DNA突变分析（精选3篇）
DNA突变分析 篇1
根癌农杆菌介导的遗传转化由于操作简单、转化效率高、插入片段稳定性好、已被广泛应用于植物转基因研究。具体思路是将外源T—DNA转入植物基因组, 以T—DNA作为插入标记, 来分离或克隆因为插入而失活的基因并研究基因功能。由于T—DNA左右边界及内部的基因结构是已知的, 因此对获得的转基因T-DNA插入突变体就可以通过已知的外源基因设计引物, 利用相应的PCR策略进行突变基因的克隆和序列分析, 对比突变的表型进而研究基因的生理生化功能。
1 T-DNA插入突变简介
T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列, 它能整合到植物基因组中并稳定地表达。T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入, 多为单拷贝。单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中, 就会表现出孟德尔遗传特性, 在后代中长期稳定表达, 且插入后不再移动, 便于保存。早期研究认为, T-DNA在基因组中的整合是一个随机过程, 没有明显的偏爱性。以T-DNA作为插入元件, 不但能破坏插入位点基因的功能, 而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化, 为该基因的研究提供有用的线索。由于插入的T-DNA序列是已知的, 因此可以通过已知的外源基因序列, 利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析, 并对比突变的表型研究基因的功能。还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列, 建立侧翼序列数据库, 对基因进行更全面的分析。由此可见, T-DNA插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
2 T—DNA标签的应用
2.1 大规模的植物基因功能分析
大规模的植物基因功能分析目前使用最多的是插入突变的策略。由于农杆菌介导的T-DNA转化方法具有高效、重复性好、简便易行和表达稳定等优点[8], 而且技术已经非常成熟, 大多数植物都可以使用。此外T—DNA插入随机比, 插入的位点可以贯穿整个基因组, 甚至达到饱和, 尤其像拟南芥这样的基因组很小的植物几乎可以标签到所有的基因。因此使用T—DNA作为插入突变源进行突变体的筛选并进行基因功能的研究在许多植物中应用并取得成功。现在拟南芥已经有几个大规模的T—DNA插入突变体库供人们进行研究, 美国Salk基因组分析实验中心的Salk T—DNA库就是其中之一。这些大规模的T—DNA插入库为拟南芥基因功能的进一步研究提供了有利的工具。
2.2 时空特异性启动子和表达基因的分离
如果在插入T—DNA的一端安置一个报告基因, 该报告基因没有启动子或只带有弱小的启动子, 本身不表达或表达量极低。当这样的结构整合到宿主基因组时, 如果报告基因位于内源启动子之下或者增强子附近, 或者与内源的基因进行融合就被激活表达, 并反映出正常内源基因的表达模式。利用该项技术 (trapping vector) 可以较方便地分离到一些特异性启动子和特异时空表达的基因, 而不必一定要产生突变表型。这种方法已经被成功地应用于植物启动子和基因的克隆中。
Puzio利用启动子标签法标记到一个与线虫取食有关的基因pyk20, 对该基因在各种外源激素处理和逆境胁迫反应中的基因表达模式进行研究发现, 生长素、细胞分裂素和线虫取食处理植物可提高该基因的转录水平, 而温度胁迫和外源ABA处理降低该基因的转录水平, 分析携带gus基因的转基因系和野生型的序列, 结果显示外源T—DNA插入到了该基因的启动子处。
2.3 T—DNA插入突变体库及侧翼序列库的构建
T—DNA插入突变最大的用处是构建突变体库, 在此基础上构建侧翼序列库;目前在拟南芥中已经建立了接近饱和的T—DNA插入突变体库, 该突变体库包含超过225000个独立的T—DNA插入株系, 在预测的29454个基因中有21700个基因发生了插入突变[11]。含T~DNA激活标签的拟南芥群体已经获得, 并且在这些群体中已经获得大量的异常突变体和被标记基因。Sessiens等采用Tail—PCR的方法分离了拟南芥插入突变体库85108条T—DNA侧翼序列。结果表明, 平均约1000个拟南芥激活标签转化子能发现一个形态学突变。水稻中已建立了具有一定规模的突变体库, 但远没有达到饱和的程度。水稻上大约获得了47932个T—DNA插入株系和3290个水稻激活标签转化子, 同时扩增出27621个侧翼序列。An等从6749个水稻标签系中分离了3793条T—DNA侧翼序列, 并建立了侧翼序列数据库
3 T—DNA插入突变技术存在的问题及发展方向
随着大量基因序列的获得, 基因功能的研究变得日益重要。T-DNA插入由于其自身的优越性已成为研究基因功能的重要工具。T-DNA插入突变已被广泛应用于拟南芥、水稻等模式植物的突变体库构建, 并逐渐被用于番茄、矮牵牛、香蕉、豆类的研究。但是该方法仍有一定的局限性。T—DNA插入突变的研究还主要局限于少数模式植物。究其原因, 一方面是由于植物本身的生物学特性和遗传特性所致。另一方面, T—DNA标签载体也在很大程度上影响着研究进程与研究结果。目前的标签载体大多采用Ca MV35S增强子元件, 而Ca MV 35S增强子具有组织特异性。再就是T-DNA转移和整合机制迄今尚不完全清楚, 有时会出现多拷贝插入, 且容易产生直接的串联、反向重复和边界缺失, 而且在组织培养过程中也会产生突变, 这些都增加了突变基因的分析难度, 给研究工作带来很大困难。
目前, 以T-DNA插入突变体为基础的分离、鉴定和分析基因功能的方法在决定基因组基因功能的研究中逐渐扮演重要角色。可以预见, 在不久的将来会有更多的植物基因被克隆和鉴定, 特别是控制重要农艺性状的基因, 这无疑将会给农业生产带来极大的收益。
DNA突变分析 篇2
有的城市即使年代久远依然能保持美丽和优雅 (比如伦敦) 。而有的城市并不太古老, 却看起来破破烂烂, 似乎需要进入城市ICU (重症加护病房) 。身体拥有自己的基因, 每一座城市也都有自己的基因代码。
摘要：城市、建筑与文化之关系, 是《建筑与文化》的关注点, 也是中国建筑文化研究会的关注点。中国建筑文化研究会所属中国古城文化研究院仍围绕这一焦点, 只是将目光聚焦到具有历史文化资源的城市、建筑发展上。实际上, 中国古城的保护与发展问题, 既有特性, 又有共性, 需要的不仅是官方、学界的建制, 还需要民间智囊团体的参与, 需要智囊团体之间的横向联合, 共同为中国城市、建筑发展鼓与呼。中国西部作为文化富集区域, 在成都, 读城智库研究院依托成都市城市科学研究会、四川省社会科学院等单位, 多年来通过广泛的社会联络, 逐渐明确了自己的研究课题, 形成了自己的研究特点, 积淀了一批研究成果, 在西部, 特别是成渝地区发挥越来越重要的作用。本期开始, 古城专辑板块将陆续刊登读城智库研究院的部分研究成果。除此之外, 中国建筑文化研究会所属中国古城文化研究院与读城智库研究院达成全面战略合作关系, 将从专家团队、理论框架、项目实践、成果研讨、出版推广等方面实现全方位的优势互补、共赢合作, 共同提升中国城市、建筑领域内的跨领域研究、实践水准。
DNA突变分析 篇3
1 材料与方法
1.1 病例资料
自2008年10月-2010年6月,在本院收治的IIIb～Ⅳ期肺腺癌患者42例,其中男性17例,女性25例,年龄30～83岁,<40岁者2例，40～49岁者10例，50～59岁者10例，60～69岁13例，≥70岁者7例，平均年龄(59.3±10.7)岁，中位年龄62岁。组织类型全为肺腺癌，所有患者均在知情同意后采集血样。
1.2 EGFR基因检测
经前臂静脉采集外周血液约5 m L,4℃放置过夜后离心分离血清。血清游离DNA提取后检测，检测内容：EGFR基因的外显子19(E19）和外显子21(E21）；检测方法：突变富集-液相芯片联用法；主要材料：surplexTM肿瘤靶向治疗靶标检测液相芯片（系列）；主要设备：液相芯片阅读仪；检测单位：广州益善生物技术有限公司。
1.3 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKi）的治疗
治疗方案是口服吉非替尼250 mg/d或厄罗替尼150mg/d，直至病情进展。治疗开始后前3个月每月评估疗效,随后每2个月评估1次。疗效评判标准依据实体肿瘤疗效评估指南。
1.4 统计学方法
统计学处理采用SPSS 13.0软件进行方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 42例肺腺癌患者外周血游离DNA的EGFR基因突变和临床情况见表1,总体EGFR基因检测结果：突变率47.6%（20/42例），E19缺失28.1%（11/42例），E21突变35.7%（15/42例）。42例中有11例长期大量吸烟（>400年支），突变型患者中仅3例，野生型有8例。
2.2 20例EGFR基因突变者，女性患者11例，占55.0%，服用TKIs疗效RR 60.0%(12/20)，DCR 85.0%(17/20)，TTP 72～637天，中位TTP172.5天；22例野生型服用特罗凯疗效RR 13.6%(3/22例)，DCR36.4%(8/22例)，TTP 36～221天，中位TTP 108天。组间ORR、DCR、中位TTP比较,差异存在统计学意义。见表2。
3 讨论
在晚期NSCLC的一线化疗后的总生存期（OS）是7.4～10.3个月，1年生存率为26%～43%，近年来疗效没有得到进一步的提高，因此在临床上需要一些新的治疗策略来改善患者的生存。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）的应用，为肺癌的治疗带来了新的希望。大量的临床研究证实，小分子TKIs药物（吉非替尼或厄洛替尼）对EGFR突变患者疗效较好。EGFR突变主要指19外显子的缺失和21外显子的点突变，占EGFR突变的绝大多数。IPASS研究、厄洛替尼西班牙SLCG研究、SATURN研究结果显示，EGFR突变的NSCLC患者在生存和缓解率获益令人印象深刻，毋庸置疑，EGFR突变是EGFR-TKIs个体化治疗的第一个明确靶点，也是NSCLC治疗的新里程碑。
但如何获取更准确，更简单易行的检测手段，一直是探讨的热点，近年国内外开始尝试血清循环DNA检测EGFR基因突变。业已证明,实体肿瘤(包括肺癌)患者的血循环中存在游离的肿瘤DNA,其来源主要是肿瘤组织中癌细胞凋亡后,癌细胞内的DNA释放入人体外周血,经癌组织来源的循环DNA中基因变异与循环血中DNA相一致,且肿瘤患者外周血游离DNA含量比正常健康人增高10倍[1,2]。EGFR基因突变是肿瘤特异性的体细胞遗传改变,这类突变基因仅存在于癌细胞中,体内所有正常细胞均属于野生型[3]。因而通过检测血清游离DNA的EGFR基因,可以筛选到这类肿瘤特异性的药效评估标志,从而为临床用药提供依据。最近,Kimura等[4]曾对27例Ⅲb～Ⅳ期非小细胞肺癌患者进行了血清EGFR检测,共检出突变13例(48.1%),吉非替尼的客观有效率为53.8%(7/13例),病情控制率为84.6%(11/13例),中位无进展生存时间为200 d,中位生存时间为611 d。而对EGFR野生型肺癌,吉非替尼的客观有效率为14.3%(2/14例),病情控制率为42.9%(6/14例),中位无进展生存时间为46 d,中位生存时间仅为232 d,2组间差异极为显著(P<0.01)。
本研究专门选择肺腺癌患者42例，血样中检出EGFR突变20例,突变率为50.0%,16例EGFR基因突变者进行TKIs靶向治疗,客观有效率为60.0%,疾病控制率为85.0%；TTP 72～637天，中位TTP172.5天。22例野生型TKIs治疗RR 13.6%，DCR 36.4%；TTP 36～221天，中位TTP 108天。突变型与野生型在客观疗效和疾病控制和中位TTP方面比较，差异有统计学意义。提示：依据外周血游离DNA中EGFR基因突变检测结果进行选择性靶向治疗,可以为部分肺腺癌患者提供了指导作用，尤其对于不耐受化疗兼无法获取组织学检测的腺癌患者，或多程放化疗后尚未使用TKi的肺腺癌病人。尽管尚存在一些需要解决的问题，但是由于晚期肺腺癌的组织难于获取，故外周血游离DNA中EGFR基因突变检测仍不失是一种临床治疗中可资参考的补充手段。而且血样采集方便，患者易于接受，该项技术值得临床应用。
参考文献
[1]张华,张国玲,许凯黎,等.卵巢癌血清3号染色体短臂基因杂合性丢失的研究[J].中华妇产科杂志,2002,37(5):298～300.
[2]BREMNES RM,SIRERA R,CAMPS C.Circulating tumor derived DNA andRNA markers in blood:a tool for early detection,diagnostics,and follow up[J].Lung Cancer,2005,49(1):1-12.
[3]董强刚,黄进肃,黄建,等.肺癌靶向治疗研究进展和我国肺癌的EGFR基因突变概况[J].肿瘤,2005,25(6):625-634.