细胞核蛋白

细胞核蛋白（精选12篇）

细胞核蛋白 篇1

在高等植物中,除韧皮部成熟的筛管等极少数细胞外,其他细胞都具有细胞核。细胞核是遗传信息的储存场所,承担着基因复制、转录和转录产物加工等功能,也是细胞遗传与代谢活动的调控中心。研究细胞核的蛋白质组成与动态变化,对于深入解析植物发育与逆境应答过程中的基因表达调控的分子机制具有重要意义。近年来,不断发展的高通量蛋白质组学技术平台为全面解析植物细胞核蛋白质表达谱与动态特征提供了良好的技术平台。人们已经将双向电泳、色谱技术与生物质谱技术相结合,初步研究了水稻(Oryza sativa)、维柯萨(Xerophyta viscosa)、洋葱(Allium cepa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和大豆(Glycine max)等植物细胞核的蛋白质组特征。本文综述了近年来植物细胞核蛋白质组学研究进展。

1 植物细胞核与核蛋白质的制备

目前的植物细胞核蛋白质组学研究,主要是从植物幼苗或悬浮培养细胞中提取细胞核。从幼苗中提取细胞核,首先在低温条件下将幼苗研磨成粉末,进而通过以Percoll为介质的密度梯度离心富集细胞核[1]。从悬浮培养细胞中提取细胞核,利用匀浆机破碎或细胞壁水解酶除去细胞壁,然后通过改变细胞内外渗透压破碎原生质体,并利用密度梯度离心富集细胞核[1]。获得细胞核以后,通常利用DAPI染色后的显微观察,或通过测定细胞核制备液中叶绿素含量等方法来评价细胞核的纯度。然后利用酚抽法或TCA丙酮沉淀法提取细胞核蛋白质。进而,以组蛋白或核仁纤维蛋白为细胞核标记蛋白质,通过免疫印迹实验来检测细胞核蛋白质的纯度,也可通过检测过氧化氢酶活性来评价细胞核蛋白质的纯度。

2 水稻细胞核蛋白质组学

水稻(O.sativa)是重要粮食作物,也是进行分子生物学研究的良好模式植物。Aki et al[2]利用蛋白质组学技术鉴定了563种水稻细胞核蛋白质,其中307种为DNA结合蛋白质。这些蛋白质中除了包括mRNA转录和剪切相关的因子外,还包括参与糖信号传递的己糖激酶,以及参与蛋白质相互作用的WD40类蛋白等。此外,Choudhary et al[3]鉴定了水稻响应干旱胁迫过程中的109种细胞核蛋白质,这些蛋白质主要参与胁迫防御、信号转导、染色质重塑、基因调控、转录调节、蛋白质合成与降解等过程。其中受干旱胁迫影响的蛋白质主要包括:参与胁迫早期应答的受体类蛋白激酶、33-kDa分泌蛋白、酪氨酸磷酸酶类蛋白质、无机焦磷酸酶,参与细胞代谢活动的氨基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、甲基转移酶、硫甲基转运酶,以及参与细胞防御的超氧化物歧化酶等[3]。

3 维柯萨细胞核蛋白质组学

维柯萨(X.viscosa)是典型的复苏植物,其叶片组织相对含水量可以降低到5%,在持续干旱80 h后复水,叶片仍可以完全恢复。Abdalla et al[4]鉴定了维科萨叶片细胞核中18种干旱应答蛋白质。其中参与基因表达(如反转录酶、锌指解旋酶和内含子成熟酶)、蛋白质合成(如核糖体蛋白L28和蛋白翻译延伸因子)、蛋白质折叠(如分子伴侣)、蛋白质降解(如蛋白水解酶),以及能量代谢(如ATP合成酶α链)等蛋白质表达受到干旱诱导。这表明维柯萨通过调节特定基因表达与蛋白质折叠等应对干旱胁迫[4]。

4 洋葱细胞核蛋白质组学

洋葱(A.cepa)根分生组织具有持续或周期性分裂能力,是研究细胞周期与细胞增殖的良好材料。GonzálezCamacho et al[5]比较分析了洋葱根分生组织和非分生组织细胞核蛋白质组的差异。他们利用双向电泳技术在根分生组织中检测到384个蛋白质点,在非分生组织中检测到209个蛋白质点。其中,一些人们熟知的细胞核蛋白质,如RNA聚合酶Ⅰ、B23和类核仁蛋白NopA100在细胞增殖过程中表达量明显上升。进而,他们通过双向电泳结合Western杂交实验在分生组织样品中检测到26个NopA100的蛋白质斑点,而在非分生组织中只检测到7个蛋白质斑点。这表明,NopA100被磷酸化的程度与细胞核的活性相关,在细胞周期过程中NopA100可能被高度磷酸化。

5 拟南芥细胞核蛋白质组学

拟南芥(A.thaliana)是基因组背景清楚的模式植物,适用于细胞核蛋白质组学研究。Jones et al[6]鉴定了拟南芥悬浮培养细胞细胞核表达的345种蛋白质中的416条磷酸化多肽,极大地丰富了细胞核磷酸化蛋白质数据库。其中一些蛋白质(如转录因子、染色质重塑蛋白质、RNA沉默组分和剪切体等)磷酸化位点是新鉴定到的。这些信息为进一步研究蛋白质翻译后修饰在植物细胞中mRNA的转录、可变剪切与沉默过程中的作用提供了重要线索。Calikowski et al[7]成功分离了拟南芥悬浮培养细胞的细胞核基质,并利用双向电泳技术分离得到300个核基质蛋白质斑点。他们鉴定到了36种核基质蛋白质,主要包括核仁蛋白质IMP4、Nop56、Nop58、纤维蛋白和核仁素等,也包括核糖体蛋白质、组蛋白去乙酰化酶、翻译起始因子、热激蛋白和DnaJ等。这些为深入研究核仁甲基化作用和核仁定位等生物学功能提供了重要信息。此外,Pendle et al[8]鉴定了拟南芥悬浮培养细胞核仁中的217种蛋白质。他们对其中72种蛋白质进行了GFP融合蛋白表达,结果表明87%的蛋白质表现为核仁或核仁相关定位。他们还意外地发现6种外显子联接复合体(exonjunction complex)的组分,为深入研究植物细胞mRNA向细胞核外运输和无义介导的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay)提供了线索。

6 鹰嘴豆细胞核蛋白质组学

鹰嘴豆(C.arietinum)是豆科草本植物,也是重要的粮食作物。Pandey et al[9]利用双向电泳技术分离得到了鹰嘴豆幼苗细胞核中表达的600多个蛋白质斑点,并利用液相色谱结合质谱技术鉴定了150种蛋白质。其中,多数蛋白质参与信号转导和基因表达(占36%),以及DNA修复与转录(占17%)。这也是对基因组未知植物物种细胞核蛋白质组的首次报道。他们进一步分析了鹰嘴豆幼苗147种干旱胁迫应答细胞核蛋白质组的变化。这些蛋白质包括重要的调控蛋白质和功能蛋白质,如:各种分子伴侣,以及参与基因转录与复制、细胞信号转导、染色质重塑的蛋白质[10]。

7 大豆细胞核蛋白质组学

大豆(G.max)是重要的粮食作物和油料作物,由真菌(Phakopsora pachyrhizi)引起的大豆锈病对大豆产量有很大影响。Cooper et al[11]利用高通量液相色谱结合质谱技术比较了易染病大豆品种Williams 82与含有Rpp1抗性基因的Williams 82近等基因系叶片细胞核蛋白质组的差异。他们鉴定到了4 975种细胞核蛋白质,并发现其中847种蛋白质被磷酸化修饰,其中大量蛋白质是核调控蛋白质与转录因子。这些结果表明,真菌侵染会诱导细胞核蛋白质的表达与翻译后修饰。

8 展望

近年来的植物细胞核蛋白质组学研究为深入分析植物基因表达与调控机制提供了重要信息。但是由于受到蛋白质分离技术和质谱检测灵敏度的限制,对一些低丰度表达核蛋白质的鉴定仍然是植物细胞核蛋白质组学研究的瓶颈。今后,随着更多植物种类全基因组序列测定的完成,以及蛋白质分级与鉴定技术的完善,对更多物种细胞核蛋白质组进行研究将成为可能。同时,深入分析细胞核蛋白质的翻译后修饰与相互作用将为解析植物发育与环境应答的调控机制提供更重要的信息。

参考文献

[1]CALIKOWSKI T T,MEIER I.Isolation of nuclear proteins[M]//SANCHEZ-SERRANO J J,SALINAS J.Arabidopsis protocols:Methods in molecularbiology.Totowa New Jersey:Humana Press,2006:393-402.

[2]AKI T,YANAGISAWA S.Application of rice nuclear proteome analysisto the identification of evolutionarily conserved and glucose-responsivenuclear proteins[J].J Proteome Res,2009,8(8):3912-3924.

[3]CHOUDHARY M K,BASU D,DATTA A,et al.Dehydration-responsivenuclear proteome of rice(Oryza sativa L.)illustrates protein network,novel regulators of cellular adaptation,and evolutionary perspective[J].Mol Cell Proteomics,2009,8(7):1579-1598.

[4]ABDALLA K O,BAKER B,RAFUDEEN M S.Proteomic analysis ofnuclear proteins during dehydration of the resurrection plant Xerophytaviscose[J].Plant Growth Regul,2010(62):279-292.

[5]GONZALEZ-CAMACHO F,MEDINA F J.Identification of specific plantnucleolar phosphoproteins in a functional proteomic analysis[J].Proteo-mics,2004,4(2):407-417.

[6]JONES A M,MACLEAN D,STUDHOLME D J,et al.Phosphoproteomic analysis of nuclei-enriched fractions from Arabidopsis thaliana[J].JProteomics,2009,72(3):439-451.

[7]CALIKOWSKI T T,MEULIA T,MEIER I.A proteomic study of the Arabidopsis nuclear matrix[J].J Cell Biochem,2003,90(2):361-378.

[8]PENDLE A F,CLARK G P,BOON R,et al.Proteomic analysis of theArabidopsis nucleolus suggests novel nucleolar functions[J].Mol BiolCell,2005,16(1):260-269.

[9]PANDEY A,CHOUDHARY M K,BHUSHAN D,et al.The nuclearproteome of chickpea(Cicer arietinum L.)reveals predicted and unexp-ected proteins[J].J Proteome Res,2006,5(12):3301-3311.

[10]PANDEY A,CHAKRABORTY S,DATTA A,et al.Proteomics approachto identify dehydration responsive nuclear proteins from chickpea(Cicer arietinum L.)[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(1):88-107.

[11]COOPER B,CAMPBELL K B,FENG J,et al.Nuclear proteomicchanges linked to soybean rust resistance[J].Mol Biosyst,2011,7(3):773-783.

细胞核蛋白 篇2

间充质干细胞定向成骨细胞分化的蛋白质组学分析

目的:探讨用蛋白质组学方法分析人骨髓间充质干细胞(MSCs)定向成骨细胞诱导分化中细胞蛋白表达谱的改变. 方法: 从人骨髓细胞中分离获得MSCs,经细胞表型及多向分化能力测定鉴定MSCs的纯度和功能后,采用定向成骨细胞分化诱导培养体系,于分化后14 d分别提取未分化细胞及分化后细胞的`总蛋白,双向电泳分析,确定蛋白差异点,经酶切后行蛋白肽质量指纹谱鉴定差异蛋白表达. 结果: 双向电泳找到38个蛋白差异点,质谱分析鉴定出23个差异蛋白分子表达. 结论: 用蛋白质组学方法可高通量筛选与MSCs定向诱导成骨细胞分化相关的重要蛋白.

作 者：刘元林 于晓l 刘晓丹 李秀森 毛宁 LIU Yuan-Lin YU Xiao-Dan LIU Xiao-Dan LI Xiu-Sen MAO Ning 作者单位：军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850刊 名：第四军医大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF THE FOURTH MILITARY MEDICAL UNIVERSITY年，卷(期)：200627(17)分类号：Q5关键词：蛋白质组学 间质干细胞 蛋白表达

细胞核蛋白 篇3

关键词：植物种子；贮藏蛋白质；表达与调控；细胞内转运

引言

植物种子内贮藏的蛋白质在种子发育的后期会进行大量的合成和积累，为种子萌发过程提供所需要的碳、氮和硫等必要的营养元素。此外，豆类、谷类等也为动物和人类提供了丰富的氮源营养，并且某些种子贮藏的大量蛋白质具有一定的药学功能。目前，各国研究者们都关注于种子贮藏蛋白质的研究，也取得了诸多进展。这些研究有的关注于种子贮藏蛋白质表达中的调控机制，有的研究植物种子贮藏蛋白质的应用，如植物分类、植物进化，等等。植物种子中蛋白质的某些特性，能够使得细胞分裂在受精几天后即可完成，随后的细胞分化并没有分裂；第二，种子发育过程中的代谢活动主要是合成蛋白质、糖类、脂类等化合物，因此，研究种子贮藏蛋白质可以让人们更加深入地了解掌握种子的发育规律；同时，研究种子贮藏的蛋白质不仅有助于改善人们的营养，还有助于研究开发新的植物药物。

1、植物种子贮藏蛋白质的研究历程

植物种子贮藏的丰富蛋白质主要在种子发育后期进行合成积累，具有一定的经济价值和重要的生理学功能。很早以前，就已经有研究者开始关注并且进行了大量的相关研究，其对贮藏蛋白质的结构特征和分类进行了大量的系统分析与试验，对其有着较为完整而系统的分类。根据溶解性不同，我们可以将种子贮藏蛋白质分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白等类别。其中，清蛋白一般可以在水中溶解；球蛋白则易溶于稀盐溶液，是植物种子最主要的贮藏蛋白质；球蛋白是双子叶植物种子中含量多的蛋白质；谷蛋白是一种高分子量化合物，通常溶解于稀酸或者稀碱溶液；而醇溶蛋白则溶解于乙醇和水的混合物之中。植物种子贮藏蛋白质主要用于贮藏氮源，为种子萌发过程提供所需要的碳、氮和硫等营养元素，并且如豆类、谷类等植物的种子也会为动物和人类提供了丰富的氮源营养。随着科学技术的发展，部分与生物相关研究的新技术也层出不穷，同时，研究生物化学和分子生物学的技术手段不断改进，已能够较为深入掌握贮藏蛋白质的转录，表达调控以及细胞内转运的规律。

2、植物种子贮藏蛋白质的表达与调控

植物种子贮藏蛋白质的表达指的是不同植物表达的蛋白质是不同的，同一种植物在不同的生长时期，所表达的蛋白质也是不相同的。植物种子贮藏蛋白质的差异，以及为什么能够表达出这些差异，一直是学者们所关注的问题。近年来，国内外生物领域对当前种子贮藏蛋白质的调控机制和蛋白质组学的研究取得了很多进展，笔者通过查阅资料，从一些研究者的研究中找到了答案：种子贮藏蛋白质的表达是受到精确的调控的，这种调控可能来源于DNA的转录、RNA的翻译，也或者是蛋白质的转录后期加工修饰。研究表明，通过调控植物种子贮藏蛋白质的表达，可以提高需要的蛋白质在植物种子中的含量，提高经济效益，同时也提高了植物种子包含的营养学价值。为了研究植物种子贮藏蛋白质的表达与调控，我们首先需要了解其编码基因，编码植物种子贮藏蛋白质的基因大多数是多基因家族，多基因家族，顾名思义就是由多个基因串联在一起，同时进行转录与翻译表达。一个基因的突变可能会引起其它基因的变化，而不同的基因之间存在着相互作用，调控基因和表达的基因之间也会存在一定的作用，并且调控基因可以去调节基因表达；在贮藏蛋白质基因之间，同样存在着相互作用，一种贮藏蛋白质基因表达，可能会促进或者抑制其它贮藏蛋白质基因的表达，换句话说就是，一种贮藏蛋白质的含量上升，可能使得其它贮藏蛋白质的含量上升或者下降。

3、植物种子贮藏蛋白质在细胞内的转运

贮藏蛋白质刚刚合成时被称为前体，位于粗面内质网上，然后会根据自身的特性，通过多种途径运输到蛋白质体中，或者运输到蛋白质贮藏型的液泡中。醇溶蛋白直接在粗面内质网上形成前体，该前体聚合，形成凝聚体，然后出芽，形成蛋白体；球蛋白、白蛋白和谷蛋白由依赖受体的运输或者依赖聚集体的运输方式，运送到贮藏蛋白质的蛋白质贮藏型液泡中。这部分的研究内容主要包含贮藏蛋白质在细胞内的转运有贮藏蛋白质分选信号，到目前为止，国内外已经发现了三种液泡分选信号，即分别为序列特异性、c末端和物理结构型分选信号。其中，针对前两种研究较多，并对其规律掌握也较为深入，简单来说这两种分选信号是一种跨膜受体，能够参与到液泡分选贮藏蛋白质的过程中，并包含一些水解酶和贮藏蛋白质，为植物的遗传奠定基础作用。

结语

综上所述，研究植物种子贮藏蛋白质有利于了解其表达调控机制、细胞内运输机制，进而对其合理调控，为人类所用，创造出更多的经济价值和营养价值。

参考文献：

[1] 黄荟，姜孝成，程红焱，宋松泉.种子蛋白质组的研究进展[J].植物学通报.2008（05）

[2] 蔺瑞，张美莉，张家超.裸燕麦球蛋白的分离纯化及其抗氧化活性研究[J].食品科学.2011（01）

[3] 李春梅，杨守萍，盖钧镒，喻德跃.野生大豆与栽培大豆种子差异蛋白质组学研究[J].生物化学与生物物理进展.2007（12）

细胞核蛋白 篇4

研究显示,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号转导系统在肿瘤化疗耐药中发挥重要作用,化疗药物能够引起MAPKs信号传导系统的激活及MDR的产生,而MAPKs信号转导通路特异性阻断剂体外可逆转MDR细胞的耐药性[2]。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)是MAPKs家族中的重要成员。有报道显示,ERK1、ERK2和肿瘤细胞化疗耐药性的发生有关[3];而ERK5是MAPKs信号转导通路中相对较新的一条通路,其在肿瘤细胞MDR方面的研究较少[4]。Bad是Bcl-2家族中与Bcl-2、Bcl-x L相关的促凋亡基因,具有促凋亡活性, 广泛分布在机体各种组织,对防御自身免疫、维持造血细胞稳态有重要意义,并有肿瘤抑制因子活性[5]。 膀胱癌细胞MDR中Bad的作用及与ERK家族的内在联系目前尚未明确。

本研究诱导建立人膀胱癌MDR细胞及其亲本细胞。通过检测ERK1、ERK2和ERK5蛋白的表达和研究Bad基因和蛋白水平的变化,初步探讨Bad在膀胱癌细胞MDR中的作用及与ERK可能的内在联系,为逆转膀胱癌细胞MDR提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株人膀胱癌细胞株T24,购自中南大学细胞生物中心,所有实验重复3次。

1.1.2主要试剂DMEM高糖培养基和胎牛血清购自美国Hycone公司,CCK-8 kit购自美国Sigma公司,化疗药物异环磷酰胺 (Ifosfamide,Ifex)、顺铂 (Cisplatin,CDDP)及多西他赛(Docetaxel,DOC)购自中国齐鲁制药有限公司,MRP-1、P-gp、ERK5、Bad、 GAPDH和 β-actin一抗购自美国Abcam公司 , ERK1/2、p-ERK1/2一抗购自美国Cell Signalling公司,Goat Anti-rabbit二抗和Rabbit Anti-goat二抗购自中国博士德公司,ECL kit购自美国Bio-rad公司,高纯度总RNA快速提取试剂盒和转录试剂盒购自日本Ta Ka Ra公司,荧光定量PCR试剂IQ SYBR Green Supermix购自美国Bio-Rad公司。

1.1.3主要仪器全波长酶标仪购自美国MD公司,荧光定量PCR仪和凝胶成像仪均购自美国Biorad公司。

1.2实验方法

1.2.1耐药细胞株的诱导采用小剂量缓慢诱导法[6],接种对数生长期膀胱癌细胞T24,待细胞增殖至80%左右融合时,加入Ifex 0.01μg/ml作用12 h, 恢复常规培养5 d,随后逐步提高Ifex的质量浓度至细胞在0.1μg/ml的浓度下死亡率 <5%,将获得的耐药细胞株命名为T24/Ifex。

1.2.2耐药细胞对化疗药物敏感性的检测检测前将细胞脱药培养10 d,取生长状态良好、处于对数生长期细胞,制备单细胞悬液,采用CCK-8法分别检测T24及T24/Ifex细胞对Ifex、DOC和CDDP等化疗药物的敏感性。线性拟合法计算获得半抑制浓度 (half maximal inhibitory concentration,IC50)值,耐药指数(resistance index,RI)= 耐药细胞IC50值 / 亲本细胞IC50值,RI<5为低度耐药;5~15为中度耐药; >15为高度耐药。

1.2.3 Western blot检测相关蛋白的表达按分子克隆实验指南第3版的方法进行裂解、抽提细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。将所得的蛋白于10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳(恒流,25 m A),电转恒流,200 m A至PVDF膜,5%脱脂牛奶或5%BSA封闭1 h后,分别加入相应一抗4℃孵育过夜。加辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2 h。ECL试剂盒显影,结果在图像分析系统中进行分析。

1.2.4荧光定量PCR检测Bad m RNA表达Trizol法提取细胞总RNA,置于 -80℃冰箱冷冻保存,按逆转录试剂盒提供的操作步骤合成c DNA,置于 -20℃ 冰箱冷冻保存。Bad上游引物:5'-GTCGTATCCAGT GCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3', 下游引物 :5'-GCAACCCGTAGATCCGAACTT-3', GAPDH上游引物:5'-TGCGGGTGCTCCGCTCCGCA GC-3'; 下游引物 :5'-CAGTGCACGCTCCGA-3'。 12.5μl扩增反应体系中加入c DNA模板10.5μl(稀释比例为1∶10),上、下游引物各1.0μl。扩增条件: 50℃预变性3 min,95℃变性3 min,95℃退火10 s, 59℃延伸20 s,共40个循环,72℃继续延伸20 s。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,两组比较用t检验,多组比较用 χ2检验,P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1耐药细胞对化疗药物的敏感性

耐药细胞T24/Ifex不仅对诱导药物Ifex产生耐药,还对其他抗肿瘤药物DOC和CDDP产生不同程度的耐药。其中,耐药细胞T24/Ifex对Ifex的RI为7.359,符合耐药中介标准[7]。见表1。

2.2MDR相关蛋白的表达变化

Western blot结果显示,MRP-1和P-gp蛋白在耐药细胞T24/Ifex中的表达显著高于亲本细胞T24, 差异有统计学意义。见图1和表2。

2.3ERK1、ERK2和ERK5蛋白的表达变化

Western blot结果显示,ERK1和ERK2蛋白在耐药细胞T24/Ifex中的表达水平高于亲本细胞T24, 差异有统计学意义(见图2);同时,耐药细胞T24/Ifex中ERK2磷酸化水平较亲本细胞下降,而ERK1磷酸水平无显著变化,并且p-ERK1/2与ERK1/2的比值下降(见图2);耐药细胞ERK5蛋白表达较亲本细胞上调,差异有统计学意义(见图3和表3)。

2.4Bad的mRNA和蛋白表达变化

实时荧光定量PCR检测发现,耐药细胞T24/Ifex中的Bad m RNA表达水平低于亲本细胞T24,约为亲本细胞T24的0.5倍(P <0.01),差异有统计学意义。Western blot检测发现,耐药细胞T24/Ifex中Bad蛋白表达水平(0.36)较亲本细胞T24(0.23)下降(P < 0.01),差异有统计学意义。Bad基因和蛋白水平变化一致。

3讨论

化疗药物体外诱导肿瘤细胞耐药,是目前最常用的建立体外肿瘤细胞耐药模型的方法。本研究采用小剂量缓慢诱导法,使人膀胱癌耐药细胞T24/Ifex达到中度耐药,并对其他几种结构、机制不同的化疗药物有不同程度耐药,MDR相关蛋白MRP-1和P-gp表达显著上调,证实人膀胱癌MDR细胞模型建立成功。

MAPKs信号转导通路在肿瘤化疗耐药中的作用日益受到重视。有证据表明,通过影响肿瘤细胞MAPKs家族蛋白表达水平有可能逆转肿瘤细胞MDR。目前,大多数研究认为过度表达的ERK1和ERK2能上调耐药相关基因蛋白的表达,从而促进肿瘤MDR的发生[8]。ERK5是ERK家族的重要组成部分,也是MAPKs信号通路中研究最少的通路,其在肿瘤组织新生血管生成及肿瘤细胞侵袭和转移中都发挥重要作用。与其他MAPKs家族成员一样, ERK5对于正常细胞的生存、增殖和分化起着极其重要的作用。但ERK5与膀胱癌化疗MDR的关系尚不明确。本研究Western blot结果显示,与亲本细胞T24比较,人膀胱癌MDR细胞T24/Ifex中,ERK1、ERK2和ERK5蛋白表达水平升高,ERK1蛋白磷酸化水平无显著变化,p-ERK2磷酸化水平下降,提示ERK1、ERK2和ERK5蛋白表达与化疗耐药性成正相关。KISUCK譧等[9]研究发现,小鼠白血病细胞株L1210/VCR MDR与ERK持续上调活化有关,其机制可能是引起P-gp表达增加,使细胞内VCR浓度降低,而MEK特异性抑制剂PD98059和U0126可抑制ERK1和ERK2的活性,从而提高细胞内VCR浓度并且逆转L1210/VCR的耐药性。SUN等[10]发现,非甾体类抗炎药舒林酸可以激活ERK通路并使COX-2表达上调,而通过PD98059抑制ERK1和ERK2的活性可抑制COX-2表达,并显著增加舒林酸引起的结直肠癌细胞凋亡。这些研究结果提示ERK1、 ERK2和ERK5与肿瘤细胞MDR的发生、发展存在关联。

Bad基因,是一种促凋亡基因,编码产物可通过与Bcl-2家族中的凋亡抑制基因Bcl-2和Bcl-x L的表达产物结合为异源二聚体,通过浓度依赖性方式替换Bcl-x L/Bax、Bcl-2/Bax二聚体中的Bax,从而达到促进细胞凋亡的目的。Bad基因如何作用于特定的肿瘤细胞并影响其功能目前尚不清楚,其在肿瘤细胞凋亡中是否发挥重要作用在不同学者的研究中也是众说纷纭。刘艳等[11]发现,Bad蛋白能够逆转肺癌雷帕霉素耐药性。本研究发现,在人膀胱癌MDR细胞T24/Ifex中Bad基因和蛋白水平的表达下降, 提示Bad表达下调,可能是肿瘤细胞MDR形成的关键。Bad表达的调控非常复杂,在不同的细胞有不同的方式,涉及到转录水平调节、亚细胞定位调节、磷酸化调节、蛋白酶体依赖的降解等多个方面。OLAV ARR魱A等[12]研究发现,MAPKs信号通路一定程度上参与Bad表达的调控,ERK1/2的磷酸化可以促进Bad的表达及活化,发挥其促凋亡作用。冯云等[13]研究发现一氧化碳中毒后,大鼠海马神经ERK1/2表达下调,Bad早期表达上调后又回落,提示ERK1/2、Bad蛋白介导海马区神经元的凋亡,参与DEACMP的发生。然而在膀胱癌细胞MDR中,ERK5和Bad的关系尚不明确。

细胞核蛋白 篇5

间充质干细胞分化为心肌样细胞与P120连环蛋白mRNA表达

目的:研究5-氮杂胞苷(5-azacytidine, 5-aza)诱导体外骨髓间充质干细胞(marrow measenchymal stem cells, MSCs)向心肌细胞发展的作用及其机制.方法:从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs,培养传代后用不同浓度的5-aza诱导,倒置光显微镜和透射电镜观察诱导前后细胞形态变化;流式细胞术检测细胞周期改变;MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响;免疫细胞化学法检测肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达;RT-PCR检测P120连环蛋白1A mRNA的表达.结果:5-aza对MSCs有抑制增殖的作用(P<0.05);在光镜和透射电镜下可见有心肌样细胞的`形态变化;免疫细胞化学检测结果表明,MSCs的经5-aza诱导14d,肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达均较对照组显著增高(P<0.01); PT-PCR结果表明P120连环蛋白mRNA表达明显,而对照组未见表达.结论:MSCs可在体外被5-aza诱导分化成心肌样细胞,这可能与P120连环蛋白1A mRNA表达有关.

作 者：陈莉 买霞 陈小义 徐瑞成 CHEN Li MAI Xia CHEN Xiao-yi XU Rui-cheng  作者单位：中国人民武装警察部队医学院细胞生物学教研室,天津市,300162 刊 名：心血管康复医学杂志  ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CARDIOVASCULAR REHABILITATION MEDICINE 年，卷(期)：2008 17(3) 分类号：Q95209 关键词：间充质干细胞   肌细胞,心脏   5-氮杂胞苷  

细胞核蛋白 篇6

英国桑格研究所的科学家们把卵子的这种蛋白质以罗马掌管生育和婚姻女神“Juno”的名字命名，他们声称这一发现揭开了怀孕最初始阶段的过程，而我们直到现在对于这一阶段都知之甚少。

桑格研究所的资深作者Gavin Wright博士说道：“我们解开了生物学一个存在已久的秘密。没有蛋白质的这种基本互动，受精活动就不会发生。我们有可能借助这一发现改善不孕的治疗，并且开发出新的避孕药。”

日本科学家在2005年在精子表面鉴定出了关键蛋白质，这种蛋白质使它们附着到较大卵细胞的薄膜上。他们以一座婚姻神社的名字“Izumo1”為它命名。然而，在卵细胞上寻找相应的表面蛋白质事实上是很困难的，这或许是因为精细胞和卵细胞之间的交互作用比较微弱，因而难以测量。

桑格研究所的科学家借助人造的Izumo1蛋白，在老鼠精细胞表面发现了与之捆绑的Juno蛋白。通过为老鼠进行基因工程改造，科学家们证实，当雌性老鼠缺乏Juno基因和蛋白时，它就会不孕，而且当雄性老鼠缺乏Izumo1基因和蛋白时也同样会出现不育。

这项研究的第一作者，桑格研究所的Enrica Bianchi说道：“这对蛋白质是已知首个精、卵细胞识别互动的基本要素。两种蛋白质的捆绑非常微弱，这或许就解释了为何这一过程直到现在对我们来说都是一个谜。”

细胞核蛋白 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院2008—2013年有完整临床和病理学诊断资料, 并行手术切除的大肠癌患者42例, 术前均无放疗或化疗史。其中男24例, 女18例;年龄≤45岁14例 (33.3%) , 46~65岁13例 (31.0%) , >65岁15例 (35.7%) ;管状腺癌23例 (54.8%) , 乳头腺癌10例 (23.8%) , 黏液腺癌9例 (21.4%) 。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器

试剂包括小鼠抗人CK1 9单克隆抗体 (美国Chemicon公司) 、羊抗小鼠二抗试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司) , 以及多聚赖氨酸、多聚甲醛、明胶、甘油、香草酚等。仪器包括OLYMPUS BX-70荧光显微镜成像系统、德国徕卡切片机、三气培养箱、数码照相机、电子天平和微量加样枪。

1.2.2 操作

将大肠癌及癌旁组织取材后固定, 制作石蜡标本, 待收集试验所需材料充足, 将其常规切片及裱片, 应用CK19单克隆抗体行免疫组织化学检测, 磷酸缓冲盐溶液代替一抗。

1.2.3 图像分析

免疫组化切片在2 00倍显微镜下观察结直肠癌标本, 每张切片随机选取5个视野。采用OLYMPUS BX-70荧光显微镜成像系统拍照, 经Image-Pro Plus5.1图像分析系统对阳性细胞进行图像分析。

2 结果

大肠癌42例中CK19表达率为100%, 而癌旁正常组织CK19表达均为阴性。

3 讨论

大肠癌的发生与环境、饮食、遗传、社会经济状况等多种因素有关, 在这些因素共同作用下细胞周期发生紊乱、细胞失控性生长。大肠癌发生还与高脂肪、高蛋白质饮食、过量饮酒、进食纤维较少密切相关。目前, 对于大肠癌与其肿瘤标记物的研究很多, 都在试图找出一个有效的标记物, 便于更好地指导治疗。细胞角蛋白作为细胞骨架蛋白无疑成为研究重点之一[4]。角蛋白是上皮细胞中间丝蛋白, 具有突出的分子多样性, 其杂聚中间丝是由配对的Ⅰ型和Ⅱ型分子组成。人体中有54个功能性角蛋白基因存在, 代表了上皮类型和细胞分化阶段的高度特异性模式。作为上皮细胞骨架的一部分, 角蛋白对于上皮细胞和组织保持机械稳定性、完整性起着非常重要的作用。此外, 还有一些角蛋白起调控功能并参与细胞内信号途径, 如压力保护、伤口愈合和细胞凋亡[5]等。恶性肿瘤中90%都是上皮源性肿瘤, 在其发生发展的过程中, 中间丝蛋白始终保持特有的保守性, 所以细胞角蛋白成为诊断肿瘤的重要工具。CK19是人细胞角蛋白一个亚型, 相对分子质量为54000, 主要表达于上皮细胞, 如乳腺、肺、胰腺、膀胱等腺上皮, 而正常胃肠腺上皮一般不表达。

Hernandez等[6]应用大肠癌组织芯片检测了CK20和CK19在癌、黏膜中的表达, 结果表明CK1 9与阳性肿瘤的进展有关。近年来, 一种新的大肠癌变途径被大家逐渐认识, 即增生性息肉-锯齿状腺瘤-癌顺序[7]。依据增生性息肉-锯齿状腺瘤-癌变途径理论, CK19的表达很可能是循此路径发生大肠癌的标志物之一[8], 同时CK19在正常大肠组织中无阳性表达。本文结果显示, 大肠癌中CK19表达率为100%, 而癌旁正常组织CK19表达均为阴性, 与上述结论一致, 表明CK19可作为大肠癌的特异性表面标志物用于明确诊断。

摘要：目的 探讨细胞角蛋白19 (CK19) 在大肠癌细胞的表达意义。方法 选取该院2008-2013年收治的大肠癌患者42例, 癌组织及癌旁组织标本均经组织固定、石蜡包埋后切片, 应用CK19单克隆抗体进行免疫组织化学染色, 采用荧光显微镜成像系统拍照, 经图像分析系统对阳性细胞进行图像分析。结果 大肠癌中CK19表达率为100%, 而癌旁正常结肠组织CK19表达均为阴性。结论 CK19可作为大肠癌的特异性表面标志物用于明确诊断。

关键词：大肠癌,细胞角蛋白19,免疫组织化学染色

参考文献

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日本找到癌症干细胞标志蛋白 篇8

京都大学消化内科教授千叶勉领导的研究小组在研究中注意到消化道中的一种蛋白质Dclk1, 他们分析了罹患大肠癌的实验鼠, 发现含这种蛋白质的细胞会在较长一段时间内持续产生癌细胞。他们通过基因操作成功地有选择地清除了含Dclk1蛋白质的细胞, 实验鼠体内的大肠癌组织面积缩小了80%以上, 有些甚至完全消失, 而且未发现副作用。

治疗癌症如果不把癌症干细胞彻底清除, 则癌症很容易复发和转移, 因此必须找到癌症干细胞, 对其“斩草除根”。而此前人们陆续发现的癌症干细胞所含的一些标志物质同时也存在于正常干细胞内, 如果以这些物质为目标清除癌症干细胞的话, 会误伤到正常干细胞, 导致副作用的出现。

研究人员表示, 这是首次找到只存在于癌症干细胞内的标志物质, 以此物质为目标, 可实现对癌症干细胞的精准攻击, 有望用来研发几乎没有副作用的抗癌药物。另外, Dclk1蛋白质很可能也是胰腺癌、胃癌等其他癌症的标志蛋白。

无细胞蛋白表达系统研究进展 篇9

近年来, 无细胞蛋白质表达系统再次受到关注。相比较体内表达, 无细胞蛋白表达系统具有其明显的优点[], 例如, 不受细胞生理限制可进行较大量的毒性蛋白表达;产物的活性和溶解性增加;产物不受胞内蛋白酶的降解;反应可以在短时间内进行;无需繁杂的下游处理;适合于高通量表达。而且通过优化反应系统, 可以得到高产率表达产物。总之, 在无细胞系统合成蛋白质可提高目标蛋白的表达效果。

随着核酸测序技术、芯片技术和RNA干扰技术的建立和突破, 人们对核酸信息的了解越来越多。而生命过程最终多是以蛋白质形式执行其功能的, 因此对蛋白质结构和功能的研究成为后基因组时代重要的工作。因此, 发展能够合成任何目标蛋白系统以及实现高通量表达是当今生物技术中重要的课题。

2 无细胞蛋白表达系统

无细胞蛋白质合成系统是一种以外源DNA或m RNA为模板, 利用细胞抽提物中的蛋白合成机器、蛋白折叠因子及其他相关酶系, 通过添加氨基酸、T7聚合酶和能量物质等来实现蛋白质表达的体外系统 (如图一) , 1958年, Zamecnik首次证明, 从细胞抽提物中获得的翻译机器可以介导体外的蛋白的合成;1961年, Nirenberg和Matthaei[4]利用蛋白质的无细胞合成体系, 以破译遗传密码子。该方法对蛋白翻译机制的研究, 同样也作出了重要贡献。然而, 当时由于此方法的表达量有限, 无法进行规模化生产, 因此, 在过去几十年一直没能被重视起来。

随着人们对蛋白质生物合成机制的深入了解, 建立稳定的无细胞蛋白表达体系已成为可能。现已确定, 蛋白质生物合成的机器是核糖体, 如果存在有t RNA, 以及蛋白折叠加工必需的酶和各种相关因子, 只要提供外源的RNA模板、氨基酸和能量, 无需其他的细胞结构 (如线粒体) , 蛋白质合成也能顺利进行。而在各种细胞的裂解液中几乎都含有蛋白质生物合成所需的核糖体以及各种酶和因子。因此, 可以在无细胞体系中实现蛋白质表达, 通过对无细胞反应体系的优化, 系统的稳定性和蛋白产率得到了大幅度的提高。

目前, 已开发出来的无细胞表达系统有原核和真核系统两大类型。原核系统通常是通过E.coli BL21 (DE3) 或其他敲除了内源蛋白酶和核酸水解酶的菌种, 如A19来进行无细胞表达体系的建立;真核系统, 目前较为成熟的是利用兔网织红细胞和麦芽提取物来实现无细胞蛋白表达系统的建立。理论上来说, 任何遗传信息都可以在这两大类体外表达体系中进行翻译而得到目的蛋白, 但不同的系统有着不同的特点, 应该根据自己的需求来进行选择。

2.1 原核系统

原核系统表达系统主要利用大肠杆菌的提取物来实现的。目前对大肠杆菌蛋白合成机制已有十分详细的认识, 这使得大肠杆菌的体外表达系统也随之不断得到改进。大肠杆菌提取物基础上建立的无细胞蛋白表达系统有一个很大的优势就是它的耐受性, 它可以在含有其它不同成份杂质时仍可以进行目标蛋白的表达。因此人们可以根据需要加入特殊添加剂如蛋白酶抑制剂, 分子伴侣, 代谢物, 非天然氨基酸甚至是少量的变性剂, 也可掺入特殊标记的氨基酸获得带标记蛋白质。为此, 该体系的弹性非常大, 可以加入许多其它必要成份以提高产率和提高溶解性。例如:微修饰过的反应环境可以变成氧化环境以帮助蛋白形成正确的二硫键, 然后正确的折叠。加入酶和底物可以完成特定的修饰, 比如在丝氨酸和苏氨酸残基上进行特定磷酸化修饰。但是, 蛋白的翻译后加工和如何正确折叠仍然是一个问题, 特别是利用这一系统合成那些多结构域构成和含有二硫键的真核蛋白。不过, 由于真核体外合成体系也未能解决蛋白质翻译后加工的问题, 而大肠杆菌的材料来源成本最低, 实用性高, 表达效率也高, 因而依旧是体外表达的热门选择。

2.2 真核系统

2.2.1 兔网织红细胞

兔网织红细胞是应用得较早的一个体外表达系统。网织红细胞由红细胞分化而来, 在体内主要是负责合成大量血红蛋白 (90%以上) , 以及球蛋白。这种未成熟的红细胞本身不带细胞核, 但却保留了这种高效翻译各种核酸信息的能力, 而没有复杂的背景, 即使在较低的丰度下也能比较高效地合成产物。根据测定, 体外合成外源蛋白的效率接近完整网织红细胞自身合成内源蛋白的效率。此外网织红细胞体系内源的核酸酶很少, 有助于长链RNA的稳定 (包括有帽子或者没帽子结构的RNA) , 因而可以合成较大的蛋白。

2.2.1 麦芽提取物

麦芽提取物是不同于网织红细胞裂解物的另一个无细胞体外合成体系。由于内源的m RNA很少, 这个系统可用于各种病毒、酵母、高等植物乃至哺乳动物蛋白的合成。这个体系要求RNA有帽子结构才能更好的翻译。此系统广泛用于放射标记多肽和蛋白的合成。合成量不太高, 直到最近[5]才通过延长合成时间的方式提高了产率。如果要保持麦芽提取物系统持续数日的合成效率, 就必需保证反应体系不含有任何会破坏核糖体功能以及其它合成中使用到的相关的酶。这样此系统的合成效率可以被不断加强, 由试验结果显示, 24小时内最高的合成量可达1mg/ml。麦芽提取物系统和大肠杆菌系统都适合进行高通量的蛋白质组学研究。

3 应用

利用无细胞体系表达蛋白质已经应用于很多方面, 但是大致可以归属于以下两个方面。

3.1 结构蛋白质组研究中的应用

首先, 利用无细胞体系可以进行蛋白质的高通量表达, 能同时得到许多用于结晶的蛋白质, 进而开展结构蛋白质组的研究。第二, 特别是膜蛋白和有细胞毒性的蛋白质都可以利用无细胞体系进行表达。第三, 可以在蛋白质中人为地引入硒代半胱氨酸, 有利于蛋白质的X射线结晶学研究。第四, 因为可以在很小体积内进行无细胞体系的蛋白质表达, 这样有利于蛋白质的同位素标记, 例如进行了双重同位素标记蛋白质后, 无需烦杂的纯化, 即可进行灵敏的NMR测定。

3.2 功能蛋白质组研究中的应用

同样是由于无细胞体系可以进行蛋白质高通量、微量化的表达, 表达后又可省去烦杂的分离纯化, 因此对表达产物的活性测定非常容易, 尤其是对酶的活性研究。如果进一步降低无细胞表达体系的体积, 使得反应浓集在很小区域内 (例如在96孔板中) , 几乎可以达到蛋白质 (微) 阵列的目的。

在无细胞体系表达蛋白质时可以引入非天然氨基酸 (其中包括荧光和生物素光标记的氨基酸、可以进行光化反应的修饰氨基酸) , 对蛋白质进行修饰和标记。这样可以更为有效地研究蛋白质组中得到的各个组分的功能。

4 讨论及展望

体外表达由于是在无细胞的条件下进行的, 缺少蛋白质翻译后加工所需要的细胞器和空间结构, 所以其致命的弱点就是:即使是真核体外表达系统, 目前依然无法对蛋白进行糖基化和其它天然蛋白必需的高级修饰。所以有必要对体系进行改进, 如渗入单糖基化的氨基酸或加入微粒体 (microsome) 等, 理论上可以实现一些必要的修饰。

乳铁蛋白对胃癌细胞增殖的影响 篇10

1 材料与方法

1.1 主要材料

胃癌细胞系MGC-803为本室保存。Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司。qRT-PCR miRNA Detection Kit购自广州天根生物公司。miR-218 mimics为Ambion公司产品。DMEM培养基购自Hyclone公司, 胎牛血清来自杭州四季青。MTS细胞增殖/毒性检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 细胞培养

胃癌细胞系MGC-803培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中, 在95%的湿度、5%的CO2、37℃条件下培养。用不同浓度重组人乳铁蛋白干预MGC-803细胞。

1.3 MTS法检测细胞增殖活性

取对数生长期的MGC-803细胞, 胰蛋白酶消化后接种于96孔板中, 每组设6个复孔, 处理组细胞加入不同浓度重组人乳铁蛋白的培养基, 对照组加入相同体积的不含重组人乳铁蛋白的培养基放37℃、5% CO2培养箱中培养。在未接种细胞的孔中加入DMEM培养基中作为调零孔。接种后24、48、72和96h各检测1次。检测时每孔加20μL MTS检测试剂, 37℃孵育2h, 在酶标仪上测定570nm波长处吸光度值 (A570) 。细胞增殖抑制率= (1-实验A值/对照组A值) ×100%。

2 结果

采用0 (对照组) 、0.1、1、10、100μg/L重组人乳铁蛋白处理MGC-803细胞24、48、72h, 分别取细胞进行MTS检测, 结果发现乳铁蛋白能明显抑制MGC-803细胞的增殖 (P<0.05) , 其抑制作用呈现出剂量-时间依赖性 (见图1、表1) 。

3 讨论

乳铁蛋白属于转铁蛋白家族, 是一种非血红素铁结合蛋白。因与铁结合后形成的复合物呈红色, 故早前又称为“红色蛋白”[1]。它广泛分布于哺乳动物 (人、牛、羊、马、狗、猪和一些啮齿类) 乳汁、唾液、精液、泪液、气管和鼻腔分泌物、胰液等外分泌液, 以及血浆、中性粒细胞次级颗粒中[1]。它在人类初乳中含量最高, 可达6～8mg/mL, 成熟乳汁中含量在1g/L左右。乳铁蛋白具有广泛的生物学功能, 除参与铁代谢外, 具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能[1]。乳铁蛋白的多种重要生物学功能使其在畜牧、食品营养品、医药界受到广泛关注。乳铁蛋白在多种肿瘤中下调或缺失, 它能抑制宫颈癌细胞、头颈部肿瘤细胞等肿瘤细胞的增殖, 并且发现乳铁蛋白能阻止细胞周期G1/S进程[4,5]。研究也显示, 乳铁蛋白能调控细胞周期调控蛋白如p21、p27和Rb的表达和活性, 从而调控细胞周期影响肿瘤细胞生长增殖[4]。

本研究通过采用重组人乳铁蛋白处理胃癌细胞MGC-803, 结果发现乳铁蛋白能明显抑制MGC-803细胞的增殖 (P<0.05) , 其抑制作用呈现出剂量-时间依赖性。乳铁蛋白产品在畜牧业、食品行业已经开始使用, 安全性很好。因此, 本研究对于乳铁蛋白应用于胃癌的预防和治疗将具有十分重要的意义。

参考文献

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细胞核蛋白 篇11

摘要：以雄性Wistar大鼠为研究对象，进行“一次性大强度离心运动”，一次性离心运动实验为16°下坡跑台跑，定量大负荷间歇性运动，跑速为26.8 m/min，运动5 min×10组，组间歇1 min。离心运动后不同时段取大鼠后肢腓肠肌外侧头进行分析大强度离心运动后大鼠骨骼肌细胞骨架蛋白含量的变化特点；与延迟性骨骼肌损伤时血清酶升高的关系；探讨细胞骨架蛋白在骨骼肌纤维中存在的特点和作用。

关键词：离心运动；细胞外基质蛋白；骨骼肌微损伤；膜完整性

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)05-0618-05

骨骼肌细胞膜连接了细胞内骨架与细胞外基质（ECM），在维持骨骼肌细胞的结构和功能中发挥了重要作用。在骨骼肌中基膜（细胞外基质）—肌细胞膜—细胞骨架中的一些连接蛋白的缺失导致了骨骼肌疾病从而使人们对它们连接的重要生物作用有了认识［1］。细胞外基质（ECM）决定组织的形态和结构，ECM不同成分之间相互作用形成立体骨架结构，对细胞起着支持作用。细胞只有通过ECM连接才构成组织，ECM决定组织的牵张强度。细胞外基质蛋白在维持肌细胞的结构以及力的传导过程中发挥了重要作用。

对于运动后骨骼肌微损伤的发生及恢复过程中肌细胞的细胞内骨架、肌细胞膜在结构、功能方面的变化的研究已经相对比较成熟，但对于骨骼肌细胞外基质在运动后结构、功能方面变化的研究目前还较少，因此本研究的目的是探讨运动后骨骼肌微损伤后ECM中的重要蛋白laminin-2，collagenIV蛋白含量的异同及离心方式运动对其影响；探讨损伤发生过程中基质蛋白laminin-2基因表达的变化特征，为今后能够更加深入全面的研究运动后骨骼肌微损伤发生的机制提供理论基础和依据。

1研究方法

1.1实验对象与分组雄性Wistar大鼠42只，分为7组，每组6只，体重300～360 g，由北京维通过利华实验动物技术有限公司提供，国家标准啮齿类动物饲料，分笼饲养，自由饮食，室温17～23℃，相对湿度60%～75%，保持12 h光照。

正式实验前3 d，所有动物进行5～10 min跑台运动，以熟悉跑台，速度为5～10 m/min，坡度为0°。大鼠跑台为杭州段氏制作BCPT-98型。

一次性离心运动的实验大鼠采用Armstrong(1983)［2］、田野［3］所设计的-16°下坡跑台跑，模型略有改进，以更适合模拟离心方式运动造成的损伤。定量大负荷间歇性运动，跑速为26.8 m/min，相当于最大摄氧量的80％～90%［4］，运动5 min，间歇1 min，共进行10组。给以少量声、光、电刺激，以激励大鼠运动。

实验组在一次性离心运动后即刻、运动后4 h、12 h、24 h、48 h、72 h，取材为每组6只，分别取大鼠后肢腓肠肌外侧头进行分析。安静对照组取材与实验组相同部位。

1.2测试样本的采集与处理1） 大鼠血清的采集：大鼠称重后，用20%的乌来糖(或称乌拉坦)按0.01 mL/g体重腹腔注射麻醉，心脏取血置于离心管中，倾斜静置2～3 h后进行常规血清分离（2 000转/min，15 min），-20℃冰箱保存待测。

2） 用于匀浆的样本采集：取血后速取左侧腓肠肌外侧头,切约为4 min×4 min×4 mm3，用锡纸包好、标记后放入液氮中冰冻保存，留做匀浆用。

3） 用于冷冻切片的样本采集：大鼠称重后，颈椎脱位法处死，取血后小心剪取约3 min×3 min×5 mm的腓肠肌（切勿牵拉）投入用液氮预冷的装有正已烷（-70℃）的小烧杯中速冻，之后用锡纸包好放入液氮中保存，用于冷冻切片。

4） 组织匀浆总蛋白测试：10%匀浆，总蛋白（TP）的测试采用Bradford法［5］（即考马斯亮蓝法）法。

5） 血清CK、LDH的测试方法：测试采用酶动力法，试剂盒购自北京北控中生生物科技股份有限公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为MD-100半自动生化分析仪。

6） 羟脯氨酸（hydroxyproline）测试。原理：羟脯氨酸在胶元蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此羟脯氨酸能反映胶元代谢情况。羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。

试剂盒购自南京建成生物制品公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为721分光光度计。

7） laminin-2原位杂交测试。大鼠Laminin-2基因的寡核苷酸探针序列设计参考Maher,J.J等［6］，用Blast在NCBI的RGD（Rat Genome Database）中验证其定位，使用Oligo 6.0验证其不含稳定的二聚体和发夹结构。其序列为： 5' AGGAGGTTGTCAGCAACAGCGGTCTTGACATGGACAACGA 3' ，由北京奥科生物技术有限公司合成，3'端地高辛标记。

8） 组织切片的图像分析。组织切片染色后，显微镜观察，通过Panasonic WV-CP410/G摄像头和BOSER BS602A图像采集卡进行图像采集，之后用Scion Image (National Institutes of Health, USA)进行分析。用Scion Image分别测量不同类型肌细胞膜染色的光密度，以此反映其含量。每样本测量上、下、左、右、中部5个视野。

9） 肌肉匀浆方法：秤取腓肠肌肉样品，迅速剪碎后放入玻璃匀浆器中，以1:10的比例加入匀浆液进行匀浆。

10） 冷冻切片：在SLEE冷冻切片机上进行切片，厚度为15μm，切片恒温-20℃。将实验组贴于一张切片上，以便于比较［7］。

1.3指标测试与方法11） 肌肉匀浆测SOD、MDA方法：SOD的测试采用黄嘌呤氧化酶法，MDA的测试采用硫代巴比妥酸（TBA）法，试剂盒均购自南京建成生物制品公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为721分光光度计。

冷冻切片。固定：切片自然干燥，浸入新鲜配制的4%多聚甲醛中2 min。消化：胃蛋白酶，一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30～180 min，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。

1.4数据统计方法对观察分析结果用统计学分析软件SPSS11.5进行ANOVA单因素方差分析。

2结果

2.1离心方式运动后血清CK、LDH 以及羟脯氨酸的变化┎馐越峁见表1。

血清CK、LDH的变化呈现相似的趋势，在离心运动后即刻最高随后呈现下降的趋势到12 h后达到最底点，然后呈现上升的趋势到48 h后又呈现下降趋势(图1)。ANOVA分析表明：运动后即刻CK与其它各时段均有非常显著性差异，玃<0.01;LDH除24 h外的各时段和即刻组均有显著性差异,玃<0.05;CK 4 h组高于12 h组、72 h组，差异显著，玃<0.05;12 h最低，与除24 h外的各段均有显著差异，玃<0.05；肌组织中SOD值从离心运动后即刻开始升高，到12 h达最高，48 h又有一次高峰，随后下降。运动后肌组织SOD含量，在12 h显著高于安静对照、72 h含量，玃＜0.05(表2)。

肌组织中MDA变化规律与SOD相似(表2，图3)，在运动后即刻开始升高，12 h达最高，在48 h又有一次高峰趋势，其后下降。其中12 h肌组织MDA含量与安静对照、运动后48 h、72 h差异显著，玃＜0.05。图3，肌组织MDA扩大十倍显示。

2.2运动后细胞外基质蛋白含量变化与骨骼肌内容物泄漏及自由基代谢变化的相关分析(表3，图4)。

图5，图6。测量每张切片中5个视野（左上、左下、中、右上、右下）的蓝紫色颗粒的光密度值，结果见表4和图7。

离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著，玃＜0.05；随后逐渐升高，在48 h达到最大，在4 h后直至72 h均处于较高水平，对照组与4 h组至72 h组差异显著玃＜0.05(图7)；

腓肠肌外侧头，冷冻切片，15 μm厚；寡核苷酸探针，地高辛标记，碱性磷酸酶系统显色，杂交阳性信号为蓝紫色颗粒(图8)。

腓肠肌外侧头，冷冻切片，15μm厚；寡核苷酸探针，地高辛标记，碱性磷酸酶系统显色，杂交阳性信号为蓝紫色颗粒(图9)。

3分析与讨论

3.1离心运动后大鼠肌纤维中细胞外基质蛋白laminin-2,cllagenIV含量的变化根据对腓肠肌组织切片的观察来看，我们观察到离心运动后腓肠肌更为明显。ECM的量受到身体活动的影响，一定形式的慢性负荷练习可以增加胶元的含量，只不过是胶元合成的类型以及胶元合成的程度情况不同。这些变化可以改变组织的粘弹性以及机械特性，使组织更易抗拉。［8-9］在laminin-2基因缺失大鼠的研究中发现［10-11］，伴随着laminin-2的减少而CollagenIV含量呈增加趋势，而本研究却发现离心运动后laminin-2含量增加伴随着CollagenIV含量的减少，laminin-2蛋白和CollagenIV之间是否存在着动态平衡，二者之间的增加和减少是否存在着因果关系？需要进一步研究的证实。

3.2运动后骨骼肌内容物泄漏、羟脯氨酸、自由基代谢变化以及骨架蛋白含量变化的相关分析羟脯氨酸是胶元蛋白的一种主要氨基酸，是反映体内胶元代谢的生化标志物，在胶元蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此羟脯氨酸能反映胶元代谢情况。血清羟脯氨酸与血清LDH呈负相关；而血清羟脯氨酸与collagenIV没有相关性，可能和collagenIV本身的特殊性有关系，collagenIV作为细胞外基质蛋白的一种，在细胞外基质中含量很少并且是基膜的框架结构，也是基膜特有的胶原，在组织中细胞排列和骨骼肌中维持力的稳定性中发挥着重要的作用［12-13］，在运动过程中可能没有对胶元的代谢产物羟脯氨酸的增加作出贡献有关,本研究证实了这一点，即羟脯氨酸虽然是胶元的代谢产物但主要是I、III型胶元的代谢产物，也有相关文献报道羟脯氨酸主要是I、III型胶元的代谢产物［14］；肌组织中MDA水平与SOD水平相关；肌组织中SOD与血清LDH水平负相关；

本研究发现细胞外基质蛋白collagenIV与血清CK呈正相关；而Mackey, Donnell y（2004）［15］在以人为研究对象进行一次性离心运动后也同样发现了collagenIV与血清CK的明显的相关关系提示可能骨骼肌的离心收缩影响了IV型胶元的代谢更新。

3.3研究骨骼肌在损伤过程中laminin-2基因表达的变化特征细胞外基质蛋白laminin-2基因mRNA的原位杂交结果代表了laminin-2基因表达水平。如图10所示，离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著玃＜0.05，随后逐渐升高，在48 h达到最大，在4 h后直至72 h均处于较高水平，对照组与4 h组至72 h组差异显著；本研究观察到了即刻laminin-2基因水平的降低但是没有观察到蛋白水平的下降，可能和实际蛋白水平有下降的趋势但是没有设置相应的时相观察到相应的实验结果，也有可能离心运动后即刻laminin-2基因表达水平的下降激活了laminin-2基因的调控过程使得laminini-2基因表达水平提高从而增加laminin-2蛋白的合成，laminin-2蛋白的升高也有可能和其本身就有较强的修复能力有关，从图11我们可以看到laminin-2基因和蛋白变化有大致相同的趋势。

4结论

1） 离心运动后基质蛋白laminin-2在24 h处于最高水平，24 h与其它各组组差异显著,其它组间的变化无显著性差异,说明了laminin-2是有较强调整和修复能力的蛋白，其变化有可能是因为其相邻蛋白的减少而代偿性的增加以维持机体的功能。

2） 本实验发现肌细胞外基质蛋白含量collagenIV的变化与血清CK相关，提示可能骨骼肌的离心收缩影响了collagenIV的代谢更新；

3） 离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著；随后逐渐升高，在48 h达到最大，laminin-2基因和蛋白的表现了基本相同的变化趋势。

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细胞核蛋白 篇12

1 资料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 标本选取

选取临床上怀疑骨肉瘤且未经化疗的病例, 行穿刺活检术。分别取瘤体组织和癌旁组织。取出标本一部分放入冻存管立即置于液氮中保存, 一部分送中南大学湘雅二医院病理科行病理检查。选用病理结果诊断为骨肉瘤的标本4例进行实验。

1.1.2 主要试剂及仪器

Protease inhibitor (上海世仪生物科技有限公司) , Proteome ProfilerTM ANTIBODY AR-RAYS kit (美国R&D Systems公司) , 摇床 (WD-9405A型, 北京市六一仪器厂, 沃德生物医学仪器公司) , 离心机 (Thermo BR4i, 美国) , 蛋白质浓度测定仪 (DUR800, BECKMAN COULTER, 美国) , Aprotinin (Sigma, Catalog#A6279) Leupeptin (Sigma, Catalog#L8511) , Pepstatin (Sigma, Catalog#P4265) , X-ray film (Kodak BioMax ML, Catalog#1788207) , ImageJ1.42图像处理软件, Photoshop图像处理软件。

1.2 方法

1.2.1 提取蛋白

a) 配制核蛋白-40裂解缓冲液 (10mm Hepes, pH7.5;142.5mM KCl;5mM MgCl2;1mM EDTA;1%NP-40) , 加入蛋白酶抑制剂 (1mg/mL Aprotinin;1mg/mL Pepstatin;1mg/mL Leupeptin;1mm PMSF) 和磷酸酶抑制剂 (2mm sodium orthovanadate;5mm sodium fluoride) 置冰上备用。b) 分别取未经化疗的病理组织活检确定的骨肉瘤组织及癌旁组织约80mg, 放到预冷的研钵中加入液氮研磨。研磨成微细均匀的粉末即可。加入上述混合液, 充分溶解后移入EP管中。4℃, 重悬、轻柔旋转30 min。14 000g, 离心5min, 取上清液移入EP管中。c) 蛋白质浓度测定。取400μg总蛋白上样。

1.2.2 人类细胞凋亡芯片检测

人类细胞凋亡芯片是一种快速、灵敏、经济的工具, 可以同时筛选35种凋亡相关蛋白的相对表达水平, 而不用进行大量的免疫沉淀反应和Western Blots操作。每个捕获抗体用已知靶蛋白的细胞株的细胞提取物进行精心的筛选。

按照说明书操作, 简要介绍如下:a) 用2.0mL的缓冲液1 (在Proteome ProfilerTM ANTIBODY ARRAYS kit中) 在摇床上孵育1h, 在250μg稀释的裂解缓冲液中摇床上2~8℃孵育过夜。b) 加入Detection Antibody Cocktail (在Proteome ProfilerTM ANTIBODY ARRAYS kit中) 在摇床上孵育1h, 蒸馏水反复冲洗3遍, 每一遍10min。c) 加入稀释的Streptavidin-HRP (在Proteome ProfilerTM ANTIBODY ARRAYS kit中) 在摇床上孵育30 min, 蒸馏水反复冲洗3遍, 每一遍10min。X-ray胶片显影, 扫描胶片。

1.2.3 图像处理

应用Photoshop图像处理软件进行图片剪切, 应用ImageJ1.42图像处理软件计算每个点的灰度值。

1.3 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件, 同种蛋白在癌组织和癌旁组织中表达差异采用两个独立样本t检验, α=0.05作为检验标准。

2 结果

2.1 病理组织结果临床怀疑骨肉瘤的患者行穿刺手术取活体组织标本, 送中南大学湘雅二医院病理科诊断 (见图1) 。

2.2 蛋白芯片分析结果, 见图2~6。

2.3 不同蛋白表达数据分析结果, 见图7。

3 讨论

蛋白质芯片技术是一种新型的用于样本蛋白分析的生物芯片技术。因具有高通量、髙灵敏度、高特异性、应用广泛等特点[3], 备受医学领域关注。目前用于肿瘤标记物的筛选, 包括消化系统、呼吸系统、生殖系统, 但是在骨肉瘤中应用较少。从细胞凋亡的角度来看, 恶性肿瘤的发生是凋亡机制受到抑制, 肿瘤细胞减少受阻所致[4]。骨肉瘤属于恶性程度极高的肿瘤。本研究证实抑制凋亡蛋白Bcl-2、cIAP、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中表达上调。目前研究抑制细胞凋亡通过两个途径:a) 与肿瘤坏死因子 (TNF) 受体结合抑制核转录因子NF-κB;b) 与各种参与凋亡的因子 (生长因子、细胞因子等) 结合。

图7癌旁组织和骨肉瘤组织Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin蛋白的表达 (P<0.05)

Bcl-2是Bcl家族中主要的抑制凋亡基因之一。线粒体在细胞的凋亡过程中发挥了核心的作用, Bcl-2蛋白位于线粒体膜上、核膜和粗面内质网, 不促进细胞增殖, 而是延长细胞寿命, 是一个明确的生存信号, 但当有其他癌基因如C-myc被激活, 细胞就会不断增殖[5]。主要的机制如下:a) Bcl-2能改变线粒体巯基的氧化还原状态来控制其膜电位, 从而调控细胞凋亡。b) 在细胞凋亡过程中, caspase可使线粒体PT (permeability transition pore) 通道打开, 导致线粒体内的细胞色素C释放到胞质中, Bcl-2蛋白可能是线粒体PT孔道的组成成分, 它在较高PH条件下能形成离子通道, 一般情况下它能封闭孔道的活性, 使一些小分子不能自由通透, 从而保护细胞免于凋亡。c) Bcl-2能将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上, 使其不能发挥凋亡作用[6]。Zhao等[7]通过慢病毒诱导Bcl-2的表达下调, 提高阿霉素对骨肉瘤细胞的敏感性, 证实Bcl-2抑制骨肉瘤细胞的凋亡作用。Liu等[8]证实在骨肉瘤细胞中, 紫杉醇和吡柔比星可以在G2/M或G0/G1期阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡, 而这个过程依赖Bcl-2/Bax。王大平等[9]发现Bcl-2蛋白在骨肉瘤的表达水平明显高于骨良性肿瘤, 认为Bcl-2蛋白高度表达与骨肉瘤的发生有关。本研究发现Bcl-2蛋白在骨肉瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织。刘金洋等证实Bcl-2可能通过抑制Fas蛋白的表达来引起骨肉瘤的发生[10]。高天等[11]证实Bcl-2、凋亡指数 (AI) 可能成为评估骨肉瘤预后的一项重要指标。

cIAP-2和Survivin属于凋亡抑制蛋白家族。一方面它们可以抑制Caspase的作用来抑制凋亡, cIAP-2可以直接抑制Caspase的作用, 而有研究报道survivin并不能直接抑制caspase, 而是通过与凋亡抑制剂 (Smac) 相互作用抑制其发挥促进凋亡功能[12]。另一方面cIAP-2、Survivin和Clusterin可以通过TNF受体激活核转录因子NF-kB, 导致细胞增殖分化, 发挥抗凋亡作用[13]。劳克诚等[14]研究证实Survivin基因可能在骨肉瘤的发生发展中起重要作用, 可能为骨肉瘤的基因治疗提供了新的靶点。刘国辉等[15]研究证实Survivin mRNA在骨肉瘤组织中特异性表达, 可能在骨肉瘤的发生发展中起重要作用, 阻断Survivin mRNA的表达可为骨肉瘤的治疗提供新的途径。高嵩等[16]研究证实survivin蛋白表达与骨肉瘤发生发展密切相关, survivin蛋白可作为判断骨肉瘤发生发展的良好指标, 并为以survivin基因为靶点进行基因治疗提供理论依据。有研究表明Survivin mRNA高表达骨肉瘤患者的预后不良[17]。Survivin蛋白被阻断后明显抑制了骨肉瘤细胞系MG-63的分化和入侵[18]。在骨肉瘤细胞中, 通过小干扰RNA使clusterin基因沉默表达从而诱导自然凋亡、降低生长能力、降低细胞对遗传毒性和氧化应激的敏感性, 说明clusterin蛋白抑制骨肉瘤细胞凋亡的作用[19]。

HSP27为小分子热休克蛋白家族的主要成员, 在多种肿瘤表达增高, 与肿瘤的预后密切相关, 但在不同肿瘤, 其意义有所不同。可能的机制如下:a) 抑制热休克过程中蛋白的合成, 使真核细胞中未折叠的蛋白的量减少, 从而减弱对细胞的破坏作用。b) HSP 27可以防止热休克后肌动蛋白 (Actin) 的破坏, 维护细胞骨架的稳定, 增加对热的耐受性[20]。c) 在热休克后刺激RNA及蛋白质的合成, 协助细胞在死亡之前修复热休克造成的损伤, 使细胞尽快恢复正常生理功能[21]。d) 维持谷胱甘肽水平, 可以减少细胞间的活性氧 (ROS) , 维持线粒体膜电势稳定, 阻止细胞色素c的释放, 从而阻止细胞色素c依赖的细胞凋亡途径[22]。HSP-27可以和与Caspase-3结合, 抑制其活性, 从而抑制细胞凋亡的发生[23]。

本实验选取的标本是未经化疗的骨肉瘤组织和癌旁组织, 与处理过的组织相比更能说明疾病的发生状态。结果显示抑制凋亡蛋白Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中表达上调, 并且具有相同或相似的调节通路, 说明它们可能在骨肉瘤发病机制中同时发挥作用。本实验存在的不足:a) 样本例数较少;b) 人类细胞凋亡芯片虽然具有髙灵敏度、高特异性特点, 但同时也是高通量的, 需要相关的实验方法如免疫组化、PCR、细胞培养等进行证实。在接下来的研究中我们会对其它的凋亡相关蛋白表达进行分析、探讨。

摘要：目的 通过人类细胞凋亡芯片筛选骨肉瘤中表达异常的凋亡相关蛋白, 为近一步深入功能机制研究奠定基础。方法 应用人类细胞凋亡芯片, 筛选骨肉瘤组织及癌旁组织中表达有差异的凋亡相关蛋白。应用ImageJ1.42图片处理软件求出每个孔的灰度值, 进行统计分析。结果 凋亡相关蛋白Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中和癌旁组织中都有表达, 且其在骨肉瘤组织中的表达水平大于癌旁组织 (P<0.05) 。结论 凋亡蛋白Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中表达上调, 可能参与骨肉瘤的发病机制。