自由基清除剂

自由基清除剂（共10篇）

自由基清除剂 篇1

脑卒中是目前人类继心血管病和癌症之后第三大常见的死亡原因。在我国, 随着人口老年化的趋势, 卒中的发病率与死亡率不断增高。对于其中70%的缺血性损伤 (缺血性卒中) 的治疗, 除了在出现神经系统症状3 h内给予溶栓药重组组织型纤溶酶原激活物 (recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA) 被证实有效之外, 尚无有效的治疗方案。并且, 在缺血期后, 可能会出现自发性或使用rt-PA后引起的再灌注损伤。而这种损伤形成的主要原因就是自由基的连续生成[1]。许多动物实验与临床实验都证明, 及时有效地清除所自由基的脑保护治疗是减轻缺血性脑卒中再灌注损伤的有效措施[2]。NXY-059, 化学名为N- (叔丁基) -2, 2, 4-二磺酸基苯基硝酮二钠盐 (disodium2, 4-disulfophenyl-N-tert-butylnitrone) (分子式C11H13NNa2O7S2) 是一种硝酮类化合物, 具有较强的捕获碳和氧自由基的作用[3]。动物和临床研究初步显示, NXY-059能有效地减轻缺血性卒中的再灌注损伤, 是一种有潜力的抗自由基药物。

1 NXY-059的药代动力学

健康试验者静脉注射NXY-059的研究显示[4], NXY-059的正常半衰期为2 h～4 h, 稳态分布体积 (Vss) 为13 L～15 L, 血浆非结合率为0.53～0.58, 血浆清除率为9 mL/min～76 mL/min。大部分通过肾脏排泄, 以滤过为主, 原型母体化合物的尿回收率约为80%～90%, 相关系数平方 (r2) 为0.93。

2 NXY-059的动物缺血模型研究

在大鼠一过性大脑中动脉阻断2 h模型中, NXY-059能改善大鼠神经行为功能, 减少皮层与皮层下梗死组织学的损害, 而且这种神经保护作用呈剂量依赖性。NXY-059在大鼠大脑中动脉闭塞后4 h～5 h后给药仍然具有神经保护效应, 静脉使用30 mg/kg, 并于1 h后予以30 mg/ (kg ·h) 维持46 h～58 h, 可使梗死体积缩小37%～58%[5]。

在绒猴大脑中动脉完全闭塞4 h的模型中, 实验结果显示, NXY-059在灵长类动物大脑中动脉完全闭塞4 h后使用, 仍有积极有效的神经保护作用, 能明显改善运动功能和空间忽视现象, 减少皮层、白质和皮层下的梗死体积[6]。

细胞色素C是细胞程序性死亡 (凋亡) 的起始因子之一。Han等[7]研究发现NXY-059在减少Wistar大鼠缺血再灌注后的梗死体积 (从37.2%缩小为12.5%) 的同时, 通过免疫组化方法观察发现在再灌注后6 h开始, 细胞色素C含量身高, 12 h～24 h达到顶峰。提示NXY-059能通过抑制细胞色素C的含量升高来减少细胞的凋亡。

虽然NXY-059在大脑缺血的最初1 h～4 h内不能通过血-脑屏障 (blood-brain barria, BBB) , 但当缺血时间达到9 h之后, NXY-059通过内皮细胞转运的能力上升到原来的350%, 这可能是NXY-059治疗永久性大脑缺血性损伤的原因所在[8]。相同剂量使用时, NXY-059的效果优于其原型化合物α-苯基叔丁基硝酮 (α-phenyl-ter-butyl, PBN) 。永久性大鼠大脑中动脉缺血模型中, 闭塞5 min后静脉输注75.4 mg/kg后, 再予以70 mg/ (kg·h) 维持23 h 55 min后, 大鼠梗死体积缩小了80%[9]。

Jonathan等[10]通过对比NXY-059、氯甲噻唑 (clomethiazole) 和AR-R15896AR (一种可能有脑保护作用的化合物) 的脑保护作用, 虽然三者都能改善在大脑中动脉缺血3周后的脑皮质、白质的腔隙性状态, 但持续使用10周后, 只有NXY-059还有脑保护作用。并且, NXY-059拥有上述两者不具备的对于大脑皮质下部分的缺血保护作用。

3 NXY-059的临床研究

3.1 临床疗效

SAINT-I (stroke acute ischemic NXY-059 treatment I) 的3期临床实验是一项随机、双盲、安慰剂对照试验, 共吸纳了1 722例急性缺血性卒中患者, 患者在卒中发病之后随机接受72 h的安慰剂输注或在6 h内静脉输注NXY-059。以改良的Rankin残疾量表 (mRS) 评分, 0分～5分, 0分代表无残疾症状, 5分代表卧床不起需持续护理, 以之评估90 d后的残疾状况。统计数据表明:在1 699例可进行有效分析的患者中, NXY-059较安慰剂显著改善了患者改良的Rankin残疾量表评分 (平均2.71分, 95%患者1.01分～1.42分;安慰剂组平均2.84分) 的总体分布 (P<0.05) 。

在急性缺血性卒中发病后6 h内给予NXY-059可显著改善患者主要预后 (发病第90 d后残疾减少) , 但不能改善其他预后指标[11]。

SAINT-Ⅱ (stroke acute ischemic NXY-059 treatment Ⅱ) 临床试验也是一项随机、双盲、安慰剂对照试验。该项试验选取了过多的样本量 (3 306例急性缺血性卒中患者) , 随机分为两组, 一组 (1 588例患者) 持续静脉使用NXY-059, 共72 h (首剂第1 h3 370 mg/h, 后71 h静脉维持480 mg/h～960 mg/h) , 血药浓度为260 μmol/L。另一组 (1 607例患者) 在出现神经症状6 h后内使用安慰剂, 90 d后以改良的Rankin残疾量表评分评估疗效。在最终两组中有统计学意义的3 195例患者中, 两组死亡率相等, 无效率相似, Rankin评分并无不同。结果显示NXY-059在治疗急性缺血性卒中有中性疗效[12]。

3.2 临床安全性

NXY-059的临床安全性良好。一项随机对照、双盲、平行分组的多中心研究评估了NXY-059对急性卒中患者 (24 h以内的急性缺血性脑梗死) 的安全性。根据用药方法分为两组治疗:首剂1 h内250 mg, 之后71 h内85 mg/h持续给药;首剂1 h内500 mg, 之后71 h内170 mg/h持续给药。整个研究147例完成试验, 85 mg/h组48例、170 mg/h组49例、对照组 (安慰剂组) 50例。3组中出现各种不良反应 (症状) 的比例依次如下:血压升高8%、4%、6%;头痛8%、29%、24%;恶性呕吐6%、6%、8%;血糖升高8%、22%、18%;肾功能不全8%、12%、8%;部分凝血酶原时间 (APTT) 延长8%、10%、6%。3组中死亡的患者比例0%、10%、4%。两治疗组的非结合稳态平均血药浓度为:25 μmol/L和45 μmol/L。NXY-059的清除率为4.6 L/h。研究结果显示, NXY-059对急性缺血性卒中患者安全有效, 各种不良反应的发生率与安慰剂相当或相似[13]。Lees等[14]观察另一项随机、对照、双盲、平行分组的多中心研究来评估对急性缺血性卒中患者使用高浓度NXY-059的耐受性与安全性。持续给药浓度高达420 mg/h和844 mg/h的两组。研究结果同时显示, 更高浓度的NXY-059对卒中患者安全有效, 并没有增加患者的死亡率。

4 结论与展望

虽然SAINT-Ⅱ试验并没有获得令人鼓舞的对于急性缺血性脑梗死疗效的良好结果, 但不得不考虑:对于急性脑梗死的预后, 样本个体差异 (种族的单一) 、病灶部位、大小、数目以及治疗的是否及时都与其有明确相关性。而后循环缺血 (posterior circulation ischemia, PCI) 的预后, 尤其是基底动脉闭塞 (basilar artery occulation, BAO) 的预后不如前循环。所以对于NXY-059临床疗效的试验应该更科学、更完善、更有说服力。

NXY-059的自由基捕获作用、超长的治疗时间窗、较好的疗效以及使用的安全性, 都证明其有着广泛的研究使用前景。下一步研究必须同时监测剂量-浓度-疗效的相关性, 决定最大安全剂量与最小有效剂量;进一步明确治疗时间窗;动物研究实验研究时需要进行生理指标监测;研究方法要随机、双盲, 并且结果的可重复一致性, 同时观察组织学改变及短期与长期的神经行为机能。当然, 这些研究必须要从循证医学的角度出发, 重新认真评价NXY-059的作用与疗效, 尽早得出能够进行A级临床推荐的循证依据。

自由基清除剂 篇2

留兰香非精油组分清除自由基和活性氧的研究

越来越多的疾病如肿瘤、炎症、白内障、糖尿病和心脑血管疾病的`发生与发展,经研究证明与自由基直接或间接作用有关[1～2].为了减轻或消除过量自由基对人体的损伤,急需筛选天然无毒的自由基清除剂.因此,从植物中寻找清除自由基的有效药物已引起国内外广泛重视.

作 者：朱慧 陈季武 胡斌 秦海燕 张军  作者单位：华东师范大学,生命科学学院,上海,62 刊 名：华东师范大学学报（自然科学版）  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF EAST CHINA NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE) 年，卷(期)： “”(2) 分类号：Q505 关键词： 

自由基清除剂 篇3

关键词：荞麦；黄酮；自由基清除率

中图分类号： S517.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0355-02

荞麦别称乌麦、三角麦，我国是其生产大国[1]。1984年，宁夏回族自治区开展了荞麦引种观察、品种鉴定、品种比较试验，截至2004年已进行了6轮，确定了一批荞麦新品种，北海道、美国甜荞、北早生就是其中的选种作物[2]。荞麦是药食同源的物种，富含黄酮类化合物，尤其富含芸香苷。黄酮类化合物具有降低血糖、血脂等功能，对于治疗糖尿病、高血压、心脏病有辅助疗效，同时还是天然抗氧化剂，具有清除自由基的作用[3]。本研究对比3种荞麦黄酮含量以及清除自由基的作用，旨在为开发利用天然荞麦保健产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验中荞麦品种为北海道、美国甜荞、北早生，均产自宁夏回族自治区固原市，由固原市农业科学研究所鉴定并提供。芸香苷对照品（92.5%）由中国药品生物制品检定所提供，批号100080-200707，DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，C18H12N5O6）纯度>95%。Al（NO3）3、NaNO2、NaOH、无水乙醇（天津科密欧化学试剂）为分析纯；水为蒸馏水。主要仪器：万分之一AEU-210电子天平（日本岛津公司）；UV-1600紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；瑞尔回流提取装置。

1.2 方法

1.2.1 3种荞麦样品溶液的制备

取3个荞麦品种洗净、烘干、粉碎，过40目筛，精密称取5.0 g置于索氏提取器中，在料液比1 g ∶30 mL、乙醇浓度75%、80 ℃下提取4 h，将提取液浓缩至100 mL[4]。

1.2.2 芸香苷标准曲线

准确称取芸香苷标准品10.0 mg，用30%乙醇稍微加热使其完全溶解，转入50 mL容量瓶中，用30%乙醇定容，摇匀，得到0.2 mg/mL芸香苷标准溶液。准确吸取芸香苷标准溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置于25 mL容量瓶中，加入5% NaNO2 0.7 mL，静置5 min，加入10% Al（NO3）3 0.7 mL，摇匀，静置6 min，加入1 mol/L NaOH 溶液5 mL，用30%乙醇定容，静置10 min，以未加芸香苷标准溶液的显色试剂乙醇溶液作为空白对照，在510 nm处测定吸光度，绘制曲线。

1.2.3 总黄酮含量的测定

准确吸取2 mL 3种荞麦的样品溶液置于25 mL容量瓶中，按“1.2.2”节所述方法用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法操作，在510 nm处测定吸光度，测定黄酮类物质含量，对3种荞麦样品溶液黄酮含量进行比较。平行测定3次，按以下公式计算黄酮含量：

R=C×12.5×0.15.0×100%。（1）

式中：R代表黄酮含量，%；C代表由标准曲线得到的黄酮含量，mg/mL。

1.2.4 对DPPH自由基清除率的测定

准确称取DPPH 20 mg，用无水乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成 0.2 mg/mL DPPH标准溶液，避光保存。取2 mL DPPH标准溶液，加入无水乙醇，定容于10 mL容量瓶中，配制成0.02 mg/mL DPPH工作液，避光保存。取2 mL DPPH工作液，加2 mL溶剂，在515 nm处测定其吸光度Dd。取2 mL DPPH工作液加2 mL荞麦样品液，在515 nm处测其吸光度Di。取2 mL荞麦样品溶液加2 mL溶剂，在515 nm处测其吸光度Dj。荞麦样品溶液对DPPH自由基的清除率（K）计算公式[5-6]如下：

K=[1-（Di-Dj）/Dd]×100%。（2）

2 结果与分析

2.1 芸香苷标准曲线

以吸光度为纵坐标、芸香苷浓度为横坐标，制作标准曲线图，回归方程为y=11.848x+0.003 5，r2=0.999 1（图1）。

2.2 3种荞麦总黄酮含量

由吸光度根据标准曲线查出3种荞麦样品中黄酮的含量，荞麦样品中总黄酮含量以芸香苷相对量表示（表1至表4）。

2.3 3个荞麦品种对DPPH自由基的清除作用

按照“1.2.4”节中测得的吸光度，Dd（即2 mL DPPH+2 mL溶剂）值为0.490，根据公式，计算DPPH自由基清除率（表5）。

3 结论

本研究对3个荞麦品种的黄酮含量进行了测定，结果表明，北海道黄酮含量（0.652%）略高于美国甜荞（0.626%），北早生黄酮含量最低（0.568%）。DPPH是常用的检测清除自由基活性的方法，3种荞麦提取液对DPPH自由基均有一定的清除能力，北海道清除率最高（54.7%），其次是美国甜荞（52.6%），最低的是北早生（41.6%），表明DPPH自由基清除率和黃酮含量有关。

参考文献：

[1]贾玮玮，刘敦化. 宁夏荞麦开发利用研究进展[J]. 保鲜与加工，2009，9（1）：1-4.

[2]马均伊，赵佰图. 宁夏荞麦品种选育的回顾与思考[J]. 宁夏农林科技，2005（5）：62-64.

[3]张素斌，廖燕婷. 4种甜荞麦黄酮提取方法的比较研究[J]. 食品与机械，2012，28（6）：150-153.

[4]姜忠丽，王俊伟. 苦荞麦中总黄酮提取工艺的研究[J]. 农业机械，2011（20）：166-168.

[5]许 钢. 苦荞麦黄酮提取最佳条件及抗氧化研究[J]. 中国食品学报，2008，8（3）：78-83.

自由基清除剂 篇4

资料与方法

细胞与材料:准备10 mgEDA、新生牛血清、高糖DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶、SOD和MDA检测试剂、立体定向仪、酶联免疫检测仪、紫外/可见分光光度计。选择适宜实验大鼠32只,体重160～250 g。使用本院实验室C6脑胶质瘤细胞,进行细胞培养和传代。

MTT比色法:选取处于对数生长期的细胞,用胰酶消化成单细胞悬液,在培养板中接种。细胞贴壁生长之后,在培养板中分别加入浓度1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3的EDA 100μL,并将培养板放置适宜培养箱中进行培养,经过48 h,将浓度5g/L的MTT溶液加入培养板,一孔20μL,4 h之后去掉上清液。样品用酶标仪检测各孔的吸光度值(A490),进而计算EDA对肿瘤细胞的增殖率K,K=100%×(实验组A490-对照组A490)/对照组A490

构建动物模型:选取处于对数生长期的瘤细胞制成单细胞悬液,向大鼠接种。5d后,将这些接种大鼠分4组,高剂量EDA组、低剂量EDA组、对照组和空白组。前3组分别进行腹腔内注射EDA 3 mg/(kg·次),EDA 1 mg/(kg·次),生理盐水,2次/d空白组用于肿瘤组织与正常脑组织中SOD的活力与MDA含量的检测。

SOD活力与MDA含量检测:接种20d后,将大鼠断头取脑,配制成10%的脑浆,使用黄嘌呤氧化酶方法测定SOD活力,使用硫代巴比妥酸法测定MDA含量,使用BCA法检测组织蛋白的含量

EDA对肿瘤的作用效果:构建模型后20d,实施心脏灌流,进行冠状切皮。用HE将肿瘤最大切皮进行染色,测定切皮长宽径m和n,计算肿瘤体积V。V=π×m×n2/6

统计学方法:对所收集的数据采用SPSS 17.0进行分析,计量资料用()表示,用t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

浓度1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3的EDA进行作用,时间48 h,细胞出现30.8%、22.5%、13.4%、8.4%的增殖率。胶质瘤组织与正常脑组织相比,SOD的活力较小,MDA的含量较高,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

高剂量EDA组肿瘤的平均体积与低剂量EDA组比较,差异有统计学意义(P<0.05),高剂量EDA组肿瘤的平均体积与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),低剂量EDA组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

讨论

外层电子轨道上,存在不成对电子的原子、分子和原子团,这些粒子均称为自由基[1]自由基对肿瘤的治疗具有一定的作用,能够在一定程度上抑制肿瘤的发展[2]。使用化疗药物可能是通过产生自由基而加快肿瘤细胞死亡的[3]。然而,自由基同样参与肿瘤的产生与发展,对肿瘤的发展具有重要影响[4]。目前,尚不清楚自由基是促进肿瘤发展还是抑制肿瘤发展[5]。

本次研究,胶质瘤组织与正常脑组织相比,SOD的活力较小,MDA的含量较高,差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量EDA组肿瘤的平均体积与低剂量EDA组比较,差异有统计学意义(P<0.05)高剂量EDA组肿瘤的平均体积与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量EDA组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。可见,自由基清除剂EDA能够提高肿瘤细胞生长活力,促进其生长,自由基对肿瘤治疗存在一定的价值。

参考文献

[1]赵心同.氧自由基与脑胶质瘤瘤周水肿关系的实验研究[J].现代生物医学进展,2011,3(2]:428-431.

[2]赵洪洋.脑胶质瘤治疗中自由基清除剂的价值[J].中华肿瘤防治杂志,2011,8(3):571-574.

[3]罗敏捷.恶性胶质瘤组织MGMT基因启动子甲基化状态及蛋白表达与患者临床预后的相关性研究[D].南方医科大学,2012,11(2):15.

[4]戴宜武.脑胶质瘤治疗进展[J].中华临床医师杂志(电子版),2013,14(7):6225-6228.

自由基清除剂 篇5

[关键词] 青钱柳;提取物;脂质过氧化;自由基

文章编号:1003-1383(2009)04-0381-03

中图分类号:R 963

文献标识码:A

青钱柳[Cyclocarya paliurus(Batal) Iljinskaya](CPS)又名青钱李(江西),系双子叶植物纲(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属植物,它是我国独有珍稀树种资源[1],分布于广西、江西、浙江等地的山区、溪谷或石灰岩山地,为广西特色植物。据《中国中药志要》记载,其树皮、树叶具有清热解毒,止痛功能,可用于治疗顽癣。长期以来民间用其叶片做茶,因其味甜有清热解暑、降糖、降压的功效,又称为甜茶,神茶等[2]。青钱柳干叶的主要成分有糖、氨基酸、有机酸、黄酮、酸性物质、内酯、香豆精、三萜及皂甙、甾醇等[2]。我国从1970年开始对青钱柳进行药用开发研究,发现青钱柳具有明显的降血糖、降血压、减肥、抗肿瘤、抗衰老、抗过敏、清热解暑、提高人体免疫力、促进新陈代谢等多种功效,尤其对治疗糖尿病有显著疗效[3]。本实验对青钱柳不同提取物的体外抗氧化性进行了研究,为更进一步开发青钱柳保健产品提供理论依据。

材料与方法

1.动物 昆明种小鼠,雌雄各半,体重(20±2)g,由桂林医学院实验动物中心提供。

2.实验材料与仪器 青钱柳采自广西阳朔县白沙镇青钱柳基地,752GW型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)、FA2004电子天平(上海精科天平)、小型三用水箱(北京医疗设备厂)、XHB型旋涡混合器(江苏康健医疗用品有限公司)、LD0.8离心机(北京医用离心机厂)、旋转蒸发器(RE52型,上海亚荣仪器厂生产)。

3.试剂 丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、蒸馏水、邻二氮菲、硫酸亚铁、过氧化氢均为分析纯,PBS液为自制。



4.实验方法

(1)青钱柳不同溶剂提取物的制备 取烘干过筛的青钱柳粉末,分别按固液比1∶20加入去离子水,用旋转蒸发器提取2 h,过滤,去残渣。滤液分两部分,一部分加入80%乙醇提取后再用水提取,利用水提醇沉淀法[4]用三氯醋酸去蛋白质后得到青钱柳多糖合物,另一部分加入80%乙醇,提取1.5 h,分别用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取,得正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、石油醚提取物,最后剩余的为水提物。各提取物均用真空浓缩至膏状,并于40℃真空干燥,冷藏备用。

(2)CPS对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的影响 小鼠禁食12 h后摘除眼球放血处死,取肝,在0~4℃下用生理盐水制成5%肝匀浆。实验分为对照组(10%肝匀浆)、阳性组(VitC)和高、中、低3个剂量的青钱柳提取物组(10%肝匀浆和青钱柳不同溶剂提取物配液)。以硫代巴比妥酸法测定MDA含量,并计算抑制率:

抑制率(IR)=(对照组MDA-提取物组MDA)/对照组MDA。

(3)CPS对羟自由基的清除作用

采用亚铁离子催化过氧化氢产生(•OH)的方法。在样品管中加0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液1 ml,PBS 2 ml和1 ml样品,旋涡混合器混匀后,加0.75 mmol/L的硫酸亚铁溶液1 ml,旋涡混合器混匀后,加0.01%过氧化氢溶液1 ml,置恒温水浴中37℃保温1 h。反应液置比色皿中,于分光光度计中在536 nm测定吸光度As。用1 ml蒸馏水代替1 ml样品,测定吸光度为Ap。吸光度为Ab的管不加过氧化氢和样品,都以蒸馏水代替。按以下公式计算羟自由基的清除率(d%):d%=(As-Ap)/(Ab-Ap)×100。

5.统计学处理 计量资料以均数±标准差(-±s)表示,采用EXCEL统计软件以t检验进行统计学处理,以P<0.05为有统计学意义。

结果

1.CPS对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的影响 青钱柳各提取物对MDA的生成均有抑制作用,随着各提取物浓度增加,部分提取物的抑制率也会相应增高。五种提取物中对MDA抑制最强的为正丁醇提取物,在浓度为1.0 mg•ml-1时,对小鼠肝组织自发性MDA的抑制率大小为:正丁醇>石油醚>多糖>水>乙酸乙酯。见表1。

表1 CPS对小鼠肝脏自发性脂质过氧化的影响(-±s,n=6)

组别浓度(mg•ml-1)MDA(nmol•mgprot-1)抑制率(%)

对照组 11.388 ±0.306

VitC1.06.831±0.221※40.0

正丁醇提取物0.18.826 ±0.405※22.5

0.56.522 ±0.385※42.7

1.05.646 ±0.363※50.4

水提物0.19.742 ±0.164※14.5

0.58.715 ±0.325※23.5

1.07.844 ±0.386※31.1

多糖合物0.18.652 ±0.368※24.0

0.56.788 ±0.386※40.4

1.07.257±0.383※36.3

乙酸乙酯提取物0.18.531 ±0.459※25.1

0.58.848 ±0.317※22.3

1.08.528 ±0.388※25.1

石油醚提取物0.19.284 ±0.315※18.5

0.57.488 ±0.243※34.2

1.07.081 ±0.571※37.8

注:与正常对照组比: ※P<0.01

2.CPS对羟自由基的清除作用 CPS对•OH有清除作用,且作用较强。特别是正丁醇提取物、水提物和多糖合物,最高清除率可高达80%以上。随着各提取物浓度的增加,对•OH自由基的清除率不断增大。但到了一定浓度,再增加其浓度,反而清除率有所降低。

半清除率(IC50)指清除率为50%时所需样品的浓度,根据不同浓度样品的清除率作曲线求出。所需浓度越低,表明半清除率越高,清除效果越好。通过计算所得IC50值,可比较各青钱柳提取物对羟自由基的清除率:水>石油醚>正丁醇>多糖>乙酸乙酯。见表2。

表2 CPS对•OH自由基的清除作用(-±s,n=6)

观察项目水提物

石油醚提取物

正丁醇提取浓度(mg•ml-1)0.020.050.100.150.300.250.300.400.050.100.15

0.300.50

清除率(%)33.7±1.243.1±1.552.5±0.961.0±1.294.5±1.741.3±0.753.9±1.675.7±1.2

3.0±0.99.2±1.719.0±01.641.7±1.290.4±1.2

IC50(mg•ml-1)0.09

0.29

0.31

(续)表2

观察项目多糖合物

乙酸乙酯提取物

浓度(mg•ml-1)0.300.400.500.600.700.800.900.250.300.350.40

清除率(%)44.3±0.955.0±00.762.4±1.171.0±60.780.0±0.987.8±0.983.9±1.218.6±0.9

40.1±1.247.7±0.721.6±1.2

IC50(mg•ml-1)0.33

0.35

讨论

青钱柳为广西特有珍稀植物,对它的开发利用还十分有限,青钱柳既有明显的药理价值又具备一定的食品保健功能,进行工业化开发利用前景十分广阔。针对青钱柳叶中含有黄酮、多糖、内酯等多种有效成分,本实验提取了五种青钱柳提取物,考察青钱柳的体外抗氧化活性,为其药理作用提供科学依据。

脂质过氧化产物丙二醛等可导致人体细胞氧化损害、老化、致癌和动脉硬化等多种疾病。过氧化脂质大部分由肝细胞产生,其分解也主要在肝脏。MDA是过氧化脂质的主要降解产物,其含量可反映脂质过氧化的程度。故MDA的水平测定可用作检测抗过氧化作用。本实验结果表明,CPS可明显降低小鼠自发性MDA的生成,且活性与浓度有明显的量效关系。

羟自由基是反应药物抗氧化活性的重要指标。本实验利用Fenton反应产生羟自由基:H2O2+Fe2+=•OH+OH+Fe3+。Fe2+与邻二氮菲生成红色配合物,加入CPS后,减弱了•OH对Fe2+/邻二氮菲的氧化作用,引起自由基的变化,通过测定其吸光度值的变化,推断CPS对•OH的作用。结果表明CPS对羟自由基有较好清除作用,是天然高效的自由基清除剂。

CPS较高的体外抗氧化活性可能与其中含有黄酮类化合物有关。黄酮类化合物具有的多酚结构,能提供活泼质子,与自由基结合成稳定的产物,因而有较强的抗氧化作用[5]。黄酮类成分具有保肝、扩冠、抗炎、降低血管脆性,解除痉挛,增强心脏收缩,还有一定程度的抗菌及抑制肿瘤细胞等作用。同茶叶相比,青钱柳黄酮类化合物含量相对较高,可作为这些物质的补充源[6]。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].第21卷.北京:科学出版社,1979,18-19.

[2]谢明勇,李 磊.青钱柳化学成份和生物活性研究概况[J].中草药,2001,32(4):365-366.

[3]柳板誉,梁彦兰.混交林中青钱柳生长规律的研究[J].江西农业大学学报,2004,26(3):381-385.

[4]王著禄,陈海生,郑钦岳,等.商陆多糖的分离和纯化[J].第二军医大学学报,1990,11(1):56.

[5]张培刚,郑鸿雁,昌有权,等.松针黄酮的体外抗氧化作用研究[J].食品科学,2005,26(9):506-508.

[6]谢明勇,王远兴,温辉梁,等.青钱柳中黄酮甙和维生素含量的测定[J].食品科学,2001,22(1):66-68.

(收稿日期:2009-05-18 修回日期:2009-07-15)

自由基清除剂 篇6

1 资料与方法

1. 1 一般资料选取2014 年1 月~2015 年8 月到本院就诊的99 例急性脑梗死患者, 均符合全国第四届脑血管病会议[1]中急性脑梗死诊断标准;认知功能良好;无相关药物禁忌证。男64 例, 女35 例;年龄35~76 岁, 平均年龄 (58.3±12.5) 岁。按照治疗方法分为治疗组 (57 例) 和对照组 (42 例) 。

1. 2 方法两组患者入院后及时给予常规治疗, 脱水、降颅压、改善微循环、预防感染、抗凝、止血, 纠正患者水电解质、酸碱紊乱, 营养神经, 合理饮食, 注意保护脑细胞。对照组患者采取自由基清除剂治疗, 取30 mg依达拉奉+0.9%氯化钠注射液100 ml静脉滴注, 2 次/d, 连续2 周。治疗组在对照组基础上联合亚低温治疗, 以降温毯维持肛温32~34℃ , 头戴冰帽, 在6 h内控制温度32~34℃ , 患者治疗5~7 d。患者在结束亚低温治疗后, 每4~6 小时复温1℃ , 使直肠温度恢复至36.5~37.5℃。患者在接受亚低温治疗期间, 密切注意患者血压、呼吸、心率、血钾、神志等变化。

1. 3 疗效评价标准[2]基本痊愈:患者症状、体征恢复正常, 神经功能缺损评分 (NIHSS评分) 减少≥ 90% ;显效:症状、体征改善明显, NIHSS评分降低46%~89%, 病残1~3 级;有效:症状、体征减轻, NIHSS评分降低18%~45%;无效:症状、体征无变化或加重, NIHSS评分降低<18%。总有效率= ( 基本痊愈+ 显效+ 有效) / 总例数 ×100%。

1. 4 统计学方法采用SPSS18.0 统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差 ( ±s) 表示, 采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 采用 χ2检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 两组患者治疗效果对比治疗组基本痊愈17 例, 显效24 例, 有效14 例, 无效2 例, 总有效率为96.5% ;对照组基本痊愈4 例, 显效10 例, 有效19 例, 无效9 例, 总有效率为78.6%。两组对比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2. 2 两组患者治疗前后血糖、血乳酸对比治疗前两组患者血糖、血乳酸对比, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。治疗后两组患者血糖、血乳酸较治疗前明显降低, 治疗组治疗后血糖、血乳酸低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

注:与治疗前对比, aP<0.05 ;与对照组对比, bP>0.05, cP<0.05

3 讨论

氧自由基的产生与脑缺血再灌注组织损伤密切相关, 脑组织在产生大量氧自由基后, 脑梗死发生后会导致脑组织出现缺血再灌注损伤。脑组织内存在丰富的不饱和脂肪酸, 易被氧化, 属于自由基连锁反应和脂质过氧化作用产物, 因此脑组织内抗过氧化能力及清除自由基的能力相较于其他组织明显降低[3]。而脑组织在发生缺血、缺氧后, 氧自由基不断生成并增多, 导致脑损伤进一步加重。氧自由基清除剂的应用, 是临床改善患者神经功能、修复脑损伤的主要措施。

依达拉奉是临床强效的自由基清除剂, 通过清除脑组织氧自由基, 抑制自由基的级联损伤, 修复脑细胞损害, 改善脑组织供血供氧, 抑制细胞凋亡, 促使神经功能修复。同时依达拉奉可抑制机体炎症介质的释放, 减轻机体炎症反应, 以此保护脑细胞。依达拉奉亲脂性强, 易透过血脑屏障, 血药浓度较高且稳定, 安全性高。

患者在发病后, 脑血流量氧供和脑组织氧供的平衡关系被破坏, 致脑组织缺血缺氧。通常脑组织通过葡萄糖行无氧酵解分解, 使脑组织、血浆及脑脊液乳酸含量增高, 致高血糖、高血乳酸。高血糖会增加患者血浆渗透压, 损害细胞膜功能, 致神经细胞代谢紊乱。高血乳酸会损伤脑组织微循环, 致神经功能进一步损伤。亚低温的应用对脑缺血的保护已得到证实。亚低温是降低患者体温致理想状态, 可改善脑组织缺血缺氧状态, 减轻机体脂质过氧化反应, 提高体内自由基清除能力。机体在亚低温下, 会抑制机体氧自由基的产生和连锁反应, 减轻缺血神经元的损伤, 保护脑组织细胞功能。亚低温通过降低缺血区颅内温度, 抑制一氧化氮合成酶活性和氧自由基产生, 保护神经元功能;同时降低脑组织耗氧量, 稳定细胞各质膜, 减轻脂质过氧化, 维持脑组织血供氧供平衡状态, 改善机体神经细胞代谢, 促进患者神经功能恢复。

综上所述, 对急性脑梗死患者采取自由基清除剂联合亚低温治疗, 效果显著, 临床价值高, 值得临床推广使用。

摘要：目的 分析自由基清除剂与亚低温结合治疗急性脑梗死的临床效果。方法 99例急性脑梗死患者, 随机分为对照组 (42例) 与治疗组 (57例) 。对照组经自由基清除剂治疗, 治疗组经自由基清除剂联合亚低温治疗。比较两组治疗效果。结果 治疗组总有效率 (96.5%) 高于对照组 (78.6%) (P<0.05) ;治疗前两组患者血糖、血乳酸对比, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。治疗后两组患者血糖、血乳酸较治疗前明显降低, 治疗组治疗后血糖、血乳酸低于对照组 (P<0.05) 。结论 对急性脑梗死患者采取自由基清除剂联合亚低温治疗, 效果显著, 值得临床推广使用。

关键词：自由基清除剂,亚低温,急性脑梗死

参考文献

[1]戴建明.亚低温治疗对中度脑外伤患者炎症细胞因子的影响.实用心脑肺血管病杂志, 2009, 17 (14) :250-251.

[2]刘春燕, 花爱辉, 李嘉民, 等.自由基损伤在急性脑梗死合并代谢综合征发病中的作用.中国全科医学, 2010, 13 (7) :2206.

自由基清除剂 篇7

1 临床资料

1.1 一般资料

所有78例研究对象均为2008年10月至2010年12月在我院住院化疗的急性脑梗死患者, 其中男43例、女35例, 年龄最大75岁, 最小46岁, 平均年龄 (60.6+2.3) 岁。

1.2 分组与用药

随机将上述78例患者分为实验组和对照组, 每组均为39例, 实验组用依达拉奉联合亚低温治疗, 对照组单纯用依达拉奉治疗。实验组男20例, 女19例, 年龄46～74岁, 平均年龄 (59.8+3.1) 岁;分型:大梗死10例, 小梗死15例, 腔隙梗死14例。对照组男21例, 女18例, 年龄47～75岁, 平均年龄 (61.2+2.4) 岁;分型:大梗死12例, 小梗死14例, 腔隙梗死13例。2组患者在性别、年龄、分型等各方面进行比较, 均不具有显著性差异 (P>0.05) , 具有可比性。

1.3 观察记录

观察并记录患者的病情变化情况和药物可能引起的不良反应, 根据《新药临床研究指导原则》所定。有效:症状体征明显改善, 梗死面积缩小较大, 肌力提高二级以上;显效:症状体征有所改善, 梗死面积缩小, 肌力提高一级以上;无效:症状体征无改善, 其他项目也无改善, 有效和显效统归为有效。

注:经计算χ2=5.64>χ20.05=3.84, 所以P<0.05, 2组的治疗效果具有统计学差异, 实验组的治疗效果优于对照组

注:经计算χ2=3.95>χ20.05=3.84, 所以P<0.05, 2组的治疗效果具有统计学差异, 实验组的不良反应发生率明显低于对照组

1.4 统计结果

运用SPSS 13.0统计学软件进行处理, 运用卡方检验 (χ2) 对结果进行统计, 以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 有效率比较

实验组39例中25例有效, 对照组39例中34例有效, 有效率分别为64.10%和87.18%, 两者对比见表1。

2.2 不良反应发生情况

研究过程中记录到的实验组和对照组的不良反应发生例数分别为3例和9例, 不良反应发生率分别为7.69%和23.07%, 见表2。

3 讨论

脑梗死又称缺血性脑卒中, 是指局部脑组织因血液循环障碍, 缺血、缺氧而发生的软化坏死。它主要是由于供应脑部血液的动脉出现粥样硬化和血栓形成, 使管腔狭窄甚至闭塞, 导致局灶性急性脑供血不足而发病。脑梗死是脑血管病中最常见者, 约占75%, 病死率平均10%～15%, 致残率极高, 且极易复发。临床常表现为头痛, 眩晕, 耳鸣, 半身不遂等。急性脑梗死的治疗尤为重要。依达拉奉作为一种近年来被广泛应用的自由基清除剂, 被越来越多地运用于急性脑梗死的治疗中, 而亚低温疗法也是被广泛应用于急性脑梗死治疗的方法之一。

本研究通过将2种治疗急性脑梗死的方法联合起来, 发现联合之后治疗作用明显增加, 而相应的不良反应的发生率反而明显降低, 二者联合是一种不错的治疗方法, 值得在临床推广使用。但是对于为何二者联合之后药效增加, 而毒副作用减弱, “增效减毒”的机制何在?还需要我们进一步的探究。

参考文献

[1]李玉林.病理学[M].第7版.北京:人民卫生出版社出版, 2007.

自由基清除剂 篇8

1 仪器与材料

HY - 3A多功能振荡器,江苏金坛市金南仪器厂; UV -2550PC紫外可见分光光度计,日本。

绞股蓝,产自浙江丽水。将绞股蓝60 ℃ 烘干,粉碎过40 目筛,样品密闭避光保存,备用。芦丁对照品,二苯基苦基苯肼( DPPH) ,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2. 1 绞股蓝中黄酮类物质的提取

参考文献[6 - 8]的提取方法。准确称取1. 0 g的绞股蓝样品,于250 m L锥形瓶中,分别加入30 m L 80 ℃ 的蒸馏水和30 m L 25 ℃ 50% 的乙醇溶液( 固液比1 ∶30) ,设置一定温度浸取10 min,置于多功能振荡器上振荡30 min,抽滤得提取液,密闭、避光储存,备用。

2. 2 芦丁标准曲线的制作

准确吸取不同体积的芦丁标准溶液于7 支25. 00 m L比色管中,加入5% 亚硝酸钠溶液1. 0 m L,10% 硝酸铝溶液1. 0 m L混匀,室温静置6 min,最后加入4% 氢氧化钠溶液10 m L,蒸馏水定容至25. 00 m L,室温静置15 min,510 nm波长处测得其吸光度,绘制A - C标准曲线。

如图1 所示,得线性回归方程: y = 12. 162x + 0. 0002,R =0. 9993。

2. 3 提取液中黄酮类物质含量的测定

参考文献[9]测定提取液中总黄酮含量。分别用吸量管准确吸取50% 乙醇绞股蓝提取液和80 ℃ 水绞股蓝提取液各1 m L于25 m L比色管中,加入5% 亚硝酸钠溶液1 m L混匀,室温静置6 min,然后加入10% 硝酸铝溶液1 m L混匀,室温静置6 min,最后加入4% 氢氧化钠溶液10 m L,加蒸馏水定容至25. 00 m L,室温静置15 min,510 nm波长处测得其吸光度分别为0. 1473 和0. 4390。由线性回归方程知,25 ℃ 50% 乙醇绞股蓝提取液和80 ℃ 水绞股蓝提取液中黄酮类物质的浓度分别为0. 012 mg / m L和0. 036 mg / m L。计算得到两种不同绞股蓝提取液中黄酮的含量分别为0. 6% 和1. 8% ,即6. 00 mg/g和18. 0 mg / g。

2. 4提取液清除DPPH自由基的能力与黄酮类物质量效关系

在1 号试管中依次加入2. 5 m L 6. 5 × 10- 5mol / L DPPH溶液和1. 5 m L体积分数为50% 的乙醇溶液,纯水稀释至10. 00m L,混匀,室温静置20 min,于517 nm处测定其吸光度记为A0,在2 号和3 号试管中分别加入2. 5 m L 6. 5 × 10- 5mol / L的DPPH溶液和相同体积的两种绞股蓝提取液,纯水稀释至10. 00m L混匀,室温静置20 min后,于517 nm处测定其吸光度记为As1和As2; 在4 号和5 号试管中分别加入2. 5 m L 50% 的乙醇溶液和等体积的两种绞股蓝提取液,纯水稀释至10. 00 m L混匀,室温静置20 min,于517 nm处测定其吸光度记为Ar1和As2。

按以下公式计算提取液对DPPH自由基的清除率,结果见表1,表2。

从表1 可以看出: 80 ℃ 水绞股蓝提取液对DPPH自由基有清除效果,且效果很明显。测定液中黄酮类物质含量在0. 09 ~0. 27 mg /10 m L范围内对DPPH清除率随浓度上升明显提高。但当测定液中黄酮类物质浓度达到0. 36 mg/10 m L时,清除率逐渐降低。这与有关报道相符[10,11],一些天然抗氧化剂在高浓度时会表现促氧化作用,对自由基清除能力下降。

从表2 可以看出: 25 ℃ 50% 乙醇绞股蓝提取液对DPPH自由基有清除效果,测定液中黄酮类物质浓度0. 15 mg/10 m L时,清除率可达40. 70%。测定液中黄酮浓度在0. 03 ~ 0. 15 mg/10 m L范围内对DPPH清除率随浓度上升而提高。比较表1 和表2 可以看出,80 ℃ 水绞股蓝提取液比50% 乙醇绞股蓝提取液对DPPH自由基的清除效果明显要好。说明提取液温度对提取效果影响明显; 随着提取液温度升高,绞股蓝中水溶性黄酮类物质含量较多。

3 结论

以80 ℃ 纯水和25 ℃ 50% 的乙醇溶液为提取溶剂,以普通震荡法提取绞股蓝中黄酮类( 包括儿茶素、原花青素) 物质,80 ℃ 纯水提取液中黄酮类物质含量较25 ℃ 50% 的乙醇溶液高得多,说明提取液温度对黄酮类物质提取效果影响较大。固液比均为1∶30 的80 ℃ 纯水绞股蓝提取液比25 ℃ 50% 的乙醇溶液绞股蓝提取液,清除DPPH自由基能力明显要好。说明80 ℃水绞股蓝提取液中水溶性黄酮类物质含量较多,符合人们平时喝茶保健习惯。清除自由基能力与提取物中黄酮类物质含量并不完全呈正比。因此,食品工业生产过程提取绞股蓝中黄酮类物质,可以用75 ~ 80 ℃ 普通纯水作为提取溶剂,既节约提取成本也便于规模化生产。

摘要：分别以80℃水和25℃50%的乙醇溶液为提取溶剂,固液比1∶30,以普通震荡法提取绞股蓝中黄酮类(包括儿茶素、原花青素)物质,紫外显色法测定两种提取液中黄酮类物质含量。结果表明:提取液中黄酮类物质含量分别为18.0 mg/g和6.00 mg/g,提取液温度对绞股蓝中黄酮类物质的提取效果影响较大。80℃水提取液比25℃50%的乙醇提取液清除DPPH自由基的能力更强;清除自由基能力与提取物中黄酮类物质含量并不完全呈正比。

自由基清除剂 篇9

自由基具有很强的化学性质, 正常生物体内自由基处于稳衡性动态[1]。当机体发生病变或受到外界环境污染, 电离辐射、化学毒物及药物的影响时, 可引发机体自由基稳衡态紊乱, 产生多种自由基, 自由基与衰老、癌症、心脑血管疾病及炎症的发生有密切的关系[2]。由于亚油酸的氧化性、使其可以用来作为抗氧化剂抗氧化活性的测定物之一, 常被用来做物质抗氧化活性的测定。

2 实验材料及仪器

(1) 杏仁油、葡萄籽油来自为超临界CO2萃取所得到的植物油, 其成分中均含有挥发性成分。 (2) 亚油酸购自美国sigema 公司, 邻菲罗林 , 邻苯三酚, 氯化亚铁, 硫氰酸铵等为国产。UV-U800型可见紫外双光分光光度计等。

3 实验方法

3.1 羟自由基体系检测物质清除自由基能力

原理:Fenton反应是生物体内产生.OH 的主要来源, 其反应式如下:

Fe2++H2O2―Fe3++OH-+.OH

其中的Fe2+可与邻菲罗啉生成红色络合物, 可作为反应中的氧化还原指示剂, 当向反应体系中加入羟基自由基清除剂时, 该反应向正方向进行, Fe2+不断减少, Fe2+-邻菲罗啉络合物随着Fe2+的不断减少颜色逐渐变浅, 通过测定其反应溶液在536nm处的吸光值 (OD值) , 其吸光值的变化可反应所加自由基清除剂对羟基自由基的清除能力。并计算其IC50值。

实验步骤:Fenton反应体系的建立。

该反应体系所需要的溶液及试剂为:PBS缓冲液 (这pH=7.4) 、邻菲罗啉无水乙醇 (0.75mol/L) 、去离子水、FeSO4溶液 (0.75mmol/L) 、双氧水 (0.01%, V/V) ;杏仁油无水乙醇溶液 、葡萄籽油无水乙醇溶液 (均分为0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.025 mg/mL、0.0125 mg/mL、0.00625 mg/mL)

操作方法:按表1顺序加入反应液 。

反应体系置于37℃恒温水浴锅中, 于准确反应1.5小时后立即取出并迅速测定其在536nm处的吸光度 (OD值) (蒸馏水作参比, 便于提高精度, 测三次, 取平均值)

清除率计算:I= (油样吸光度- A1) / A0×100

I样品对羟自由基的清除率, %

A0不含样品和双氧水的吸光度

A1不含样品只含双氧水的吸光度

3.2 超氧阴离子自由基清除体系

邻苯三酚在弱碱性环境中 (pH=8.2) 发生自身氧化分解产生O2.并不断积累, 导致反应在320nm处吸光度发生变化 (吸光度随反应地进行而线性增大) , 如果加入超氧阴离子自由基清除剂, 其吸光度会有所改变。通过测定反应时间内含清除剂的反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液相比较便可得出其对O2清除能力。

反应体系制备; 试剂及药品:Tris-Hcl (pH=8.2) 、重蒸水、邻苯三酚溶液 (30mmol/L) 杏仁油无水乙醇溶液 、葡萄籽油无水乙醇溶液 (均分为0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.025 mg/mL、0.0125 mg/mL、0.00625 mg/mL)

操作方法:按表2顺序加入反应液

备注:邻苯三酚溶液和反映体系均在25℃下配置并反应20min 后迅速取出320nm 处测吸光值, 双蒸水作参比, 测三次, 取平均值 (自氧化速率测定方法:每隔30s测一次吸光值, 计算线性范围内每1min吸光值增值)

O2.清除率计算R= (V空-V样) /V空×100

R-样品对O2.清除率

V空-邻苯三酚自氧化速率

V样-加入样品后氧化速率

实验数据用Excel2003和SPSS11.5数据分析软件进行处理

4 结果与分析

4.1.1 羟自由基体系不同浓度油样添加物对羟自由基清除率 (见表3)

4.1.2 样品检测结果的精密度分析数据 (见表4)

4.2.1 样品对超氧阴离子自由基清除率 (见表5)

4.2.2 样品检测结果的精密度分析数据 (见表6)

5 结果与讨论

自由基清除剂 篇10

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

桦褐孔菌子实体, 干燥、粉碎备用。SOD、MDA、CK、BUN和LDH试剂盒购自南京建成生物工程研究所, 其余试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物

清洁级雄性昆明种小鼠, 体重20~22g, 在室温25℃、湿度50%条件下适应性饲养, 饲养方式采用立体笼式饲养, 给予标准饲料, 自由饮水。

2 实验方法

2.1 精致多糖的制备

取桦褐孔菌干燥子实体的粗粉, 用95%乙醇回流提取, 提取液减压回收溶剂, 得乙醇提取物。加水煎煮提取, 所得水提取液浓缩加乙醇至含醇量达80%, 静置、抽滤, 得粗多糖, 反复醇沉后, 沉淀用丙酮洗涤3次, 抽滤, 得精制多糖 (PS) 。

2.2 自由基清除率的测定

2.2.1 样品制备

称取10mg PS, 溶解于1mL无水乙醇中, 浓度为10mg mL。依次稀释为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg mL、0.0625mg/mL、0.0313mg/mL。

2.2.2 自由基清除率的测定

采用DPPH分析法评价抗氧化活性。517nm处测定吸光度。分别取50μLPS乙醇溶液于96well中, 每样4孔, 再分别加入200μLDPPH的乙醇溶液 (DPPH浓度为1.2×10-5mol L) , 混合均匀, 放置30min, 用酶标仪在517nm处测定其吸光度Ai。同时测200μL DPPH溶液+50μL乙醇混合后的吸光度A0和50μL样品液+200μL乙醇混合后的吸光度Aj, 按下式计算自由基清除率:

2.3 动物实验

将小鼠随机分为对照组、模型对照组、PS-L、PS-M、PS-H5组。后3组每天分别给予PS (100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg) , 剂量选择根据人体推荐剂量的10倍、20倍和30倍, 确定低中高3组剂量。对照组和模型对照组每天给予等剂量赋形剂。对照组不进行游泳训练, 模型对照组及PS给药组连续进行游泳训练10d, 每天30min, 第11天, 5组小鼠均进行1次尾部负荷体重5%的力竭性游泳, 最后下沉经10s后不能返回水面为力竭。力竭游泳结束后, 即刻进行颈动脉、肝脏采血, 分离血清, 测定血清CK、BUN、LDH含量, 测定肝脏SOD、MDA含量, 所有测定皆按试剂说明进行。

2.4 数据处理

采用Graphpad Prism软件, 测定值用x軃±s表示, 用“One-way ANOVA and Turkey’s multiple comparison tests”进行多组数据间对比。

3 结果

3.1 自由基清除率测定

测定不同浓度PS对DPPH自由基的清除率, PS随着浓度增加, 自由基清除率逐渐增高, 表明其清除能力与浓度有一定的量效关系, 但当PS增加到0.5mg/mL时, 清除率基本不变。结果如表1所示。

3.2 力竭游泳后各项指标

与对照组相比, 模型对照组小鼠游泳后, 抗氧化能力降低, 丙二醛、血清乳酸脱氢酶、尿素氮和肌酸激酶水平升高, 差异均有显著性意义 (P<0.05) 。与模型对照组相比, PS给药组小鼠抗氧化能力有所回升, 丙二醛、血清乳酸脱氢酶、尿素氮和肌酸激酶水平有所下降, 其中PS-M和PS-H给药组 (200mg/kg和300mg/kg) 5项指标改变与模型对照组比较具有显著性差异 (P<0.05) , 如表2所示。

注:与对照组进行比较, #P<0.05;与模型对照组进行比较, *P<0.05。

4 讨论

目前有关抗氧化疲劳中药提取物的研究, 尤其是关于桦褐孔菌的研究在国内外尚未有报道, 对其与血糖、血乳酸、血尿素氮、总抗氧化力变化关系的研究也非常少。运动耐力的提高是抗疲劳宏观表现, 力竭游泳实验可以用于反映动物运动疲劳程度, 通过对游泳后小鼠相关血清指标的测定可以反映桦褐孔菌多糖抗小鼠运动疲劳的能力。研究表明桦褐孔菌多糖具有良好的清除自由基能力, 且随着浓度增加自由基清除率逐渐增高, 一定浓度后清除率基本不变。机体不正常的代谢骤然产生大量的氧自由基, 当氧自由基的数量超过体内抗氧化防御能力时, 必然导致运动性疲劳[2]。SOD、MDA、CK、BUN和LDH是体内蛋白质代谢相关产物, 是评价运动性疲劳强度的重要指标。本实验表明桦褐孔菌多糖能显著降低小鼠运动后MDA、CK、BUN和LDH含量, 升高SOD, 提高运动耐力, 具有良好的抗疲劳作用。

参考文献

[1]戴芳澜.中国真菌总汇[M].北京:科学出版社, 1979.