肠道微生物群落结构

肠道微生物群落结构（精选6篇）

肠道微生物群落结构 篇1

水产养殖业作为一个快速发展的行业,在取得辉煌成就的同时,也不可避免地导致了诸多问题,如高密度养殖模式下出现的鱼类病害频发和药物滥用等,为了更加有效地防控病害发生和改善养殖水产品质量,通过在水产养殖过程中使用生物浮床[1,2,3]和微生态制剂[4,5]来调控和改善养殖水体水质条件,进而提高养殖效益和水产品品质已得到普遍认可。随着人类对生活品质的追求以及水产养殖技术的不断提高,作为重要水产养殖对象和重要蛋白质供应源的鱼类,其健康养殖和品质备受关注。

鱼类肠道微生物在形成过程中,有些微生物成为固有菌群,有些微生物则成为非固有菌群[6]。固有菌群是鱼类肠道不可或缺的组成部分,其在鱼类的营养吸收、免疫调节和疾病防御等方面发挥着重要作用。另外,固有微生物作为鱼类肠道微生物的优势菌群,能作为肠道黏膜表面的天然物理屏障,抵抗致病菌的入侵;而非固有微生物在正常情况下通常能够维持鱼类肠道微生物的动态平衡。当肠道内外环境条件如水温、酸碱度等发生改变,非固有微生物中的病原菌或条件致病菌就会发生恶性增殖,破坏原有的动态平衡,导致疾病的发生[7]。因此,研究鱼类肠道微生物菌落的群落结构对于鱼类的健康绿色养殖具有重要的意义。

鱼菜共生模式是一种结合生物浮床技术的新型健康生态养殖技术,已有研究表明鱼菜共生养殖模式在改善养殖水质和提高养殖效益方面具有明显的优势[8,9]。但是现有的研究多是从水质和浮游生物等方面的改善来阐明鱼菜共生模式的优点,缺少关于鱼菜共生养殖模式中鱼类肠道微生物群落结构的研究报道。因此,该研究以鱼菜共生系统中的4种不同食性的鱼类为研究对象,并借助宏基因组学技术,尝试深入分析鱼菜共生模式中鱼类肠道内含物中微生物的群落结构,为推广应用养殖水体生物调控技术和鱼类健康养殖技术奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫(Carassius auratus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichthys nobilis)4种实验鱼类采集于湖北省红安县中海农业科技有限公司高桥养殖基地同一成鱼养殖池塘。池塘面积1.2 hm2,平均水深1.80 m,水面上架设覆盖率为3.5%的空心菜生物浮床,构建成鱼菜共生系统。实验时间为2015年6月10日~2015年8月23日。每天用商业鱼饲料(草鱼707系列,海大集团)投喂2次(08:30和15:30)。鱼样采样时间为2015年8月23日上午06:00,水温29.3℃,p H为7.05,溶解氧为3.34 mg·L-1。在地拉网渔获物中,每种鱼随机选择3尾规格一致(体质量和健康状况等)的个体(草鱼1.50 kg,鲫0.22 kg,鲢0.78 kg,鳙1.2 kg);然后立即冰浴,并在2 h内运回实验室,用大剂量的MS222(Sigma,Germany)麻醉,再用无菌水和70%乙醇先后冲洗鱼类体表;最后在无菌操作下,用无菌剪刀解剖,将肠道从腹腔取出,剪取前、中、后肠并将肠道内含物挤出混合收集起来。12个肠道内含物样品编号为草鱼CJ(C1~C3),鲫JJ(J1~J3),鲢LJ(L1~L3),鳙YJ(Y1~Y3)。将样品存放于-20℃,直至提取DNA。

1.2 样品DNA的提取

使用Stool DNA Kit试剂盒(OMEGA,美国)提取肠道内含物微生物的DNA。所有样品的DNA提取步骤均参照Stool DNA Kit试剂盒说明书,并对提取到的样品基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测质量。

1.3 高通量测序分析

针对细菌16S rRNA基因V3+V4区设计含barcode的特异引物338F/806R,引物序列为338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3',806R:5'-GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR扩增采用r Taq DNA Polymerase-20μL反应体系,10×Buffer 2μL,2.5 mmo L·L-1d NTPs 2μL,引物338F/806R各0.8μL,Taq酶0.2μL,BSA 0.2μL,模板DNA 10ng,补dd H2O至20μL。PCR条件为95℃变性3min;95℃30 s,55℃30 s,72℃45 s,27个循环;最后72℃延伸10 min(PCR仪为ABI GeneAmp9700型)。

PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳检测,条带清晰,片段大小合适(430 bp),使用Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen,美国)切胶回收PCR产物,以Tris-HCl洗脱后连接“Y”接头,使用磁珠筛选去除接头自连片段,按照每个样品测一万条序列加入1 ng PCR产物的标准富集PCR产物,然后用0.1 mo L·L-1的氢氧化钠(Na OH)溶液变性,获得单链DNA片段,构建测序文库后在16S-338F-806R Miseq平台进行高通量测序(上海美吉生物公司)。

1.4 数据分析

对获得的测序数据,用MOTHUR软件结合EXCEL 2010和SPSS 19.0软件进行数据统计和分析。数据的统计分析以每个样品中可操作的分类单元(OTU,Operational Taxonomic Unit)作为分类和计算的依据。设置差异显著性水平P=0.05,当P<0.05时表示差异显著。

2 结果

2.1 16S rRNA基因测序结果分析

以97%相似性水平为标准划分可操作分类单元(OTU),YJ、CJ、JJ和LJ样品数据分别可划分为298、380、412和395个OTU(表1)。通过计算在同一样本中检测到的随机选择扩增子序列的覆盖率(Good's coverage)来评估抽样的完整性,此研究中各样品OTUs的覆盖率是99.83%~99.89%。覆盖率的水平表明此研究中各样品中的全部微生物种类几乎都被检测到了。

注:YJ、CJ、JJ和LJ分别代表Y1~Y3、C1~C3、J1~J3和L1~L3;后表、后图同此。Note:YJ.Y1~Y3;CJ.C1~C3;JJ.J1~J3;LJ.L1~L3;the same case in the following tables and figures.

2.2 微生物的组成分析

将有效序列进行系谱分类,并统计各种鱼类中重要的细菌门类及其相对丰度(表2)。结果表明,门类学水平上,梭杆菌门(Fusobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)是4种鱼类肠道内含物菌落中最主要的菌门。草鱼肠道内含物微生物菌落中放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度(0.69%)明显低于其他3种鱼类,而拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度(24.27%)明显高于其他3种鱼类。鲢肠道内含物微生物菌落中放线菌门的相对丰度(25.03%)明显高于其他3种鱼类。鳙肠道内含物微生物菌落中变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度(1.77%)明显低于其他3种鱼类。鲫肠道内含物微生物菌落中拟杆菌门的相对丰度(0.44%)明显低于其他3种鱼类(表2)。

%

筛选出每种鱼类肠道内含物微生物中相对丰度最高的前10类微生物菌落,并在菌属水平上对每个样品的菌群结构及分布进行统计分析(图1)。在这4种鱼类肠道内含物微生物菌落的优势菌属中,有13个菌属得到了明确分类鉴定,有9个类别未得到明确分类鉴定(图1)。研究结果表明鱼菜共生养殖模式下,不同鱼类的肠道内含物微生物群落中最丰富的优势微生物菌群均是鲸杆菌属(Cetobacterium)[草鱼(23.16±13.80)%;鲢(14.96±12.36)%;鳙(39.72±7.17)%;鲫(42.34±36.32)%]。另外,草鱼肠道内含物微生物菌落中还含有丰富的拟杆菌属(Bacteroides)[(21.90±37.79)%]和梭状芽胞杆菌属(Clostridium)[(3.40±2.93)%];鲢肠道内含物微生物菌落中还含有丰富的梭状芽胞杆菌属[(13.59±13.14)%]、分歧杆菌属(Mycobacterium)[(9.11±9.47)%]、气单胞菌属(Aeromonas)[(8.71±15.09)%]和芽孢杆菌属(Bacillus)[(4.21±6.81)%];鳙肠道内含物微生物菌落中还含有丰富的梭状芽孢杆菌属[(15.48±1.85%)]和Macellibacteroides[(4.83±6.75)%];鲫肠道内含物微生物菌落中还含有丰富的芽孢杆菌属[(5.41±3.55)%]、假单胞菌属(Pseudomonas)[(2.60±1.77)%]、分歧杆菌属[(2.02±2.85)%]、乳球菌属(Lactococcus)[(1.96±1.32)%]和梭状芽孢杆菌属[(0.53±0.26)%](图1)。

2.3 鱼类肠道的核心微生物菌落

研究微生物菌群的一个主要热点是为每个物种鉴别出核心微生物群落。宏基因组技术中,通常使用文氏图来鉴别某个物种的核心微生物或其候选项。

研究结果表明草鱼肠道内含物样品的3个克隆文库一共有668个OTU,其中71个共同OTUs,优势菌类主要有鲸杆菌属(23.16%)、拟杆菌属(21.89%)、梭菌纲(Clostridia)(13.27%)和芽孢杆菌纲(Bacilli)(1.73%)(图2)。鲢肠道内含物样品的3个克隆文库一共有797个OTU,其中66个共同OTUs,优势菌类主要有鲸杆菌属(14.96%)、梭状芽胞杆菌属(12.18%)和芽孢杆菌属(4.08%)(图2)。鳙肠道内含物样品的3个克隆文库一共有455个OTU,其中166个共同OTUs,优势菌类主要有鲸杆菌属(39.72%)、梭状芽胞杆菌属(11.28%)、厌氧杆菌属(Barnesiella)(2.59%)和Macellibacteroides(4.83%)(图2)。鲫肠道内含物样品的3个克隆文库一共有690个OTU,其中144个共同OTUs,优势菌类主要有鲸杆菌属(42.34%)、梭菌纲(6.69%)和芽孢杆菌属(7.27%)(图2)。

为进一步研究鱼菜共生养殖模式下鱼类肠道内含物菌落之间的共同核心优势菌属及其差异,统计分析了实验中4种鱼类的共同核心菌属(在每个样品中均存在),发现了22个共同核心菌属,其中有11个菌属得到了明确分类鉴定,有11个类别未得到明确分类鉴定(图3)。共同核心菌属中相对丰度最高的菌属主要是鲸杆菌属、梭状芽孢杆菌属、芽孢杆菌属等,所有鱼类肠道内含物样品中均检测到了鲸杆菌属、梭状芽孢杆菌属、芽孢杆菌属和乳球菌属(图3)。研究结果说明鱼菜共生养殖模式下,鱼类肠道内含物的微生物菌落中含有丰富的有益菌属。通过对这22个共同核心菌属进行非参数检验分析,发现乳球菌属和香味菌属(Myroides)在不同鱼类之间有显著性差异(P<0.05,KruskalWallis),而其他菌属在不同鱼类之间没有显著性差异(P>0.05,Kruskal-Wallis)。综合分析研究结果,发现鱼菜共生模式下不同鱼类的肠道内含物微生物群落中最丰富的核心优势微生物菌群是鲸杆菌属和梭状芽孢杆菌属。

2.4 不同食性鱼类肠道内含物中微生物群落结构之间的关系

为研究不同食性鱼类的肠道内含物中微生物群落结构之间的关系,实验中将这不同食性的4种鱼类(鲢和鳙是滤食性鱼类,草鱼是草食性鱼类,鲫是杂食性鱼类)的肠道内含物微生物群落进行LEf SE分析(图4)。结果发现,鳙肠道内含物微生物群落与其他3种鱼类的肠道内含物微生物群落之间没有显著性差异;但是其他3种不同食性的鱼类的肠道内含物微生物菌落之间在某些菌属上具有显著性差异(图4)。草鱼和鲫肠道内含物微生物菌落之间主要在疣微菌类(Verrucomicrobia、Verrucomicrobiales、Verrucomicrobiae和Akkermansia)、芽孢杆菌类(Bacillales和Bacillus)、放线菌类(Actinobacteria)和假单胞菌类(Pseudomonadaceae、Pseudomonas和Pseudomonadales)等菌类上有显著性差异(图4-A);草鱼和鲢肠道内含物微生物菌落之间主要在两个菌属(Hydrogenoanaerobacterium和CL500_29_marine_group)上有显著性差异(图4-B);鲫和鲢肠道内含物微生物菌落之间主要在沙雷菌属(Serratia)、稳杆菌属(Empedobacter)、拟杆菌类(Bacteroidales或Bacteroidia)等菌类上有显著性差异(图4-C)。这些研究结果表明鱼菜共生模式下不同食性鱼类的肠道内含物微生物既可能具有显著性差异,也可能彼此之间没有显著性差异。因此推断食性不是造成不同食性鱼类肠道微生物菌落差异的唯一决定性因素。

分支图中的红色和绿色节点分别表示在红色组别和绿色组别中起到重要作用的微生物类群。节点亮度和大小成比例。只显示LDA值大于2.5的微生物类群。Red and green in the taxonomic cladogram taxa are enriched in the two group,respectively.The brightness of each dot is proportional to its effect size.Only taxa meeting an LDA significant threshold>2.5 are shown.

3 讨论

与陆生脊椎动物一样,鱼类肠道微生物菌群在营养吸收和病源防御等方面对宿主的健康发挥着重要的调节作用[10,11,12,13,14]。FLINT等[15]研究发现鱼类肠道微生物对宿主的各项生命机能具有十分重要的调节作用。ARKADIOS等[16]研究表明养殖鱼类消化道微生物菌群结构和数量的变化会直接影响鱼类肠道功能的正常发挥和对疾病的防御,进而影响养殖对象的成活率和产品质量。KASHIWADA等[17]通过研究鲤的肠道内微生物发现其可以合成维生素B12、维生素B1、尼克酸、泛酸、生物素等。SMITH等[18]通过研究鱼类肠道中的厌氧菌群发现其可以分泌挥发性脂肪酸,而这种脂肪酸可以促进鱼类对营养物质的消化吸收。RAWL和MA-HOWALD[19]研究表明鱼类肠道内微生物与鱼类肠道上皮细胞增殖、成熟以及免疫功能相关。

草鱼、鲢、鳙和鲫是中国淡水养殖鱼类的主要品种,其中草鱼是中国最重要的淡水养殖鱼类之一,而草鱼是草食性鱼类,纤维素是其主要的营养物质来源,但是草鱼本身并不能分泌纤维素降解酶[20,21]。因此,草鱼需要其肠道微生物中的纤维素降解菌来帮助其分解食物中的纤维素,进而获得营养物质,保证新陈代谢和生理生化功能的正常发挥。已有研究表明,氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、梭状芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、放线菌属(Actinomyces)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)等菌属是纤维素降解细菌,其中梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属是草鱼肠道菌落中的主要纤维素降解细菌[12,22]。该研究中,在所有的草鱼肠道内含物菌落中均检测到了梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属,其相对丰度分别达到3.40%和1.18%,说明鱼菜共生模式中草鱼的肠道微生物中含有大量的纤维素降解细菌,有利于草鱼对营养的消化吸收。

有研究表明鲸杆菌属具有发酵多肽碳水化合物的能力,还可以产生维生素B12[23],对鱼类的营养吸收发挥重要的作用。拟杆菌属、梭状芽孢杆菌属和梭杆菌属(Fusobacterium)中的专性厌氧菌是淡水鱼的肠道优势内源性菌群的主要种类[6]。芽孢杆菌属、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属和乳杆菌属(Lactobacillus)都是水产益生菌[12],乳酸菌作为一种重要的益生菌,可以增强宿主免疫力,其在生长过程中会产生细菌素和乳酸,抑制某些病原细菌的生长,抵抗病原菌入侵肠道,从而对宿主产生积极影响[24,25]。该研究发现夏季(8月)同一养殖池塘中的不同鱼类(草鱼、鲫、鲢和鳙)的肠道内含物微生物菌落中主要的优势菌属是鲸杆菌属、梭状芽孢杆菌属、拟杆菌属和芽孢杆菌属等,其中鲸杆菌属和梭状芽孢杆菌属含量最丰富,但在非优势菌属(乳球菌属和香味菌属)之间具有显著性差异(P<0.05,Kruskal-Wallis)。出现这种差异的原因可能与宿主的免疫状态相关,乳球菌属是一类肠道益生菌,对宿主的免疫调节具有重要作用[24,25],而香味菌属的某些种类是条件致病菌,对多种抗生素具有耐药性,对宿主免疫调节会产生重要影响[26,27]。综上,说明鱼菜共生模式中鱼类的肠道微生物中的优势菌属主要是有益菌,鱼菜共生模式能够有效改善鱼类肠道微生物的动态平衡,使鱼类具有更健康的肠道微生态环境,有利于鱼类的生长发育。

有学者通过研究春季(4月)同一养殖池塘中不同食性的鱼类发现草鱼、鲫和鳙的肠道内含物微生物菌落中最丰富的优势微生物菌落都是鲸杆菌属[28],而通过研究冬季(12月)同一湖泊中不同食性鱼类的肠道微生物菌落发现草鱼、鲫、鲢和鳙的肠道内含物微生物菌落中最丰富的优势微生物菌落都是短波单胞菌属(Brevundimonas)和马赛菌属(Massilia)等[29]。与这些研究结果相比,该研究的结果说明鱼菜共生模式中鱼类肠道微生物菌群与其他养殖模式中鱼类的肠道微生物菌落具有差异性,但同一养殖环境下不同鱼类的肠道微生物菌落组成和优势菌落却具有相似性,这说明鱼类肠道微生物菌落的组成会受到养殖环境等诸多因素的影响[30,31]。

很多研究发现,食性是影响鱼类肠道微生物菌落的重要因素[29,32,33,34]。LI等[29]研究发现,同一野外养殖环境下不同鱼类的肠道微生物菌落直接受食性和基因型的双重影响。WARD等[32]研究发现食性是影响鱼类肠道微生物菌落的一个重要因素,而且肉食性鱼类的肠道微生物菌落OTU数量明显低于其他食性的鱼类。INGERSLEV等[33]和NI等[34]的研究结果都表明食性和栖息地是影响肠道微生物菌落的两个主要因素。但该研究发现不同食性的鱼类的肠道微生物菌落既可能出现显著性差异,也可能没有显著性差异,因此推断食性不是造成不同食性的鱼类肠道微生物菌落差异的唯一决定性因素。没有出现显著性差异的原因可能是该研究在进行线性判别分析(LDA)时选取LDA>2.5为临界值进行分析,导致LDA≤2.5的显著性差异菌属没有在LEf SE分析图中显示;也可能由于该研究中鱼类肠道内含物的实验样品数量有限,未能充分挖掘出真实情况,犯了统计学中“拒真”的错误;还可能是发育阶段、肠道结构甚至系统发育地位等因素对鱼类肠道微生物菌落的综合影响效应超过了食性对鱼类肠道微生物菌落的单一影响效应。有研究表明发育阶段、肠道结构、饵料成分和营养水平、栖息地和周围环境如水温与盐度、饲养环境、甚至系统发育地位等因素能对鱼类的肠道微生物菌落组成造成直接或间接影响[30,31,35]。由此可见,鱼类肠道微生物菌落会受到多个因素的影响,但这些因素是单独发挥作用或协同发挥作用,还需要应用更科学合理的分析手段和增加样本数量进行更深入的研究,才能得到更正确的结论。

该研究借助高通量测序技术和生物学信息学分析方法研究了鱼菜共生模式下不同鱼类肠道微生物的群落结构,具有一定的代表性,为推广应用养殖水体生物调控技术和鱼类健康养殖技术奠定了一定的理论基础,但由于实验样品数量的限制和缺乏严格的控制实验及对照实验,致使该研究结果具有局限性,更严谨科学的研究结论需要更深入的研究。

摘要：为研究鱼菜共生模式下不同鱼类肠道微生物的菌落结构,采用宏基因组学测序技术和生物信息学分析手段,构建了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲫(Carassius auratus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichthys nobilis)4种鲤科鱼类的肠道内含物等12个样品的16S rDNA测序克隆文库,分析了这4种鲤科鱼类肠道微生物的菌落组成和多样性。结果表明,鱼菜共生模式下不同鲤科鱼类肠道内含物微生物优势菌落的组成十分相似(P>0.05,Kruskal-Wallis),优势微生物菌群均是鲸杆菌属(Cetobacterium)和梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)和芽孢杆菌属(Bacillus)等,其中鲸杆菌属和梭状芽孢杆菌属含量最丰富,且主要在非优势菌属之间具有显著差异(P<0.05,Kruskal-Wallis),研究结果还表明食性不是造成不同食性鲤科鱼类肠道微生物菌落差异的唯一决定性因素。

关键词：鱼菜共生模式,鲤科,肠道微生物群落结构,食性,16S rDNA

肠道微生物群落结构 篇2

同时产甲烷反硝化颗粒污泥中微生物群落结构

摘要：在UASB成功运行同时产甲烷反硝化小试基础上,针对反应器内颗粒污泥,通过构建古菌和细菌的16S rDNA基因文库、RADAR遗传变异分型和测序比对等技术进行了微生物系统发育关系和群落结构分析.结果表明,在颗粒污泥的古菌中,产甲烷髦毛菌和产甲烷杆菌是主要菌群,随机选出的88个古菌克隆子,这两类古菌的.16S rDNA序列分别占古菌总量71.59%和22.73%;而颗粒污泥中细菌的多样性要高于古菌,低GC革兰氏阳性菌和ε变型菌纲分支的细菌是细菌的主要菌群,在随机选出的133个细菌克隆子中,这2类细菌的16S rDNA序列分别占细菌总量的49.62%和12.03%.作 者：孙寓姣    左剑恶    陈莉莉    SUN Yu-jiao    ZUO Jian-e    CHEN Li-li  作者单位：清华大学环境科学与工程系,北京,100084 期 刊：中国环境科学  ISTICPKU  Journal：CHINA ENVIRONMENTAL SCIENCE 年，卷(期)：, 27(1) 分类号：X7 关键词：同时产甲烷反硝化    颗粒污泥    16S rDNA基因文库    群落结构   

肠道微生物群落结构 篇3

传统上,获得油藏微生物资源信息主要是依赖纯培养技术,导致大部分油藏微生物没有得到充分认识[6]。现代分子生物学技术在微生物多样性研究上的应用克服了传统微生物培养技术的限制,能对样品进行较客观的分析,较精确地揭示微生物种类和多样性[7]。本文即运用T-RFLP技术来分析复杂的油藏生态系统,研究大庆油田微生物群落结构。将分子微生物生态学技术系统引入油藏微生物群落结构的分析和微生物采油技术的研究与开发,对微生物提高原油采收率技术的发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

样品取自大庆油田采油三厂聚驱后油藏采出液返排水和注入污水。

1.1.2 试剂

RsaⅠ和HhaⅠ两种限制性内切酶,DNA提取试剂盒,DNA纯化试剂盒。

1.1.3 仪器

ABI自动测序仪3130。

1.2 方法

1.2.1 环境总DNA的提取:

使用0.22μm滤膜采集菌体,冻融破碎细胞提取DNA[8]。

1.2.2 16S rDNA基因扩增引物:

细菌(8F:5′FAM-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′,1492R:5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′);古菌(109F:5′FAM-ACK GCT CAG TAA CAC GT-3′,915R :5′-GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT-3′)。

扩增条件:95℃ 5min;94℃ 30min;50℃ 30min;72℃ 60min;30个循环;72℃ 5min。

1.2.3 带FAM标记16S rDNA基因的限制性酶切:

选用RsaⅠ和HhaⅠ两种限制性内切酶进行酶切。

1.2.4 限制性片断的基因扫描:

用ABI自动测序仪3130进行毛细管电泳和片段分析。

1.2.5 克隆、测序:

对微生物群落目标DNA的PCR扩增,PCR产物的回收纯化,微生物群落目标DNA克隆并对克隆文库中克隆的分类以及克隆的目标DNA片段序列测定、比对,可以得到该克隆的种属情况。

2 结果与分析

2.1 聚驱后油藏微生物群落结构基因图谱对比

从聚驱后油藏微生物群落结构基因图谱可以看出(图1),聚驱后油藏细菌群落结构基因图谱显示,聚驱后油井各样品细菌种类差异不大,说明聚驱后油藏细菌群落相对稳定。聚驱后油藏古菌群落结构基因图谱可以看出,古菌群落结构大体类似,说明聚驱后油藏古菌群落稳定。

横坐标为特征DNA片段长度(bp),纵坐标为特征DNA片段的荧光强度。

2.2 克隆文库

为了对油藏微生物群落中单一微生物目标DNA片段的分离、纯化和扩增、方便后续测序和分析和对油藏微生物群落中微生物进行初步鉴定,建立了克隆文库。根据对克隆文库的筛选,对克隆文库测序和与已知细、古菌16S rDNA序列进行比对,找到相近序列后,利用neighbor-joining等方法计算各种16S rDNA序列之间的亲缘关系。

2.2.1 聚驱后油藏细菌群落克隆文库

利用聚驱后油藏细菌群落16S rDNA构建克隆文库,共挑取了49个阳性克隆,T-RFLP分型结果如下表所示,共出现21个不同类型。

根据分型结果挑选克隆进行测序,挑取27个克隆进行测序,所得的序列在Genbank中比对的结果表明这些克隆可分为5个类群,其中15个克隆属于变形杆菌(proteobacteria),12个克隆则分别分布在拟杆菌(Bacteroidetes)、脱铁杆菌(Deferribacteres)、厚壁菌(Firmicutes)以及未确定分类的类群中。

在变形杆菌纲中,克隆主要分布在α- proteobacteria、β- proteobacteria、γ- proteobacteria、δ- proteobacteria、ε- proteobacteria中。其中只有BJ-56所代表的类型(T-RF为419bp)的克隆分布在α- proteobacteria中,与分离自地中海的Brevundimonas sp.同源性最高,达100%。在β- proteobacteria纲中,克隆与已培养的细菌相似性不太高,其中BJ-54所代表的类型的克隆(T-RF为119bp)与固氮菌Azovibrio restrictus的亲缘关系最近,达94%。

在Deferribacteres中,克隆与已培养的细菌相似性很低,与分离自油田的Flexistipes sp. vp180 的相似性仅为90%。在Firmicutes 中,克隆与具有产乙酸功能的Dehalobacterium formicoaceticum 的相似性为96%。在Bacteroidetes中,克隆与已培养的细菌相似性很低,与Genbank中来自ANAMMOX的淤泥的细菌克隆的相似性为99%。

在未确定分类地位的类群中,与来自油田的细菌克隆相似性为97%,硫酸盐还原菌群的克隆的相似性为95%。根据克隆之间的比对(聚类)结果,表明可分为3个组:Group Ⅰ(BJ-1)、 Group Ⅱ( B-J19、BJ-52)和Group Ⅲ( BJ-43),这3个组之间的相似性不高于85%。这3个组极可能是一类新细菌,有待进一步研究。

根据对克隆文库的筛选,对克隆文库测序和与已知细菌16S rDNA序列进行比对,找到相近序列后,利用neighbor-joining等方法计算各种16S rDNA序列之间的亲缘关系,构建系统发育树如图2所示。

2.2.2 聚驱后油藏古菌群落克隆文库

构建的古菌克隆文库中共挑取了48个阳性克隆,根据T-RF分型结果,表明该古菌克隆文库共有5个不同的类群。其中T-RF为225bp、184bp、386bp的克隆数量均超过10个,T-RF为281bp的克隆数量最少,仅为3个。这5个类群的T-RF在JQ5的古菌群落的T-RFLP图谱中均能找到对应的峰。每个类群挑选2～3个克隆测序,共挑选12个克隆。

所得序列在Genbank中的比对结果表明这些克隆和产甲烷菌亲缘关系很近。T-RF为79bp的克隆与来自厌氧消化污泥中的产甲烷菌克隆NOBI-1相似性达100%;T-RF为225bp和386bp的克隆均与Methanothrix thermophila有很高的相似性;T-RF为184bp的克隆与来自地下水中的古菌克隆相似性达到99%,与已培养的产甲烷菌Methanolobus taylorii和Methanolobus oregonensis的相似性均为95%。

ND:未知分离或发现的环境。

3 讨论

T-RFLP是评估复杂微生物群落多样性、比较不同生态环境下微生物群落多样性及结构的快速有效的方法,克服了传统培养方法检测微生物的不足揭示了油藏微生物群落多样性的真实情况及其物种组成,可为研究微生物生态、生化等各项指标的基础,其发展为调控油藏本源微生物将具有重要意义。目前,分子微生物生态学技术在我国油田开发应用刚刚起步,还存在一些不完善的地方,对油藏微生物样落结构的长期变化和演替规律缺少明显的了解。在研究微生物群落结构与提高采收率的对应关系方面还缺乏系统的工作,在实际进行油藏微生物群落生物多样性研究时,往往需要将两种以上的方法组合起来使用,以提高检测的精度和准确性。本文运用的T-RFLP技术系统地分析了大庆油田聚驱后油藏微生物群落结构,得到5个类群的细菌克隆,其中15个克隆属于变形杆菌(proteobacteria),12个克隆则分别分布在拟杆菌(Bacteroidetes)、脱铁杆菌(Deferribacteres)、厚壁菌(Firmicutes)以及未确定分类的类群中;古菌克隆文库12个克隆分属于5个不同的类群,所得序列在Genbank中的比对结果表明这些克隆和产甲烷菌亲缘关系很近。该研究从分子生态学角度更准确地掌握了油藏微生物生态变化规律,表明大庆油田聚驱后油藏含有丰富的本源微生物群落,为本源微生物驱油方案的优化和驱油效果的提高起到跟踪指导作用。

参考文献

[1]Li H,Yang SZ,Mu BZ,et al.Molecular phylogenetic diversity of the mi-crobial community associated with a high-temperature petroleum reservoir atan offshore oilfield[J].MS Microbiol Ecol,2007,60(1):74-84.

[2]Nazina TN,Shestakova NM,Grigoriyan AA,et al.Phylogenetic diver-sity and activity of anaerobic microorganisms of high-temperature horizonsof the Dagang oil field(P.R.China)[J].Microbiology,2006,75(1):55-65.

[3]Li H,Yang SZ,Mu BZ.Phylogenetic diversity and structure of the ar-chaeal community in a continental high-temperature,water-flooded pe-troleum reservoir[J].Current Microbiology,2007,55(5):382-388.

[4]袁三青,薛燕芬,高鹏,等.T-RFLP技术分析油藏微生物多样性[J].微生物学报,2007,47(2):290-294.

[5]李辉,牟伯中,等.油藏微生物多样性的分子生态学研究进展[J].微生物学通报,2008,35(5):803-808.

[6]黄永红,袁红梅,丁海燕,等.分子生物学技术在微生物采油中的应用[J].油气田地面工程,2009,28(5):47-48.

[7]王大威,杨振宇,石梅,等.分子生物学在石油微生物多样性研究中的应用[J].生物技术,2005,15(5):86-89.

肠道微生物群落结构 篇4

摘要：采用DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术,于的7～9月中旬对高浓度CO2(700和500μmol・mol-1)处理下的红松幼苗根际和根外0～10 cm土壤微生物群落结构进行了研究.结果表明,大气CO2浓度升高对红松根际和非根际土壤细菌群落结构产生了较大的影响,主要表现为部分细菌物种的出现,或原有细菌数量的丰富以及原有物种的.消失或其数量被削弱的现象,但主要建群种未变.作 者：贾夏 韩士杰 赵永华 周玉梅 JIA Xia HAN Shijie ZHAO Yonghua ZHOU Yumei 作者单位：贾夏,JIA Xia(长安大学环境科学与工程学院,西安,710054)

韩士杰,周玉梅,HAN Shijie,ZHOU Yumei(中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳,110016)

赵永华,ZHAO Yonghua(长安大学资源学院国土系,西安,710054)

肠道微生物群落结构 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

观察组:在本院接受治疗的外阴阴道念珠菌病女性患者,共110例。纳入标准:(1)有外阴瘙痒、尿痛、灼痛感、白带黏稠的症状;(2)白带涂片发现存在酵母菌或假菌丝;(3)发病次数1年内≥4次;(4)有接受抗真菌治疗,诊断检查仍然是阳性;(5)治疗前15天没有接受抗真菌治疗。排除标准:(1)有严重免疫系统疾病、糖尿病患者;(2)联合应用抗生素和糖皮质激素者;(3)无定期诊治者。对照组:110例正常健康体检女性。两组研究对象均知情同意、自愿参加。对照组平均年龄(35.1±5.2)岁,平均产次(2.3±0.7)次,孕次(2.9±0.6)次,体重(57.9±10.6)kg,体质量指数(Body Mass Index,BMI)(23.7±2.8)kg/m2;观察组平均年龄(34.7±5.6)岁,平均产次(2.4±0.8)次,孕次(3.0±0.7)次,体重(57.1±10.3)kg,BMI(23.6±2.6)kg/m2;两组在年龄、产次、孕次、体重及BMI等一般资料上比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

检测两组女性的阴道p H值,把精密p H试纸置于阴道分泌物中,根据试纸说明读取p H值。在阴道侧壁上方1/3区域,使用无菌棉拭子采集女性的阴道分泌物,并将阴道分泌物放在载玻片上,然后制成涂片并染色,充分干燥后应用10×100倍油镜进行检查,进而区分乳酸杆菌、阴道加特纳菌、动弯杆菌、拟杆菌及革兰菌等。从油镜中观察到的细菌数量进行打分,0分表示无细菌,1分:细菌数量<1×1 000,2分:细菌数量介于(1~4)×1 000,3分:细菌数量介于(5~30)×1 000,4分:细菌数量>30×1 000。使用Nugent革兰染色评分系统计算Nugent革兰染色评分。比较两组的菌群多样性和阴道菌群优势菌,主要应用10×100倍油镜,其中依据可辨认的细菌种类来划分菌群的多样性,观察细菌的种类,判断优势菌。

1.3 统计学方法

采用SPSS 14.0统计学软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,配对t检验;计数资料用百分比(%)表示,采用2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阴道p H值和Nugent革兰染色评分

观察组的阴道p H值和Nugent革兰染色评分高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

注:†与对照组相比,P<0.05。

2.2 菌群多样性

观察组菌群多样性主要集中在Ⅰ-Ⅱ级,Ⅲ和Ⅳ级比较少见,对照组菌群多样性主要集中在Ⅰ级,Ⅱ级比较少见,观察组的菌群多样性Ⅰ级低于对照组、Ⅱ级高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注:†与对照组相比,P<0.05。

2.3 阴道菌群优势菌

观察组和对照组在阴道菌群优势菌比例方面比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

注:†与对照组相比,P<0.05。

3 讨论

阴道中占优势的乳酸杆菌具有生物屏障的保护功效,主要通过免疫调节、生物拮抗以及化学反应等机制发挥作用[3]。乳酸杆菌通过糖酵解功能会引起乳酸的大量积聚,使得阴道处于酸性的微环境中,从而有效抑制病原微生物[4]。另外,乳酸分子自身也是一种抗微生物成分,具有保护宿主的作用[5]。另外,最近研究显示乳酸菌能够促进外周IL-23的合成,激活Thl7淋巴细胞激活通路,进而有效抑制细菌的入侵[6]。本次研究结果显示观察组人群的乳酸杆菌的优势地位明显丧失,观察组的阴道p H值为(4.52±0.33),高于对照组的(4.08±0.30),说明拮抗作用和生物屏障受到抑制,是引起外阴阴道念珠菌病反复发作的重要原因。

现阶段,临床上对复发性外阴阴道念珠菌病的治疗主要通过巩固性抗真菌的方法,然而全身或局部用药的治疗效果都不是十分理想[7],患者的复发率仍然十分高,所以寻找有效的治疗方法是临床关注的重点。目前,临床上达成的共识是乳酸杆菌不可直接用于外阴阴道念珠菌病的治疗,但在一定程度上可以恢复乳酸杆菌的优势地位,显著降低外阴阴道念珠菌病的发病率。目前,临床上应用的乳酸杆菌制剂的种类较多,然而阴道专用的乳酸杆菌种类并不多,阴道专用的乳酸杆菌可在阴道中定居、繁殖,保证阴道菌群的平衡[8]。临床上对于乳杆菌制剂治疗复发性外阴阴道念珠菌病的疗效有较大的争议,需要更多的研究和实践来证明。

综上可知,外阴阴道念珠菌病患者的阴道微生物群落结构较正常人群会发生明显变化,主要体现在阴道p H值升高、菌群多样性集中在Ⅰ-Ⅱ级、阴道菌群优势菌改变,造成阴道生物屏障严重被削弱。

摘要：目的 研究阴道微生物群落结构与复发型外阴阴道念珠菌病的相关性。方法 选择复发型外阴阴道念珠菌病女性患者110例设为观察组,同时选择110例健康体检女性设为对照组,比较两组阴道pH值和Nugent革兰染色评分,两组的菌群多样性,并且对两组阴道菌群优势菌进行对比。结果 观察组的阴道pH值和Nugent革兰染色评分高于对照组的阴道pH值和Nugent革兰染色评分,差异具有统计学意义(P<0.05);观察组菌群多样性主要集中在Ⅰ-Ⅱ级,Ⅲ和Ⅳ级比较少见,对照组菌群多样性主要集中在Ⅰ级,Ⅱ级比较少见,观察组的菌群多样性Ⅰ级低于对照组、Ⅱ级高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组和对照组在阴道菌群优势菌比例方面比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 外阴阴道念珠菌病患者的阴道微生物群落结构较正常人群会发生明显变化,主要体现在阴道pH值升高、菌群多样性集中在Ⅰ-Ⅱ级、阴道菌群优势菌改变,造成阴道生物屏障严重被削弱。

关键词：外阴阴道念珠菌病,阴道微生物群落结构,相关性,研究分析

参考文献

[1]黎小东,宋卫忠,李平,等.广州地区妇女外阴阴道念珠菌病的病原分类及其体外药敏分析[J].国际检验医学杂志,2013,34(17):2281-2284.

[2]范娟,沈健,蒋建华,等.复发性外阴阴道念珠菌病的阴道微生态特征分析[J].中国真菌学杂志,2015,10(4):210-215.

[3]汤雅琴,崔桂华,张霞,等.复发性外阴阴道念珠菌病患者念珠菌菌种鉴定及药敏分析[J].中国热带医学,2012,12(1):118-119.

[4]陈芳.中西医结合治疗多囊卵巢综合征及复发性外阴阴道念珠菌病临床分析[J].亚太传统医药,2014,10(14):65-66.

[5]高飞,曹萍,吴颖,等.30例复发性外阴阴道念珠菌病患者致病菌株分析[J].重庆医学,2013,42(13):1466-1467,1470.

[6]徐海萍,王桂芝,王君,等.外阴阴道念珠菌病的致病菌群分析[J].中华皮肤科杂志,2013,46(2):128-129.

[7]周玲,刘正飞,朱波.复发性外阴阴道念珠菌病63例菌种鉴定及药敏试验分析[J].实用医院临床杂志,2012,9(4):174-175.

肠道微生物群落结构 篇6

水生生物是水域生态系统的重要组成部分,其中浮游植物是天然水域的初级生产者,其种类和数量的变化通过“上行效应”直接影响初级消费者和次级消费者,在生态链中起着重要的作用[1,2,3]。对环境的变化比较敏感,能更好地反映水域生态环境的变化。浮游动物种类和数量的变化也直接或间接通过“上行效应”和“下行效应”对水生生物的分布和丰度产生影响,也是较佳的水环境质量特征指示类群[4,5,6]。大型底栖动物在水域生态系统中也具有重要的生态学作用,处于食物链中的关键环节,其通过钻营、翻耕和摄取底泥,加速水体的自净过程,对环境的变化具有敏感响应。因此,保持水域水生生物的多样性对流域生态平衡的维持意义重大。基于此,于2015 年春季对渭河滩华阴河段人工湖水生生物群落结构进行了调查,以期为渭河滩湿地的科学合理利用和生态保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 调查点位设置

所调查的人工湖是2014 年修建的集旅游、观光、休闲、科研及保持生态平衡于一体的湿地集水区。湖区长方形,南北走向,水深1.2~1.6 m,水域面积98.6 hm2。 根据人工湖的具体形状选择在进水口、湖中央和出水口各设置1 个采样点进行现场采样。

1.2 样品采集与鉴定

1.2.1 浮游植物的调查。 浮游植物样品用有机玻璃采水器在水面下取混合水样1 000 m L, 加入1.5%鲁哥试液固定,固定样本在室内静置48 h,用虹吸管浓缩定容至30 m L。混匀浓缩样品,依据水生生物参考资料,在生物显微镜下鉴定种类并计数。

1.2.2 浮游动物调查。 用有机玻璃采水器取30 L上下层混合水样,用25# 浮游生物网过滤浓缩至30 m L后,现场加入5%甲醛溶液固定。混匀浓缩样品,依据水生生物参考资料,在生物显微镜下鉴定浮游动物种类,并记录个体数量。

1.2.3 大型底栖动物调查。 底栖动物样品采集使用1/16 m2蚌斗式采泥器,从每个采样点采集泥样3 份,泥样经孔径为60 目的筛绢网洗涤,剩余物置于白瓷盘中, 以肉眼所见为准,挑出底栖动物,样品用70%酒精固定。依据水生生物参考资料,样品进行种类鉴定、计数,然后将每个物种放在吸水纸上,用镊子轻轻拨动,30 s后用电子天平称重(精度为0.000 1 g),并换算成1 m2的生物量。

1.3 数据处理

密度计算公式:N=(Vs×n)/(V×Va)

式中:N为1 L水中浮游植物(动物)个体数(ind./L),V为采样体积(L),Vs为沉淀体积(m L),Va为计数体积(m L),n为计数所得的个体数。

生物量依据各种类个体湿重换算。

2 调查结果

2.1 浮游植物群落结构

此次调查共发现浮游植物五大类24 个种属,硅藻门和绿藻门占主导。其中,硅藻门的种类占总种类的53.6%,绿藻门占24.2%,隐藻门占10.4%,蓝藻门占5.1%,裸藻门占6.7%(图1)。优势种为小球藻(Chlorella sp.)和尖尾蓝隐藻(Chroomonas acuta),其密度分别占总密度的12.5%和68.6% 。 此次调查数据统计显示,浮游植物总密度为1 237.8×104个/L,总生物量16.766 mg/L。

2.2 浮游动物群落结构

此次调查共检出浮游动物四大类12 种属,桡足类占主导。其中,轮虫的种类占总种类的12.5%,枝角类占12.5%,桡足类占71.0%,原生动物占4.0%(图2)。优势种为毛饰拟剑水蚤(Paracyclops fimbriatus)和无节幼体(Nauplii),其密度分别占总密度的73.9%和15.2%。调查数据分析显示,浮游动物总密度为633.4 个/L,总生物量为17.602 mg/L。

2.3 大型底栖动物群落结构

此次调查共发现大型底栖动物4 种属,其中静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)隶属于软体动物门的腹足类肺腮亚纲基眼目椎实螺科椎实螺属,其密度为116.7 ind./m2, 占总密度的9.7%;中华米虾(Caridina denticulata sinensis)隶属于甲壳动物亚门的十足类、腹胚亚目、真虾下目匙指虾科,其密度为438.1 ind./m2,占总密度的36.4%;霍甫水丝蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)隶属于环节动物门的水栖寡毛类近孔寡毛目颤蚓科水丝蚓属,其密度为31.3 ind./m2, 占总密度的2.6%;羽摇蚊幼虫(Tendipus gr.plumosus)隶属于水生昆虫类的有翅亚纲双翅目摇蚊科摇蚊属羽摇蚊,其密度为617.4ind./m2, 占总密度的51.3% ( 图3)。 底栖动物密度为1 203.6ind./m2,总生物量为43.703 0 g/m2。

3 讨论

水生生物是生活在各类水体中的生物总称,其种类繁多,有各种微生物、藻类、水生高等植物、各种无脊椎动物和脊椎动物。其生活方式也多种多样,有漂浮、浮游、游泳、固着和穴居等。按功能划分,水生生物包含自养生物(各种水生植物)、异养生物(各种水生生物)和分解者(各种水生微生物)。不同功能的生物种群生活在一起,构成特定的生物群落,不同生物群落之间及其与环境之间,进行着相互作用、协调,维持特定的物质和能量流动过程,对水环境保护起着重要作用。

本次调查发现,华阴渭河滩人工湖浮游植物种类组成比较多样,共检测到5 个门类,主要以硅藻门的种类为主,占总种类数的50%以上,此外浮游植物的数量也较为丰富,这表明浮游植物群落结构较为稳定。浮游动物的组成相比浮游植物较为单一,以桡足类为主,其种类数占到了一半以上。从现存量来看,浮游动物的数量较多,多以单体生物量较大的桡足类毛饰拟剑水蚤为主,其群落结构稳定性较差。大型底栖动物组成也较为单一,以羽摇蚊幼虫和中华米虾为主。此次调查由于人工湖为新建工程,湖区水生植物和野杂鱼类群落结构尚未形成,出现的个别物种对湖区的生态影响较小。因此,渭河滩华阴河段人工湖水生生物群落结构较为简单,稳定性相对较差,受环境影响较大。