未免疫兔出血症疫苗的幼兔5只，并各用20～30日龄未断奶未免疫兔出血症疫苗的仔兔5只进行安全试验，处理方法同“1.8.2.2”节。

1.8.2.4对肉兔生产性能的影响5批次疫苗各用35～40日龄的健康肉兔5只，分别皮下注射2 mL/只，以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，每日10：00测量并记录 14 d 内家兔的体温，观察45 d内家兔生长发育情况，记录注射疫苗时和观察期结束时家兔的体质量，观察期内饲料消耗的重量，观察期结束时出栏家兔数量，并计算家兔增重、饲料报酬（料肉比）、出栏率等。

1.9效力试验

1.9.1易感家兔效力试验实验室制备的5批次疫苗各用2～3月龄健康易感家兔5只，分别皮下注射1 mL/只，21 d后，连同相同条件对照兔5只，各皮下注射兔出血症病毒皖阜株肝毒1 mL，连续观察7 d，记录死亡与保护的动物数量，对死亡兔剖检观察并取肝脏进行人“O”型红细胞凝集试验。

1.9.2怀孕母兔效力试验实验室制备的5批次疫苗各用健康怀孕母兔5只，处理方法同“1.9.1”节。

2结果与分析

2.1抗原红细胞凝集效价

经测定，5批次细胞培养物红细胞凝集效价在1 ∶512～1 ∶1 024 之间，分别为1 ∶1 024、1 ∶512、1 ∶512、1 ∶1 024、1 ∶512。

2.2灭活检验

用甲醛溶液对细胞培养物进行灭活，结果显示，接种灭活细胞培养物的Sf9昆虫细胞及正常Sf9昆虫细胞生长状况良好，细胞分裂正常。收获接毒细胞培养物，于-20 ℃以下反复冻融3次，取适量再次接种生长良好的Sf9细胞，于27～28 ℃ 培养5 d，结果显示，接种灭活细胞培养物的Sf9昆虫细胞及正常Sf9昆虫细胞生长状况良好，细胞分裂正常；而加入未灭活细胞培养物的细胞病变明显，细胞培养物具有血凝性。说明接毒细胞培养物灭活完全。

2.3疫苗配制

按“1.6”节的方法制备试验用疫苗5批次，约4 000 mL/批次，批号为101、102、103、104、105。

2.4性状、无菌检验、甲醛残留量测定

对5批次疫苗进行性状、无菌检验、甲醛残留量测定，结果显示，5批次疫苗（101、102、103、104、105）外观为浅黄色均匀混悬液，静置后上层为浅黄色的澄清液体，下层有少量沉淀。TG小管、GA斜面在37 ℃培养7 d，TG小管、GA斜面、GP小管在25 ℃培养7 d均无菌生长，无菌检验合格。经检验，疫苗甲醛残留量在0.042%～0.087%之间，符合质量标准。

2.5安全试验

2.5.1单剂量安全试验用5批次疫苗对家兔进行单剂量安全试验，连续观察14 d，结果显示，免疫兔和对照兔的精神状态、饮食、粪便等均正常，免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，说明疫苗对2～3月龄健康易感家兔单剂量接种及单剂量重复接种均是安全的。

2.5.2超剂量安全试验

2.5.2.1不同品种家兔安全试验用5批次疫苗进行不同品种家兔安全试验，结果显示，观察期60 d，2～3月龄肉兔、獭兔、毛兔3个品种家兔的精神状态、饮食、粪便等均正常；免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，疫苗接种后30 d及60 d，剖检注射部位未见炎症反应，疫苗吸收良好，说明疫苗对不同品种的家兔是安全的。

2.5.2.2怀孕母兔安全试验用5批次疫苗进行怀孕母兔安全试验，结果显示，观察期14 d，免疫兔和对照兔的精神状态、饮食、粪便等均正常；免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，母兔均正常妊娠、分娩，免疫兔和对照兔生产的仔兔数量没有差异，胎儿健康，未见异常，说明疫苗对怀孕母兔是安全的。

2.5.2.3其他日龄家兔安全试验用5批次疫苗对其他日龄家兔进行安全试验，结果显示，观察期14 d，未断奶仔兔、已断奶幼兔的免疫兔和对照兔精神状态、饮食、粪便等均正常，仔兔正常断奶，并且生长良好；免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，说明该疫苗对未断奶仔兔和已断奶幼兔均是安全的。

2.5.2.4对肉兔生产性能的影响用5批次疫苗进行肉兔生产性能影响试验，结果显示，观察期14 d，免疫兔和对照兔体温处于38.5～39.5 ℃的正常范围内，免疫兔与对照兔相比较，体温没有明显差异（图1）。观察期45 d，免疫兔和对照兔生长发育均良好，免疫组各5只家兔共增加体质量分别为6 207、6 367、6 314、5 960、6 068 g，对照组5只家兔共增加体质量6 108 g，由此计算饲料报酬（料肉比），免疫组与对照组相比较，差异不显著（P>0.05）；出栏率均为100%（表1）。结果说明该疫苗对肉兔生产性能没有影响。

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2.6效力试验

用5批次疫苗进行效力试验，结果（表2）显示，5批疫苗免疫易感家兔全部健康存活，对照兔死亡5只，死亡兔出现兔出血症典型的病理变化，对死亡兔肝脏悬液作人“O”型红细胞凝集试验，均为RHDV阳性。另一组攻毒结果显示，5批疫苗免疫母兔全部健康存活，对照兔死亡4只，死亡兔出现兔出血症典型的病理变化，对死亡兔肝脏悬液作人“O”型红细胞凝集试验，均为阳性。结果说明该疫苗可以对母兔和易感家兔提供完全保护。

3讨论

目前，由于兔出血症病毒不能在兔体以外的组织或细胞上增殖，因此，只能通过用强毒接种易感兔，收获含毒组织制成乳剂，用甲醛灭活后制成疫苗[6，11]。这种生产方式主要存在以下缺陷和不足：易感兔来源少、生产成本高、污染物安全处理困难且易造成散毒、动物福利难以保障等。利用基因工程技术开发新疫苗是解决当前传统疫苗问题的有效途径，国内外已经用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等多种表达系统对RHDV的免疫蛋白VP60进行了表达，并且多数表达系统都表现出良好的免疫原性[3，12]。杆状病毒系统表达的RHDV重组衣壳蛋白能够很好地自聚形成能够凝集人“O”型红细胞的病毒样颗粒（VLPs），由于VLPs结构与成熟病毒相似，但不含病毒核酸，不具有感染性，所以在体内这种空壳结构VLPs不会引发感染，因此作为疫苗非常安全[13]。而且VLPs能够在很低剂量的抗体情况下引发有效的保护性反应，这将大大降低疫苗的成本，同时该表达系统具有低成本、高表达和易于规模生产等特点[14，15]。

本研究在完成重组兔出血症病毒VP60杆状病毒毒种的构建及特性研究的基础上，实验室试制了5批次疫苗（批号101、102、103、104、105），共计约20 000 mL。按照现行《中国兽药典》附录对5批次疫苗进行性状、无菌、甲醛残留量检验及安全、效力试验，结果显示，5批次疫苗无菌检验、甲醛残留量均合格。安全性结果表明，该疫苗可以用于怀孕母兔，优于目前市售组织灭活疫苗，并且对20～30日龄未断奶仔兔、35日龄已断奶幼兔都非常安全，对肉兔的各项生产性能也没有影响。本研究的安全性试验是使用5批次疫苗免疫3个品种家兔的多次试验完成的，试验结果说明该疫苗对各个年龄段的家兔均是安全的。疫苗免疫21 d后2～3月龄家兔和母兔用致死剂量的兔出血症病毒攻击保护率都达100%，说明该疫苗免疫原性良好。该疫苗具有较高的安全性和良好的免疫原性，市场前景乐观。

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：275-277.

禽流感灭活疫苗 篇4

只需打一针，就可以预防禽流感 (H9) 、鸡新城疫、传染性支气管炎、减蛋综合征四种常见高危害禽病，而且使用户成本节约一半。这样省力省钱的新型疫苗，已被研制成功了。

由洛阳普莱柯生物工程有限公司承担的“家禽主要疫病新型诊断技术及新型疫苗研究与开发”项目取得阶段性重大成果，在国内首创禽流感 (H9) 四联灭活疫苗，拥有完全自主知识产权。该项目的研制成功标志着我国禽用多联灭活疫苗自主研发和创新能力上了一个新台阶，达到了国际先进水平。

禽流感 (H9) 四联灭活疫苗是目前预防禽流感 (H9) 等四种重要家禽疫病最经济高效的疫苗，可大大降低免疫注射劳动强度及应激反应，技术水平在国际上也处于领先地位，对保障我国养禽业的健康发展、打破国外制药企业的暴利销售具有重要意义。该疫苗已经投放市场，预计在三年的新药保护期内，每年直接经济效益可达亿元。

禽流感灭活疫苗 篇5

1 材料与方法

1.1 试验动物

1日龄健康海兰褐蛋鸡, 购于泰安东岳种禽有限公司。

1.2 试验材料

96孔V型微量反应板、移液器、生理盐水、1%鸡红细胞悬液。禽流感H9亚型血凝抑制试验抗原由中国科学院提供;禽流感灭活疫苗 (H9亚型) 购于乾元浩生物股份有限公司。

1.3 试验动物的处理

600只健康海兰褐蛋鸡根据不同免疫途径随机分为A、B、C、D、E 5组, 每组120只。A组为空白对照、B组为颈部皮下注射、C组为胸部肌肉注射、D组为翅根部肌肉注射、E组为腿部肌肉注射。在45日龄、95日龄分别注射禽流感灭活疫苗 (H9) 0.5 ml。试验在相同的环境下, 采用同种饲料进行饲喂, 同一免疫程序 (表1) 进行免疫预防, 每隔3d随机选取15只鸡翅静脉采血, 分离血清, 根据HI法检测鸡只的抗体水平, 根据平均值绘制抗体消减曲线。

1.4 抗体水平检测

采用血凝 (HA) 与血凝抑制试验 (HI) (《高致病性禽流感诊断技术》中华人民共和国国家标准GB/T 18936-2003) 。

(ml)

2 结果

不同防疫部位下禽流感 (H9) 抗体滴度见图1, 45日龄免疫禽流感H9亚型疫苗后, D组 (翅根部肌肉注射) 抗体上升速度最快, 57日龄达到阶段性最高值, 为8.2 log2, B组 (颈部皮下注射) 上升速度最慢, 这主要因为肌肉注射, 吸收速度比皮下注射快, 产生抗体也较快, 而皮下注射, 疫苗吸收缓慢而均匀, 产生抗体比较慢;57~72日龄, B、C、D、E组抗体水平基本一致, 抗体曲线变化相吻合且抗体水平一直维持在6log2以上;72日龄以后, E组 (腿部肌肉注射) 抗体滴度平均值最高, 且E组抗体滴度较其他组高0.5~2.0个滴度, B、C、D组抗体水平比较稳定, 均匀度也较好。

3 讨论

通过45日龄、95日龄2次禽流感灭活疫苗的免疫, 由H9亚型抗体变化曲线可清楚的看出腿肌注射效果最好, 抗体滴度比颈部皮下、胸部肌肉、翅根部肌肉3种注射部位高;而颈部皮下、胸部肌肉、翅根部肌肉3种注射部位免疫效果基本一致。

腿部肌肉注射禽流感灭活疫苗 (H9N2亚型) , 颈部皮下注射禽流感二价灭活疫苗 (H5+H9) 、重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗 (H5N1, Re-4+-5株) 、禽流感灭活疫苗 (H9N2亚型) , 胸肌注射禽流感灭活疫苗 (H9N2亚型) 、传染性法氏囊卵黄抗体;翅根部肌肉注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗 (H5N1, Re-4+-5株) 、禽流感灭活疫苗 (H9N2亚型) 。除了腿部肌肉外, 其它防疫部位均注射两种以上疫苗, 而且每个部位吸收疫苗是有限的, 防疫频繁、疫苗剂量过大均会影响到疫苗的吸收效果。在实际操作中, 要熟练掌握各种防疫手法, 不能因为省时省力而每次都注射在同一部位, 不利于疫苗的吸收, 从而影响免疫效果。

整个蛋鸡的饲养过程中, 疫苗的免疫作统筹的安排, 尽量不要短期内同一部位重复注射, 同一部位油苗的注射最好低于3次。

摘要：通过45、95日龄2次禽流感灭活疫苗 (H9N2亚型) 的免疫, 探讨不同免疫途径对禽流感 (H9) HI抗体的影响。结果表明, 腿部肌肉注射免疫效果相对较好, 抗体滴度平均值较其他组约高0.5～2.0个滴度, 抗体维持时间也较长。而颈部皮下、胸部肌肉、翅根部肌肉3种注射部位免疫效果基本一致。

关键词：禽流感灭活疫苗,免疫部位,免疫效果

参考文献

[1]于康震, 陈化兰, 唐秀英.97香港禽流感[J].中国畜禽传染病, 1998, 20 (3) :187-191.

[2]易波.禽流感病毒的公共危害及预防研究进展[J].浙江预防医学, 2005, 17 (2) :61-63.

禽流感灭活疫苗 篇6

关键词：免疫增强剂,新城疫-禽流感,二联三价灭活疫苗,抗体滴度

新城疫 (Newcastle disease, ND) 和禽流感 (Avian influenza) 是危害禽类的重大疾病, 其病原分别是新城疫病毒和禽流感病毒, 都属于高度接触性传染病, 给世界养禽业造成了巨大的经济损失[1,2,3]。目前, 新城疫和禽流感的预防主要是接种疫苗[4,5], 鸡新城疫疫苗主要有弱毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程苗[6,7], 而弱毒疫苗为目前市场上最常见的疫苗。禽流感现阶段常见的疫苗为全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗[8,9]。虽然使用常规疫苗免疫接种可以防制新城疫、禽流感, 但在实际情况下常规单苗存在免疫繁琐、免疫效果不尽理想、成本高等缺点, 针对市场的需求, 进而研制出既节约成本又增强免疫效果的免疫增强剂。

免疫增强剂即广义上的佐剂, 都是通过调动免疫系统的功能, 提高机体的病原微生物的特异性反应来发挥其作用, 是治疗和预防疾病的重要物质, 特别是对疫苗发挥保护性作用起独特的效果, 能有效影响免疫反应的质量 (型的控制、局部免疫以及细胞类型的控制) , 稳定、便宜而且容易生产和保存[10,11]。本研究所用到的多种免疫增强剂, 涉及小分子多肽类、多糖类等免疫增强剂能显著提高机体免疫系统功能, 增强疫苗的免疫效果, 减少疾病发生[12,13]。探讨各种免疫增强剂对鸡体感染新城疫, 禽流感的免疫调节作用, 为应对新城疫、禽流感能够达到更加理想的免疫预防奠定了理论依据。

1 材料与方法

1.1抗原及试验动物抗原由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂提供, 包括新城疫 (La Sota株) 5倍浓缩抗原HA为11 log2, 禽流感Re-7株5倍浓缩抗原HA为10 log2, 禽流感Re-6株5倍浓缩抗原HA为10 log2。125只SPF鸡 (28日龄) 均由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂动物房SPF种蛋孵化。

1.2 主要试剂及仪器 囊素三肽购自上海淘普生物科技有限公司。黄芪多糖、香菇多糖、猪苓多糖、灰树花多糖均购自浙江方格药业有限公司。注射用白油由法国MARCOL52注射白油提供。硬脂酸铝购自上海远航试剂厂。司本-80和吐温-80均购自广东省肇庆市超能实业有限公司。无菌检验培养基由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂提供。台式微型剪切机T-18型购自德国IKA公。LS900激光颗粒粒度分析仪购自青岛欧美克公司。八道移液器购自德国艾本德公司。

1.3 水相的制备 (1) 将1组事先配制好的囊素三肽溶液加入事先配置好的水相中;使浓度达到每1 000 m L疫苗中含囊素三肽10 mg, 囊素三肽含量达到1%。 (2) 将2组黄芪多糖、3 组灰树花多糖、4 组香菇多糖、5组猪苓多糖原粉按一定比例溶于注射用水中制成相对应的黄芪多糖、灰树花多糖、香菇多糖、猪苓多糖溶液加入事先配置好的水相中, 使其浓度达到疫苗总量的3%。

1.4 油相的制备将注射用白油、司苯-80、硬脂酸铝按一定比例经高压灭菌混匀制成油相。

1.5 乳化将配制好的油相先与含有囊素三肽的水相用德国IKAT18型高速剪切机先进行预乳化, 待将水相加入完全后, 按一定转速、时间乳化结束, 分装于100 m L瓶中备用动物试验。分别将预先配置好的含有黄芪多糖的水相、灰树花多糖水相、猪苓多糖水相、香菇多糖水相溶液经高压灭菌后按一定比例加入5 倍浓缩灭活抗原充分混匀后, 缓缓加入油相, 用德国IKAT18型高速剪切机预乳, 待将水相加入后, 按一定转速, 时间乳化结束, 分装于100 m L瓶中备用动物试验。

1.6 剂剂型型取1清洁吸管, 吸取少量疫苗滴于冷水中, 应呈油滴状不扩散。

1.7 稳定性 取10 mL疫苗于离心管中, 经3500 r/min离心15 min, 应不出现分层现象;疫苗在37 ℃左右条件, 放置21 d不应有破乳现象。

1.8黏度用下口内径为1.2 mm、上口内径为2.7 mm的1 mL移液吸管在25 ℃左右的条件下吸取疫苗1 mL, 令其垂直流出, 记录流出0.4 mL所需的时间。

1.9 颗粒度取5 μL疫苗混匀于10 mL白油中, 置于LS900激光粒度分析仪中检测。

1.10 无菌检验疫苗抽样, 分别取硫乙醇酸盐培养基2支, 琼脂培养基2支, 葡萄糖培养基1支, 每支接种疫苗0.2 mL分别放置于37 ℃、25 ℃培养箱中做无菌检验。

1.11 效力检验28 日龄SPF鸡125 只分为12 组, 每组10 只;第1~5 组免疫添加含免疫增强剂及含有正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3 mL;第6 组免疫添加不含免疫增强剂及含有正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3 mL;第7~11 组免疫添加含免疫增强剂及含有1/5 正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3 mL;第12组免疫添加不含免疫增强剂及含有1/5 正常抗原含量的新城疫-禽流感二联三价灭活疫苗0.3 mL;另取5 只作为空白对照。分别在免疫后的第14、21、28 天采血收集血清, 检测抗体, 经spss对各个数据的方差分析统计。

2 结果

2.1 检验结果

2.1.1疫苗物理性状及无菌检验

2.1.2抗体检测结果见表1。

2.2 数据分析

2.2.1 抗原正常含量的情况下 (Re-6 株) 在14 d、21 d时相比于对照组的抗体水平, 黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高, 囊素多肽组显著提高, 而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28 d时相比于对照组的抗体水平, 囊素多肽组、灰树花多糖组均极显著提高, 黄芪多糖组显著提高, 香菇多糖组、猪苓多糖组均与对照组无显著性差异。

2.2.2 抗原含量为正常含量1/5 的情况下 (Re-6 株) 在14 d时相比于对照组的抗体水平, 囊素多肽组, 黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高, 而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在21 d、28 d时相比于对照组的抗体水平, 黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高, 囊素多肽组显著提高, 而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。

注:显著性水平α=0.05, *表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。

注:显著性水平α=0.05, *表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。

2.2.3 在抗原正常含量的情况下 (Re-7株) 在14 d时相比于对照组的抗体水平, 黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高, 囊素多肽组显著提高, 而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在21 d时相比于对照组的抗体水平, 黄芪多糖极显著提高, 囊素多肽组与灰树花多糖组均显著提高, 而香菇多糖与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28 d时相比于对照组的抗体水平, 囊素多肽组、黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高, 而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。

注:显著性水平α=0.05, *表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。

2.2.4在抗原含量为正常含量1/5的情况下 (Re-7株) 在14 d、21 d时相比于对照组的抗体水平, 黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高, 囊素多肽组显著提高, 而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28 d时相比于对照组的抗体水平, 囊素多肽组与黄芪多糖组均显著提高, 灰树花多糖组显著提高, 香菇多糖组与猪苓多糖均无显著提高。

2.2.5在抗原正常含量的情况下 (La Sota株) 在14 d时相比于对照组的抗体水平, 囊素多肽组、黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高, 而香菇多糖与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在21 d时相比于对照组的抗体水平, 灰树花多糖组极显著提高, 囊素多肽组与黄芪多糖组显著提高, 香菇多糖组与猪苓多糖组均无显著提高;在28 d时囊素多肽组、黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高, 而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。

2.2.6在抗原含量为正常含量1/5的情况下 (La Sota株) 在14 d、21 d时相比于对照组的抗体水平, 囊素多肽组、黄芪多糖组与灰树花多糖组均极显著提高, 而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。在28 d时囊素多肽组、黄芪多糖组、灰树花多糖组、香菇多糖组与猪苓多糖组均无显著提高。

3讨论

疫苗物理性状方面, 囊素三肽组疫苗的颜色无改变, 呈乳白色, 无分层现象, 黏度、颗粒度也和普通疫苗无明显差异, 但黄芪多糖、灰树花多糖、香菇多糖、猪苓多糖组疫苗颜色均有不同程度的改变, 黏度、颗粒度也有不同程度的增加, 并且在高速离心后稳定性不理想, 并且伴有沉淀析出。

相比于对照组的抗体水平, 在抗原含量正常情况下, 其中, 添加有囊素多肽、黄芪多糖、灰树花多糖的疫苗免疫鸡后产生的抗体水平均呈显著提高, 而香菇多糖组与猪苓多糖组则与对照组无显著性差异。且在抗原含量减量的情况下其中添加有囊素多肽、黄芪多糖、灰树花多糖的疫苗免疫鸡后产生的抗体水平相比于添加香菇多糖、猪苓多糖及未添加免疫增强剂的抗体水平呈显著提高, 使其达到既能增强抗体又能降低成本的实用效果。

禽流感灭活疫苗 篇7

1 材料与方法

1.1 免疫用疫苗

重组H5亚型禽流感油乳剂灭活苗,由哈尔滨兽医研究所生产。

1.2 试验用鸭

由上海奉贤某鸭场提供1日龄无免疫鸭苗160羽。

1.3 免疫程序

11日龄时进行免疫,分组情况如下:A、B组免0.5 mL,C组免0.8 mL,D组免1 mL,E组为非免疫对照组;39日龄时B组1 mL剂量二免;A,B,C,D组每组30羽,E组40羽,每次随即抽取20羽。

1.4 体液抗体检测

血凝抑制试验检测鸭血清HI抗体效价,具体参照GB/T 18936-2003。

1.5 细胞因子浓度水平检测

酶联免疫吸附测定法定量测定鸭血清中4种细胞因子含量,ELISA试剂盒购自武汉中美生物工程公司,产品编号分别为E0049du(r-IFN)、E0073du(IL-2)、E0077du(IL-4)和E0080du(IL-8)。用系列标准品结果定量计算样品浓度的直线回归方程,将导出的样品浓度列表做趋势图。

2 结果

2.1 血凝抑制试验

结果见图1。A组效价在首免30 d(41日龄)达到峰值6 lg2后下降;B组效价在二免12 d(51日龄)达到峰值9 lg2后一直保持较高水平(7 lg2以上);C组效价在首免35 d(46日龄)达到峰值6.5 lg2;D组效价峰值仅4 lg2,这是因为首免剂量大(1 mL),鸭应激反应较强,影响了抗体水平的上升。从监测到的具体效价水平来看,B组首免4周后效价水平在3 lg2～4 lg2之间,适宜进行二免。

2.2 细胞因子浓度结果见图2～图5,具体如下:

1)r-IFN浓度仅在A组36日龄和B组21、31日龄出现变化,其峰值(21～28 pg/mL)与其他因子浓度水平相比较低。

2)IL-2浓度在A组的31日龄(418 pg/mL),B组31日龄、51日龄(210 pg/mL、270 pg/mL),C组46日龄(247 pg/mL)出现峰值,A组平均水平高于其他免疫组。

3)A、B、C 3组IL-4浓度均于21日龄出现浓度峰值。另外,在B组的41日龄(372 pg/mL)出现另一峰值。

4)4个免疫组的IL-8浓度均于31日龄出现峰值,另外,在B组的46日龄(1 281 pg/mL)出现另一峰值。

3 讨论

1)从图1可以看出,各免疫组在首免20后(31日龄)均可以达到4lg2的抗体水平,0.8 mL组(C组)效价上升最快,首免15 d后效价水平便一直高于4lg2。抗体效价在二免3周后后可达到9lg2,且持续时间较长。

2)在禽流感灭活疫苗免疫后,除r-IFN外各细胞因子均出现不同程度的水平增长,由于该疫苗使用无免疫原性的油乳佐剂,故这种增长显然由于H5亚型禽流感灭活抗原的缓慢释放刺激机体所产生[1,2]。

3)从图3-图5中可以看出,体液抗体在疫苗免疫后一直处于平稳上升趋势,而IL2、IL-4和IL-8的浓度变化并非如此,而是在迅速达到峰值后,分别在首免10～20 d后开始下降,在二次免疫中再次上升到更高水平。这一现象提示我们在禽流感免疫中,细胞因子水平虽与体液抗体水平呈一定相关性[3],但由于其具有协同性、叠加性和拮抗性等特点,浓度变化不同于体液抗体。

4)从图3-图5中可以看出,一般在IL-2、IL-4和IL-8浓度峰值出现后5～15 d,体液抗体效价出现峰值。这一现象提示我们,细胞因子变化与体液免疫抗体水平具有一定相关性,为评价禽流感疫苗免疫保护力提供了新思路。

5)D组的体液抗体和细胞因子浓度一直处于低水平,呈明显相关性,可能正是因为其低下的细胞因子水平无法介导足够强的体液反应所造成。这也提示我们,在鸭的禽流感免疫中,虽然在加强免疫或紧急接种时可以通过增加免疫剂量来刺激机体产生更加坚强持久的保护,但在首次免疫时不宜剂量过大。

摘要：选取健康无免疫白羽肉鸭160羽分为A、B、C、D、E五组。A组～D组分别免疫0.5mL、0.5mL、0.8mL、1mL重组H5亚型禽流感油乳剂灭活疫苗,E组为非免疫对照组。在39日龄,B组1mL剂量进行二免。免疫后,每隔5d用血凝抑制试验和酶联免疫吸附测定分别监测体液抗体和细胞因子(r-IFN、IL-2、IL-4和IL-8)浓度水平。结果表明,A、B、C、D各组试验鸭在疫苗免疫后体液抗体和细胞因子均出现增长并呈一定相关性,E组无增长趋势。

关键词：鸭,禽流感,重组禽流感灭活疫苗,细胞因子

参考文献

[1]贾立军,刘秀梵,卢建红,等.H5亚型高致病性禽流感疫苗的免疫效力[J].畜牧兽医学报,2004(35):542-545.

[2]付朝阳,于康震,唐秀英,等.H9亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫产生期内T淋巴细胞表型亚类的检测与研究[J].中国预防兽医学报,2001,23(6):430-433.

禽流感灭活疫苗 篇8

1鸡场基本情况

该养殖户从事养鸡多年, 具有一定的管理经验和诊病用药知识, 存养规模4 000羽。该场建在山坡树林下, 与村庄和主要交通道路较远, 自然隔离条件较好, 但林中常年均有野鸟, 近三年生产经营正常。该场的免疫程序为:1日龄接种马立克氏病疫苗、11日龄接种法氏囊病疫苗、18日龄接种新-支二联苗、23日龄进行法氏囊病疫苗二免、27日龄接种禽流感疫苗、33日龄进行新-支二联苗二免、65日龄肌注新城疫Ⅰ系疫苗、75日龄肌注禽霍乱疫苗、95日龄进行禽流感疫苗二免。

2疫苗来源

疫苗为政府统一采购的哈尔滨维科生物技术开发公司生产的重组禽流感病毒灭活疫苗 (H5N1亚型、Re-6株) , 生产批号:2012048, 生产日期:20121114, 有效期12个月。其他疫苗为业主从市场采购。

3检测方法

随机抽取鸡只采血, 待检血样经当天离心后立即用血凝与血凝抑制试验方法检测。检测试剂为哈尔滨维科生物技术开发公司生产, 生产批号:2012002, 生产日期:20120605, 有效期24个月。红细胞采自自备的未接种任何疫苗的公鸡, 现配现用。

4结果与分析

放养鸡群禽流感免疫效价测定结果见表1。

1) 1日龄血样检测结果:免疫效价≥1:16的有12份, 占60.0%, 表明该批鸡的母源抗体水平较低。

2) 14日龄和32日龄的检测结果:免疫效价≥1:16的分别占检测样品的27.5%和6.0%, 表明该批鸡处于高度风险状态。

3) 47日龄检测结果:免疫效价≥1:16的占94.0%, 表明该批鸡已经获得理想的免疫保护效价。62日龄、77日龄、92日龄的检测结果免疫效价≥1:16的占比分别为98.0%、94.0%、90.0%, 表明该批鸡保持高滴度的免疫抗体效价。

4) 110日龄的检测结果:免疫效价≥1:16占比为86.0%, 表明禽流感二免2周后仍没有提高免疫效价。

5) 125日龄和143日龄的检测结果:免疫效价≥1:16的占比均为94.0%, 表明禽流感二免使得抗体免疫效价维持在较高和均衡的水平。

5结论与建议

1) 该次免疫效价跟踪检测的结论是: (1) 规模化林下放养鸡群在1月龄左右接种重组禽流感病毒灭活疫苗 (H5N1亚型、Re-6株) , 经20 d后能获得较高的免疫效价, 约4周时达最高值, 之后以每2周4个百分点的速率下降。 (2) 禽流感二免加强免疫后不能在2周内使免疫效价提高, 但在1个月后能重新获得较高的免疫效价, 并保持比较均衡的状态。 (3) 在母源抗体较低的情况下, 1月龄左右接种禽流感疫苗, 在产生有效免疫抗体前有比较长时间的感染野毒风险 (约1个月) 。

2) 该次免疫效价跟踪检测的1日龄血样偏少, 是由于采血样需剪断鸡颈部、畜主考虑经济效益所致。免疫程序也是畜主自行制定。该批次鸡于150日龄后销售, 约10 d售完。

3) 建议畜主以禽苗的母源抗体水平来确定禽流感的首免时间。鉴于目前广大家禽饲养者的条件所限, 每批苗种进行母源抗体检测不现实, 建议种禽场和动物防疫主管部门应制定禽苗中禽流感母源抗体水平强制检测制度, 以便真正使禽流感的强制免疫制度达到预期效果。

禽流感灭活疫苗 篇9

1 材料与方法

1.1 抗原

鸡新城疫病毒弱毒La Sota株的抗原液, 由辽宁益康生物股份有限公司普通灭活疫苗车间生产, 批次:2012013、2012014、2012015, 无菌检验为阴性, 病毒含量分别为每108.7EID50/0.1 ml、108.9EID50/0.1 ml、108.7EID50/0.1 ml, HA效价均为11 log2。

1.2 疫苗乳化用白油

购自美国KLEAROL, 由辽宁益康生物股份有限公司普通灭活疫苗车间配制生产, 无菌检验为阴性, 配制工艺符合灭活疫苗白油配制规程。

1.3 试验动物

45日龄SPF鸡, 由辽宁益康生物股份有限公司质检部检验用动物舍提供, 鸡质量符合SPF要求, 检验环境条件符合检验规程要求。

1.4 其他器材

乳化用高速组织捣碎机、血凝板、移液器、效价测定用的抗原和血球等由公司质检部提供。

1.5 抗原的灭活及检测

1.5.1 灭活条件的选择

取相同批次鸡新城疫病毒弱毒La Sota株抗原液各200 ml置于250 ml玻璃瓶内, 分别采用表1中按不同甲醛浓度和灭活温度进行灭活, 组别分别为A、B、C、D。灭活过程摇动3~4次, 使抗原快速、均匀的达到灭活温度。重复3批, 分别为2012013、2012014、2012015批。

1.5.2 灭活彻底性检验

灭活结束后, 对上述灭活的鸡新城疫病毒弱毒La Sota株抗原液进行取样, 接种10日龄SPF鸡胚各10枚, 0.1 m L/胚, 37℃继续孵育120 h, 收获鸡胚液, 测定HA效价。如HA效价为阴性, 认为灭活完全。

1.5.3 灭活后的血凝效价测定

按《中国兽药典》方法测定灭活后的抗原HA效价, 比较不同灭活条件的HA差异。

1.6 疫苗配制与免疫

将上述灭活彻底的抗原液按水相:油相=1:3进行乳化。乳化后疫苗的外观、剂型、稳定性和黏度均符合疫苗质量标准的要求。取做好的疫苗分别免疫45日龄SPF鸡各10只, 20μL/只, 另取5只不免疫做对照。21 d后, 每只鸡肌肉注射105EID50的强毒。疫苗于4℃放置180 d后, 再次免疫SPF鸡进行抗体检测。比较两次疫苗免疫效果的差异。

2 结果

2.1 抗原灭活彻底性检测

4种灭活方法灭活的抗原, 经接种10日龄SPF鸡胚, 测定HA效价, 结果均为阴性。结果表明, 4种方法均可有效灭活鸡新城疫抗原。结果见表2。

2.2 灭活后的血凝效价测定

结果见表3。在保证病毒灭活彻底的前提下, 灭活时甲醛浓度越低、灭活的温度越低, 灭活后鸡新城疫病毒弱毒La Sota株抗原的血凝活性越高。

2.3 疫苗HI抗体效价

疫苗分别在制备后30日 (30 d) 和180日后 (180 d) 进行免疫检测, 免疫鸡的HI抗体水平见表4。

结果表明, 同样的抗原, 灭活时用甲醛浓度不同, 制备疫苗的HI抗体效价不同, 甲醛浓度低的效价相对高些。由于灭活时用甲醛浓度不同、灭活时的温度不同所生产的疫苗放置180 d后, HI抗体效价也不同;甲醛浓度越低、灭活温度越低则疫苗的HI抗体效价越好。

3 讨论

3.1鸡新城疫灭活疫苗的HI抗体效价及其稳定性是衡量疫苗质量的重点指标, 怎样在疫苗生产中降低半成品的污染率, 并在疫苗生产中提高HI抗体效价及其稳定性, 一直是疫苗厂家的管理和技术重点。在没有发现更好的灭活方法和灭活剂之前, 研究重点是遵照规程利用小试验探索最佳的灭活方法, 该试验数据对疫苗的生产有一定的参考作用。试验结论能否适用于疫苗生产, 将进行进一步的试验来验证。

3.2通过多年的鸡新城疫疫苗生产和效价检验证明:灭活甲醛含量高对疫苗效价和稳定性有影响, 甲醛越高影响越大, 最根本的原因可能是甲醛对抗原的破坏作用从而影响抗原的血凝活性。是不是甲醛越低对效价的影响越小;少量甲醛在对动物进行疫苗免疫时是否对效价有促进作用还有待进一步研究。