老年大鼠

老年大鼠（共7篇）

老年大鼠 篇1

摘要：为了研究白酒对老年性大鼠的镇痛作用, 试验以老年性大鼠为研究对象, 采用生理盐水和56°白酒对大鼠进行灌胃处理, 记录热板和压板测痛仪测得的不同时间后爪缩爪反应潜伏期 (HWL) , 观察白酒对老年性大鼠痛觉调节作用的影响, 并探究其调节作用的生理机制。结果表明:与对照组相比, 0.5 mL的白酒能明显延长大鼠的HWL, 说明白酒对老年性大鼠具有明显的镇痛作用。

关键词：大鼠,生理盐水,白酒,镇痛作用

适量饮酒对人身体有很多好处, 有试验已经证明白酒1/3的热量能补偿肝脏的消化能量, 2/3的热量在肝脏外参加碳水化合物、蛋白质等营养素能量代谢。饮适量白酒还促使循环系统效能加快, 并能刺激胃液与唾液分泌, 起到健胃作用[1]。如果睡前饮少量白酒, 有利于睡眠, 可缓解失眠。此外, 白酒还有通风、散寒、舒筋、活血等作用。白酒的主要成分是乙醇, 乙醇进入人体浓度达到0.05%会出现兴奋和欣快感;如果浓度达到0.1%人就会失去自制能力;浓度达到0.2%多数人就会酩酊大醉;浓度达到0.4%时人就可能失去知觉甚至有生命危险, 还可使高血压病的发病率升高[2]。白酒对人的中枢神经系统损害最严重, 可使神经系统从兴奋到高度抑制, 严重破坏神经系统正常功能。日本有关研究机构的学者发现, 乙醇对神经系统的抑制作用表现为在血液中达到一定浓度后, 就会促使离子通道开放, 从而产生抑制效应。通过这条离子通道在人体内产生作用, 离子通道的增强与血液中乙醇含量有关[3]。学者们还发现, 这条通道与镇痛作用也有关系, 为了进一步探讨有关乙醇抑制作用及其产生的生理机制, 研究采用大鼠灌胃和热板、压板测痛的方法, 记录白酒对大鼠后爪缩爪反应潜伏期 (HWL) , 并分析白酒对老年性大鼠镇痛作用的影响, 试图探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物及药品

试验选用健康雄性大鼠6只, 体重为400～450 g, 由北京中国科学院动物研究所提供。试验前大鼠自由饮水及进食。生理盐水, 由长春师范学院生命科学学院自配;56°红星二锅头酒, 由北京红星酒厂有限公司生产。

1.2 主要仪器

热板测痛仪 (型号为XZC-2B) , 由山东医学科学院设备供应维修站提供;压板测痛仪 (型号为UGO Basile, Type7200) , 意大利生产;灌胃注射针等, 由长春师范学院生命科学学院提供。

1.3 试验准备及试验步骤

试验前1周对所有大鼠进行训练, 训练时参考孙衍刚等[4]的方法, 1周内每天对大鼠训练3轮, 每轮3次。捏紧大鼠的颈部皮肤, 不要让它左右摇晃头, 将尾巴连同脊柱拉紧拉直, 拿好灌胃针, 针进入口腔后压针, 使其脑袋后仰, 使口腔与食管呈一条直线[5]。通过注射器针管将生理盐水或白酒直接灌入大鼠胃内。在灌输生理盐水和白酒前后分别测试大鼠HWL, 作为基础值, 检测3次。记录各时间点的HWL, 对各组数据进行统计处理。

1.4 数据处理

全部数据均以平均值±标准误表示, 组间数据采用t检验。各组采用单因素方差 (One-way ANOVA) 分析处理。*表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) , ***表示差异极其显著 (P<0.001) 。

2 结果与分析

2.1 大鼠生理盐水灌胃处理

采用生理盐水对大鼠进行灌胃处理, 处理分别在灌胃后5, 10, 15, 20, 30, 60分钟检测HWL, 对照组未作处理只检测基础HWL, 见表1。

注:数据肩标*表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) , ***表示差异极其显著 (P<0.001) , 无肩标表示差异不显著 (P>0.05) 。

2.2 0.5 mL 56°白酒对大鼠镇痛作用的调节

用56°白酒0.5 mL对6只大鼠进行灌胃处理, 分别在灌胃后5, 10, 15, 20, 30, 60分钟检测大鼠的HWL。与对照组相比, 差异有统计学意义, 灌胃后的大鼠HWL明显延长, 见表1。

3 讨论

研究采用灌胃生理盐水或白酒检测大鼠痛觉阈值变化的方法, 探究白酒对老年性大鼠镇痛作用的影响[6]。以往研究发现, 神经轴突, 特别是外周神经轴突受到损伤后诱发的疼痛等一系列感觉异常是神经元损伤后自身修复过程中伴随的功能活动代偿表现。轴突损伤区及胞体膜上大量堆积由胞体合成的Na+、K+和Ca2+等通道蛋白和受体物质是神经元产生自发电活动及神经元电活动之间混线现象的基础 。自发的非正常生理编码信息的异位传入电活动诱发痛觉过敏、痛性感觉异常、自发性疼痛及感觉倒错等异常感觉[7], 这就是慢性痛觉病的发生机理。在正常情况下, 疼痛是保护机体的信号, 但是有时慢性痛可以持续几个月或几年, 这种对病理状态的生理保护性提示不仅是无用的而且令人痛苦。这种慢性痛是临床的主要难题之一, 因此药物镇痛作用机制的研究受到国内外学者的广泛重视[8]。

研究发现:在一定浓度范围内, 用白酒对大鼠进行灌胃处理, 能显著延长大鼠的痛觉阈值, 对其痛觉调节产生抑制作用, 即具有镇痛作用, 并且这种镇痛作用效果在10分钟左右最显著。关于镇痛作用机制的研究还有很多:鞘内注射可乐定可以抑制甲醛致痛大鼠的疼痛反应, 阻止疼痛信号在脊髓内的传导, 从而产生抗伤害作用, 而且具有超前镇痛效应[9]。疼痛患者常伴有躯体症状, 如疲劳、失眠、消化道症状、神经系统症状、焦虑、恐惧、抑郁和孤独等, 导致患者生活质量下降[10]。麻醉性镇痛药可以缓解患者的痛苦, 但其连续使用后易产生耐受性并成瘾, 内源性物质如甘丙肽及激动剂等也具有明显的镇痛作用[11,12], 根据专家推荐的三阶梯止痛原则, 合理使用麻醉性镇痛药物不但可以消除患者持续疼痛, 而且又可以减小成瘾的危险性。试验的镇痛作用机制可能与麻醉性药物类似, 其深层的作用机制还有待于进一步研究。

参考文献

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[11]FU L B, WANG X B, JIAO S, et al.Antinociceptive effects of in-tracerebroventricular injection of the galanin receptor 1 agonist M617 in rats[J].Neurosci Lett, 2011, 491:174-176.

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老年大鼠 篇2

1 实验材料

1.1 药物与试剂

丹龙胶囊 (浸膏) :浓度为7.92g (生药) /g, 批号:20000409, 丹龙胶囊临床拟用量为33.25g (生药) /日, 由本院制剂研究室提供。乌蛇止痒丸:其主要成分有乌梢蛇、蛇床子、人工牛黄、当归、牡丹皮、苦参、防风、苍术等, 规格30g/瓶, 临床用量7.5g (生药) /日, 广州中药一厂生产, 批号:00040027。维肤膏:湖南天龙医药化工实业有限公司生产, 批号:000403。伊文思蓝;上海化学试剂采购供应站试剂厂生产, 批号:750429。其他试剂均为AR或CP。

1.2 动物

SD系清洁级老年大鼠, 雌性, 体重300～400g, 月龄18个月, 由本院实验动物中心提供。合格证号:035号。实验动物环境设施合格证号:027号。

1.3 仪器

751G-W分光光度计:上海分析仪器厂生产。HPIAS-1000图像分析系统:同济医科大学华海公司生产, 湖南医科大学病理教研室提供。

2 方法与结果

2.1 对老年大鼠皮肤水份和胶原蛋白含量的影响

选取SD系清洁级老年大鼠54只, 体重 (360±21) g, 随机分成6组, 每组9只。分别为空白对照组 (灌胃生理盐水10ml/kg) 、乌蛇止痒丸组 (等效剂量为0.7g (生药) /kg, 灌胃体积为10ml/kg) 、维肤膏组 (背部两侧皮肤脱毛约2cm2, 每天涂1次维肤膏, 每次涂2g/kg于两侧) , 丹龙低、中、高剂量组 (其剂量分别为3.0、6.0、12.0g (生药) /kg, 相当于临床等效剂量的1、2、4倍, 灌胃体积为10ml/kg) 。各组动物按表1剂量灌胃给药, 每天1次, 连续15天, 第15天给药后1小时处死动物, 剪毛, 剥取背部左右两侧皮肤, 清除脂肪, 取右侧皮肤, 称重, 于60℃恒温箱中干燥48小时, 再称重, 计算皮肤含水百分率;另取右侧皮肤约10mg, 经水解、中和、氧化、显色后于562nm处测定光密度 (OD) , 以每毫克OD值表示皮肤胶原蛋白含量。数据以undefined表示, 统计处理采用SPSS10.0 for Windows软件包进行处理, 组间比较采用方差分析 (下同) 。

结果见表1。

与空白对照组比较*P<0.05, **P<0.01;与乌蛇止痒丸组比较#P<0.05, ##P<0.01

2.2 对老年大鼠皮肤胶原纤维含量的影响

取上项试验老年大鼠左侧皮肤, 经甲醛固定, 脱水包埋切片, Weigert’s染色, 用95%Alc分色, 再用Van giesodn's液染色, 用95%乙醇分色, 经无水Alc脱水, 二甲苯透明, 封片 (此步由湖南中医学院组胚教研究室成) , 用HPIAS-1000图像分析系统 (同济医大华海公司产) 进行观察分析 (此步由湖南医科大学病理室完成) , 计算每张切片上代表欲检测VG染色阳性物质的平均光密度 (OD) , 每张切片选择5个视野, 取其平均OD值表示胶原纤维的含量。结果见表2。

与空白对照组比较*P<0.05, **P<0.01;与乌蛇止痒丸组比较#P<0.05, ##P<0.01

3 讨论

皮肤由表皮、真皮及皮下组织 (附属器) 组成。皮肤老化, 皮肤表皮角质层变薄, 角质层中自然润泽因子 (NMF) 含量不断减少, 皮肤水分丧失, 细胞皱缩、老化, 组织缺少、萎缩, 皮肤表面的水脂乳化物 (HE) 含量减少, 角质层丧失柔润, 真皮内的各种纤维、血管及皮肤附属器官中的无定形的基质均随之变化[1]。

真皮层的主要成分是胶原纤维和弹性纤维, 它们是维持皮肤组织韧性和弹性的重要成分。研究表明, 皮肤的可溶性胶原纤维减少, 而不溶性胶原纤维增加, 其稳定性逐渐增加, 而皮肤的伸展度也随之减少。真皮层I型与Ⅲ型胶原最多, 婴儿及青年人皮肤I型胶原的含量约占70%, Ⅲ型胶原占30%;当皮肤衰老时, 胶原含量逐渐降低且两者比例逐渐倒置, 胶原变粗, 出现异常交联。

弹性纤维的中心核是弹性蛋白, 它具有很强的伸缩性和弹性, 是维系皮肤弹性的重要结构。皮肤衰老时, 弹性蛋白减少、变性, 纤维增粗、卷曲、聚焦成团, 使皮肤弹性下降、松弛, 出现皱纹[2]。无论是内源性还是外源性老化过程都对皮肤胶原纤维和弹性纤维数量和质量产生影响[3]。

中医认为, 年老体虚, 五脏虚损, 气血失调, 痰浊瘀阻, 肾精不足则皮肤无华;脾虚则面色萎黄;肺虚则气滞血瘀, 皮肤甲错, 皮肤瘀斑衰老。临床治疗多采用养血润燥、调理气血、祛风止痒之品[4,5]。中药丹龙胶囊具有调整阴阳、调理气血、调治脏腑和祛痰延衰的作用。

本研究结果表明:丹龙胶囊能提高老年大鼠皮肤含水量、胶原蛋白含量和胶原纤维含量, 改善老年大鼠皮肤干燥, 组织结构老化的症状。表明具有养阴润燥、凉血通络等功能的丹龙胶囊, 能较好地解决老年皮肤老化的主要问题, 对老年性皮肤干燥、衰老等具有确切的疗效。

参考文献

[1]刘仲荣, 范红霞, 张海龙.皮肤老化的一般特征及发生机制.皮肤老化与化妆品系列讲座 (一) .中国美容医学, 2004, 13 (4) :479.

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[4]傅丽珍.加味当归饮子中药汽疗治疗老年皮肤瘙痒症30例临床观察.中国中医药科技, 2006, 13 (4) :272.

老年大鼠 篇3

1 材料与仪器

1.1 材料

黑桑椹(鲜桑采于山西省夏县,用塑料袋封藏后,放4℃冰箱中保存。用时,经筛选后,压榨,过滤,获取桑果汁,冷藏备用)。其他试剂均为分析纯。

Wistar大鼠(南方医科大学实验动物中心,合格证号97A034)。

1.2 仪器

UV-2501紫外分光光度计(日本岛津);荧光分光光度计(Hitachi F4500,Japan);离心机(Beckman公司);LAUDA-C数显恒温水浴锅(German);Millin-Q超纯水制备机(USA)。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 动物处理

选用20月龄的Wistar大鼠40只,雌雄各半,用常备饲料喂养1周后按体重随机分为3组。正常对照组:饲以基础饲料;桑椹组:基础饲料中加10%黑桑椹果(10%fruits);果汁组:基础饲料加10%果汁(10%juice)。动物在(25±3)℃,(50±10)%湿度条件下分笼饲养[8],自由饮食(20~30 g/d),喂养10周后,眼眶采血测定,常规法获得血红细胞和血清测定有关指标。

2.1.2 测定血浆和红细胞的丙二醛含量(MDA)

MDA含量用Wasowicz W等[9]改进的荧光法测定。

2.1.3 SOD,ATPase,GSH-Px活性的测定

SOD活性采用改良的邻苯三酚自氧化法测定[10];用定磷法测定细胞膜ATP酶[活性单位为μg Pi/(mg Pr·h)][11]。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性采用DTNB直接法测定(活性单位为U/g·Hb)。

2.1.4 红细胞膜流动性测定

不同处理大鼠红细胞加等体积2×10-6mol/L荧光探剂1.6-diphenyl-1.3.5-hexatriene(DPH)37℃温育30 min,在4℃12 000 r/min离心10 min取沉淀,用PBS洗2次,以3 ml PBS重悬,迅速在Hitachi F4500荧光分光光度计(加偏振片)上测定其平行和垂直时的荧光强度(Ⅰ‖,Ⅰ⊥),测定条件:25℃,Ex=362 nm,Em=432 nm,狭缝5/5。计算荧光偏振度P和微黏度η,按公式:P=(Ⅰ‖-Ⅰ⊥)/(Ⅰ‖+Ⅰ⊥),η=2P/(0.46-P)。

2.1.5 血清的胆固醇(TC),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),抗动脉硬化指数(AAI)的测定

血清的胆固醇(TC)含量用邻苯二甲醛法;高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)用聚乙二醇(PEG)沉淀法测定;抗动脉硬化指数AAI=HDL-C/TC[12]。

2.1.6 统计分析

数据采用表达,用Origin 8.0软件进行常规t检验。

2.2 结果

2.2.1 黑桑椹对大鼠血清和红细胞膜MDA含量的影响结果见图1,2。

从图1可见,10%桑椹果与果汁处理后大鼠血清MDA含量降低,与对照组相比,均有显著性差异(**P<0.01)。从图2可见,10%桑椹果汁处理后,大鼠红细胞膜MDA含量与对照组相比显著降低(*P<0.05)。10%桑椹果处理后,红细胞膜MDA含量下降,但是与对照组没有显著性差异。

2.2.2 桑椹对红细胞SOD,GSH-Px活性的影响结果见图3,4。

从图3可见,10%桑椹果汁处理后,大鼠红细胞SOD活性与对照组相比显著升高(*P<0.05)。10%桑椹果处理后,大鼠红细胞SOD活性与对照组没有呈现显著性差异。从图4可见,10%桑椹和10%果汁使大鼠红细胞GSH-Px活性均显著升高,与对照组比较有极显著性差异(**P<0.01)。

2.2.3 桑椹对红细胞膜ATPase活性和膜流动性的影响

结果见图5,6。

从图5可见,桑椹果和果汁使大鼠红细胞膜ATPase活性提高,但是各组间没有显著性差异。从图6可见,桑椹使大鼠红细胞膜的微黏度η降低,10%果汁组大鼠红细胞η与对照组相比,有极显著性差异(**P<0.01),10%桑椹组与对照组相比无显著性差异。细胞膜η与细胞膜流动性之间呈负相关。结果表明,桑椹使老年大鼠红细胞膜的流动性升高。

2.2.4 桑椹对大鼠血中TC,HDL-C,AAI的影响

结果见表1。

从表1可见,与对照组相比,桑椹果和果汁使大鼠血中的TC含量稍有下降,使高密度脂蛋白含量升高,但没有显著性差异。10%桑椹果和10%果汁显著地提高了老年大鼠的抗动脉硬化指数(*P<0.05)。

3 讨论

老年人动脉硬化和血中胆固醇高是一种普遍问题。研究表明一些中药具有降低血中胆固醇含量、抗动脉硬化的效应。黑桑椹是一种富含多种营养成分、药食同源的食物。老年大鼠体内自由基增加,红细胞膜受到氧化损伤后,可使膜的流动性降低,脆性增加,而各种蛋白酶的活性降低,细胞内脂质过氧化的终产物如MDA含量增加,从而导致机体老化。本文研究结果表明:与对照组相比,黑桑椹能升高老年大鼠血细胞抗氧化酶SOD、GSH-Px和ATPase的活性;能提高大鼠红细胞膜脂的流动性,并显著降低血清和血浆的MDA含量。这从一个方面表明黑桑椹具有改善血液自由基代谢和活血的作用。另外10%的黑桑椹果和10%的黑桑椹果汁能降低血中总胆固醇;升高血中高密度脂蛋白;并显著提高老年大鼠的抗动脉硬化指数。这从另一个方面说明黑桑椹或果汁具有降脂和抗动脉硬化的功效,有利于改善老年大鼠健康状态。

黑桑椹营养丰富,味美甘甜,被视为夏令水果中的珍品。对其成分进行研究发现,黑桑椹具有丰富的抗氧化成分维生素E,维生素C,β-胡萝卜素和生物类黄酮如芦丁、桑色素、槲皮素等成分,含有大量的微量元素。目前,尽管黑桑椹活血降脂的机制尚不明确,但必然与其含有各种活性成分有关。

本文研究结果提示,黑桑椹具有良好的活血降脂效果,这对延缓机体衰老有益,值得进一步深入研究,并考虑将其作为老年人降脂保健功能食品或辅助治疗药物进一步研究和开发,必然会有广泛的应用前景。

摘要：目的:研究黑桑椹对老年大鼠的活血降脂作用。方法:老年大鼠被随机分为对照组、10%果汁组、10%桑椹果组3组,8周后,大鼠的血清和血液用于各项指标的。结果:与对照组相比,黑桑椹果汁和桑椹果组大鼠的红细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、膜结合酶(Na+-K+-ATP酶)活性,以及高密度脂蛋白含量均增加;膜脂流动性得到改善;同时,桑椹组的血清和红细胞膜中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量和血液总胆固醇含量降低;处理组抗动脉硬化指数与对照组相比显著升高(P<0.05)。结论:黑桑椹果与果汁具有一定的活血、降脂和抗动脉粥样硬化的效果。

老年大鼠 篇4

1 材料与方法

1. 1 动物与试剂

1. 1. 1 动物健康Sprage-Dawley ( SD) 大鼠84 只, 清洁级, 12 月龄, 体重490 ~510 g, 雌雄各半, 由湖北医药学院实验动物中心[许可证号: SCXK ( 鄂) 2005-0008]提供。动物随机分为3 组: 正常对照组28 只, CAS模型组28 只, 游泳干预组28 只。3 组实验环境相同, 单笼喂养, 予灯光模拟黑夜和白天, 给予灯光12 h/d, 在实验开始后有1 周的适应期, 均给予正常喂食。

1. 1. 2实验试剂维生素D3注射液、胆固醇、猪胆盐、丙基硫氧嘧啶片, 总胆固醇 ( TC) 、甘油三酯 ( TG) 、高密度脂蛋白胆固醇 ( HDL-C) 、低密度脂蛋白胆固醇 ( LDL-C) 、氧化低密度脂蛋白 ( oxidized Low densitylipoprotein, ox-LDL, 美国ADL) 等试剂盒, 白介素-1β ( Interleukin-1β, IL-1β) 、白介素-6 ( Interleukin-6, IL-6) 等试剂盒, 均购自武汉博士德公司; 猪油自制。本实验于2012 年6 -11 月实施。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 CAS老年动物模型制备[4]CAS模型组和游泳干预组喂饲高胆固醇饲料 ( 4% 胆固醇、10% 猪油、5% 白糖、0. 5% 胆酸钠、0. 2% 丙基硫氧嘧啶、80. 3% 基础饲料) , 并在饲养开始时, 腹腔注射维生素D32 ml / kg ( 60 万U/kg) 。12 周后, 随机抽取10% 大鼠, 取CA做病理切片, 苏木素- 伊红 ( HE) 染色; 光学显微镜下观察, 有75%大鼠出现典型动脉粥样硬化斑块, 即表明CAS老年大鼠模型建立成功。

1. 2. 2 游泳训练干预方式CAS模型复制成功后, 游泳干预组在Morris水迷宫内进行定点、定位航行训练:历时12 周, 从第1 天起, 每天9: 00、15: 00 各训练1 次;每周训练5 d。在迷宫水池中划出直径线, 其与池壁的2 个交点处, 1 个标记为航行起点, 另1 个放置平台 ( 与水面平) , 即航行终点。训练时, 选择航行起点为入水点, 将大鼠面向池壁放入水中, 让大鼠寻找、游向并爬上平台。循序渐进地加大游泳运动训练强度, 第1 ~ 4周, 每次训练让大鼠由起点至终点重复航行10 次, 第5 ~ 8周航行15 次, 第9 ~ 12 周航行20 次。如果大鼠在120 s内未找到平台, 须将其引至平台; 如发现大鼠有力竭表现时 ( 下沉后10 s不露出水面) 将其捞出水面休息5 min后, 继续训练至结束。

1. 3 检测指标与方法

1. 3. 1 旷场实验 ( open field test, OFT) [5]又称敞箱实验, 是评价实验动物在新异环境中的自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。游泳训练干预12 周后, 实施OFT。将动物置于规格为100 cm × 100 cm × 50 cm的木箱中, 木箱底部用笔划分成面积相等的25 块方格, 沿墙格为外周格, 其他为中央格, 将动物放正中格中, 观察者在实验室内用摄像系统记录动物在旷场内5 min的行为表现, 要求单盲法, 并有两位观察者, 取两人的观测均值。观察指标包括穿格次数 ( 3 爪以上跨入邻格的次数) 、直立次数 ( 两前肢离地1 cm以上的次数) 以及修饰次数 ( 理毛的次数) 。室内为暗光, 实验过程伴有噪声。每次实验后, 需清洗方箱内壁及底面, 以免上次动物余留的信息 ( 如动物的大、小便、气味) 影响下次测试结果。更换动物, 继续实验。

1. 3. 2 血脂浓度与血清因子的检测游泳干预12 周后, 将3 组大鼠麻醉, 开胸于右心室插管取血10 ml, 放入预先加入抗氧化剂的试管中, 摇匀, 静置30 min后, 3 000 r / min离心10 min ( 美国Sigma离心机, 离心半径13. 5 cm) , 取血清, 放入- 20 ℃ 冰箱中保存待测。一部分血清用相应试剂盒分别测定TC、TG、HDL-C、LDL-C和ox-LDL; 另一部分血清, 运用放射免疫方法, 采用GC -1500 型 γ 放射免疫计数器、相应试剂盒检测IL-1β、IL-6。严格按照试剂盒说明操作。

1. 3. 3病理学检查游泳干预12 周后, 取3 组大鼠CA做病理切片, HE染色, 观察各组大鼠CAS斑块发生率和CA狭窄程度的变化。

1. 4 统计方法计量资料统计描述用 ± s表示, 数据处理采用t检验; 并应用SPSS 17. 0 软件对实验数据进行统计学分析, 检验水准 α =0. 05。

2 结果

2. 1 4 组大鼠在OFT中情感行为变化与正常对照组比较, CAS模型组穿格次数、直立次数及修饰次数明显增多 ( t = 11. 051, P < 0. 01; t =15. 475, P < 0. 01;t = 36. 764, P < 0. 01) ; 与CAS模型组比较, 游泳干预组上述各指标则明显减少 ( t =9. 538, P <0. 01;t = 11. 729, P < 0. 01; t = 22. 591, P < 0. 01 ) , 且接近正常对照组 ( P >0. 05) 。见表1。

注: 与CAS模型组比较, aP < 0. 01; CAS—冠状动脉粥样硬化。

2. 3 3 组大鼠血脂和ox-LDL水平比较CAS模型组TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平, 比正常对照组明显升高 ( t = 9. 821, P < 0. 01; t = 13. 936, P < 0. 01;t = 17. 201, P < 0. 01; t = 4. 129, P < 0. 01) ; 游泳干预组TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明显低于CAS模型组 ( t =7. 956, P < 0. 01; t = 10. 963, P < 0. 01; t =15. 41, P < 0. 01; t = 3. 566, P < 0. 01) , 但略高于正常对照组 ( P > 0. 05) , 而血清中HDL-C则高于CAS模型组 ( t =3. 418, P <0. 01) 。见表2。

( n =28,  ±s, )

注: 与CAS模型组比较, aP < 0. 01。CAS—冠状边脉粥样硬化, TC—总胆固醇, TG—甘油三脂, HDC-C—高密度脂蛋白胆固醇, LDC-C—低密度脂蛋白胆固醇, Ox-LDL—氧化低密度脂蛋白。

2. 3 3 组大鼠血清中致炎因子检测结果与正常对照组比较, CAS模型组血清中IL-1β、IL-6 水平明显增高 ( t =18. 912, P <0. 01; t =12. 034, P <0. 01) ; 与CAS模型组比较, 游泳干预组明显降低 ( t =14. 147, P <0. 01;t = 9. 867, P < 0. 01) 。见表3。

注: 与CAS模型组比较, aP < 0. 05。CAS—冠脉动脉粥样硬化;IC-1β—白介素-1β; IL-6—白介素-6。

2. 4 3 组大鼠病理学检查结果CAS模型组CAS斑块发生率、CA狭窄程度分别比正常对照组显著升高 ( t =53. 704, P <0. 01; t =49. 439, P <0. 01) ; 而游泳干预组上述两指标则明显低于CAS模型组 ( t = 36. 560, P < 0. 01; t = 30. 034, P < 0. 01 ) , 但高于正常对照组 ( t =41. 498, P <0. 01; t =38. 163, P <0. 01) 。见表4。

注: 分别与CAS模型组和正常对照组比较, aP < 0. 01。CAS—冠状动脉粥样硬化; CA—冠状动脉。

3 讨论

本研究结果显示, 与CAS模型组比较, 游泳干预组穿格次数、直立次数及修饰次数明显减少, 且接近正常对照组。大鼠游泳训练, 是机体全身心的运动, 对心血管具有直接作用, 可反射调节机体的神经内分泌和自主神经功能, 增强循环生理机能, 提高心脏的贮备功能和冠状动脉血流, 增加最大的有氧活动, 从而改善心肌血供, 稳定心理状态[6]。因此, 出现本结果, 游泳运动干预改善了CAS大鼠较高的状态焦虑水平。

本研究结果进一步显示, 游泳干预组血清中TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平低于CAS模型组, 但血清中HDL-C水平高于后者。这说明游泳运动可减少机体脂肪含量, 改善脂代谢, 延缓冠状动脉粥样硬化斑块的发生和发展。LDL-C把TC从肝脏运送到全身组织中, HDL-C将各组织中的TC送回肝脏代谢。当LDL-C, 尤其是ox-LDL过量时, 它携带的TC便积存在动脉壁上, 容易引起动脉硬化。ox-LDL是导致动脉粥样硬化和血栓形成的主要原因, 可影响血管内皮细胞、白细胞、血小板的功能, 促进凝血过程而抑制纤溶系统活性。HDL-C主要在肝脏中合成, 它的主要生理功能是转运磷脂和胆固醇[7]。血清中HDL-C被认为是抗动脉硬化的脂蛋白, 冠状动脉的保护因子。HDL-C水平与动脉管腔狭窄程度、冠心病发率呈显著负相关。HDL-C升高能降低冠心病发生的危险, 在TC中HDL-C占的比例越大, 患冠心病危险性越小; 而降低则是冠心病的先兆。在估计心血管病的危险因素中, HDL-C降低比TC和TG升高更有意义[8]。

本研究结果还显示, 与CAS模型组比较, 游泳干预组血清中IL-1β、IL-6 水平明显降低。近年的研究已证实动脉粥样硬化过程中炎症反应不仅发生在血管腔内壁, 在粥样硬化的动脉外膜通常也存在炎性浸润。IL-1β 主要由活化的单核巨噬细胞产生, 与受体 ( IL-1R) 结合后产生生物学作用。IL-1β 作用于血管的内皮细胞, 能引起巨噬细胞趋化因子-1 ( MCP-1) 和细胞黏附分子如E-选择素 ( E-selectin) 的表达, 而MCP-1和E-选择素介导的单核细胞贴壁和向内皮下迁移在动脉粥样斑块形成的早期起着十分重要的作用。IL-6 也称B细胞分化因子, 是由血管内皮细胞及平滑肌细胞、单核巨噬细胞分泌, 其作用于血管壁而引起血管损伤, 在炎症反应中起到核心作用[9-10]。

本研究病理学检查结果显示, 游泳干预组CAS斑块发生率、CA狭窄程度分别明显低于CAS模型组, 但高于正常对照组。这表明, 游泳运动干预, 通过改善CAS模型大鼠焦虑状态, 降低血清中TC、TG、LDL-C、ox-LDL以及IL-1β 与IL-6 水平, 提高血清中HDL-C水平, 从而有效减缓CAS斑块、CA狭窄的发展。总之, 游泳运动是一种可促进身体健康的刺激因素; 游泳运动干预能改善心血管功能, 促进心血管形态结构与功能重塑, 对CAS老年大鼠有一定的防治作用。

摘要：目的 探讨游泳运动干预对冠状动脉粥样硬化 (CAS) 老年大鼠的影响。方法 选取12月龄健康SD大鼠84只, 随机分为正常对照组、CAS模型组和游泳干预组, 各28只。通过喂饲高胆固醇饲料, 建立CAS动物模型;采用游泳训练方式对其进行干预, 观察、比较各组大鼠情感行为、血脂水平、血清氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL) 、白介素-1β (IL-1β) 和IL-6浓度, 以及CAS斑块发生率和冠状动脉 (CA) 狭窄程度的变化。结果 ①与CAS模型组比较, 游泳干预组穿格次数、直立次数及修饰次数明显减少 (P<0.05) , 接近正常对照组 (P>0.05) 。②游泳干预组血清中总胆固醇 (TC) 、甘油三酯 (TG) 、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 和ox-LDL水平明显低于CAS模型组 (P<0.05) , 但略高于正常对照组 (P>0.05) ;而血清中高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 则高于CAS模型组 (P<0.05) 。③与CAS模型组比较, 游泳干预组血清中IL-1β、IL-6水平明显降低 (P<0.05) 。④游泳干预组CAS斑块发生率、CA狭窄程度分别明显低于CAS模型组 (P<0.01) , 但高于正常对照组 (P<0.05) 。结论 游泳运动干预对冠状动脉粥样硬化老年大鼠有一定的防治作用。

关键词：冠状动脉粥样硬化,血脂,氧化低密度脂蛋白,白介素-1β,白介素-6,运动

参考文献

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老年大鼠 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

健康离乳Wistar大鼠21只, 体重50 g左右, 活动能力相近, 由山西医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 饲料

低碘饲料是以来自低碘地区山西省安泽县魏家湾村的小麦、玉米、大豆为原料制成的, 碘含量为0.085 8 μg/g, 氟含量为26.51 mg/kg;正常饲料由山西医科大学实验动物中心提供, 碘含量为0.354 3 μg/g, 氟含量为25.57 mg/kg。氟、碘的测定分别采用氟离子电极法和硫氰酸铁-亚硝酸催化动力学法。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立

取离乳Wistar大鼠21只, 随机分为4组:对照组 (5只) 大鼠饲喂大鼠标准饲料, 饮自来水;高氟组 (5只) 大鼠饲喂大鼠正常饲料, 饮100 mg/L氟化钠去离子水;低碘组 (5只) 大鼠饲喂低碘饲料 (定做) , 饮去离子水;高氟低碘组 (6只) 大鼠饲喂低碘饲料, 饮100 mg/L氟化钠去离子水。饲喂3个月, 收集一昼夜尿液, 测其碘含量 (对照组为1 627.9 μg/L, 高氟组为1 314.5 μg/L, 低碘组为651.1 μg/L, 高氟低碘组为1 401.7 μg/L) , 根据尿碘含量可确定动物模型的建立。在此条件下共饲喂19个月。

大鼠在20月龄时脱颈处死, 立即取出甲状腺组织, 用冰冷的PBS漂洗3次至无血液存留, 再用不锈钢剪刀将其剪碎, 加适量PBS到玻璃匀浆器中, 研磨, 并过300目筛得到单细胞悬液, 台盼兰染色、镜检细胞存活率, 如细胞存活率达90%以上立即进行单细胞凝胶电泳。

1.2.2 胶板的制备

①第1层胶的制备:

将预热56 ℃的0.5%正常熔点琼脂糖 (NMA, 溶于无Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液PBS中) 80 μL滴到同样预热的载玻片的磨砂面上, 迅速盖上干净的盖玻片, 4 ℃放置10 min使其凝固。

②第2层胶的制备:

取含1 000个细胞的PBS 10 μL和0.5%低熔点琼脂糖 (LMA, 溶于无Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液PBS) 75 μL在37 ℃混匀, 然后轻轻揭去盖玻片, 将含细胞的LMA滴到第1层胶板上, 立即盖上干净的盖玻片, 4 ℃放置10 min使其凝固。

③第3层胶的制备:

在凝固的LMA层上滴加预热37 ℃的0.5% LMA 85 μL, 盖上盖玻片, 使其凝固。第1层胶的主要目的是使第2层胶平整和附着紧密, 第3层胶的目的是对第2层胶的细胞起保护作用。

1.2.3 细胞裂解

移去盖玻片, 将载玻片浸入新配制的细胞裂解液 (NaCl 2.5 mol/L, Na2EDTA 100 mmol/L, Tris 10 mmol/L, N-十二烷基肌氨酸钠1%, pH值为10) 中保存, 用前加1%体积的Triton-X-100、10%的DMSO) 至少裂解1 h。此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜, 除去蛋白质、RNA等, 仅存留核骨架。

1.2.4 DNA碱解旋

裂解1 h后取出载玻片, 用PBS冲洗2次以去掉载玻片表面高浓度的盐, 然后将载玻片置于水平电泳槽中, 倒入新配制的碱性电泳缓冲液 (Na2EDTA 1 mmol/L, NaOH 300 mmol/L, pH值为13) 中, 约覆过胶面0.25 cm, 碱解旋20 min, 以便使DNA在碱性条件下解螺旋形成单链DNA, 使DNA断链在电泳场中易于迁移。在预试验中观察到碱解旋的时间延长可使DNA迁移长度增加。

1.2.5 电泳、中和与染色

在25 V、300 mA的条件下电泳20 min;将载玻片取出, 用吸水纸吸干电泳缓冲液, 用Tris-HCl (pH值为7.5) 中和15 min;然后在每片载玻片上滴加30 μg/mL溴化乙锭 (EB) 水溶液50 μL, 盖上盖玻片, 染色20 min后即可观察。

1.2.6 观察与数据处理

EB染色后的样本应尽快在荧光显微镜下观察电泳图谱。每张载玻片随机拍摄25个细胞, 计算拖尾率并用游标卡尺测量细胞头长和尾长, 以此评估细胞DNA受损情况并对大鼠甲状腺组织细胞的损伤进行分级 (本研究将DNA链断裂分为三级:Ⅰ级, 彗星尾长/彗星头长<1;Ⅱ级, 1<彗星尾长/彗星头长<2;Ⅲ级, 彗星尾长/彗星头长≥2。Ⅰ级、Ⅱ级为一般型DNA链断裂, 其中Ⅰ级为轻微型DNA链断裂。Ⅲ级DNA链断裂表现为很小的彗星头, 大而圆的彗星尾, 像一把大扫帚, 又称为凋亡型DNA链断裂) 。运用SPSS软件对数据进行统计分析。

2 结果

2.1 高氟低碘对老年大鼠甲状腺细胞拖尾率的影响

每只大鼠的甲状腺制一张片子, 每张片子随机选择100个细胞, 计数拖尾细胞数并计算拖尾细胞百分率。结果表明:高氟组、低碘组和高氟低碘组的老年大鼠甲状腺细胞拖尾率极显著高于对照组 (P<0.01) ;高氟低碘组老年大鼠甲状腺细胞拖尾率比高氟组和低碘组稍有增加, 但高氟组、低碘组和高氟低碘组组间差异不显著 (P>0.05) (见表1) 。

注:与对照组相比, 数据肩标**表示差异极显著 (P<0.01) 。

2.2 高氟低碘对老年大鼠甲状腺细胞拖尾长度的影响

每只大鼠的甲状腺制一张片子, 随机选择25个细胞测量彗星尾长。结果表明:高氟组、低碘组和高氟低碘组的老年大鼠甲状腺细胞的拖尾长度与对照组相比差异显著或极显著 (P<0.05或P<0.01) , 并且高氟低碘组甲状腺细胞的拖尾长度比高氟组和低碘组明显增长 (P<0.05) (见表2、图1～4) 。

注:与对照组相比, 数据肩标*表示差异显著 (P<0.05) , **表示差异极显著 (P<0.01) 。

2.3 高氟低碘对老年大鼠甲状腺细胞DNA损伤程度分级

甲状腺细胞DNA损伤分级结果表明:高氟组老年大鼠甲状腺细胞DNA损伤主要是Ⅱ级、Ⅲ级 (Ⅱ级为39.13%、Ⅲ级为47.83%) ;而低碘组的甲状腺细胞DNA损伤的3个级别所占比率几乎平均, Ⅱ级损伤较高;高氟低碘组的细胞损伤以Ⅲ级损伤为主, 高达69.23% (见表3) 。

3 讨论

3.1 年龄对动物机体各系统的影响

试验中, 老年大鼠甲状腺细胞的DNA损伤较大。陈军等[1]报道, 青年SD大鼠的大脑细胞总损伤率仅为7.75%。贺凌飞等[2]检测青年SD大鼠的肝细胞DNA损伤时发现, 其总损伤率仅为9.40%。在甲状腺未检索到相关DNA损伤的资料, 但从中可看出老年大鼠比青年大鼠损伤严重的趋势。由此推断, 衰老可以造成各组织细胞DNA损伤。随着年龄的增长, 机体组织结构和功能退化, 体内自由基水平呈增长趋势, 同时自由基清除机制却呈退化趋势, 结果造成体内自由基大量聚集。自由基增多可使细胞中的多种物质发生氧化, 影响生物酶活性, 细胞凋亡率增加, 导致细胞DNA损伤。

3.2 高氟低碘对老年大鼠甲状腺细胞DNA损伤的影响

甲状腺是对氟最敏感的器官, 氟可引起甲状腺结构和功能的损害。甲状腺具有较强的摄取和蓄积氟的能力, 在非骨组织中, 甲状腺含氟量仅低于主动脉中蓄积的氟量[3]。进入机体中的氟可直接作用于甲状腺, 破坏甲状腺滤泡的组织结构, 造成甲状腺滤泡上皮细胞细胞质减少, 核固缩, 上皮顶端微绒毛减少, 甲状腺滤泡上皮细胞线粒体内外膜、嵴膜、基质不完全甚至完全消失, 出现普遍的空泡样变, 进一步干扰甲状腺激素的合成和分泌, 抑制催化甲状腺球蛋白分解出甲状腺素 (T4) 和三碘甲状腺原氨酸 (T3) 的蛋白水解酶的活性, 使血清T3、T4水平发生异常改变。此外, 高氟还干扰甲状腺-垂体-下丘脑这条反馈途径, 使甲状腺素合成和分泌的调节紊乱, 促甲状腺激素 (TSH) 代谢异常。如果在碘充足的情况下, 甲状腺通过增生、机化等途径还可有效地颉颃氟的侵害, 甲状腺滤泡增生, 增加甲状腺激素的合成与分泌, 通过甲状腺-垂体-下丘脑轴反馈系统调节机体各组织器官功能, 抵抗氟的损害。但在碘不足的情况下, 碘缺乏的本身就影响甲状腺功能和机体的发育, 造成全身各组织的损伤, 缺碘更增加了氟的毒性损害。

参考文献

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[2]贺凌飞, 陈建刚.氟中毒对大鼠口腔黏膜细胞和肝细胞DNA损伤的影响[J].中国地方病防治杂志, 2003, 18 (5) :272-274.

老年大鼠 篇6

1 材料与方法

1.1

药品与试剂 DZP由上海旭东制药有限公司提供 (批号071201) 。乙酰胆碱 (Ach) 、左旋硝基精氨酸甲酯 (L-NAME) 、吲哚美辛 (Indo) 均购自Sigma公司。其余试剂为市售分析纯。

1.2 大鼠离体主动脉环标本的制备

SD大鼠, 雄性, 月龄>18个月, 体重420 g～470 g, 由成都达硕生物科技有限公司提供。血管环用两根不锈钢微型挂钩贯穿血管管腔, 横向悬挂在10 mL 浴槽内, 下方固定, 上方以一细钢丝连于张力换能器, 其静息张力调节为2 g, 使用BL-420F计算机生物信号记录分析系统 (成都泰盟科技有限公司) 记录血管环张力变化。浴液为HEPES液, 浴槽中通以100% 氧, 37 ℃平衡1 h, 每15 min 换液1次。以KCl 60 mmol/L 收缩动脉环3次, 以诱发血管的最大收缩幅度。待血管环稳定后, 用KCl 60 mmol/L 预收缩动脉环达峰值, 加入Ach 10 μmol/L 检验血管内皮的完整性, 舒张幅度不超过收缩幅度的5%时, 认为内皮去除完全。

1.3 大鼠主动脉舒张作用测定

采用内皮完整或去内皮的胸主动脉环, 加入KCl (30 mmol/L) 待血管环收缩达到稳定后, 累积加入DZP使浴槽中的终浓度依次递增为10-6 mol/L, 3×10-6 mol/L, 10-5 mol/L, 3×10-5 mol/L, 10-4 mol/L, 3×10-4 mol/L。观察血管环的舒张反应, 制作DZP的累积浓度-血管反应曲线, 并以KCl诱发的血管环的最大收缩幅度为100%, 计算DZP各浓度的舒张百分比。

1.4 统计学处理$(\overline{x}\pm s)$

计量资料以均数±标准差表示。应用SPSS 13.0作统计分析, 两样本 t 检验进行差异显著性检验。

2结果

2.1 DZP对KCl引起的主动脉环预收缩的影响 DZP10-6mol/L, 3×10-6mol/L, 10-5mol/L, 3×10-5mol/L, 10-4mol/L, 3×10-4 mol/L 对KCl预收缩的血管环产生浓度依赖性的舒张作用 (见图1) , 其最大舒张百分比Emax为 (106.64±2.77) %, 舒张达最大收缩50%时的药物浓度EC50 为 (3.05±0.47) ×10-5 mol/L。而对照组, 累积加入溶剂对KCl预收缩的血管环的舒张作用均不明显。内皮完整组与去内皮组比较有统计学意义 (P<0.05) , 内皮完整组与去内皮组比较有统计学意义 (P<0.05) 。

2.2内皮对DZP舒血管作用的影响

DZP浓度依赖性舒张KCl预收缩的去内皮胸主动环。Emax为 (104.79±1.52) %, EC50为 (4.55±0.33) ×10-5 mol/L。与内皮完整组比较, 当DZP浓度为10-6 mol/L, 3×10-6 mol/L, 10-5 mol/L, 3×10-5 mol/L时, 两者之间有统计学意义, DZP浓度为10-4 mol/L, 3×10-4mol/L时, 两者之间无统计学意义。详见图1。

2.3 L-NAME、Indo对DZP舒血管作用的影响

在KCl预收缩的内皮完整胸主动脉环上, L-NAME (0.1 mmol/L) 减弱DZP (3×10-5 mol/L) 对血管的舒张作用, 对DZP (3×10-4 mol/L) 的舒血管作用无显著性影响, 环氧合酶抑制剂Indo对DZP (3×10-5, 3×10-4 mol/L) 的舒血管作用均无明显影响。详见图2。

2.4 DZP对无钙液预处理血管环的作用 在无钙HEPES液中, 随着CaCl2的浓度 (0.1 mmol/L～3.0 mmol/L) 增加, 预先用KCl 30 mmol/L 去极化的血管环呈浓度依赖性收缩, 而用DZP (3×10-5mol/L, 3×10-4 mol/L) 预处理20 min, 可使CaCl2量效曲线非平行右下移。详见图3。

3 讨论

老年人血管顺应性减弱, 血压调控能力下降, 血压易波动, 容易受到药物的影响[5]。DZP是老年人常用药物之一, 在发挥其镇静催眠作用的同时, 对老年人血管也有一定的影响。实验结果显示, DZP对KCl预收缩的内皮完整及去内皮的老年大鼠胸主动脉环均具有浓度依赖性的舒张作用, 去内皮后低浓度DZP (10-6 mol/L, 3×10-6 mol/L, 10-5 mol/L, 3×10-5 mol/L) 的舒血管作用减弱, 而高浓度DZP (10-4 mol/L, 3×10-4 mol/L) 的舒血管作用没有明显变化, 提示低浓度DZP通过内皮依赖性和非内皮依赖性两种方式舒张血管, 而高浓度DZP可能直接作用于血管平滑肌使血管舒张。内皮细胞通过释放NO、前列环素 (PGI2) 等血管舒张物质调节血管平滑肌的张力[6]。本研究结果显示, NO合酶抑制剂L-NAME能显著抑制低浓度DZP (3×10-5 mol/L) 对内皮完整血管的舒张作用, 但未阻断高浓度DZP (3×10-4 mol/L) 的舒血管作用。提示NO途径可能参与低浓度DZP的舒血管作用。环氧合酶抑制剂Indo对DZP的舒血管作用无明显影响, 提示PGI2未参与DZP的舒血管作用。

Ca2+是引起平滑肌收缩的关键因子[7], 血管平滑肌收缩依赖于细胞外Ca2+内流和细胞内Ca2+释放。由于血管平滑肌无横管系统, 线粒体较少, 肌质网不发达, 不能存储大量的Ca2+, 其收缩对外源性Ca2+依赖性较大。高钾使血管平滑肌细胞膜去极化, 电压依赖性钙通道 (VDC) 开放, Ca2+内流增加[8], 从而引起平滑肌收缩。DZP对KCl预收缩的血管环产生舒张作用, 提示DZP可能通过抑制VDC, 阻滞细胞外Ca2+内流而产生舒血管作用。高钾去极化时CaCl2引起的浓度依赖性收缩主要依赖于外钙内流[9], DZP预处理后可以使得CaCl2量效曲线非平行右下移, 进一步证实降低外钙内流是DZP舒血管作用的主要机制之一。

DZP对老年大鼠离体胸主动脉具有浓度依赖性的舒张作用, 其机制可能是通过减少Ca2+通过VDC内流入血管平滑肌细胞而起作用。在低浓度时, DZP通过内皮依赖性和非内皮依赖性两种方式舒张血管, 与内皮源性舒血管因子NO有关;在高浓度时, DZP的舒血管作用是非内皮依赖性的, 具体机制有待于进一步研究。

摘要：目的观察地西泮 (DZP) 对老年大鼠离体胸主动脉血管反应性的影响及其可能机制。方法采用离体血管张力实验方法, 观察DZP对氯化钾 (KCl) 预收缩血管环的作用, 并检测DZP对经无钙液预处理后的血管环的作用。结果累积浓度的DZP对高浓度KCl引起的血管环收缩有浓度依赖性的舒张作用。去内皮后, 低浓度 (106mol/L, 3×106mol/L, 105mol/L, 3×105mol/L) DZP的舒血管作用减弱。DZP预处理后, CaCl2收缩血管环的量效曲线非平行右下移。结论DZP对KCl预收缩老年大鼠离体胸主动脉有浓度依赖性的舒张作用。

关键词：地西泮,老年大鼠,胸主动脉环

参考文献

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老年大鼠 篇7

1 材料与方法

1.1 芯片及主要仪器

大鼠Oligo GEArray炎症细胞因子与受体基因芯片(inflammatory cytokines and receptors microarray)(112个相关基因,SuperArray,USA),购自上海康成生物有限公司。扫描仪(GeneChip Scanner 1000);图像数据分析软件:GEArray Expression Analysis Suite。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-10酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)试剂盒(RapidBio Lab, USA)。

1.2 主要药物

采用辽宁产朝鲜淫羊藿,由上海第二军医大学天然药化研究所提取EF,其纯度为80%。

1.3 动物与分组

清洁级健康雄性SD大鼠30只,购于四川省医学科学院实验动物中心,分为4月龄(4 m)、24月龄(24 m)和24 m+EF共3组,每组10只。24 m+EF组予EF灌胃, 24 m组给予等量蒸馏水灌胃,均自满21月龄当天开始,连续90 d,其余常规喂养。

1.4 取材

大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,2%碘酊、75%酒精消毒,打开头颅,迅速取出海马组织并立即放入液氮中,转置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.5 基因芯片实验

每组10只大鼠组织样本总RNA等量混合后进行基因表达谱检测。用Trizol-氯仿-异丙醇提取组织总RNA;用SuperScriptⅡ和双链cDNA合成试剂盒合成和纯化cDNA,用Rneasy Mini 试剂盒用于体外转录合成cRNA以及cRNA 的纯化及片段化。用Cy-3、Cy-5逆转录荧光标记,制作cDNA探针。将GEAhyb杂交液注入装有Oligo GEArray芯片杂交管中杂交芯片。用Fluidics Station 450系统对芯片进行洗脱和染色。通过X胶片和GeneChip Scanner 1000 扫描仪获得芯片图像,获取基因表达荧光信号强度值,用内参照基因(管家基因)原始获取信号进行均衡和修正。用GEArray表达分析配套软件进行芯片数据分析。计算荧光信号的强度和比值。基因差异表达相差2倍以上,即表达上调[信号比的对数值,Signal Log Ratio(SLR)>2,表达下调(SLR<-2)为有统计学意义。

1.6 海马组织上清液制备

取出海马组织,用冷生理盐水清洗并用滤纸吸干,加人冷生理盐水,玻璃匀浆器研磨制备成海马组织匀浆,1500 r/min 4 ℃离心10 min,取上清备用。

1.7 ELISA检测

从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条,加入100 μl标准品、100 μl已稀释标本于相应反应板孔中;每孔加入100 μl Biotin anti rat TNF-α、或IL-6、或IL-10,22 ℃温育20 min;每孔加入100 μl 1× HRP,22 ℃温育10 min;每孔加入100 μl TMB显色液,22 ℃温育20 min。每孔加入100μl终止液。15min内在酶标仪450 nm处读样品A值。以A值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据A值在标准曲线上查出其浓度。

1.8 统计分析

数据用均数±标准差表示,采用SPSS软件进行独立样本t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织RNA鉴定

提取的RNA OD260/OD280值>2.0,电泳图谱出现28S和18S清晰条带,表明RNA纯度高。

2.2 芯片扫描结果

用Cy3和Cy5标记的荧光探针与芯片杂交结果显示,全部阳性对照信号清晰,阴性对照信号很弱,表明实验数据可靠。

2.3 24 m组海马组织中差异表达基因

与4 m组比较,24 m组SLR>2的促炎性反应细胞因子与受体基因9个,即白介素(IL-12β、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8rβ)、肿瘤坏死因子(TNF、TNFSF11)、趋化因子(CCL2、CX3CL1)。SLR<-2的抗炎细胞因子与受体基因有:IL-10rα、IL-13、IL-4r、IL-9r、转化生长因子-α(TGF-α)、TGF-β1,共6个。

2.4 24 m+EF组海马组织中差异表达基因

与24 m组比较,24 m+EF组中SLR>2的抗炎细胞因子与受体基因有:IL-10、IL-10rα、IL-13、IL-9r、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-βr2,共8个;SLR<-2的促炎细胞因子与受体基因有:CCL2、CCL3、CX3CL1、IL-15、IL-18、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-6r、IL-8rβ、TNF,共11个。

2.5 各组大鼠海马组织上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平变化特征

从表1可知,与4 m组相比,24 m组海马组织上清液中TNF-α和IL-6水平显著升高(P<0.01),24 m组IL-10水平稍升高,但没有统计学显著差异。与24 m组比较,24 m+EF组中TNF-α和IL-6皆明显降低,IL-10水平均明显升高(P<0.01)。

2.6 各组大鼠海马组织上清液中TNF-α/IL-10和IL-6

/IL-10比值变化 表2表明,24 m组中TNF-α/IL-10和IL-6/IL-10比值都显著高于4 m组(P<0.01)。24 m+EF组中TNF-α/IL-10和IL-6/IL-10比值皆明显低于24 m组(P<0.01)。

注:与4 m组比较, **P< 0.01;与24 m组比较,△△P< 0.01

注:与4 m组比较,**P< 0.01;与24 m组比较,△△P< 0.01

3 讨论

炎性细胞因子是由神经、免疫、内分泌以及组织细胞分泌的具有高度生物活性的可溶性蛋白或糖蛋白。许多炎性细胞因子交互作用构成了炎性细胞因子网络:促炎性细胞因子网络和抗炎性细胞因子网络,这两者的动态平衡维持着机体的促炎与抗炎反应体系平衡,维持炎症的正常生理功能,而这种平衡一旦被打破就会引起病理性炎症变化。基于炎性细胞因子网络在炎性衰老进程中可能起着关键作用,结合细胞因子的特性,本研究就以炎性细胞因子网络为切入点,探讨炎性衰老机制和干预策略。

结果表明,与青年大鼠相比,老年大鼠海马上调的促炎性细胞因子基因有白介素、肿瘤坏死因子和趋化因子,这些促炎性反应细胞因子与受体基因表达上调,可能是促炎性细胞因子网络和抗炎性细胞因子网络失去平衡的关键原因之一,进而导致促炎性反应状态升高,促-抗炎性反应体系失衡,参与炎性衰老的发生发展。本研究结果与以前相关报道的结果相符。研究认为促炎症细胞因子在慢性炎症所致机体的炎性衰老中有重要的作用[5]。大量人群研究表明血清IL-6水平可作为老年人炎性衰老的预测指标[6,7]。高促炎症反应状态存在的原因是循环中促炎症细胞因子介质,包括IL-1、IL-6、TNF-α和前列腺素E2(PGE2)水平的升高[6,7],老年人的组织器官时刻处于这种炎性环境之中。这些结果是从单基因角度研究得出的。而本实验是从多基因,以高通量基因表达谱芯片为具体检测手段,所得到的结果更能反应炎症细胞因子网络的内涵。

海马通过调节下丘脑-垂体-肾上腺轴功能参与调控应激和机体衰老进程[8]。老龄大鼠的海马IL-1β升高,抗氧化酶活性下降,由此认为IL-1β升高是引起衰老的重要原因[9]。因此,本实验选择了海马组织作为实验观察对象。

促炎细胞因子(如TNT-α、IFN-β、IFN-γ等)通过产生活性氧和激活AT m/p53/p21(WAF1/Cip1)信号通路诱导上皮细胞衰老[10]。趋化因子受体CXCR2通过p53通路诱导成纤维细胞衰老;DNA损伤激活NF-κB等信号通路产生促炎细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8等),血清中促炎细胞因子阻滞细胞周期,促进和维持细胞衰老表型[11]。炎症细胞因子网络贯通于炎症和衰老过程,是炎性衰老研究理想的对象。

EF是从小蘖科淫羊藿属植物的茎叶中提取的总黄酮类成分。实验研究表明,EF具有干预衰老的功效[12]。本研究结果发现,EF下调的促炎性细胞因子基因及其数量几乎都是老年大鼠上调的那部分促炎性细胞因子基因,说明EF可能通过下调内源性促炎性细胞因子基因表达,重塑促-抗炎性细胞因子网络和促-抗炎性反应体系新的平衡,以多基因靶点和多环节方式有效干预炎性衰老。

TNF-α、IL-6和IL-10是目前研究和衡量炎症反应程度通用的有效指标,是调控炎性细胞因子网络的关键成员,可能是炎性衰老的炎性细胞因子调控机制的核心。TNF-α/IL-10比值或IL-6/IL-10比值可以反应炎症反应的程度和趋势[13]。因此本实验将IL-6、和TNF-α指标同时进行综合检测,这对促炎性细胞因子网络所引起的促炎性反应程度的评判更加客观、准确。

本研究发现,老年大鼠海马组织中TNF-α和IL-6蛋白表达上调,与基因( mRNA)水平的研究结果相一致,也与Francechi等[1]的研究结论相符。老年大鼠海马组织中TNF-α/IL-10比值和IL-6/IL-10比值比青年大鼠升高,提示促炎性反应相对于抗炎性反应占有明显优势,是机体促炎和抗炎反应平衡失调的原因。而EF能够下调老年大鼠海马组织中内源性TNF-α、IL-6蛋白表达,上调内源性IL-10蛋白表达,而且使TNF-α/IL-10比值和IL-6/IL-10比值下降,说明EF通过下调机体促炎性反应,同时上调抗炎性反应,使得大鼠体内原本失衡的促炎和抗炎反应体系重归于平衡状态。