柱前衍生（精选8篇）
柱前衍生 篇1
甲醛广泛应用于皮革加工过程中,但甲醛对皮肤和粘膜有刺激作用,并与人体许多恶性肿瘤如肺癌、胃癌、肾癌等的形成有一定的关系,因此必须严格控制皮革中甲醛含量。为了保证消费者的健康安全,各国纷纷制订了皮革中甲醛含量的限量标准[1,2],如法国规定直接与皮肤接触的皮革制品中甲醛残留量不得超过 200 mg/kg,德国和奥地利规定甲醛残留量不得超过150 mg/kg,日本规定不直接接触皮肤的皮革制品中甲醛残留量不得超过400 mg/kg,婴儿用品则不得超过20 mg/kg。
目前,甲醛测定方法主要有碘量法[3]、电化学法[4]、气相色谱法[5]、气相色谱-质谱联用法[6]、光度法[7,8,9,10,11,12]、液相色谱法[12,13,14,15]等,碘量法不能测定微量甲醛,光度法受提取液颜色干扰较大。液相色谱法虽不受干扰,但目前国内外文献报道均未对衍生化条件等反应条件进行细致的研究,各文献采用的条件也互相矛盾,这给采用液相色谱法测定甲醛带来很大的困扰。本文针对影响测试结果的各项因素进行了研究,建立了测定皮革中甲醛含量的高效液相色谱方法,该方法检出限低,精密度和回收率均令人满意,完全能满足皮革中甲醛检测工作的需要。采用该方法对皮革中甲醛进行测定,并采用分光光度法进行对比测试,对测试结果进行了t值检验,对方法的准确性进行验证。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司),配岛津Shim-pack XR-ODS色谱柱(75 mm×3.0 mm×2.2 μm),SPD-M20A二极管阵列检测器。UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。Heidolph 4003旋转蒸发仪(德国Heidolph公司),配循环冷却水系统。氮吹仪(北京康林科技有限责任公司)。SW22型恒温水浴振荡器(Julabo公司)。
甲醛标准品(水溶液,浓度为10.4 mg/mL)由中国计量科学研究院提供,2,4-二硝基苯肼(纯度(99.0 %, DNPH)由国药集团化学试剂有限公司提供。甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)均由Tedia公司提供;磷酸、无水硫酸钠、氯化钠、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、环己烷、正己烷、十二烷基磺酸钠均为分析纯试剂,均由广州化学试剂厂提供。Na2HPO4(纯度99.5 %)由天津市津科精细化工研究所提供,实验用水为经Millipore系统处理的去离子水。0.2 (m滤膜由德国Membrana公司提供。
甲醛标准贮备液:取1 mL甲醛标准品,用去离子水稀释至100 mL,其质量浓度为104 mg/L。
DNPH溶液:取0.1718 g DNPH用乙腈溶解并定容至50 mL,其浓度为3436 mg/L。
十二烷基磺酸钠溶液(0.1%):取1.0 g十二烷基磺酸钠,溶解于1000 mL中。
缓冲溶液:0.02 mol/L Na2HPO4水溶液,用磷酸调节pH=5.00。
2,4-二硝基苯腙:DNPH溶液用2 mol/L盐酸进行饱和处理,再加入甲醛溶液,生成橙黄色沉淀2,4-二硝基苯腙,过滤,用2 mol/L盐酸和去离子水冲洗沉淀,干燥。
1.2 色谱分析条件
色谱柱:岛津Shim-pack XR-ODS色谱柱(75 mm×3.0 mm×2.2 μm);流动相:甲醇/水(V/V)= 70/30;流速:0.5 mL/min;检测波长:348 nm;进样量:1 μL;柱温:40 ℃。
1.3 实验方法
1.3.1 样品分析
皮革样品按QB/T2716的规定进行处理,剪碎的皮革试样在称重前按QB/T2707规定进行空气调节。精确称取2 g试样,放入100 mL锥形瓶中,加入50 mL已预热到40 ℃的十二烷基磺酸钠溶液,盖紧盖子,在(40±0.5)℃水浴中震荡60 min。温热的萃取液用真空玻璃纤维过滤器过滤到锥形瓶中,密闭在锥形瓶中的滤液被冷却至室温。
取上述滤液10 mL于50 mL磨口锥形瓶中,加入缓冲溶液20 mL 、DNPH溶液0.6 mL,调节溶液的pH值=5.0,在60 ℃下恒温水浴振荡20 min,取出后用冰水迅速冷却至室温。加入1.5 g氯化钠,分别用10、5、5 mL二氯甲烷提取,合并二氯甲烷提取液,用旋转蒸发仪浓缩至近干,再用氮气吹干,用甲醇定容至1 mL,过滤后进行液相色谱分析,外标法定量,保留时间定性,并用紫外-可见吸收光谱进行辅助定性。
1.3.2 工作曲线
将甲醛标准贮备液用去离子水稀释,配制成浓度为0.05、0.10、0.21、0.52、1.30、2.60、5.20、10.40、20.80、41.60、83.20 mg/L的甲醛标准系列溶液,各取1 mL于50 mL磨口锥形瓶中,以下操作同1.3.1。
2 结果与讨论
2.1 方法原理
甲醛与2,4-二硝基苯肼在酸性介质中发生化学反应,最终生成橙色化合物2,4-二硝基苯腙,反应式如下:
2.2 检测波长的确定
橙色化合物2,4-二硝基苯腙在紫外-可见光区有强吸收,图2是其甲醇溶液的紫外-可见吸收光谱图。从图1可以看出,2,4-二硝基苯腙在348 nm处有一个强吸收峰,且该吸收峰峰形对称,受干扰小,因此本文选择348 nm为检测波长。
2.3 流动相的确定
测定甲醛时可选择乙腈/水[14]、甲醇/水[15]、甲醇/乙腈/水[16]等体系作为流动相,甲醇毒性远小于乙腈,本文选择甲醇/水作为流动相。改变流动相中甲醇/水的比例,考察不同甲醇/水比例的流动相下的分离效果。实验结果表明,当甲醇/水(V/V) = 70/30时,灵敏度高,保留时间适宜,且 2,4-二硝基苯肼与DNPH的分离效果令人满意。因此本文选定的流动相为甲醇/水(V/V)=70/30。图2为该
流动相下甲醛标样的典型HPLC图,从图中可以看出,色谱峰峰形对称而尖锐,谱峰之间完全分离。
2.4 衍生化条件的优化
2.4.1 缓冲溶液pH值的确定
甲醛与DNPH发生羰基亲核加成反应,生成2,4-二硝基苯腙。碱可以增加亲核性试剂的亲核能力,而酸可以加强羰基上碳原子的电正性,有利于引起亲核性进攻,因此,反应体系的pH值对该反应影响很大。为考察缓冲溶液pH值的影响,保持其它反应条件不变,改变缓冲溶液的pH值,观察衍生物色谱峰面积的变化,结果发现,2,4-二硝基苯腙的色谱峰面积随着缓冲溶液pH值的增大而逐渐增加,且在pH=5.0时达到最大值,然后逐渐减少。因此,本文确定衍生化反应的最佳pH值为5.0。
2.4.2 衍生化时间的确定
为考察衍生化时间的影响,保持其它条件不变,改变衍生化时间,观察衍生化产物色谱峰面积的变化,结果表明,随衍生化时间的增加,衍生化产物的色谱峰面积逐渐增大,20 min时达到最大值,反应时间继续增加时,2,4-二硝基苯腙峰面积基本保持不变。因此本文选择的衍生化时间为20 min。
2.4.3 衍生化温度的确定
为考察温度对衍生化反应的影响,保持其它条件不变,改变衍生化温度,观察衍生化产物色谱峰面积的变化。结果表明,衍生化产物的色谱峰面积随着衍生化温度的升高而逐渐增大,在60 ℃时达到最大值,温度继续升高时,峰面积反而有所下降,因此本文选择的衍生化温度为60 ℃。
2.4.4 DNPH的确定
DNPH与甲醛发生衍生化反应,其用量对衍生物反应的进行有一定影响。保持其它条件不变,改变DNPH溶液的加入量,观察衍生物色谱峰面积的变化。结果发现,衍生物的色谱峰面积随DNPH的用量增加而逐渐增大;当DNPH用量为0.6 mL时,色谱峰达到最大值;DNPH用量继续增加时,色谱峰面积基本保持不变。因此本文选择选择的DNPH用量为0.6 mL。
2.5 提取条件的优化
2.5.1 氯化钠的用量
加入氯化钠可以产生盐效应,增加溶液的离子强度,降低有机物在水相中的溶解度。2,4-二硝基苯腙微溶于水中,加入适量的氯化钠可以降低它在水相中的溶解度。保持其它条件不变,改变氯化钠的加入量,考察氯化钠用量对提取效果的影响。实验结果表明,2,4-二硝基苯腙的色谱峰面积随着氯化钠用量的增大而逐渐增大,当氯化钠用量为1.5 g时达到最大值;但氯化钠用量继续增加时,色谱峰面积则反而缓慢下降。因此本文选择氯化钠的用量为1.5 g。
2.5.2 提取溶剂的选择
衍生化产物为有机相,需采用有机溶剂进行萃取富集。正己烷、环己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂是最常使用的提取试剂,本文考察了这几种提取溶剂的提取效果。结果发现二氯甲烷的提取效果最好。因此本文选择二氯甲烷为提取溶剂。
2.5.3 衍生后干燥方式的选择
提取溶液通常需要进行干燥处理,常用的干燥方式有4种:
(1)直接水浴旋转蒸发至干;
(2)直接用氮气吹干;
(3)先加无水硫酸钠脱水,然后水浴上旋转蒸发至干;
(4)先加无水硫酸钠进行脱水,再用氮气吹干。对比试验结果表明,第1种方法效果最好,该方法操作简便,测得的甲醛值最高。
2.6 定性定量分析
2.6.1 定性分析
分别取样品溶液和甲醛标准溶液进行衍生化,然后进行超高效液相色谱分析,比较其在规定检测波长下色谱峰的保留时间及紫外-可见吸收光谱进行定性。
2.6.2 定量分析
2.6.2.1 线性关系及检出限
在本方法确定的实验条件下,对不同质量浓度的甲醛标准溶液进行测定,结果表明,当甲醛质量浓度为0.05~83.20 mg/L时,其浓度c与响应值A有良好的线性关系,其线性方程为A=31736c+ 382.27,r=0.9999。
在本方法中,这相当于样品中甲醛含量为0.25-418 mg/kg。对于甲醛含量过高的样品,可将提取液适当稀释后再进行测试。对于甲醛含量过低的样品,可将提取液适当浓缩后再进行测试。
在S/N(信噪比)=3的条件下,确定方法的检出限为0.01 mg/L。
2.6.2.2 方法的精密度
使用液相色谱法测定甲醛,可以有效地排除杂质的干扰,且通过色谱峰保留时间和紫外-可见吸收光谱的双重比对,可有效地避免假阳性。选取三个不同甲醛含量水平的阳性皮革样品,每个样品测定9份平行样,计算方法的精密度,表1的结果表明,精密度实验RSD均小于3%。
2.6.2.3 方法的回收率
采用在实际样品中加标实测方式进行回收率实验,取2#样品27份,分为三组,每份约2 g(每份样品中含甲醛约54 μg),分别加入2、5、10 mL浓度为10.40 μg/mL的甲醛标准溶液,按照与样品同样的测试方法进行测定,计算回收率,每个添加水平测定9份平行样,实验结果见表2。
2.7 实际样品测试
对市售皮革制品进行测定,测试结果表明,部分样品中有甲醛残留,少数样品中甲醛含量还相当高,远远超出了限量要求。表3列出了部分阳性样品的测试结果,图3给出了阳性样品的HPLC图。
2.8 对比试验
选取不同甲醛含量水平的样品,按GB/T 19941-2005中比色法的规定进行对比试验。由于
光度法受提取液颜色干扰较大,因此为确保结果的准确性,用于对比试验的样品要求提取液基本无颜色。分别采用本方法和比色法对三个不同甲醛含量水平的样品进行9次平行样测试,结果见表4。从表4可以看出,对于甲醛含量较低的样品,色谱法的精密度明显好于光度法。
对采用这两种方法测得的数据进行t值检验,以判断这两种方法之间是否存在显著性差异。
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对于1#、2#、3#样品,其s、t分别为0.286,0.148;1.648,0.180;5.389,0.028。
查t分布表[16]:f=n1+n2-2=16时,若α=0.05,则tundefined=1.746。对于1#、2#、3#样品,其t值均小于tundefined。因此,这两种方法之间不存在显著性差异。
3 结论
甲醛与DNPH在酸性介质中发生化学反应,生成2,4-二硝基苯腙,采用超高效液相色谱对产物进行分析,从而建立了一种测定皮革中甲醛的液相色谱方法。采用该方法对实际样品进行了测定,并与分光光度法的测定结果进行了比较,结果表明这两种方法的测定结果间无显著性差异。
柱前衍生 篇2
介绍一种荧光试剂monobromobimane柱前衍生,反相高效液相色谱-荧光检测测定标准样品和植物组织中植物络合素(PCn)等巯基化合物的方法.结果表明,采用乙腈和0.1%三氟乙酸组成的.二元梯度洗脱程序,标准混合液中PCn等5种巯基化合物15 min内得到很好的分离.以谷胱甘肽为代表考察方法的精密度,在1.25～160 ng/μL浓度范围内与峰高有较好的线性关系,相关系数r2=0.999 9.谷胱甘肽的回收率平均为97.64%,40 d内的变异系数平均为2.21%.方法具有快速、灵敏、稳定性好、易于实施、同时测定PCn等多种巯基化合物等优点.通过该方法的应用,首次揭示Cd超积累植物东南景天对Cd的超量积累和解毒与PCn无关.
作 者：孙琴 叶志鸿 王晓蓉 黄铭洪 Sun Qin YE Zhi-hong WANG Xiao-rong Huang Ming-Hong 作者单位：孙琴,Sun Qin(污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京,210093;香港浸会大学资源与环境管理研究所,中国香港)叶志鸿,YE Zhi-hong(中山大学生命科学学院,广州,510275)
王晓蓉,WANG Xiao-rong(污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京,210093)
柱前衍生 篇3
1 材料与方法
1.1 供试材料
白茶样品为福鼎大白茶加工制成。
1.2 衍生化反应原理
一级氨基酸的衍生化反应邻苯二甲醛(OPA)与2-巯基乙醇(或巯基丙酸)联用,在常温下迅速同一级氨基酸发生定量反应,对每种氨基酸都生成唯一的有较强荧光和紫外吸收的异吲哚衍生物(不太稳定),反应方程式如下:
衍生化反应速度非常迅速,反应完全,且在室温下即可完成,容易实现自动化,自动化操作保证了衍生化的重复性,使用自动进样器便可完成衍生化反应的全部操作。OPA衍生化法提供了很好的重现性,衍生化反应不受水和盐类的影响。
1.3 分析方法
1.3.1 原料处理
准确称取磨碎好的白茶样品2g,放入样品瓶中,加入40ml 50%乙醇,水浴浸提30min后,冷却过滤,滤液用50%乙醇定容至50ml,作为进样样品备用。取1μl 0.4 mol/L硼酸缓冲溶液后洗针,吸入1μl样品(或标准品)后洗针,再吸入1μl OPA衍生试剂,空气混合15次后洗针、进样(均由自动进样器自动完成)。
1.3.2 色谱分析条件
安捷伦公司Agilent 1100 HPLC由四元泵,自动脱气装置,自动进样器,柱温控制器,二极管阵列检测器,色谱工作站等组成。氨基酸分析时OPA自动衍生。色谱柱:Hypersil ODS C18 4.6'250cm。起始流动相:A:93%;B:7%。梯度洗脱,并相应调整流速,如表1所示。流速:1～1.2 ml/min;检测波长:338 nm。
流动相的配制A相:称取结晶醋酸钠7.00 g,加纯水1000 ml;加入三乙胺110 ml,用5%冰醋酸调节pH=7.20±0.02;取出5 ml该溶液,加入5 ml四氢呋喃。混匀,用0.22 mm滤膜过滤。B相:称取结晶醋酸钠2.20 g,加HPLC甲醇400 ml;加入HPLC乙腈400 ml,用1～2%冰醋酸调节pH=7.20±0.02;混匀,用0.22 mm滤膜过滤。备用。
OPA (邻苯二甲醛)衍生试剂称取100 mg OPA,加入1 ml HPLC甲醇,加入100μg巯基丙酸,再加入9 ml 0.4mol硼酸缓冲溶液混匀。
氨基酸标准品配制取0.5 ml 2.5μmol/ml氨基酸标准品加入0.5 ml 2mg/ml茶氨酸标准品,于自动进样瓶中混匀。氨基酸标准品浓度为1.25μmol/ml,其中半胱氨酸浓度为0.625μmol/ml,茶氨酸浓度为1 mmg/ml。
1.3.3 定性和定量分析。
根据标样进行定性和定量分析
2 结果与分析
2.1 色谱图
图1是高效液相色谱检测游离氨基酸标准品的色谱图,图2是高效液相色谱检测白茶样品中游离氨基酸的色谱图,从图1、图2可以看出用OPA衍生HPLC测定白茶中的氨基酸组分可以得到很好的分离。
2.2 白茶样品中氨基酸分析
从色谱图看,该方法能够较好地分离氨基酸的组分,色谱图形较好。通过对检测结果与标准样品进行分析,鉴定出14种氨基酸(表2),出峰顺序为:天冬氨酸-谷氨酸-丝氨酸-组氨酸-甘氨酸-苏氨酸-丙氨酸-精氨酸-茶氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-蛋氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸,但未检测到标准样品中的谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸。氨基酸总量占茶叶干重的1.37%。含量最高的是茶氨酸,占氨基酸总量的66.96%;其次是精氨酸,占氨基酸总量的12.45%;接着是苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸等,它们的含量分别占氨基酸总量的5.42%、4.98%、3.22%。在所鉴定出的14种氨基酸中,含有7种人体必需氨基酸(赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸),占氨基酸总物;因为该衍生化反应速度非常迅速,反应完全,且在室温下即可完成,容易实现自动化,自动化操作保证了衍生化的重复
3 讨论
OPA氨基酸分析方法,其核心在于邻苯二甲醛(OPA)与巯基丙酸联用,在常温下迅速同一级氨基酸发生定量反应,对每种氨基酸都生成唯一的有较强荧光和紫外吸收的异吲哚衍生性。OPA的衍生化法提供了很好的重现性,衍生化反应不受水和盐类的影响。
该方法与朱旗等采用Waters公司生产的AccQ.Tag衍生方法经HPLC检测分析茶叶的游离氨基酸[8,10],在出峰顺序上面存在差异,这可能与所采用的色谱柱和衍生方法不同有关。
茶氨酸是一种神经递质,具有降血压、抗疲劳、抗肿瘤等功效[5,6,7]。本研究发现在茶叶中茶氨酸占总游离氨基酸的比例最高,同时还发现白茶中茶氨酸所占的比例比绿茶及速溶茶的含量均高[8,9,10]。茶氨酸的含量可能与采摘茶叶的嫩度、加工工艺和茶树品种有很大的关系,白茶中的白毫银针主要采摘刚刚生长出来的幼芽;并且白茶的加工过程不炒不揉,只经过萎凋和干燥两道工序,对茶叶的成分破坏少,故茶氨酸含量较高。本研究样品的游离氨基酸中人体必需氨基酸含量较高,长期饮用对人体大有裨益。
摘要：氨基酸是茶叶中重要化学成分,对茶叶品质有重要的影响。本试验采用OPA柱前衍生高效液相色谱法检测分析白茶中游离氨基酸的含量。在白茶中游离氨基酸总量占茶叶干重的1.37%,在样品中共检测出14种游离氨基酸,其中茶氨酸的含量最高,占氨基酸总量的66.96%,其次是精氨酸、苏氨酸、丝氨酸等。结果表明,用OPA柱前衍生高效液相色谱法是一种快速、简便检测白茶中游离氨基酸含量的方法。
关键词：OPA,HPLC,白茶,氨基酸
参考文献
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柱前衍生 篇4
丙戊酸钠为一线广谱抗癫痫药物, 因分子结构中没有能够产生紫外光谱吸收的结构, 用一般的HPLC法难于直接测定, 文献报道多用毛细管气相色谱法、酶联免疫法、荧光偏振免疫法等。目前应用较多的是“柱前衍生化高效液相色谱法检测丙戊酸钠的血清含量”, 为了开展丙戊酸钠临床血药浓度监测, 对文献[1,2]报道的柱前衍生化-高效液相色谱检测方法进行了综合, 经过改进的方法检测结果稳定、准确, 可以投入临床使用。
1 仪器及试剂
P230Ⅱ高效液相色谱仪 (大连伊利特分析仪器仪器有限公司) ; XW-80涡旋混合器 (上海精科实业有限公司) ;岛津AUW220D十万分之一天平。
色谱纯甲醇:天津凯通化学试剂有限公司生产;丙戊酸钠对照品 (湖南省湘中制药有限公司提供, 含量:99.8%, 批号090405) 环己烷羧酸 (美国Sigma公司, 批号:08265PD, ) ;ω-溴苯乙酮 (国药集团化学试剂有限公司, 批号:20090212) ;其它试剂均为分析纯。
2 方法及结果
2.1 色谱条件
色谱柱: Hypersil ODS2 C18 (4.6mm×250mm, 5μm) ;柱温:30℃;检测波长:248nm;流动相:甲醇:水 (75:25) ;流速:1.0mL·min-1;进样量:15μL。
2.2 试验溶液的制备
精密称取丙戊酸钠对照品37.6mg, 置50mL容量瓶中, 用0.2mol·L-1氨水稀释至刻度 (含丙戊酸钠0.752mg·mL-1) , 摇匀, 作为丙戊酸钠标准溶液。精密称取50.2mg环己烷羧酸, 置50mL容量瓶中, 用0.2 mol·L-1氨水溶解并稀释至刻度, 再精密量取该液5mL, 置25mL容量瓶中, 0.2mol·L-1氨水稀释至刻度, 摇匀, 作为内标溶液 (含环己烷羧酸0.2008mg·mL-1) 。精密称取125.4mg ω-溴苯乙酮, 置25mL容量瓶中, 用乙腈溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为衍生化试液 (含ω-溴苯乙酮5.016mg·mL-1) , 放置于冰箱中保存。
2.3 样品制备及衍生化
取200μL血清置空白采血管中, 加入30 μL内标溶液和20μL丙戊酸钠标准溶液, 再加入200μL 1mol·L-1的硫酸溶液, 振摇混匀, 然后加入4mL正己烷振摇萃取3min, 静置5min使充分分层, 分离出上清液2mL于另一试管中, 加入40μL衍生化试液和20μL三乙胺, 漩涡混匀, 于63℃水浴衍生10min, 然后在氮气流下蒸发至干, 立即取出, 用甲醇0.3mL漩涡溶解, 作为血清样品溶液。
2.4 色谱行为
在本实验条件下, 衍生试剂峰与丙戊酸钠及内标衍生物能很好地分离, 血清中无明显干扰峰。内标衍生物保留时间为7.00min, 丙戊酸钠衍生物保留时间为10.90min。色谱图见图1。
A 空白血清;B 血清+内标;C 血清+丙戊酸钠;D 血清+内标+丙戊酸钠。1 内标;2 丙戊酸钠
2.5 标准曲线的制作
按2.3项下方法, 分别制备8份样品溶液, 丙戊酸钠标准溶液加入量分别为:18.80、37.60、56.40、75.20、94.00、112.80、127.84、150.40μg·mL-1, 按色谱条件分别进样, 计算各自的标准浓度 (Y) 对其峰高与内标峰高比值 (X) 的线性回归, 其线性关系式为Y=86.852X+1.9179, r=0.9988, 线性范围为18.80μg～150.40μg·mL-1, 定量下限为18.80μg·mL-1。
2.6 精密度及回收率试验
按2.3项下方法, 分别制备高中低三个浓度 (94.00、75.20、56.40μg·mL-1) 血清样品溶液各5份, 连续测定3d, 以内标法计算其方法回收率及日内、日间精密度。结果见表1。
2.7 稳定性试验
2.7.1 衍生物稳定性试验
按2.3制备高、中、低三个浓度 (94.00、75.20、56.40μg·mL-1) 的样品溶液, 分别于0、24、48h时各进样2次, 以丙戊酸钠与内标峰面积比值计算RSD, 各样品RSD为:0.82%;0.82%;1.30%。说明样品在48h内检测, 结果稳定。
2.7.2 含药血清样品稳定性试验
取血清9mL , 分为高、中、低 (94.00、75.20、56.40μg·mL-1) 3个浓度组, 各组分别加入丙戊酸钠标准溶液375μL、300μL和225μL, 漩涡混匀, 置冰箱冷藏 (2～10℃) 保存, 然后于0、5、10d分别取血清200μL各5份, 各加入30μL内标溶液, 从加入200μL 1mol·L-1的硫酸溶液开始, 按2.3项下方法制备样品溶液。取水200μL , 从加入30 μL内标溶液开始按2.3项下方法制备对照品溶液。按2.1色谱条件分别检测对照品溶液和样品溶液, 记录色谱图。以内标法计算各样品回收率和各浓度回收率的RSD。结果, 高、中、低三个浓度样品回收率和RSD分别为95.44±7.65, RSD=8.02%;93.92±3.37, RSD=3.59%;99.32±3.81, RSD=3.83%;说明血清样品置冰箱 (2～10℃) 冷藏保存, 10d内检测, 结果稳定。
3 讨论
3.1 检测波长的确定
文献[1,2,3,4]报道检测波长有266、248、235和254nm, 本文作者在以甲醇为溶剂, 丙戊酸钠含量为0.752mg·mL-1于200nm～280nm进行紫外扫描, 上述各个波长处均有吸收, 当浓度减少为0.2mg·mL-1时, 266nm波长处吸收很小, 其他波长有吸收, 随着波长减小, 吸收度加大;当以同一浓度 (0.752mg·mL-1) 样品, 分别在266、248、235和254nm检测, 丙戊酸钠及环己烷羧酸峰高按248、254、235和266nm依次递减, 因而本文选择248nm作为吸收波长进行试验。
3.2 提取衍生溶媒的选择
文献报道提取衍生化溶媒有二氯甲烷[1]]和正己烷[2], 本文在用二氯甲烷作为溶媒, 在248nm检测时, 空白溶液在内标和丙戊酸钠保留时间处有吸收峰出现, 改变流动相比例不能使杂质峰分开;在266nm处, 空白、内标、丙戊酸钠和样品溶液均没有吸收峰出现, 可能是检测浓度较低所致。因而选用正己烷作为衍生化溶媒。
3.3 蒸干终点的确定
在接近蒸干时, 应注意随时观察, 发现已蒸干立即取出, 否则将会出现环己烷羧酸峰减小, 丙戊酸钠峰加大现象。
3.4 计算方法的确定
内标法计算血清样品浓度, 可以用峰高或峰面积[5]计算, 试验结果显示以峰高计算样品浓度较以峰面积计算样品浓度准确, 稳定, 因而采用峰面积计算样品含量。
3.5 衍生化试剂用量的确定
有报道[6]衍生化试剂用量为2.5～10倍, 本试验用量为7.33倍, 当小于7.33倍时, 线性关系试验中的高浓度部分会出现非理想峰高和峰形, 因而选用本实验用量。
参考文献
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柱前衍生 篇5
关键词：柱前衍生,高效液相色谱法,亚硝胺
亚硝胺是对含有N-N=O化合物的一类物质的统称,其具有较强的致癌性。亚硝胺类化合物的数量很大,而且多数亚硝胺化合物的致癌性都很强。现有研究表明,已经检测到的亚硝胺类化合物种类有300多种,有270种以上能够诱导至少1种动物癌症。食品中发现的亚硝胺主要为N-二甲基亚硝胺、N-二乙基亚硝胺、亚硝胺吡咯烷等。
目前,针对《食品中N-亚硝胺的检测标准(GB/T5009.26-2003)》中规定的标准检测方法为气相色谱-热能分析仪法和气相色谱-高分辨率质谱法。但气相色谱-热能分析仪法需要专用的热能检测器,高分辨率质谱仪价格昂贵,一般检测实验室较少配备。液相色谱法检测食品中亚硝胺虽有报道[1,2],但由于在紫外光的照射下会发生分解,造成检测结果的偏差。但液相色谱具有价格低廉、操作简便的优点,国内各级实验室都配备。在实际检测过程中,寻找一种应用高效液相色谱法测定食品中亚硝胺污染物的方法十分必要。本文通过丹磺酰氯衍生反应改变N-亚硝胺的结构,提高液相色谱对N-亚硝胺的选择性和灵敏度,建立了一套基于柱前衍生高效液相色谱测定肉制品中种亚硝胺的新方法,方法简单,适用性强,解决了各级食品检测实验室由于检测设备的限制而无法对这一类食品中的重要污染物进行监测的难题。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪,配荧光检测器。
标准储备溶液的配制:准确称取适量N-二甲基亚硝胺(NDMA)、N-二乙基亚硝胺(NDEA)、亚硝胺吡咯烷(NPIR)标准品0.100 0 g于100 m L棕色容量瓶中,用乙腈溶解并稀释定容至刻度,4℃冰箱中保存备用。
丹磺酰氯衍生试剂的配制:称取丹磺酰氯试剂1.00 g,用乙腈溶解并定容至100 m L容量瓶中。
脱亚硝基化试剂的配制:准确移取48%HBr O31.0 m L到10 m L容量瓶中,加冰醋酸稀释到刻度。
二氯甲烷、乙腈、正己烷均为色谱纯;其他试剂均为分析纯,试验用水为超纯水。
SPE柱的预处理:在6 m L SPE柱中装填Ambersorb 572填料1 500 mg,填料上下各垫一层玻璃棉,依次用正己烷10m L、二氯甲烷10 m L淋洗,抽干残留溶剂后再用纯水10 m L润洗,备用。
1.2 仪器工作条件
色谱柱:ODS-2 Hypersil C18柱(200×4.6 mm,5μm);柱温30℃;进样体积50μL;流速1.0 m L/min;流动相为乙腈-水(55∶45);检测波长:激发波长350 nm,发生波长530 nm。
1.3 试验方法
称取粉碎的样品200.0 g于500 m L水蒸气蒸馏装置的蒸馏烧瓶中,加入水100 m L及氯化钠120 g,充分振摇使氯化钠完全溶解,连接蒸馏装置,收集馏出液400 m L。馏出液过SPE柱,保持流速为6 m L/min[3]。
572柱萃取完成后,35 k Pa负压下抽干去除残余水分,用二氯甲烷7 m L将亚硝胺化合物洗脱下来。将洗脱液再过无水硫酸钠柱脱水后,用氮吹仪于40℃下浓缩至约100μL。将上述浓缩液转移到1.5 m L反应瓶中,加入脱亚硝基化试剂20μL,密封后置于100℃控温箱中进行脱亚硝基化反应10min。冷却至室温后,加入2 mol/L氢氧化钠溶液100μL,使之呈碱性,然后加入饱和碳酸氢钠溶液300μL进行缓冲,再加入丹酰氯溶液100μL,盖塞混匀后,于40℃恒温水浴振荡器内避光反应45 min。反应完毕后,用乙腈定容至5 m L,振荡混匀后,取适量溶液,用0.45μm有机滤膜过滤后待测。同时做空白试验。
2 结果与分析
2.1 脱亚硝基化反应
要将N-亚硝胺化合物结构中的N-NO键断开,需要脱亚硝基试剂(氢溴酸和冰醋酸的混合物),反应发生后,会产生相应的二级胺和NO自由基。根据文献[3]报道,在100℃下反应10 min可得到满意的结果,因此试验选取100℃和10 min作为脱亚硝基化反应的温度和时间。
2.2 衍生反应条件的优化
不同的衍生化反应物和反应条件对衍生化反应具有重要的影响。将N-二乙基亚硝胺的脱亚硝基化产物、二乙胺(DMA)应用在试验中,确定另一种反应物为丹磺酰氯,在不同的反应条件下进行试验,从而确定衍生化反应的条件。
2.2.1 反应温度的选择。
为了明确反应温度对试验效果的影响,进行了不同温度下的衍生化反应试验。试验设置的温度为20、30、40、60、80℃,反应物为二乙胺与丹磺酰氯,结果发现适当提高温度有利于提高衍生化反应的进行,反应在40℃时衍生物含量最大,继续升高温度对衍生物的生成量影响不大,甚至反而下降,这可能是由于温度过高导致其他副反应的产生,故选择40℃作为最佳反应温度。
2.2.2 反应时间的选择。
根据文献报道[4],丹磺酰氯与生物多胺的反应在放置过夜或在较短时间内适当加热均能反应完全,本文固定其他条件,测定在40℃时,二乙胺与丹磺酰氯在20~60 min内反应产物的影响,发现在40 min后衍生化产物的生成量基本稳定,故本试验选定45 min作为反应时间。
2.2.3 p H值对衍生反应的影响。研究表明[5],弱碱性的反应环境能够使丹磺酰氯衍生反应获得较好的效果,而溶液的酸碱性会随着N-亚硝胺脱亚硝基化反应的进行而逐渐改变,在试验结束后,溶液呈强酸性,要选择强碱对其进行中和。本试验过程中选择的强碱试剂为Na OH溶液,试剂的浓度为2 mol/L,由此来改变溶液的p H值,再加入300μL饱和Na HCO3组成缓冲溶液,以考察溶液p H值对反应的影响,结果表明加入100μL的2 mol/L Na OH溶液时的产率最高[6,7,8,9,10]。
2.3 色谱条件的优化
试验考察了乙腈-水和甲醇-水2种流动相对目标化合物的分离效果。结果表明,乙腈比甲醇的洗脱能力强,有更好的分离能力,使用甲醇作流动相时,目标化合物不仅保留时间长而且峰型较宽,试验选择乙腈和水作为流动相,当乙腈:水的比例为55∶45时,3种化合物峰型良好,且相互之间能够很好的分离。优化后的标样分离图谱见图1。
2.4 线性关系和检出限
将试验仪器按照试验设计进行设置,测定和绘制标准溶液。绘制标准曲线的过程中以浓度X(μg/L)、峰面积(Y)分别作为横纵坐标。结果表明,在0.5~50.0μg/L浓度范围内,3种亚硝胺化合物线性关系良好,线性相关系数均达到0.995以上,检出限均在0.2μg/kg(表1)
2.5 方法回收率与精密度
在某腌猪肉样品中分别加入3种亚硝胺化合物混合标准溶液,使其中亚硝胺的含量分别为2.0、20.0μg/kg,连续测定6次,计算回收率和相对标准偏差(RSD),结果见表2。可以看出,回收率和相对标准偏差均能满足分析得要求。
3 结论
本文建立了通过柱前衍生以高效液相色谱荧光检测的方法分析食品中N-亚硝二甲胺、N-亚硝二乙胺、N-亚硝吡咯烷污染物的新方法,该方法的线性范围及回收率均能满足分析的要求,可用于肉制品中亚硝胺污染物的检测分析。
参考文献
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柱前衍生 篇6
1 仪器与试药
安捷伦1100s、1200s高效液相色谱仪 (VWD、DAD检测器) ;METTLER AG135电子天平;Binder ED-53电热干燥箱;IKA圆周振荡器;TW20恒温水浴箱。
地龙注射液 (广东博罗先锋药业有限公司提供) ;地龙注射液广地龙阴性制剂 (广东博罗先锋药业有限公司提供) ;丙氨酸、缬氨酸、盐酸赖氨酸、异亮氨酸和亮氨酸对照品 (中国药品生物制品检定所, 140624-200805) ;6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯 (AQC) 、AQC稀释液和p H8.8硼酸盐缓冲液 (均为Waters公司提供) ;2, 4-二硝基氟苯 (DNFB) 为生化试剂;乙腈为色谱纯, 水为超纯水, 其他试剂均为分析纯。
2 AQC方法与结果
2.1 色谱条件[4]
色谱柱:Waters Acc Q-Tag column 3.9mm×150mm;柱温:37℃;检测波长:248 nm;流动相A:取醋酸钠19.04 g, 加超纯水1000 m L溶解, 用50%磷酸溶液调节p H值至5.2, 加0.1%乙二胺四醋酸二钠溶液1.0mL, 加三乙胺2.37 mL, 用磷酸调节p H值至4.95;流动相B:乙腈-水 (3∶2) ;梯度洗脱 (0 min, 100%A;0.5 min, 98%A;15min, 93%A;19 min, 90%A;32～33 min, 67%A;34～37 min 0%A;38min, 100%A) ;流速:1.00 m L/min。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取丙氨酸对照品45 mg、缬氨酸对照品20 mg、盐酸赖氨酸对照品16 mg、异亮氨酸对照品15 mg及亮氨酸对照品30 mg, 置同一50 mL容量瓶中, 加少量0.6 mol/L溶液溶解, 用水稀释至刻度。精密量取0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 mL, 置10 mL容量瓶中, 加水稀释至刻度, 制成5个浓度的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
量取地龙注射液5 m L, 置100 m L容量瓶中, 加水稀释至刻度, 摇匀, 即得。
2.4 阴性样品溶液的制备
取地龙注射液广地龙阴性制剂, 按供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。
2.5 衍生测定法[4]
精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μL, 分别置0.4cm×5cm的小管中, 加p H8.8硼酸盐缓冲液70μL, 混匀, 加入衍生试剂AQC溶液 (AQC试剂1瓶加AQC稀释液1mL, 置55℃电热干燥箱中使溶解, 即得) 20μL, 混匀, 置55℃电热干燥箱中加热10 min, 取5μL注入液相色谱仪, 测定各氨基酸的含量。
A.对照品溶液;B.供试品溶液;C.阴性样品溶液;1.衍生剂 (AQC) ;3.丙氨酸;4.缬氨酸;5.盐酸赖氨酸;6.异亮氨酸;7.亮氨酸
2.6 干扰试验
分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液, 依法进行衍生测定, 记录色谱图, 阴性样品溶液在各氨基酸相同的保留时间处未见色谱峰, 见图1。
2.7 线性关系考察
取2.2项下对照品溶液, 按2.5项下方法衍生, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 以峰面积Y对浓度X (μg·mL-1) 进行线性回归计算, 各回归方程为:丙氨酸Y=13.962X+10.033, r=0.9997;缬氨酸Y=11.993X+9.711, r=0.9996;盐酸赖氨酸Y=4.086X+11.970, r=0.9994;异亮氨酸Y=11.387X-0.054, r=0.9998;亮氨酸Y=11.778X-24.929, r=0.9995。各氨基酸在相应的范围内线性关系良好。
2.8 精密度试验
取2.2项下对照品溶液, 按2.5项下方法衍生后, 连续进样测定6次, 各氨基酸峰面积的RSD为0.5%～1.3% (n=6) 。
2.9 稳定性试验
取衍生后的供试品溶液 (批号101001) , 分别在0、1、2、4、8、16h进样测定各氨基酸的峰面积, 其RSD为0.8%～1.3% (n=6) , 表明衍生后的供试品溶液在16h内稳定性良好。
2.1 0 重复性试验
取同一批号的地龙注射液 (批号101001) , 依法制备6份供试品溶液, 衍生后进样, 各氨基酸含量的RSD为0.7%～1.1% (n=6) 。
2.1 1 加样回收率试验
精密称取丙氨酸对照品约22mg、缬氨酸对照品15mg、盐酸赖氨酸对照品13mg、异亮氨酸对照品18mg及亮氨酸对照品22mg, 分别置50mL量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀, 制成回收用对照品溶液。精密量取已知含量的地龙注射液 (批号101001) 2.5mL, 至100mL量瓶中, 再加入回收用对照品溶液各5mL, 加水稀释至刻度, 摇匀。按2.5项下方法衍生后测定, 计算回收率。结果见表1。
2.1 2 样品测定
取不同批号的地龙注射液, 依法测定, 按回归方程计算出各氨基酸的含量, 结果见表2。
3 DNFB方法与结果
3.1 色谱条件[5]
色谱柱:Kromasil C-18, 250mm×4.6mm, 5μm;柱温:40℃;检测波长:360nm;流动相A:N-N-二甲基甲酰胺—0.025mol/L醋酸钠 (1∶100, 用冰醋酸调节p H值至6.0) ;流动相B:乙腈;梯度洗脱 (0min, 90%A;60min, 57%A;70min, 90%A) ;流速:1.00m L/min。
3.2 对照品溶液的制备
精密称取丙氨酸对照品、缬氨酸对照品、异亮氨酸对照品、亮氨酸对照品及盐酸赖氨酸对照品各62.5mg, 置同一25mL容量瓶中, 加少量0.6mol/L溶液溶解, 用水稀释至刻度, 摇匀, 制成对照品母液。精密量取对照品母液0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0mL, 置10mL容量瓶中, 加水稀释至刻度, 连同对照品母液共制成6个浓度的对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备
直接取地龙注射液。
3.4 阴性样品溶液的制备
同2.4。
3.5 衍生测定法[5]
精密量取对照品溶液与供试品溶液各1mL, 分别置25mL量瓶中, 加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液2mL与1%2, 4-二硝基氟苯的乙腈溶液2.5mL, 置60℃水浴中60min, 取出, 放冷至室温, 加p H7.0磷酸盐缓冲液 (取磷酸二氢钾0.68g, 加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1mL, 用水稀释至100mL) 至刻度, 摇匀, 滤过, 取10μL注入液相色谱仪, 测定各氨基酸的含量。
A.对照品溶液;B.供试品溶液;C.阴性样品溶液;1.衍生剂 (DNFB) ;2.丙氨酸;3.缬氨酸;4.异亮氨酸;5.亮氨酸;6.盐酸赖氨酸
3.6 干扰试验
分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液, 依法进行衍生测定, 记录色谱图, 阴性样品溶液在各氨基酸相同的保留时间处未见色谱峰, 见图2。
3.7 线性关系考察
取3.2项下对照品溶液, 按3.5项下方法衍生, 注入液相色谱仪, 记录色谱图, 以峰面积Y对浓度X (mg·mL-1) 进行线性回归计算, 各回归方程为:丙氨酸Y=1603.1X+0.3826, r=0.9999;缬氨酸Y=1053.8X+3.039, r=0.9999;异亮氨酸Y=780.55X-6.833, r=0.9998;亮氨酸Y=1633.9X+6.442, r=0.9999;盐酸赖氨酸Y=397.66X-5.819, r=0.9998。各氨基酸在相应的范围内线性关系良好。
3.8 精密度试验
取3.2项下对照品溶液, 按3.5项下方法衍生后, 连续进样测定6次, 各氨基酸峰面积的RSD为0.7%～1.2% (n=6) 。
3.9 稳定性试验
取衍生后的供试品溶液 (批号101001) , 分别在0、1、2、4、8、16h进样测定各氨基酸的峰面积, 其RSD为0.5%～1.1% (n=6) , 表明衍生后的供试品溶液在16h内稳定性良好。
3.1 0 重复性试验
取同一批号的地龙注射液 (批号101001) , 依法制备6份供试品溶液, 衍生后进样, 各氨基酸含量的RSD为0.4%～1.0% (n=6) 。
3.1 1 加样回收率试验
精密称取丙氨酸对照品约44mg、缬氨酸对照品28mg、异亮氨酸对照品35mg、亮氨酸对照品44mg及盐酸赖氨酸对照品28mg, 置50mL量瓶中, 加水溶解并稀释至刻度, 摇匀, 制成回收用对照品溶液。精密量取已知含量的地龙注射液 (批号101001) 0.5mL, 至25mL量瓶中, 再精密加入回收用对照品溶液0.5ml, 按3.5项下方法衍生后测定, 计算回收率, 结果见表3。
3.1 2 样品测定
取不同批号的地龙注射液, 依法测定, 按回归方程计算出各氨基酸的含量, 结果见表4。
4 讨论
地龙注射液现行标准[6]的含量测定法是采用薄层扫描法测定缬氨酸的含量。薄层色谱由于其定量准确度低、耗时长及仪器限制, 已逐渐被其他方法取代。而高效液相色谱法因其定量准确、重复性好、分析快速等优点, 应用越来越广泛, 技术也越来越成熟。采用柱前衍生高效液相色谱法测定地龙注射液的含量, 可以同时测定多个氨基酸, 既加强了质量控制, 又实现了准确度高的快速测定, 更有利于推广应用。
本文采用Waters公司的AQC法, 衍生反应速度快, 并可在35min内完成地龙注射液中多个氨基酸的分离测定, 是一种简便、高效的测定方法。另外由于使用的色谱柱和衍生试剂盒均来自Waters公司, 其准确度和重现性也大大提高。但也因此, AQC法的经济成本比其他方法要高一些, 甚至需要配备Waters公司的液相色谱仪, 这在一定程度上限制了其在中小型实验室的应用。
本文建立的另一种方法DNFB法也适用于地龙注射液中的氨基酸测定。与AQC法相比, 其同样色谱分离时间较短, 分析结果的准确性、重复性均较好。由于其不需要特殊指定的仪器、色谱柱和试剂, 应用起来更加方便、经济。DNFB法的主要缺点是衍生时间过长;衍生试剂DNFB熔点低, 室温下即熔融, 影响操作;使用不同填料的C18色谱柱可能会导致结果偏差等。
从测定结果看, AQC法和DNFB法可以得到较为一致的结果, 说明两种方法没有显著差异, 均可用于地龙注射液的氨基酸含量测定。实际应用中可以根据情况选择其中一种方法进行。另外, 对于工艺和质量相对稳定的样品, 可以将本文的标准曲线 (回归方程) 测定法改成外标法, 使用一个浓度相当的对照品溶液即可。
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柱前衍生 篇7
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
HPLC-1260液相色谱仪(美国安捷伦公司),固相萃取仪(美国Supelco公司),固相萃取柱(美国安捷伦公司),高速离心机(中国湘仪离心机有限公司),涡旋混匀器(美国Scientific Industries公司),食品粉碎机(中国欧科电器公司)。草甘膦标准溶液:100μg/ml,购自于农业部环境保护科研监测所。甲醇(色谱纯,德国Merck公司);0.25μm水系滤膜(天津东康科技有限公司);实验室用水为Millipore超纯水。
1.2 方法
1.2.1 溶液配制
草甘膦标准溶液:准确移取100μl的草甘膦农药标准品,用纯水做溶剂,配制成10μg/ml储备液,-20℃保存。使用时根据草甘膦对应响应值,吸取适量储备液,用甲醇配制成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 ng/ml的系列标准溶液,供高效液相色谱测定。FMOC-Cl丙酮溶液(1.0 g/L):称取100 mg FMOC-Cl用丙酮溶解并定容至100 ml,临用现配。5%硼酸盐缓冲溶液(p H=9):称取5 g硼酸钠,用水溶解并定容至100 ml,于4℃下保存。
1.2.2 样品处理
①试样制备:采集市场有代表性的6种茶叶样品,取可食部分,经缩分后,切碎,充分混匀后放入食品粉碎机粉碎,制成待测样品。分装后置于-20℃下保存,待提取。②提取:称取25 g(精确到0.01 g)捣碎的茶叶样品,加入50 ml纯水,高速匀浆2 min。试样转移至具塞离心管中,5 000 r/min离心10 min(离心半径5 cm),收集上清液,待衍生。③衍生化:取茶叶提取液1 ml于进样瓶中,加入200μl硼酸钠溶液,混匀,加入200μl FMOC-Cl衍生液,混匀,室温放置2 h。将C18固相萃取小柱分别用3 ml甲醇和3 ml水活化。将样液过活化后的C18固相萃取小柱,常压下收集初滤液,用1 ml甲醇-水(70∶30,体积分数)溶液洗脱,洗脱液与初滤液合并,过0.25μm滤膜,待分析。标准系列处理方法同上。
1.2.3 色谱参考条件
(1)色谱柱:分析柱,C18,4.6 mm×25 cm,5μm;预柱,C18预柱,4.6 mm×4.5 cm。(2)柱温:35℃。(3)荧光检测器,激发波长265 nm;发射波长315 nm。(4)流动相:甲醇-水(70+30)。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件优化
2.1.1 流动相的选择
本实验以甲醇-水为流动相,以甲醇与水混合溶液的体积比(分别为70∶30、50∶50、40∶60)为条件进行测试,甲醇比例较低时,保留时间延长,灵敏度降低,结果表明甲醇-水体积比为70∶30时,样品的出峰时间、峰形、灵敏度较适宜。另外,实验中采用乙酸铵-甲醇作为流动相进行测试,结果发现乙酸铵-甲醇流动相分离效果不如相同比例的甲醇-水。
2.1.2 柱温的选择
研究中固定其他色谱条件,将色谱柱温度从20升至40℃,结果显示草甘膦保留时间逐渐提前,为有效确证柱效及色谱柱使用寿命,方法采取柱温35℃。
2.1.3 检测波长选择
取草甘膦标准使用液在1.2.3条件下进样,分别采取多发射和多激发模式在波长200~900 nm范围内对草甘膦进行扫描,结果发现草甘膦分别在激发波长265 nm(图1)和发射波长315 nm处最强(图2)。故方法选定320 nm为发射波长,285 nm为激发波长。
2.2 衍生条件的优化
实验中分别配制质量浓度为1、5、10、15、20、25 g/L的FMOC-Cl丙酮溶液和质量浓度为10、20、30、40、50 g/L的硼酸钠缓冲溶液,对二者对草甘膦的衍生效果影响进行试验。结果表明,当FMOC-Cl丙酮溶液质量浓度为20 g/L和硼酸钠缓冲溶液质量浓度为50 g/L时衍生效果最好。在20 g/L FMOC-Cl丙酮溶液和50 g/L硼酸钠缓冲溶液浓度下,对草甘膦分别进行1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0、15.0 h衍生试验,结果发现在衍生时间为2 h时,衍生反应达到平衡。
2.3 固相萃取条件优化
实验根据文献方法采用C18固相萃取柱[22],对影响萃取的主要条件是洗脱条件进行研究。分别采用甲醇-水(90+10,体积分数)、甲醇-水(70+30,体积分数)和甲醇-水(50+50,体积分数)进行洗脱,结果证明采用甲醇-水(70+30,体积分数)可以较好地洗脱目标化合物,同时避免衍生副产物干扰。固相萃取过程中发现初滤液含有较多目标化合物,故实验中需收集初滤液。经固相萃取后两者色谱峰实现较好的分离(图3),避免了未萃取时两峰重叠现象(图4)。
2.4 线性范围及检出限
草甘膦储备液用水稀释配制成1.0μg/ml的标准溶液,配制草甘膦标准工作液系列,按方法的实验条件进样,在上述色谱条件下测定,以峰面积(A)对待测物浓度(X,ng/ml)进行线性回归。结果表明在0.5~20.0 ng/ml的标准溶液浓度范围内,草甘膦浓度与响应值有良好的线性关系(图5),其回归方程为:Y=1.005X-0.032 8;相关系数:r=0.999 7。根据色谱响应值S/N≥3标准计算,草甘膦最低检出浓度为0.02 mg/kg。
2.5 方法的回收率与精密度
精密称取阴性茶叶样品进行低浓度的加标回收试验,结果见表1。该阴性样品中加标1.00、2.00、5.00μg/kg,回收率在89.4%~98.9%之间,RSD在4.26%~13.63%之间。
注:以草甘膦标准溶液10.0μg/ml,连续进样6次,每次10μl,测得草甘膦平均峰面积为10.26,RSD为0.108%。
2.6 茶叶监测应用
用本方法对采自本市茶叶专卖店及超市等不同地方的共12份样本进行了检测,结果显示全部样品草甘膦含量均低于检出限。
3 结论
本研究建立了柱前衍生-固相萃取-高效液相色谱法测定茶叶中草甘膦。通过一系列的衍生条件优化得知:该方法操作简单,衍生反应时间短,灵敏度高,而且衍生产物稳定,反应重复性好,HPLC色谱分离条件简单,适用于基层单位开展草甘膦的监测分析。
作者声明
本文无实际或潜在的利益冲突
摘要：目的 建立快速、准确的茶叶中草甘膦的柱前衍生-固相萃取-高效液相色谱荧光测定方法。方法 茶叶提取液样经衍生后经固相萃取,在C_(18)色谱柱上,以甲醇/水(70+30,体积分数)为流动相,流速1.0 ml/min,荧光检测激发波长为265 nm,发射波长为315 nm。结果 草甘膦的加标回收率在89.4%~98.9%之间,其相对标准偏差在4.26%~13.63%之间,在0.5~20.0 ng/ml范围内呈现良好的线性,其回归系数>0.999,最低定量检出限(LOQ)为0.02 mg/kg。结论 该方法回收率高,净化效果好,杂质干扰少,可满足茶叶中痕量草甘膦的残留检测要求。
柱前衍生 篇8
1 材料与方法
1.1 仪器
美国Waters 2695高效液相色谱仪,二极管阵列检测器,分析天平(感量0.1 mg),电热干燥箱,电热恒温水浴箱。
1.2 试剂
L-羟脯氨酸(美国Sigma公司,纯度≥99.0%);甲醇、乙腈为HPLC级;苯酚(重蒸);1 mol/L三乙胺;0.1 mol/L盐酸;0.2 mol/L异硫氰酸苯酯;0.05 mol/L乙酸钠;实验用水为18.2 MΩ。
1.3 材料
30 ml蛋白水解管;20 ml玻璃具塞刻度试管;2 ml样品瓶;1.5 ml塑料离心管;0.22 μm针式过滤器(有机系)。
1.4 方法
1.4.1 标准溶液配制
准确称取0.100 0 g L-羟脯氨酸,用0.1 mol/L盐酸溶液溶解定容至100 ml,制成浓度为1 000 mg/L的储备液。将储备液用0.1 mol/L盐酸溶液稀释至浓度为100 mg/L标准使用液。分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 ml L-羟脯氨酸使用液于10 ml容量瓶中,用0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度,浓度分别为0、2、4、6、8和10 mg/L。
1.4.2 样品处理
称取混匀后乳粉样品0.100 0 g (或鲜乳0.680 0 g)于蛋白水解管中,加10 ml含有0.1%苯酚的6 mol/L盐酸溶液,旋紧盖子,振荡混匀,110 ℃下反应24 h。反应完毕,趁热将水解产物用滤纸过滤至蒸发皿中,用10 ml 0.1 mol/L盐酸溶液分3次洗涤水解管及滤纸,合并滤液至蒸发皿中,在75 ℃以下水浴中至近干,用约12 ml 0.1 mol/L盐酸溶液分3次溶解残渣,并转移到20 ml具塞玻璃试管中,再用纯水定容至20 ml,待衍生。
1.4.3 衍生
取各浓度标准溶液0.2 ml,分别置于1.5 ml塑料离心管中,加入0.1 ml 1 mol/L三乙胺和0.1 ml 0.2 mol/L异硫氰酸苯酯,混匀,室温反应1 h,加0.4 ml正己烷,盖紧盖子后剧烈振摇5～10 s,静置分层,取下层溶液0.2 ml加0.8 ml水混合,经0.22 μm针式过滤器过滤后,供HPLC测定。样品水解液同法衍生后测定。
1.4.4 色谱条件
色谱柱:SunFireTM C18,250 mm×4.6 mm(5 μm);流动相A:乙酸钠0.05 mol/L(pH 6.5);B:乙腈(60) ∶甲醇(20) ∶水(20)。采用梯度洗脱程序,流动相B洗脱程序为0～15 min,7%～45%;15～16 min,45%～100%;16～22 min,100%;22～23 min, 100%～7%;23～30 min,7%。流速为1.0 ml/min,柱温为35 ℃,进样量为20.0 μl,检测器为Waters 2996 PDA,波长为254 nm。
2 结果
2.1 梯度洗脱条件的确定
以乙腈(60):甲醇(20):水(20) 为流动相B,乙酸钠0.05 mol/L(pH 6.5) 为流动相A,采用梯度洗脱程序,比较流动相配比对分离效果的影响。试验结果表明,当初始流动相B为5%时,峰型对称性差,出峰时间长。将初始流动相B的比例升至7%比较合适,以后逐渐增加流动相B的比例,得到较好的分离效果。见图1。
2.2 方法的线性范围检出限
以L-羟脯氨酸浓度C (mg/L)为横坐标,以峰面积均值Y为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明,L-羟脯氨酸在2～10 mg/L范围内,线性关系良好,回归方程为Y=14 943 C+2 473,相关系数r=0.999 7。本方法下,以3倍信噪比S/N=3,计算出检出限为0.07 mg/L。根据取样量计算方法检出限分别为液体乳2.0 mg/kg,乳粉14 mg/kg。
2.3 方法的精密度
分别配制高(9.0 mg/L)、中(5.0 mg/L)、低(1.0 mg/L)3个浓度的标准溶液,各取20.0 μl进样6次,高浓度相对标准偏差(RSD%)为0.4%,中浓度RSD%为0.6%,低浓度RSD为0.9%。
2.4 加标回收试验
称取经测定未检出L-羟脯氨酸的同一鲜乳样品18份,每份0.680 0 g,分别加入高(8.0 mg/L)、中(5.0 mg/L)和低(2.0 mg/L)3个浓度的标准溶液,按1.4.2及1.4.3所述方法进行处理,上机测定。低浓度组平均回收率为100.3%(n=6),RSD为3.0%;中浓度组平均回收率为96.8%(n=6),RSD为4.0%;高浓度组平均回收率为95.0%(n=6),RSD为3.8%。结果见表1、图2、图3。
3 讨论
本方法以异硫氰酸苯酯为衍生剂,鲜乳的检出限为2.0 mg/kg,乳粉的检出限为14 mg/kg。加标平均回收率为95.0%～100.3%,方法精密度为0.4%～4.0%。本方法具有样品处理简单、灵敏度高、回收率高、分析时间短等优点。适用于鲜乳及乳粉中羟脯氨酸含量测定。
参考文献
[1]金苏英,林笑容,赵志红,等.高效液相色谱法测定奶粉及其他乳制品中的L-羟脯氨酸[J].检测与分析,2009,12(7):28-30.
[2]李景红,孟祥晨.高效液相色谱法检测牛乳中掺加的胶原水解蛋白[J].中国乳品工业,2008,36(11):56-59.
[3]田艳玲,孙妍,陈婧,等.乳与乳制品中动物水解蛋白L-羟脯氨酸测定法[J].中国乳品工业,2009,37(6):49-50.