自然衰老大鼠

自然衰老大鼠（精选8篇）

自然衰老大鼠 篇1

衰老是生物体各种功能普遍衰弱,以及抵抗环境伤害和恢复体内平衡能力降低的过程[1]。近年来,全球老年人口比重迅速上升[2],探索衰老机理,延缓衰老、防治与衰老相关的疾病、提高老年人的生活质量,对全球的经济发展和卫生事业将带来重大的影响。本研究采用自然衰老大鼠模型,观察温和灸“肾俞”穴对自然衰老大鼠肝组织原癌基因Rb(Rb)、原癌基因P53(P53)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、蛋白激酶C(PKC)表达的影响,以期进一步探讨艾灸延缓衰老的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由上海中医药大学实验动物中心提供的2月龄雄性清洁级SD (Sprauge-Dawley)大鼠共24只,SPF级,体重(160±20)g,适应性饲养1周后,随机分为正常组8只、自然衰老组8只、艾灸组8只。

1.2 主要试剂与仪器

Rb原位杂交试剂盒、P53原位杂交试剂盒、Bcl-2原位杂交试剂盒、PKC原位杂交试剂盒、羊抗兔SABC试剂盒、羊抗小鼠SABC试剂盒、兔抗大鼠Rb多克隆抗体、小鼠抗大鼠P53单克隆抗体、小鼠抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、小鼠抗大鼠蛋白酶C单克隆抗体、DAB显色试剂盒等选用武汉博士德生物工程有限公司产品;仪器包括恒温杂交炉(OLS 200)、显微镜(OLYMPUS BH2)、Motic图像分析系统(麦克奥迪实业集团有限公司)。

1.3 造模方法

SD大鼠适应性饲养1周后,在SPF级环境设施中正常饲养20个月,待其自然进入衰老期[4]。

1.4 分组与处理

正常组:正常情况下饲养9周。

自然衰老组:正常情况下饲养20个月。

艾灸组:温和灸肾俞穴[3],每日1次,每次5分钟,5次为一疗程,每疗程结束后休息2天,再进行下一疗程,共治疗20个月。

1.5 标本采集

实验结束后处死各组大鼠,摘取肝脏,分别置于液氮或10%中性甲醛固定液中保存备用。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 原位杂交方法检测大鼠肝组织Rb、P53、Bcl-2、PKC mRNA的表达

原位杂交探针由复旦科技有限公司合成。引物序列、探针长度见表1。Rb、P53、Bcl-2、PKC mRNA原位杂交检测按试剂盒说明书进行。

阴性对照:以预杂交液代替杂交液,并完成整个过程。

棕黄色为阳性信号,阴性对照无阳性着色。每张片子随机采集3个视野,运用MOTIC图象分析系统对阳性表达面积和阳性表达光密度进行分析。

1.6.2 免疫组化方法检测大鼠肝组织Rb、P53、Bcl-2、PKC的蛋白表达

Rb、P53、Bcl-2、PKC蛋白免疫组化检测按试剂盒说明书进行。

阴性对照:以抗体稀释液代替第一抗体孵育,并完成整个操作。

棕黄色为阳性信号,阴性对照无阳性着色。每张片子随机采集3个视野,运用MOTIC图象分析系统对阳性表达面积和阳性表达光密度进行分析。

1.7 统计学处理

各组均值以表示,应用SPSS 11.0统计软件,进行单因素方差分析,不符合方差分析条件的,采用秩和检验。

2 结果

2.1 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Rb mRNA表达的影响

表2、图1显示,自然衰老组大鼠肝组织Rb mRNA阳性表达面积和阳性表达光密度均显著高于正常组(P<0.01),艾灸组肝组织Rb mRNA阳性表达面积显著低于自然衰老组(P<0.01),但未达到正常水平(与正常组比较P<0.05)。艾灸组肝组织Rb mRNA阳性表达光密度也显著降低(P<0.01),且与正常组比较无显著性差异(P>0.05)。

2.2 温和灸对自然衰老大鼠肝组织P53 mRNA表达的影响

表3、图2显示,自然衰老组大鼠肝组织P53 mRNA阳性表达面积和阳性表达光密度均显著高于正常组(P<0.05,P<0.01),艾灸组大鼠肝组织P53 mRNA阳性表达面积与阳性表达光密度均显著低于自然衰老组 (P<0.05,P<0.01),但均未达到正常水平(P<0.05,P<0.01)。

注:与正常组比较:aP<0.05,bP<0.01;与自然衰老组比较:cP<0.01

注:与正常组比较:aP<0.05,bP<0.01;与自然衰老组比较:cP<0.05,dP<0.01

2.3 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Bcl-2 mRNA表达的影响

表4、图3显示,自然衰老组大鼠肝组织Bcl-2 mRNA阳性表达面积和阳性表达光密度均显著低于正常组(P<0.01),艾灸组大鼠肝组织Bcl-2 mRNA阳性表达面积显著高于自然衰老组(P<0.01),但未达到正常水平(与正常组比较P<0.05)。艾灸组大鼠肝组织Bcl-2 mRNA阳性表达光密度也显著增强(P<0.01),且与正常组比较无显著性差异(P>0.05)。

注:与正常组比较:aP<0.05,bP<0.01;与自然衰老组比较:cP<0.01

2.4 温和灸对自然衰老大鼠肝组织PKC mRNA表达的影响

表5、图4显示,自然衰老组大鼠肝组织PKC mRNA阳性表达面积和阳性表达光密度均显著低于正常组(P<0.01),艾灸组大鼠肝组织PKC mRNA阳性表达面积与阳性表达光密度均显著高于自然衰老组(P<0.01),但均未达到正常水平(P<0.01,P<0.05)。

注: 与正常组比较:aP<0.05,bP<0.01; 与自然衰老组比较:cP<0.01

2.5 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Rb蛋白表达的影响

表6、图5显示,自然衰老组大鼠肝组织Rb蛋白阳性表达面积和阳性表达光密度均显著高于正常组(P<0.01),艾灸组大鼠肝组织Rb蛋白阳性表达面积和阳性表达光密度均显著低于自然衰老组(P<0.01),但与正常组比较仍有显著性差异(P<0.01)。

注:与正常组比较:aP<0.01;与自然衰老组比较:bP<0.01

2.6 温和灸对自然衰老大鼠肝组织P53蛋白表达的影响

表7、图6显示,自然衰老组大鼠肝组织P53蛋白阳性表达面积和阳性表达光密度均显著高于正常组(P<0.01),艾灸组大鼠肝组织P53蛋白阳性表达面积与阳性表达光密度均显著低于自然衰老组(P<0.01),但与正常组比较仍有显著性差异(P<0.01)。

注: 与正常组比较:aP<0.01,与自然衰老组比较:bP<0.01

2.7 温和灸对自然衰老大鼠肝组织Bcl-2蛋白表达的影响

表8、图7显示,自然衰老组大鼠肝组织Bcl-2蛋白阳性表达面积和阳性表达光密度均显著低于正常组(P<0.01),艾灸组大鼠肝组织Bcl-2蛋白阳性表达面积与阳性表达光密度均显著高于自然衰老组(P<0.01),但均未达到正常水平(P<0.01)。

注:与正常组比较:aP<0.01,与自然衰老组比较:bP<0.01

2.8 温和灸对自然衰老大鼠肝组织PKC蛋白表达的影响

表9、图8显示,自然衰老组大鼠肝组织PKC蛋白阳性表达面积和阳性表达光密度均显著低于正常组(P<0.01),艾灸组大鼠肝组织PKC蛋白阳性表达面积与阳性表达光密度均显著高于自然衰老组(P<0.01,P<0.05),但均未达到正常水平(P<0.05,P<0.01)。

注:与正常组比较:aP<0.05,bP<0.01;与自然衰老组比较:cP<0.05,dP<0.01

3 讨论

衰老的发生由多种信号触发所致,肿瘤抑制基因是其中之一[4,5,6,7]。研究显示:Rb、P53、Bcl-2、PKC与衰老关系密切。Rb、P53是一类负性细胞周期的调控蛋白,为延缓衰老的负相调控因子,抑制细胞增殖,使细胞停滞于G1期,参与细胞周期分裂、衰老与凋亡。在衰老的细胞中,Rb仅以其活性的低磷酸化的生长抑制形式存在[8]。P53是序列特异性转录调控因子,通过直接或间接的方式活化或抑制其靶基因,介导细胞的生长停滞或凋亡。P53 mRNA较高水平表达于衰老细胞[9,10,11,12]。有学者研究发现Rb/P53细胞转导通路相关基因及蛋白在衰老大鼠睾丸组织发生明显改变,衰老大鼠睾丸组织P53、Rb基因表达明显高于正常对照组(P<0.01)[13]。本研究结果显示,自然衰老大鼠肝组织Rb、P53 mRNA及蛋白表达均显著高于正常组,Rb、P53 mRNA及蛋白表达与衰老呈负相关;艾灸组(温和灸20个月)大鼠肝组织Rb、P53 mRNA及蛋白表达均显著低于自然衰老组,提示温和灸可抑制衰老大鼠肝组织Rb、P53 mRNA及其蛋白的表达。

Bcl-2、PKC为延缓衰老的正相调节因子,参与细胞的增殖、分化、存活与衰亡的调控。Bcl-2多位于细胞内氧自由基产生较多的位置,如线粒体、内质网和核膜等,与细胞的抗氧化自我保护关系密切。Bcl-2对各种刺激诱导的凋亡有阻抑效应,又称为长寿基因,通常被作为衰老检测的参数指标[14]。在衰老细胞里,Bcl-2表达降低[15,16,17]。有实验表明Bcl-2的过量表达能使多种造血细胞在去除生长因子后寿命延长[18]。PKC广泛分布于哺乳动物的器官、组织和细胞中,参与多种细胞活动调控[19]。活化的PKC能使蛋白质底物上的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化,是细胞内信号传导过程中的关键分子之一。在衰老细胞内,PKC的功能失调[20,21],在细胞衰老的发生发展中起着决定性的作用[22]。本研究中,自然衰老大鼠肝组织Bcl-2、PKC mRNA及蛋白表达均显著低于正常组;艾灸组(温和灸20个月)大鼠肝组织Bcl-2、PKC mRNA及蛋白表达均显著高于自然衰老组,提示温和灸可促进衰老大鼠肝组织Rb、P53 mRNA及其蛋白的表达。

综上所述,本文研究结果提示:自然衰老大鼠肝组织Rb、P53 mRNA及其蛋白表达升高,Bcl-2、PKC mRNA及其蛋白表达降低。温和灸能抑制Rb、P53 mRNA及其蛋白的表达,促进Bcl-2、PKC mRNA及其蛋白的表达,这可能是温和灸延缓衰老的途径之一。

莫把自然衰老当成老年痴呆症 篇2

咋判断“老忘事”是老年痴呆症

老年痴呆症即阿尔茨海默病，是一种起病隐匿的神经系统退行性疾病，主要表现为认知功能下降、精神症状和行为障碍、日常生活能力的逐渐下降等。

“老忘事”是比较常见的记忆力衰退症状。很多人老了以后记忆力衰退，这是一个正常的现象，但是记忆力衰退也是老年痴呆症的重要临床症状。那么基层医生怎么分辨正常的衰老和老年痴呆症呢？这里有个简单的判断方法。

早期阶段，老年痴呆症和正常衰老的老年人很相似，都容易忘事，比如前面讲的事情马上就忘了，接了个电话后忘记刚才说了什么，东西放在哪里转眼就忘掉了。但是对于老年痴呆症患者来说，随着时间推移，这种现象的频次会越来越多。而正常衰老，随着时间推移变化并不明显。其次，老年痴呆症患者事后回忆不起来之前说过的话、做过的事，但正常衰老者事后是可以回忆起来的。

对高危人群进行早期干预

目前，我国正快速进入老龄化社会，老年痴呆症患者日益增多，患者人数目前已经超过800万。然而，有关调查数据显示，老年痴呆症患者就诊率不足1/3。如此低的就诊率，与公众教育水平、家属认知度等密切相关，在某种程度上也与基层医生诊断水平有一定的关系。

在正常老年人和老年痴呆症患者之间，还有一个群体名叫“轻度认知障碍人群”。对这一人群进行临床评估的时候，达不到痴呆诊断标准，但已开始出现与老年痴呆症相关的症状。可以说，轻度认知障碍人群是老年痴呆症的高危人群。

对轻度认知障碍人群早期发现并进行早期干预，能降低老年人罹患老年痴呆症的风险，或者推迟发生老年痴呆症的速度。早期干预手段有很多，比如运动训练，可以通过慢跑、打球、游泳等适合老年人的运动方式，也可通过智力训练，如智力游戏等训练。

目前治疗老年痴呆症的药物主要有胆碱酯酶抑制剂和谷氨酸受体拮抗剂。但调查显示，超过一半的公众认为老年痴呆症不需要用药，只需要智力训练即可，或者认为反正治不好而放弃治疗，这些观点都是错误的。

自然衰老大鼠 篇3

关键词：海马神经元,衰老,衰老相关的β半乳糖苷酶

衰老相关的β半乳糖苷酶(Senescence associated β-galactosidase,SA-β-GAL)是目前被广泛采用的一种生物学标记物,它在衰老细胞中表达升高,因此成为鉴定细胞衰老的一个标志[1,2]。值得提出的是,有些衰老的生物学标记并不具有普遍性,SA-β-GAL作为一个衰老的生物学标记在体外检测复制衰老的细胞已经得到了广泛的认可[3],但其是否能够用于检测衰老神经元,目前尚未得到证实,因此在应用上应加以验证。目前对衰老细胞的研究,衰老细胞从形态学上表现为细胞变大,变扁平[4],然而在除此以外还有端粒变短,细胞周期停滞等特征,而鉴于神经元属于静止细胞,因此在衰老细胞鉴定生物学标记的选择时具有特异性,本研究拟对培养不同天数的海马神经元进行SA-β-GAL染色,从而鉴定衰老的海马神经元,同时验证SA-β-GAL在海马神经元应用的可靠性。

1材料与方法

1.1海马神经元原代培养

分别取6月龄及18月龄雄性SD大鼠各2～3只,进行海马神经元原代培养。取海马组织:全身75%酒精消毒,断头取脑,将整个脑组织置于冷的HBSS(无Ca2+Mg2+)平衡液中,利用弯头玻璃棒将两侧海马完整取出。HBSS液洗4次,去除混杂的血管和血液。胰酶消化:用剪刀将海马组织剪成1mm3的小块,用HBSS洗4次,0.25%的胰酶37℃消化15min。终止消化:加入终浓度为10%的胎牛血清孵育5min终止消化,随后用HBSS洗4～5次去除残留的胎牛血清。吹打细胞:在15mL离心管中加入5mL Neurobasal A用Pasteur管吹打组织碎块,将浑浊的上清液收集到另一个15mL离心管中,200g离心10min,弃上清。接种细胞:沉淀用Neurobasal A液加B27重悬,在24孔板中接种在100mg/mL poly-L-lysine处理过的盖玻片上,密度约5～8×105cells/mL,在37℃,5%CO2培养箱中培养。在培养第五天加入10mmoL阿糖胞苷抑制胶质细胞和纤维母细胞生长,从接种第六天起可进行实验。

1.2SA-β-GAL的细胞化学检测

分别取细胞接种后第6d、10d和14d的培养神经元在4%的多聚甲醛中室温固定15min,-20℃保存。接种细胞的盖玻片在室温下放置约30min,用X-Gal洗液(100mM磷酸钠;2mM MgCl2;0.01%脱氧胆酸钠)洗三次,每次15min,用X-Gal染液(100mM磷酸钠,2mM MgCl2,150mM氯化钠,0.01%脱氧胆酸钠,0.02% NP-40,5mM铁氰化钾,5mM亚铁氰化钾,1mg/mL X-gal)在37℃避光16～18h,PBS清洗3次,0.1%核固红室温复染20min。晾干后中性树胶封片,光镜下观察,拍片,计数。

2结果

SA-β-GAL阳性率均随着培养时间延长而增加,在培养6d的神经元SA-β-GAL阳性表达较少,而在10d和14d的神经元中表达明显增加(p<0.001),同时培养10d的18月龄组比6月龄组阳性率明显增加(p<0.05),然而在培养14d时两组阳性率差别不明显,表1所示。

**与培养6天相比p<0.01,▲与6月龄相比p<0.05

3讨论

本研究结果提示,随着培养时间的延长,成年海马神经元中的衰老神经元明显增加,与新生大鼠海马神经元培养相比,成年大鼠神经元存活时间较短,出现SA-β-GAL阳性染色的时间较早(未发表)。在本研究中发现老年大鼠在海马神经元的体外培养中,出现SA-β-GAL标记的衰老细胞较青年大鼠早,然而在延长培养后期,衰老细胞已趋向于饱和,而此时差别并不明显。SA-β-GAL是目前比较普遍应用的衰老生物学标记物[1],多数的研究应用于复制衰老,而复制衰老是指真核细胞在完成有限分裂次数后,丧失合成DNA的能力,导致增殖能力丧失而仅维持细胞基本的代谢能力的状态,比较经典的复制衰老的细胞模型是人二倍体细胞(human diploid fibroblasts,HDFs)[2,5]。然而,神经元属于静止细胞,在体外培养中不再增殖和分裂,并且在体外研究中建立稳定可靠的衰老神经元的模型是研究中枢神经系统衰老的基础,SA-β-GAL在成年大鼠神经元培养中的成功应用,不仅使细胞培养的来源更加广泛,并且缩短了研究周期。除SA-β-GAL标记外,衰老的细胞还具有细胞变大,变扁平的形态学特点,然而在本研究中,延长培养的神经元形态学改变不明显,因此SA-β-GAL是一个比较敏感的生物学指标,在以往的研究中,我们分别在不同年龄大鼠的大脑皮层和海马区应用了SA-β-GAL标记了衰老神经元[6,7],本结果利用体外培养的方式进一步验证了结果的可靠性。

参考文献

[1] Dimri,G.P,X. Lee,G. Basile,et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo [J].Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92(20):9363～9367.

[2]Chen,Q.M.Replicative Senescence and Oxidant-Induced Pre-mature Senescence:Beyond the Control of Cell Cycle Check-points[J].Ann.N.Y.Acad.Sci,2000,908(1):111～125.

[3]Honda,S.L.M.Hjel meland,and J.T.Handa.Senescence as-sociated beta galactosidase activityin human retinal pigment epi-thelial cells exposedto mild hyperoxiain vitro[J].Br J Ophthal-mol,2002,86(2):159～162.

[4] Arking,R. Multiple longevity phenotypes and the transition from health to senescence [J].Ann N Y Acad Sci,2005,1057:16～27.

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[6]Wang BH,F.Y,Shi GZ,Xu MY,Geng YQ,Xu XH,Xu JJ.Clo-ning of LASS1Gene and Primary Study on The Association of Its Expression With Neuron Agingin Rat Cerebral Cortex[J].Prog Biochem Biophys,2006,33(8):760～768.

自然衰老大鼠 篇4

Wistar大鼠, 体重 (150±9) g, 由甘肃中医学院实验动物中心提供。锁阳咀嚼片:为水提醇沉物咀嚼片, 1g相当于生药3.3g, 本院制备。电子天平 (MP-200A) ;酶联免疫检测仪;超净工人台;CO2培养箱;分光光度仪。蔗糖、甘露醇、乳糖、淀粉、山梨醇等均为药用级。SOD、MDA、NO测试盒由南京建成生物工程研究所提供;RPMI1640:购于GIBCO BRL公司。D-半乳糖:购于上海恒信化学试剂有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

2方法

2.1 衰老模型的复制及分组给药

Wistar大鼠32只, 随机分为4组, 每组8只。除对照组外, 每只动物每日皮下按120mg·kg-1的剂量注射D-半乳糖溶液0.5ml, 连续注射7周。同时, 给药组分别灌服相应锁阳咀嚼片0.25g/kg、1.00g/kg, 正常对照组、衰老模型组灌胃等容量生理盐水, 均连续灌服6周。

2.2 指标测定

大鼠眼眶动脉采血5ml, 分离血清, 备用。取大鼠全脑 (除去小脑) , 用冷生理盐水漂洗, 除去血液, 滤纸拭干称重, 放入10ml的小烧杯内。用量筒量取预冷的生理盐水 (总量相当于组织重量的9倍) , 用移液管取2/3的生理盐水于烧杯中, 用眼科小剪剪碎组织块 (小烧杯置于冰水中) 。将剪碎的组织块倒入玻璃匀浆器中, 再将剩余的1/3的生理盐水用来冲洗残留在烧杯中的碎组织块, 一起倒入匀浆器中匀浆, 上下转动研磨6分钟, 充分研碎, 使组织充分匀浆化, 即可制成10%组织匀浆。将匀浆以3000r/min离心10分钟, 取上清液进行标本测定。用考马斯亮兰法测定脑组织蛋白含量。MDA、SOD、NO含量测定均依试剂盒说明进行。

2.3 统计方法

对所有结果采用undefined来表示。所有数据用SPSS13.0 for windows统计软件进行单因素方差分析。

3实验结果

见表1～2。

与正常组比较*P<0.05;与模型组比较△P<0.05, △P<0.01;与中药低剂量组比较#P<0.05 (下同)

4讨论

中医学认为肾气虚衰与人体衰老密切相关。锁阳, 具补肾助阳、益精润肠养筋等功能, 为延缓衰老的要药。现代医学研究证明锁阳具有多种生理活性, 特别是免疫、抗衰老、调节内分泌、改善性机能及润肠通便, 是治疗老年性疾病、延缓衰老的理想药物[1,2,3]。而本课题组在既往研究成果的基础上研制并开发的锁阳咀嚼片, 明显提高药物的生物利用度, 而且稳定性好。

自由基学说是目前公认的衰老学说之一。许多研究证明, 随着年龄的增长, 机体抗氧化酶的活性不断下降, 机体中过量氧自由基迅速与核酸、蛋白质、氨基酸、脂质等反应, 导致碱基缺失, 氢键破坏, 蛋白质交联, 多肽链断裂, 发生脂质过氧化反应, 生成丙二醛, 加快细胞中DNA、蛋臼质、脂膜等损伤, 促进细胞凋亡发生, 大量组织细胞凋亡的结果使机体老化[4,5]引发某些退行性疾病。因而自由基、细胞凋亡与衰老具有十分密切的联系。D-gal早衰动物模型对自由基损伤和免疫指标的变化与人体衰老指标改变规律基本一致。因此本实验采用该模型[6]。在正常生理情况下, SOD通过歧化体内超氧阴离子自由基, 生成过氧化氢, 由过氧化氢酶清除, 阻止了对机体组织细胞的毒性氧化损伤, 但超氧化物歧化酶随增龄而下降, 体内清除氧自由基的能力下降, 氧自由基浓度升高, 引发脂质过氧化的一系列连锁反应[7], 导致不可逆的损伤.从而产生各种生理紊乱、病理改变, 这可能是引起人类衰老的重要原因。

已有许多研究表明, 超氧阴离子自由基 (O-2) 与NO往往产生在同一生物体系, 二者能相互反应, 形成氧化能力更强的过氧亚硝酸根 (ONOO-) , 后者在一定条件下分解为羟自由基 (·OH) 和NO2自由基, 这两种自由基的氧化性都非常强, 不仅导致氧自由基反应加剧, 而且可迅猛攻击和损伤特异性清除超氧阴离子自由基的SOD等抗氧化酶分子结构中的巯基 (-SH) , 使SOD等失活。上述自由基还能直接攻击RNA和DNA, 从而促使SOD等的合成和再生减少, 显著减弱了SOD等抗氧化酶清除或降解氧自由基的能力, 对机体产生更大的细胞毒性。在衰老进程中, NO与氧自由基之间起协同作用。脂类极易在活性氧的攻击下产生快速氧化作用而产生MDA, 它与蛋白质或核酸交联后就形成脂褐素 (LPF) 。丙二醛和脂褐质是脂质过氧化的产物, 其含量的变化间接反应了氧自由基的含量[8]。

本实验发现, 锁阳咀嚼片能提高衰老模型动物血、脑组织中的SOD活性, 降低MDA、NO的含量, 表明锁阳咀嚼片可提高体内抗氧化能力、降低NO的含量, 起到延缓衰老的作用。

参考文献

[1]郑云霞, 孙启祥, 延自强.锁阳对小鼠免疫功能的影响.甘肃中医学院学报, 1991, 8 (4) :28.

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[3]石刚刚.锁阳对小鼠免疫功能及大鼠血浆睾酮水平的影响.中国医药学报, 1989, 4 (3) :27.

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[5]Albina JE, Cui S, Mateo RB, et al.Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoned macrophages.J Immunol, 1993, 150 (1) :5080.

[6]惠宏襄, 赵小宁, 金明, 等.自由基与细胞凋亡.生物化学与生物物理进展, 1996, 23 (1) :12.

[7]杨婷, 张冲, 陈清轩.衰老机制研究进展.中国生物工程杂志, 2005, 25 (3) :6.

自然衰老大鼠 篇5

1 对象与方法

1.1 研究对象及实验分组

离乳2月龄雄性SD大鼠48只(由西安交通大学医学院动物实验中心提供),体重200±10 g,体长17.8±1.5 cm。将48只大鼠随机分为A组(正常对照组,NC组)、B组(D-galactose衰老模型对照组,AC组)、C组(抗衰老中负荷训练组,LA组),各16只。A组又分为NCⅠ组(在第6周宰杀)和NCⅡ组(在第9周宰杀),各8只;B组又分为ACⅠ组(在第6周宰杀)和ACⅡ组(在第9周宰杀),各8只;C组又分为LAⅠ组(在第6周宰杀)和LAⅡ组(在第9周宰杀),各8只。

1.2 动物饲养

动物房维持在温度22±2 ℃,湿度40 %～60 %,每日按自然昼夜照明,自由进食饮水。动物饲料为实验动物专用饲料,购自西安交通大学医学院动物实验中心,饮用水为自来水。大鼠购进后均先适应性喂养1周,自由活动。在实验中将3组大鼠每组分4笼、共12笼饲养,每周换垫料2次。

1.3 动物模型的建立

大鼠经过适应性喂养1周后开始进入实验。NC组按常规喂养,自由活动、饮食,不进行任何训练,每日在颈背皮下注射一次生理盐水(125 mg/kg)[1],共6周,在第6周结束后,随机选择8只大鼠宰杀,剩余8只继续喂养3周。AC组按常规喂养,自由活动、饮食,不进行任何训练,每日在颈背皮下注射一次D-galactose(125 mg/kg)[2],共6周,在第6周结束后,随机挑选8只大鼠宰杀,剩余8只继续喂养3周。LAⅠ组按常规喂养、饮食,并从第1周开始均游泳运动,运动方式为无负重游泳,游泳池为塑料水桶,面积1.13 m2,水深50 cm,超过大鼠身长的 2倍,水温34～36 ℃,每次由专人在同一时间对大鼠进行训练,训练时间从8:00开始;每周运动3 d(周一、周三、周五),其它时间休息;在第6周结束后,全部宰杀。LAⅡ组同LAⅠ组,只是运动至9周。LAⅠ组和LAⅡ组在第1周每次游泳30 min,第2周每次运动40 min,第3周每次运动50 min,从第4周开始每次运动60 min至实验结束。

1.4 实验仪器、试剂

Olympus DM2500型荧光研究显微镜(德国),Leica-185型石蜡切片机、LeicaTp120型组织脱水机、LeicaHi1210型展片机、LeicaHi1220型烘片机、LeicaEG1160型组织包埋机等(德国),D-galactose(上海生物工程研究所),NO试剂盒、NOS试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.5 取血及测定

用20 %乌拉坦胸腔内注射麻醉,打开胸腔在胸主动脉采血,采血量5 mL/只,立即移入离心管放入全自动高速冷冻离心机,以3 500 r/min离心15 min,取血清50 μL。用南京建成出品的NO、NOS测试盒进行测试。NO、NOS测定操作严格按试剂盒说明书进行。

$\overline{x}\pm s$1.6 统计学处理

所有数据用 SPSS 12.0统计软件包进行处理,数据以表示,进行t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清NO、NOS的测试结果

AC组与NC组相比,6周末及9周末血清NO、NOS浓度均升高,说明衰老大鼠的血清NO、NOS浓度比正常对照组高,血清NO堆积可能是导致衰老的一个原因。LA组与NC组相比,6周末及9周末血清NO浓度差异均无统计学意义(P>0.05),但均明显低于AC组,说明LA组大鼠经6周运动可以减少血清NO的含量;NOS浓度在6周末比较结果与NO相同,但在9周末明显低于NC组及AC组,说明9周运动可以明显减少血清NOS浓度,可能是延缓衰老的适宜运动。详见表1。

*与NC比较P<0.05,**与NC比较P<0.01;▲与LA组比较P<0.05,▲▲LA组比较P<0.01

3 讨论

目前对于衰老机制研究尚无完整而统一的认识,故建立一种理想的衰老动物模型对于基础研究和衰老的防治都有重要的价值。由于自然衰老的动物模型周期长,较难得到,所以实验研究中一般采用人为致衰老的方法将年轻动物在短期内致衰老,这种方法具有个体差异小、实验周期短、节省人力物力等优点。目前常用的制备衰老模型的方法为D-galactose皮下注射[3]。D-galactose是葡萄糖的异构体,正常时可沿葡萄糖氧化代谢的途径分解产能,异常情况下则通过酮-烯醇互变转变为丙酮酸代谢,是糖代谢的重要环节。丙酮酸脱氢酶催化丙酮酸氧化成二氧化碳和乙酰辅酶A,丙酮酸羧化酶促使二氧化碳与丙酮酸形成草酰乙酸盐,通过羟-氨反应与蛋白质交联,而交联产物进一步脱氨、水解可生成不饱和醛、酮(如丙二醛等)。这种造模方法具有衰老变化明显、模型稳定、与自然衰老模型相似等优点。本实验在造模6周末发现,AC组大鼠毛发发黄、干涩,行动迟缓,嗜睡;这与国内外许多学者的研究结果一致[4],说明D-galactose致大鼠衰老模型建立成功。

运动后,抗氧化酶系统活性升高的维持能力是有一定限度的,与机体的疲劳程度有关。一般认为,经过运动训练后的机体短时间抗氧化酶系统活性升高,消除自由基的效率明显上升;而较长时间的亚极限或高强度运动,尤其是力竭运动后,这些酶活性不能维持较高水平,而呈逐渐下降的趋势,消除自由基的效率下降[5]。提示为避免自由基引起的损伤,运动员要尽量避免疲劳性运动或衰竭性运动训练。也就是说只有适宜的运动训练才可以有利于健康,延缓衰老。

通过6周、9周的中等负荷强度训练可以发现,AC组大鼠血清NO、NOS含量明显比NC组升高,说明衰老模型大鼠体内NO、NOS明显增多,可能是致衰老的机制之一;LA组血清NOS含量明显降低,虽然NO含量降低与AC组比较差异无统计学意义,但至少可以说明9周的运动已经使NO的产生减缓。说明9周中负荷运动可以有效延缓动脉的衰老,维持血管弹性及通畅,降低血压。

参考文献

[1]朱亚珍,朱虹光.D-半乳糖致衰老动物模型的建立及其检测方法[J].复旦学报(医学版),2007,34(4):617-619.

[2]王怀颖,张玮,石少慧,等.D-半乳糖老化模型小鼠抗氧化能力的实验研究[J].军医进修学院学报,2005,26(5):397-398.

[3]张靚,黄书怀.不同运动负荷对大鼠eNOS和iNOS活性的影响及其机理探讨[J].中国运动医学杂志,2002,1(22):23-26.

[4]王桂云,郭新民.黄茂对衰老小鼠一氧化氮、自由基及细胞凋亡的影响[J].牡丹江医学院学报,2004,25(4):14-153.

自然衰老大鼠 篇6

1 材料与方法

1.1 实验仪器

752型紫外分光光度计 (山东高密分析仪器厂) ;FSH-II型高速电动匀浆机 (江苏金运市环宇科学仪器厂) ;XHF21高速离心机 (北京医用离心机厂) ;SSW型微电脑电热恒温槽 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ;电子分析天平 (上海精密科学仪器厂) ;XW280A (旋涡混合器 (上海医科大学仪器厂) 。

1.2 药品与试剂

黄精购于河南省南阳市医药公司;D-半乳糖购于上海试剂二厂, 批号20050422;超氧化物歧化酶 (SOD) , 丙二醛 (MDA) 检测试剂盒 (购于南京建成生物工程研究所) 。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组、造模及给药

选用3～4月龄雄性SD大鼠40只, 体质量180±20 g (由河南省实验动物中心提供) , 随机分为正常对照组组、模型组、黄精低剂量组、高剂量组共4组, 每组10只。模型组、黄精低剂量组、高剂量组用3%D-半乳糖生理盐水溶液按150 mg/ (kg·d) 颈后部皮下注射6周, 生理盐水组皮下注射等量的生理盐水对照;黄精高、低剂量组分别同时给与黄精水煎剂按5 g/kg、2.5 g/kg灌胃, 模型组和生理盐水组灌给等量的生理盐水, 灌胃6周。

1.3.2 测试指标

6周后将大鼠断头处死, 在低温冰盘上取出海马组织, 制作10%的组织匀浆, 按照南京建成生物工程公司试剂盒说明书方法步骤测定。用紫外分光光度计测试MDA含量和SOD酶活性的检测。

1.4 统计学处理

实验数据用$(\overline{x}\pm s)$表示, 采用方差分析处理数据。

2 结果

大鼠海马酶学检测结果见表1。

注:正常对照组与模型组比较▲P<0.01;高剂量组与模型组比较▽P<0.01

从表 2～4可见高剂量黄精使衰老大鼠海马组织中的SOD含量显著上升 (P< 0.001) , MDA含量显著下降 (P<0.001) , 说明高剂量黄精对超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化物 (MDA) 确有明显影响。

3 讨论

海马是哺乳类动物学习和记忆的重要结构区。大量研究证实, 海马神经元受损可能是衰老大鼠学习记忆能力障碍的病理基础[4]。本实验采用检测衰老大鼠海马组织SOD活性与MDA的含量来观察海马受损的情况。衰老及机体寿命与体内自由基的产生有一定的关系, 与体内抗氧化能力有相关关系。自由基氧化损伤是衰老及线粒体损伤的机制, 增龄可使机体的抗氧化系统能力减弱, 自由基使细胞及线粒体损伤。如果不能制止自由基对细胞的破坏作用, 则自由基的损伤作用就会逐渐增大, 成为衰老机制之一。SOD是唯一能够特异性清除衰老启动因子 超氧阴离子自由基的抗氧化酶, 而超氧阴离子自由基引起的组织脂质过氧化损伤是重要因素之一。SOD是一种含有铜、锌、锰和铁的金属酶, 抑制脂质过氧化, 保护细胞免受损伤, 检测其水平可反应清除自由基的程度。MDA是脂质过氧化作用的终末产物, 比较稳定, 其含量可反映脂质过氧化水平, 同时间接反映自由基损伤程度, 是衡量脑损伤的重要指标。本实验模型型组大鼠海马中SOD活性明显低于其余 3 组, 而MDA含量升高, 说明衰老大鼠的海马组织不能及时清除氧自由基, 导致恶性循环, 神经细胞损伤更为严重。而大剂量应用黄精后, 在生化检测中, 可明显提高大鼠海马组织中SOD活性, 降低MDA含量, 达到抗衰老作用, 其机制可能与通过抗自由基损伤, 起到保护神经细胞的作用有关。

摘要：目的探讨黄精对D-半乳糖致衰老大鼠 (即AD大鼠) 海马组织中SOD活力和MDA含量的影响。方法将SD大鼠分为4组, 其中模型组、黄精高剂量组、低剂量组均颈部皮下注射D-半乳糖致亚急性衰老大鼠模型[1], 同时给予黄精进行干预, 正常组颈部皮下注射等量生理盐水。6周后测量海马组织内超氧化物歧化酶 (SOD) 活性和丙二醛 (MDA) 含量, 探讨黄精的抗衰老作用。结果模型组海马组织中SOD活性明显降低, MDA含量显著增加, 与生理盐水组相比均有显著性差异 (P<0.01) , 说明造模成功。黄精高剂量组较模型组相比有显著性差异 (0P<0.01) , 但与正常组相比无显著性差异 (0P<0.01) 。黄精低剂量组较模型组相比无显著性差异 (0P<0.01) 。结论高剂量黄精能显著消除衰老大鼠体内自由基的增加.提高超氧化物歧化酶的活性, 达到的抗衰延年作用。

关键词：黄精,D-半乳糖,衰老,抗氧化能力

参考文献

[1]赵鹏, 杨玉英.半乳糖制备亚急性衰老动物模型的可行性.中国食品卫生杂志, 1999, 11 (1) :52

[2]孙隆儒, 李铣, 郭月英, 等.黄精改善小鼠学习记忆障碍等作用的研究.沈阳药科大学学报, 2001, 18 (4) :286-289.

[3]石林, 蒙义文, 李伟.黄精及黄精多糖的药理研究.天然产物研究与开发, 1998, 11 (3) :67-71.

自然衰老大鼠 篇7

巴戟天最早是作为一种壮阳中药应用于一些基础研究和临床的,后来研究发现其具有补肾壮阳、增强性欲、抗肿瘤、缓解抑郁症状以及抗衰老等多种作用,作为提取自巴戟天的巴戟天醇提物也具有类似的作用[2,3]。以往的研究证实,巴戟天醇提物通过抗氧化以及抗凋亡而发挥其抗衰老作用的[4],而关于其对衰老大鼠免疫功能的影响尚未有报道。因此,作者旨在通过将巴戟天醇提物应用于D-半乳糖致衰老大鼠模型来探讨其对衰老大鼠免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

巴戟天醇提物提取自巴戟天(一等品,广东省德庆县药材公司,河南省食品药品检验所鉴定);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、刀豆素(canavalin,Con A)(批号:20120203、201200123,美国Sigma公司);大鼠白介素-2(IL-2),定量酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(批号:20120417,美国RD公司);PE-兔抗大鼠CD28单抗(批号:12-0280-81,美国e Bioscience公司);考马斯亮兰试剂盒(批号:20120509,南京建成生物工程研究所)。

1.2 仪器

CASTEAX2100型全自动酶联免疫分析仪(美国Beckman公司);FACSCalibur流式细胞仪(美国Becton Dicknson公司)。

1.3 实验动物

健康雄性Wistar大鼠,4月龄,体重200~245 g,平均(223±12)g,由河南省实验动物中心提供。

1.4 分组及处理

50只大鼠随机均分为空白对照组、模型对照组、维生素E组、巴戟天高剂量组、巴戟天低剂量组,每组各10只,各组大鼠常规分笼饲养。模型对照组及巴戟天高、低剂量组大鼠均每天皮下注射质量分数5%D-半乳糖1 m L/kg;空白对照组大鼠均每天皮下注射质量分数0.85%氯化钠溶液1 m L/kg;维生素E组大鼠每天在给予D-半乳糖的同时,给予维生素E 50 mg/(kg·d)灌胃;巴戟天高、低剂量组大鼠在每天给予D-半乳糖的同时,分别给予巴戟天醇提物2.1、0.7 g/(kg·d)灌胃。所有大鼠均连续给药8周,之后进行免疫功能相关指标的检测。

1.5 大鼠脏器指数的检测

首先对每只大鼠进行称重,并记录,然后常规解剖,无菌条件下取出脾脏、胸腺进行称重,计算脏器指数,公式如下:脾脏指数或胸腺指数=(脾脏重量或胸腺重量/大鼠体重)×100%。

1.6 淋巴细胞转化试验

末次给药后次日,将取出的部分脾脏制成脾细胞悬液,调节细胞浓度至1×107/mL,然后加入96孔培养板,每孔200μL,再加入20μg/mL ConA(用于T淋巴细胞转化试验)或LPS(用于B淋巴细胞转化试验),并设对照孔以及Con A刺激孔或LPS刺激孔。置于37℃、5%CO2培养箱中孵育72 h,并采用MTT法测定570 nm处OD值,根据OD值计算T、B淋巴细胞刺激指数,计算公式如下:刺激指数(SI)=(刺激孔OD值/对照孔OD值)×100%。所有实验重复3次,每次设3个复孔。

1.7 IL-2表达检测

末次给药后次日,将取出的部分脾脏与0.85%氯化钠溶液制成10%脾脏组织匀浆,采用双抗夹心ELISA法定量检测IL-2,具体操作步骤参考试剂盒说明书。

1.8 CD28表达检测

末次给药后次日,从取出的脾脏中取1 mm3脾脏组织剪碎,制成脾细胞悬液,取脾细胞悬液100μL用红细胞裂解液裂解红细胞直至液体变成无色透明,然后3 000 r/min离心3 min,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,调脾细胞浓度至2×106/m L,取其中40μL加入试管,同时往试管中加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD28单抗10μL,震荡混匀,并于4℃冰箱中孵育30 min,PBS洗涤,3 000 r/min离心3 min,然后细胞定容至0.5 m L到专用试管,上流式细胞仪进行CD28阳性淋巴细胞检测。

1.9 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析,计量资料数据以均数±标准差表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 巴戟天醇提物对大鼠脏器指数的影响

模型对照组胸腺指数、脾脏指数明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组胸腺指数、脾脏指数明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。维生素E组、巴戟天高剂量组胸腺指数、脾脏指数比较,差异无统计学意义(P>0.05);巴戟天低剂量组胸腺指数、脾脏指数低于维生素E组、巴戟天高剂量组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

注:与空白对照组比较,△P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05;与维生素E组比较,※P<0.05;与巴戟天高剂量组比较,#P<0.05

2.2 巴戟天醇提物对大鼠淋巴细胞的影响

模型对照组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。维生素E组、巴戟天高剂量组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数比较,差异无统计学意义(P>0.05);巴戟天低剂量组T淋巴细胞转化指数、B淋巴细胞转化指数低于维生素E组、巴戟天高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注:与空白对照组比较,△P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05;与维生素E组比较,※P<0.05;与巴戟天高剂量组比较,#P<0.05

2.3 巴戟天醇提物对大鼠IL-2及CD28的影响

模型对照组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,维生素E组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。维生素E组、巴戟天高剂量组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数比较,差异无统计学意义(P>0.05);巴戟天低剂量组IL-2水平以及CD28阳性淋巴细胞数低于维生素E组、巴戟天高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

注:与空白对照组比较,△P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05;与维生素E组比较,※P<0.05;与巴戟天高剂量组比较,#P<0.05

3 讨论

衰老的发生机制众多,诸如自由基过剩导致衰老理论、衰老的细胞凋亡学说、衰老的免疫功能障碍学说等,随着衰老相关机制的研究进展,衰老的免疫学说的地位越来越高。越来越多的研究表明,免疫功能下降是机体出现衰老的征兆和重要因素[5,6],随着增龄化的进展,机体免疫器官老化,免疫细胞、免疫相关因子的数量和功能发生明显变化,从而导致了感染性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病的发病率上升。D-半乳糖是一种常用的致衰老药物,其制作的模型已经被广泛应用于实验研究。研究表明,D-半乳糖致衰老模型其各种免疫功能相关指标的变化与自然衰老一致[7],例如免疫器官老化、淋巴细胞转化能力减弱、机体IL-2水平降低、胸腺指数及脾脏指数降低等。因此,本研究选择D-半乳糖致衰老模型代替自然衰老模型是切实可行的。本研究结果也提示,D-半乳糖能够降低大鼠胸腺指数、脾脏指数,T、B淋巴细胞SI,IL-2水平,以及体内CD28阳性淋巴细胞数量,进一步验证了机体免疫功能的衰退是导致衰老发生的重要因素。

胸腺是免疫调节的中枢器官,主要用于为T淋巴细胞的分化、成熟提供场所,对于机体的细胞免疫功能以及免疫反应的发生具有重要作用。而脾脏是最大的外周免疫器官,其为各种成熟的淋巴细胞提供定居场所以及发生免疫应答。胸腺和脾脏均会随着机体的增龄化进程,质量变轻,功能下降[8]。本研究结果提示,高、低剂量的巴戟天醇提物与阳性对照药物维生素E相似,均具有提高衰老大鼠脏器指数的作用,且两种剂量的巴戟天醇提物的作用不同,低剂量者作用较弱(P<0.05)。

T、B淋巴细胞在机体发生特异性免疫应答中发挥重要作用。其中T淋巴细胞主要介导细胞免疫,其杀伤作用及分泌免疫相关因子能力的下降导致机体自身免疫性疾病、恶性肿瘤等发生,随着年龄的增大,T淋巴细胞的数量和功能均会下降[9]。B淋巴细胞主要参与机体的体液免疫,通常通过分泌细胞因子进行免疫调节,且这种分泌作用于年龄的增长呈负相关[9,10]。本组实验结果提示,巴戟天醇提物与维生素E一样能够有效提高衰老大鼠降低的T、B淋巴细胞转化能力,从而促进这些细胞的增殖,且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组(P<0.05)。

IL-2主要由活化的T淋巴细胞分泌,特别是辅助性T淋巴细胞分泌能力更强。IL-2具有较强的免疫调节作用,能够促进T淋巴细胞的增殖、分化,增强T淋巴细胞及NK细胞的活性,同时还可以通过促进干扰素合成而增强细胞杀伤力。IL-2随年龄增加分泌减少被认为是衰老的免疫学说的主要分子机制[11]。本实验结果显示,巴戟天醇提物与维生素E一样能够提高衰老大鼠IL-2表达水平,从而促进T淋巴细胞及NK细胞的的增殖及杀伤作用等,且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组(P<0.05)。

CD28分子是广泛表达于T淋巴细胞表面的共刺激分子,为T淋巴细胞的活化提供第二信使,从而发挥重要作用[12]。另外,CD28还参与免疫维持及下调免疫功能,在免疫功能平衡与稳定过程中发挥重要作用。随着机体的老化,CD28分子信号转到能力下降,进而导致T淋巴细胞的增殖活化受阻,同时IL-2等细胞因子分泌减少,以致机体的细胞免疫和体液免疫均呈现衰退和紊乱,这也导致了机体的衰老[13]。本组结果显示,巴戟天醇提物与维生素E一样能够提高衰老大鼠CD28阳性淋巴细胞数量,且巴戟天高剂量组作用强于低剂量组(P<0.05)。

自然衰老大鼠 篇8

1 材料与方法

1.1 芯片及主要仪器

大鼠Oligo GEArray炎症细胞因子与受体基因芯片(inflammatory cytokines and receptors microarray)(112个相关基因,SuperArray,USA),购自上海康成生物有限公司。扫描仪(GeneChip Scanner 1000);图像数据分析软件:GEArray Expression Analysis Suite。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-10酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)试剂盒(RapidBio Lab, USA)。

1.2 主要药物

采用辽宁产朝鲜淫羊藿,由上海第二军医大学天然药化研究所提取EF,其纯度为80%。

1.3 动物与分组

清洁级健康雄性SD大鼠30只,购于四川省医学科学院实验动物中心,分为4月龄(4 m)、24月龄(24 m)和24 m+EF共3组,每组10只。24 m+EF组予EF灌胃, 24 m组给予等量蒸馏水灌胃,均自满21月龄当天开始,连续90 d,其余常规喂养。

1.4 取材

大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,2%碘酊、75%酒精消毒,打开头颅,迅速取出海马组织并立即放入液氮中,转置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.5 基因芯片实验

每组10只大鼠组织样本总RNA等量混合后进行基因表达谱检测。用Trizol-氯仿-异丙醇提取组织总RNA;用SuperScriptⅡ和双链cDNA合成试剂盒合成和纯化cDNA,用Rneasy Mini 试剂盒用于体外转录合成cRNA以及cRNA 的纯化及片段化。用Cy-3、Cy-5逆转录荧光标记,制作cDNA探针。将GEAhyb杂交液注入装有Oligo GEArray芯片杂交管中杂交芯片。用Fluidics Station 450系统对芯片进行洗脱和染色。通过X胶片和GeneChip Scanner 1000 扫描仪获得芯片图像,获取基因表达荧光信号强度值,用内参照基因(管家基因)原始获取信号进行均衡和修正。用GEArray表达分析配套软件进行芯片数据分析。计算荧光信号的强度和比值。基因差异表达相差2倍以上,即表达上调[信号比的对数值,Signal Log Ratio(SLR)>2,表达下调(SLR<-2)为有统计学意义。

1.6 海马组织上清液制备

取出海马组织,用冷生理盐水清洗并用滤纸吸干,加人冷生理盐水,玻璃匀浆器研磨制备成海马组织匀浆,1500 r/min 4 ℃离心10 min,取上清备用。

1.7 ELISA检测

从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条,加入100 μl标准品、100 μl已稀释标本于相应反应板孔中;每孔加入100 μl Biotin anti rat TNF-α、或IL-6、或IL-10,22 ℃温育20 min;每孔加入100 μl 1× HRP,22 ℃温育10 min;每孔加入100 μl TMB显色液,22 ℃温育20 min。每孔加入100μl终止液。15min内在酶标仪450 nm处读样品A值。以A值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据A值在标准曲线上查出其浓度。

1.8 统计分析

数据用均数±标准差表示,采用SPSS软件进行独立样本t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织RNA鉴定

提取的RNA OD260/OD280值>2.0,电泳图谱出现28S和18S清晰条带,表明RNA纯度高。

2.2 芯片扫描结果

用Cy3和Cy5标记的荧光探针与芯片杂交结果显示,全部阳性对照信号清晰,阴性对照信号很弱,表明实验数据可靠。

2.3 24 m组海马组织中差异表达基因

与4 m组比较,24 m组SLR>2的促炎性反应细胞因子与受体基因9个,即白介素(IL-12β、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8rβ)、肿瘤坏死因子(TNF、TNFSF11)、趋化因子(CCL2、CX3CL1)。SLR<-2的抗炎细胞因子与受体基因有:IL-10rα、IL-13、IL-4r、IL-9r、转化生长因子-α(TGF-α)、TGF-β1,共6个。

2.4 24 m+EF组海马组织中差异表达基因

与24 m组比较,24 m+EF组中SLR>2的抗炎细胞因子与受体基因有:IL-10、IL-10rα、IL-13、IL-9r、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-βr2,共8个;SLR<-2的促炎细胞因子与受体基因有:CCL2、CCL3、CX3CL1、IL-15、IL-18、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-6r、IL-8rβ、TNF,共11个。

2.5 各组大鼠海马组织上清液中TNF-α、IL-6和IL-10水平变化特征

从表1可知,与4 m组相比,24 m组海马组织上清液中TNF-α和IL-6水平显著升高(P<0.01),24 m组IL-10水平稍升高,但没有统计学显著差异。与24 m组比较,24 m+EF组中TNF-α和IL-6皆明显降低,IL-10水平均明显升高(P<0.01)。

2.6 各组大鼠海马组织上清液中TNF-α/IL-10和IL-6

/IL-10比值变化 表2表明,24 m组中TNF-α/IL-10和IL-6/IL-10比值都显著高于4 m组(P<0.01)。24 m+EF组中TNF-α/IL-10和IL-6/IL-10比值皆明显低于24 m组(P<0.01)。

注:与4 m组比较, **P< 0.01;与24 m组比较,△△P< 0.01

注:与4 m组比较,**P< 0.01;与24 m组比较,△△P< 0.01

3 讨论

炎性细胞因子是由神经、免疫、内分泌以及组织细胞分泌的具有高度生物活性的可溶性蛋白或糖蛋白。许多炎性细胞因子交互作用构成了炎性细胞因子网络:促炎性细胞因子网络和抗炎性细胞因子网络,这两者的动态平衡维持着机体的促炎与抗炎反应体系平衡,维持炎症的正常生理功能,而这种平衡一旦被打破就会引起病理性炎症变化。基于炎性细胞因子网络在炎性衰老进程中可能起着关键作用,结合细胞因子的特性,本研究就以炎性细胞因子网络为切入点,探讨炎性衰老机制和干预策略。

结果表明,与青年大鼠相比,老年大鼠海马上调的促炎性细胞因子基因有白介素、肿瘤坏死因子和趋化因子,这些促炎性反应细胞因子与受体基因表达上调,可能是促炎性细胞因子网络和抗炎性细胞因子网络失去平衡的关键原因之一,进而导致促炎性反应状态升高,促-抗炎性反应体系失衡,参与炎性衰老的发生发展。本研究结果与以前相关报道的结果相符。研究认为促炎症细胞因子在慢性炎症所致机体的炎性衰老中有重要的作用[5]。大量人群研究表明血清IL-6水平可作为老年人炎性衰老的预测指标[6,7]。高促炎症反应状态存在的原因是循环中促炎症细胞因子介质,包括IL-1、IL-6、TNF-α和前列腺素E2(PGE2)水平的升高[6,7],老年人的组织器官时刻处于这种炎性环境之中。这些结果是从单基因角度研究得出的。而本实验是从多基因,以高通量基因表达谱芯片为具体检测手段,所得到的结果更能反应炎症细胞因子网络的内涵。

海马通过调节下丘脑-垂体-肾上腺轴功能参与调控应激和机体衰老进程[8]。老龄大鼠的海马IL-1β升高,抗氧化酶活性下降,由此认为IL-1β升高是引起衰老的重要原因[9]。因此,本实验选择了海马组织作为实验观察对象。

促炎细胞因子(如TNT-α、IFN-β、IFN-γ等)通过产生活性氧和激活AT m/p53/p21(WAF1/Cip1)信号通路诱导上皮细胞衰老[10]。趋化因子受体CXCR2通过p53通路诱导成纤维细胞衰老;DNA损伤激活NF-κB等信号通路产生促炎细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8等),血清中促炎细胞因子阻滞细胞周期,促进和维持细胞衰老表型[11]。炎症细胞因子网络贯通于炎症和衰老过程,是炎性衰老研究理想的对象。

EF是从小蘖科淫羊藿属植物的茎叶中提取的总黄酮类成分。实验研究表明,EF具有干预衰老的功效[12]。本研究结果发现,EF下调的促炎性细胞因子基因及其数量几乎都是老年大鼠上调的那部分促炎性细胞因子基因,说明EF可能通过下调内源性促炎性细胞因子基因表达,重塑促-抗炎性细胞因子网络和促-抗炎性反应体系新的平衡,以多基因靶点和多环节方式有效干预炎性衰老。

TNF-α、IL-6和IL-10是目前研究和衡量炎症反应程度通用的有效指标,是调控炎性细胞因子网络的关键成员,可能是炎性衰老的炎性细胞因子调控机制的核心。TNF-α/IL-10比值或IL-6/IL-10比值可以反应炎症反应的程度和趋势[13]。因此本实验将IL-6、和TNF-α指标同时进行综合检测,这对促炎性细胞因子网络所引起的促炎性反应程度的评判更加客观、准确。

本研究发现,老年大鼠海马组织中TNF-α和IL-6蛋白表达上调,与基因( mRNA)水平的研究结果相一致,也与Francechi等[1]的研究结论相符。老年大鼠海马组织中TNF-α/IL-10比值和IL-6/IL-10比值比青年大鼠升高,提示促炎性反应相对于抗炎性反应占有明显优势,是机体促炎和抗炎反应平衡失调的原因。而EF能够下调老年大鼠海马组织中内源性TNF-α、IL-6蛋白表达,上调内源性IL-10蛋白表达,而且使TNF-α/IL-10比值和IL-6/IL-10比值下降,说明EF通过下调机体促炎性反应,同时上调抗炎性反应,使得大鼠体内原本失衡的促炎和抗炎反应体系重归于平衡状态。