a-突触核蛋白

a-突触核蛋白（精选6篇）

a-突触核蛋白 篇1

a-突触核蛋白 (a-synuclein) 是突触蛋白中的一种, 因其与神经系统变性疾病密切相关, 故近年来受到重视。但在脊髓组织中a-突触核蛋白的生理功能尚不十分明确, 有研究表明a-突触核蛋白功能障碍可触发细胞凋亡, 加重了脊髓损伤, 并严重影响了神经功能的恢复[1]。研究表明, 观察a-突触核蛋白的表达情况变化, 可为判断脊髓组织损伤和恢复的程度提供参考指标, 并为脊髓损伤后的治疗提供理论依据。本实验是通过检测a-突触核蛋白在大鼠脊髓损伤早期不同时间点表达量的变化值, 从而为进一步探讨神经组织损伤后的修复提供了一个新的思路。

1 实验材料

Wistar大鼠48只, 体重200～250g (佳木斯大学动物实验中心) , 随机分组法分为对照组和损伤组, 取损伤组按时间点分为0h, 6h, 1d, 3d, 7d组, 每组8只。①组织捣碎匀浆机 (JJ-2型) ;②高速低温离心机 (TGL-20000-CR型) ;③超低温冰箱 (BD-370LT型) ;④垂直电泳槽 (JY-SCZ2型) ;⑤电热恒温水浴箱 (ZWB-718型) ;⑥分光光度计 (723PC型) ;⑦图像分析系统 (北京仪器仪表有限公司) ;⑧RIPA裂解液 (碧云天生物技术研究所) ;⑨兔抗鼠a-synuclein多克隆抗体 (武汉博士德生物工程有限公司) ; (10) 羊抗兔抗体 (武汉博士德生物工程有限公司) 。

2 制备模型、组织取材

改良Allen法[2]制备损伤组大鼠模型。采用乙醚吸入法麻醉, 固定大鼠于俯卧位, 剪去背部鼠毛, 消毒并铺无菌孔巾。以大鼠背部正中胸10棘突为中心长约3cm切口, 暴露出其棘突, 棘突和全部椎板用咬骨钳咬除, 然后咬除胸9和11椎体的棘突和椎板, 暴露出硬膜。胸10椎体段脊髓硬膜上放置圆形金属垫片, 后将5g重的金属圆柱体于10cm释放, 打击大鼠脊髓。大鼠双后肢弛缓性瘫并伴有鼠尾痉挛性摆动, 判定为造模成功, 可缝合组织, 术后抗菌治疗。术后大鼠常温下喂养, 每日2～3次挤压大鼠膀胱排尿, 直至数日后其膀胱功能恢复。对照组采用相同方法暴露硬膜, 然后缝合组织。损伤组于造模后的0h, 6h, 1d, 3d, 7d分别取大鼠8只, 麻醉后取出胸9～11椎体段的脊髓组织, 对照组取相同段脊髓组织。

3 蛋白印迹法检测及图像分析

脊髓组织取出后, 立即三蒸水去血, 标记后-80℃超低温冰箱保存。进行实验时, 分别取少许各时间点的组织, 剪碎后匀浆机均浆, 加入裂解液冰上裂解。14000转/分、4℃离心15min。测定蛋白浓度, 配制SDS-PAGE后电泳。将膜取出, 置培养皿中用丽春红S染色, 清洗后进行封闭和免疫反应。免疫反应时, 一抗 (兔抗鼠a-synuclein多克隆抗体) 孵育过夜, TBST室温洗膜3次, 然后二抗 (羊抗兔抗体) 孵育, 再用TBST洗膜3次后ECL显影。显影时先将膜浸入发光液, 然后取膜, 将膜固定于暗盒内并放入胶片曝光。取出胶片依次放入显影液中和定影液中, 之后水洗胶片, 并干燥保存。最后扫描仪扫描图像, 计算机图像分析系统进行图像分析。

4 数据分析及统计学处理

对照组与损伤组测量后得到的图像平均光密度值进行组间比较。计量资料以均数±标准差undefined表示, 应用SPSS 18.0统计软件, 均数间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

5 结果

a-synuclein在对照组脊髓组织中有少量表达, 但在对照组对应的不同时点间的表达量无差异。损伤组于损伤后6h表达量明显增高, 之后有所下降, 1d时表达量降到低谷, 后再次升高, 于损伤后3d达到第二次表达高峰, 7d后基本恢复。蛋白印迹法图像测量值见表1、蛋白印迹法图像见图1。

注:P<0.05为差异有统计学意义, P<0.01为差异非常显著。

A.对照组;B.损伤后0h;C.损伤后6h;D.损伤后1d;E.损伤后3d;F.损伤后7d

6 讨论

a-突触核蛋白 (a-synuclein) 表达量不同对细胞凋亡所起的作用有所不同, 表达量增高时对神经细胞的凋亡有促进作用, 但表达降低时却起相反作用[3]。神经细胞中高表达a-synuclein时出现P53降解抑制, Bcl-2磷酸化加强, 引起细胞凋亡[1], 继而出现细胞的染色质凝集、细胞核和DNA碎裂、细胞色素C释放等调亡现象。当表达量降低时它可保护细胞免受氧化应激损伤[4]。a-synuclein低水平表达时可使神经细胞抵抗百草枯的损害能力增强[5]。现已经通过观察在脑损伤时a-synuclein表达量的变化规律, 为脑损伤的诊断提供了方向, 并且为判断脑损伤开始的时间提供了新的参考指标[6]。研究还发现a-synuclein可抑制热诱导的蛋白沉积, 并且与分子伴侣家族中的14-3-3蛋白具有结构同源性, 可以调控其他多种蛋白所需的氨基酸残基, 因此还具有分子伴侣作用[7]。在观察大鼠脑损伤后a-synuclein的变化时发现, α和β亚型的synuclein都出现一过性的增高, 并随着时间的延长表达量也有所变化[8], 同时, Uryu等[9]在研究脑外伤死亡者的脑组织时, 发现大部分患者脑组织中a-synuclein阳性细胞增多, 以伤后6h增加最显著。在不同的神经系统损害中a-synuclein所起的作用已经被明确的阐述了, 但脊髓损伤后其表达量的变化, 还没有相关报道。本实验通过观察脊髓损伤后a-突触核蛋白表达量的变化, 为判断脊髓组织损伤和恢复的程度提供了新的参考指标, 从而为进一步探讨神经组织损伤的机制提供重要方向, 并为促进损伤后神经组织的修复提供了一个新的思路。

参考文献

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a-突触核蛋白 篇2

1 材料与方法

1.1 主要试剂

六氟异丙醇 (HFIP) 、无酚红F12购自Sigma公司, B27添加剂、DMEM/F12、胎牛血清购自Gibco, Ng及Aβ25-35均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Aβ25-35寡聚体的制备:

将Aβ25-35肽从-20℃冰箱取出放在冰上, 在通风橱内将HFIP放在冰上预冷, 每1mg Aβ25-35加入220μLHFIP, 盖上离心管盖在室温放置60min, Aβ25-35充分溶解后放回冰上10min, 再将Aβ25-35-HFIP溶液放置室温下挥发、过夜。次日再置于通风橱内使HFIP挥发殆尽 (约2h) 。每管加44μLDMSO, 吹打混匀后, 每管加9386μLF12培养基, 4℃孵育24h, 4℃, 14000rpm离心10min后, 转移上清液至新管, 分装, 放入-20℃, 储存浓度为100μmol/L。

1.2.2 海马神经细胞的原代培养:

选用出生3d内的Wistar大鼠, 解剖分离出海马, 经0.125%胰酶于37℃培养箱中消化8~12min, 用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。经悬浮、离心、过滤等步骤收集细胞, 用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基制成细胞密度为5×105个/m L的单细胞悬液, 接种于预先铺有多聚赖氨酸的24孔培养板内的盖玻片上, 置于37℃, 5%CO2培养箱中培养, 24h后换含2%B27的DMEM/F12培养基, 每隔3d半量换液1次。

1.2.3 实验分组及Aβ25-35寡聚体干预:

海马神经细胞培养7d后, 弃原培养液, 加入DMEM培养液及Aβ25-35寡聚体。实验分为三组, 使Aβ25-35寡聚体的终浓度分别为5、10、20μmol/L, 同时设不加Aβ25-35寡聚体的对照组 (以相应体积的DMEM培养液代替) , 每组设8孔, 1h后终止培养, 进行免疫细胞化学染色。

1.2.4 免疫细胞化学染色:

4%多聚甲醛固定10min, PBS洗涤后, 加入0.3%Triton X-100, PBS洗涤, 滴加0.3%H2O2甲醇30min, 5%正常马血清室温封闭60min。加入一抗Ng (1∶200, 阴性对照以PBS代替) , 室温反应2h后入4℃冰箱过夜。次日PBS洗涤后加入生物素化二抗工作液山羊抗兔Ig G, PBS洗涤后滴加辣根酶标记链霉卵白素, PBS洗涤后常规梯度乙醇脱水, DAB显色, 二甲苯透明, 封片。

1.3 图像分析与统计处理

倒置显微镜下, 以胞浆内有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。在200倍镜下分别计数5个孔各5个视野的阳性细胞数和总细胞数, 计算阳性细胞的百分比, 以此代表神经元纯度。倒置显微镜下 (LEICA DM4000 B) 采集图像, 进行灰度定量分析 (Leica Qwin V3) , 平均灰度值1~255 (白色平均灰度值为255, 黑色平均灰度值为0) 。

1.4 统计学方法

采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析, 以均数土标准差 (±s) 表示, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠海马神经细胞原代培养形态学观察

倒置相差显微镜下观察, 接种24h后, 几乎全部细胞己贴壁, 可见光滑的突起。第3天, 神经细胞胞体增大, 突起延长并出现分枝, 胞体呈三角形或椭圆形;第5天, 神经细胞胞体进一步增大, 突起继续增粗增长, 末端分叉明显, 己交织成网, 胞体和突起晕光明显, 立体感强;第7天, 神经细胞生长旺盛, 胞体大, 突起长, 分枝连接成网, 见图1。

2.2 Aβ寡聚体不同浓度组致伤原代培养海马神经细胞的形态学观察

实验第一部分:分别以5、10、20μmol/L浓度的Aβ25-35与神经细胞共同培养1h后镜下观察发现, 10μmol/L组的细胞数目明显减少, 大部分神经元胞体缩小, 细胞间出现明显空隙, 突起数目减少, 断裂或消失, 并可见到少量细胞碎片。20μmol/L浓度的Aβ组细胞突起消失, 细胞胞膜已破裂, 有很多细胞碎片, PBS冲洗后, 碎片脱落, 无法做免疫细胞化学染色。

2.3 Aβ寡聚体不同浓度组对Ng表达的影响

实验第二部分:正常对照组, 棕黄色细胞多, 被染色的细胞多为胞体较大, 突起长, 树突多处可见棕黄色颗粒 (图2) 。与正常对照组相比, Aβ5μmol/L组着色细胞无明显减少, 突起较长, 平均灰度值略有增大, Ng表达略有减少, 但差异无显著性 (P﹥0.05) (图3) ;Aβ10μmol/L组着色细胞减少, 被染色的细胞多为胞体较小, 突起较短 (图4) , Aβ20μmol/L组细胞明显减少, 残存细胞胞体小, 突起断裂、消失 (图5) 。Aβ10μmol/L、20μmol/L组灰度值增大, Ng表达减少, 差异有显著性 (P<0.01) ;其中, Aβ10μmol/L组最明显, 与Aβ5μmol/L组比较 (P<0.01) , 差异具有统计学意义。Aβ引起的PSD-95减少具有剂量依赖性, 以Aβ10μmol/L为致突触损伤的适宜浓度见表1。

与正常对照组比较﹟P>0.05, *P<0.01;10μmol/L组与5μmol/L组比。

3 讨论

目前认为, Aβ在大脑皮层内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件, 超前于其它脑区损伤和临床症状数年[4]。然有大量的证据显示Aβ纤维发挥了多种对神经元的毒性, 然而最近有研究表明, Aβ由可溶状态到不溶状态的转变是AD发病机制中的关键环节, Aβ在形成纤维性沉积前的中间体状态, 即Aβ寡聚体亦可产生神经毒性作用。动物实验研究表明, Aβ寡聚体可以在生理水平明显抑制大鼠海马的突触传递[5,6], 提示可溶性Aβ寡聚体可能是导致AD病人脑内突触功能障碍和突触丢失的主要效应物。

突触可塑性是学习和记忆的基础, 在AD早期主要表现为显著的记忆损害, 资料表明这一表现起始于海马突触功效的微弱改变, 而此改变早于显著的神经元退行性变[2,3], 而突触丧失与AD患者的痴呆程度直接相关[7]。

神经颗粒素 (Neurogra-nin, Ng) 属Calpacitin蛋白家族, 是一种神经元特异性蛋白。主要存在于大脑皮层、海马和嗅球, Ng分布于成熟神经元的胞体、核周、树突和树突棘, 但多数Ng仍积聚于树突的胞质内, 可作为一种中枢神经系统病变树突受损的一种标记物[8,9]。Ng与学习、记忆相关的海马、神经递质及其受体、蛋白激酶等关系密切, 在正常生理状态下, 即细胞内Ca2+水平低时, Ng与Ca M结合, 而在细胞内高Ca2+浓度状态下, Ng与Ca M分离, 释放出游离的Ca M, 从而实现对Ca M及Ca2+/Ca M依赖性蛋白酶, 如Ca2+/Ca M-依赖性蛋白激酶Ⅱ (calcium-calmodulin-dependentkinaseⅡ, Ca MKⅡ) 及Ca2+/Ca M-依赖性腺苷酸环化酶等活性的调节。Ng在突触的发育、突触的稳定性和可塑性中起重要作用[10], 因此, 我们以Ng做为突触结构和功能可塑性的观察指标, 摸索Aβ25-35寡聚体致突触损伤的浓度, 亦可用做观察药物突触保护作用的指标。

实验中我们以5、10、20μmol/L浓度的Aβ25-35寡聚体加入原代培养7d的大鼠海马神经元培养基中, 观察发现, 10μmol/L Aβ25-35寡聚体组细胞数目减少, 大部分神经元胞体缩小, 突起数目减少, 断裂或消失, 并可见到少量细胞碎片, 而20μmol/L寡聚体浓度组细胞突起消失, 细胞胞膜已破裂, 有很多细胞碎片, PBS冲洗后, 碎片脱落, 无法做免疫细胞化学染色。免疫细胞化学染色后采集图像, 进行灰度定量分析, 白色灰度值最高为255, 黑色最低为0, 灰度值越低, 表明着色越多, Ng表达越强。结果, 5μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng表达略有减少, 但与正常组比较差异无显著性 (P﹥0.05) ;10μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng表达减少较明显;20μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng表达明显减少。试验再重复2次, 结果相同。故认为Aβ25-35寡聚体引起的Ng减少具有剂量依赖性, 致突触损伤模型的最佳有效浓度为10μmol/L。

本研究结果表明, Aβ25-35寡聚体能降低Ng的表达, 呈剂量依赖性, 10μmol/L Aβ的致伤作用非常显著。可以推测, 在此浓度作用下突触后信号转导和整合出现障碍, 突触可塑性严重受损, 此数据可为AD早期突触损伤模型的建立提供实验依据。

随着对Aβ寡聚体致伤机制的深入了解, 对AD复杂的病因及发病机制的不断探究, 特别对于AD早期认知障碍与突触功能损害的进一步认识, 将为AD的发病机制研究探索出新的途径, 也为AD的早期干预、治疗以及新药物的研发开拓新的思路与方向。

参考文献

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a-突触核蛋白 篇3

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

本次实验过程中研究对象, 是由广东医学院实验动物中心提供的健康雄性大鼠, 6只断乳期的幼鼠和11只22月龄的老年大鼠, 其分别为幼年组和老年组。分别对两组大鼠进行同等学习实验, 以判定海马中突触体相关蛋白在学习记忆中的作用。

1.2 试剂

由Sigma公司提供NMDA与多聚赖氨酸;由南京建成生物工程研究所提供乳酸脱氢酶试剂盒;由Protec公司提供白细胞介素-1β (IL-1β) ;由北京宝赛生物技术有限公司提供凋亡测试剂盒。购自英国的Amersham公司的ECL以及Western blot相关试剂。

1.3 Y-迷宫分辨学习实验

1.3.1 实验方法

实验主要分为学习训练及测试、记忆再现测试两大部分, 在三等分辐射式迷宫中进行。 (1) 学习能力实验方法。实验开始后, 如果大鼠直接跑到安全区域内, 则为正常。对大鼠每天进行20次由起始臂起跑的训练, 坚持1周。当大鼠的正常反应率达到90%以上, 为学会的标准。 (2) 记忆能力测试方法。将反应正常的大鼠挑选出来, 待24 h后, 再去做以上测试。尝试次数以及记忆正确率达到90%以上为记忆再现能力。实验中, 将大鼠的尝试次数、正确反应次数等相关信息做好详细的记录。

1.3.2脑组织蛋白的提取

第一步, 将已经培育好的皮层神经细胞取出;第二步, 分为小组, 每8孔为一小组, 白细胞介素-1β试验共分为6组;第三步, 将白细胞介素-1β的浓度设定为0、0.01、0.1、1、10、100;NMDA实验分为6组, 其浓度分别为0、10、50、100、200、400;第四步, 经过上步不同浓度的试验, 最终选择适宜的浓度进行下步试验[4]。

1.3.3 测定细胞生存力

细胞生存力的测定采用MTT比色法, 通过上步中经过白细胞介素-1β与NMDA处理之后的细胞, 在每一孔中加入5 g/L的MTT液, 置于37℃的孵箱中连续孵育4 h, 然后将其取出, 将培养液丢弃, 在每一孔中加入150μl的DMSO, 在微量混匀器中充分混匀, 达到酶标仪570 mm位置读取吸光度[5]。

1.3.4 免疫荧光分析

利用Annexin V免疫荧光与PI分别观察细胞凋亡、细胞坏死[6]。

1.4 统计学处理

实验所得数据采用SPSS 20.0统计软件进行分析, 计量资料采用t检验, 计数资料较采用字2检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠Y-迷宫分辨学习行为比较

幼年组达标所需的训练次数大于老年组, 且老年组的学习正确率比幼年组高, 但幼年组的记忆正确率高于老年组, 也就是说, 老年组学习能力较幼年组强, 但由于年龄差异造成老年组大鼠记忆能力下降较为明显, 表明不同年龄大鼠空间分辨学习能力和记忆能力存在差异。老年组大鼠和幼年组大鼠Y-迷宫分辨学习行为的比较如表1所示。

2.2 GAP-43与突触素在大鼠海马中的表达

老年组海马GAP-43表达量为 (209.94±38.13) g/L, 幼年组表达量为 (116.10±29.13) g/L, 老年组海马GAP-43表达明显高于幼年组 (P=0.0345<0.05) 。老年组大鼠GAP-43反应产物主要分布在颗粒细胞的边缘, 棕黄色, 幼年组海马结构中, 颗粒细胞及树突干染色极浅。观察老年组和幼年组大鼠海马内突触素表达, 其OD值分别为 (2.3±0.2) 和 (3.8±0.2) , 老年组大鼠海马内突触素表达显著低于幼年组大鼠 (P=0.021<0.05) 。

*与幼年组相比, P<0.05

2.3 突触体相关蛋白和学习记忆关系

老年组海马GAP-43表达量高于幼年组, 突触素表达显著低于幼年组, 学习能力显著高于幼年组, 但是记忆能力明显低于幼年组, 由此可得GAP-43表达量和记忆能力成反比关系, 与学习能力成正比关系, 突触素表达量与记忆能力成正比关系, 与学习能力成反比关系。

3 讨论

缺血性脑损伤是一种特殊类型的脑损伤, 发病后机体可发生急性相反应, 突触体相关蛋白作为一种重要的反应相关蛋白, 其表达水平可反应缺血性脑卒中病情严重程度, 与疾病的预后有密切的关系[7,8]。突触体相关蛋白在进化上属于是保守的蛋白质家族, 其在胞吐过程中具有重要作用, 其能够和其他的2个胞吐蛋白突触融合成为蛋白和突触小泡蛋白, 共同形成相当稳定的三元复合物, 即为SNARE复合物[9,10]。在动物出生前和出生后成长过程中, 突触体相关蛋白以及其m RNA表达量在逐渐的进行提高。GAP-43和突触素在大鼠空间分辨学习记忆的过程中发挥着重要作用, 老年大鼠的中枢神经系统保持着潜在的神经元退化修复的功能[10,11]。在本实验中, 在三等分辐射式迷宫中对两组大鼠进行学习训练及测试、记忆再现测试实验内容, 结果显示, 幼年组达标所需的训练次数大于老年组, 且老年组的学习正确率比幼年组高, 但幼年组在记忆正确率上高于老年组, 也就是说, 老年组学习能力较幼年组强, 但由于年龄差异造成了老年大鼠记忆能力下降较为明显 (P<0.05) 。

突触素是一种在小突触囊泡的膜蛋白, 其含量相当的丰富, 是胚胎神经系统突触发生和成熟的标志之一, 具有缝隙连接样通道性质并参与Ca2+依赖神经递质。标记轴突终末的数量与密度和突触可塑性有着直接的关系[12]。从以上研究结果来看, 老年大脑有一定的学习记忆能力, 突触相关蛋白参与老年大脑学习记忆变化, 老年大鼠较强的学习能力和较弱的记忆能力可能与其海马内突触相关蛋白的表达有一定的关系。研究海马中突触体相关蛋白在学习记忆中的作用对治疗老年痴呆等老年性疾病具有重要的意义, 因此, 日后, 关于这一问题我们应当进一步深入探究。

摘要：目的:研究海马中突触体相关蛋白在学习记忆中的作用。方法:以大鼠为研究对象, 将它们分为幼年组和老年组, 幼年组大鼠为断乳期, 老年组大鼠22月龄。运用Y-迷宫法对两组大鼠进行空间学习记忆行为训练, 然后用免疫组化和Western blot检验大鼠海马内突触素以及生长相关蛋白的情况。结果:老年组的学习能力较强, 幼年组记忆能力较强 (P<0.05) 。老年组海马内的生长相关蛋白 (GAP-43) 明显高于幼年组, 而突触素的表达低于幼年组 (P<0.05) 。GAP-43表达量和记忆能力成反比关系, 与学习能力成正比关系, 突触素表达量与记忆能力成正比关系, 与学习能力成反比关系。结论:GAP-43和突触素在大鼠空间分辨学习记忆的过程中发挥着重要作用, 老年大鼠的中枢神经系统保持着潜在的神经元退化修复的功能。

a-突触核蛋白 篇4

1 材料和方法

1.1 实验材料

新生24h内SD大鼠,由佳木斯大学实验动物中心提供(动物质量合格证号:黑动字第99102001)。Aβ1-42(Sigma公司);Caspase-3免疫组化试剂盒(武汉博士德公司);山羊抗小鼠Ig G(tritc)、山羊抗兔Ig G(FITC)(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

取24h内新生SD大鼠,暴露大脑半球双侧海马,用镊子夹取海马放入预冷的DMEM/F12一倍液中漂洗2~3次。胰酶消化,将消化后的组织液用200目筛网过滤去除脑膜及纤维组织。离心弃上清,加入DMEM/F12完全培养液制成单细胞悬液,接种于24孔板中置37℃、5%的CO2培养箱中培养,每3天半量换液一次,每7~8天传代一次,每天连续观察细胞生长情况及细胞形态,并拍照观察细胞生长情况。海马神经元细胞鉴定。将培养7d的海马神经细胞分为5组,加入Aβ1-42,使其终浓度分别为:A组(对照组)0μmol/L;B组2μmol/L;C组5μmol/L;D组10μmol/L;E组20μmol/L,继续培养,制备Aβ1-42诱导原代海马神经细胞建立阿尔茨海默病细胞模型。MTT法测细胞存活率,TUNEL法测定细胞凋亡率。

正常海马神经细胞作为正常对照组,10μmol/L Aβ1-42致伤海马神经细胞作为模型组。模型组分为BDNF低、中、高剂量组和空白对照组,每组分别加入BDNF至5ng/m L、20ng/m L、100ng/m L、0ng/m L终浓度。分别以Ng、Nm为一抗,行免疫荧光细胞化学染色,激光共聚焦显微镜下,采集图像,测定神经元树突Ng和轴突Nm的平均荧光强度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析,各组数据均以均数±标准差(±s)表示,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠海马神经元细胞原代培养形态学观察及鉴定

倒置相差显微镜下观察,培养至第5天神经元胞体进一步增大,突起继续增粗增长,末端分叉明显,己交织成网;至第7天神经元生长旺盛,胞体大,突起长,分枝连接成网;至第9天神经元发育成熟,呈团状聚集,整个细胞生长分布不均,神经元个体难以分出。NSE免疫细胞化学染色显示,神经元胞浆内可见棕黄色阳性颗粒,阴性对照组未见相应的免疫反应;经阳性细胞计数,培养神经元纯度为90%以上。

2.2 不同浓度Aβ1-42对海马神经细胞生存率、凋亡率的影响

正常对照组以着棕黄色细胞居多,被染色细胞的胞体较大,突起长,轴突远端生长锥染色明显。与正常对照组相比,2μmol/LAβ1-42、5μmol/LAβ1-42组着色细胞无明显减少,轴突生长锥染色少;10μmol/LAβ1-42组着色细胞减少,被染色的细胞多为胞体较小,突起较短;20μmol/LAβ1-42组细胞明显减少,残存细胞胞体小,突起断裂、消失。随着Aβ1-42浓度的增加,神经细胞生存率逐渐降低,10、20μmol/L,Aβ1-42孵育24h的神经细胞生存率明显降低(P<0.05、P<0.01)。凋亡神经元胞体明显缩小,折光性下降或消失,突起开始回缩,分枝连接出现大面积回缩断裂,细胞周围光晕消失,细胞呈点状散在分布。随着Aβ1-42浓度的增加,神经细胞凋亡率逐渐上升,凋亡神经元胞体明显缩小,折光性下降或消失,突起开始回缩,分枝连接出现大面积回缩断裂。细胞周围光晕消失,细胞呈点状散在分布,10、20μmol/L Aβ1-42孵育24h的神经细胞凋亡率明显升高(P<0.05、P<0.01)。见表1,图1~3。

(免疫细胞化学,DAB显色,×100)

(免疫细胞化学,DAB显色,×200)

(免疫细胞化学,DAB显色,×200)

*与对照组比较,P<0.05;**与对照组比较,P<0.01。

2.3 BDNF对Aβ致伤海马神经细胞突触形态及Ng、Nm表达的影响

正常对照组,分化后的细胞突起逐渐延长、密集,与邻近分化细胞交织成网状。Aβ致伤后,细胞较少,胞体较小,突起变短或消失;与0ng/m L相比,BDNF5ng/m L、20ng/m L、100ng/m L浓度组随着浓度增高,神经细胞存活状态有所恢复,有较多的圆形细胞,多数细胞突起较少且较短。见图4~11。不同浓度BDNF与10μmol/L Aβ1-42共孵育24h,致伤神经细胞Ng的荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.01),BDNF低、中、高剂量组荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,BDNF低剂量组神经细胞Ng的荧光强度差异无显著性意义(P>0.05),BDNF中、高剂量组荧光强度明显增强(P<0.01);BDNF中、高剂量组间荧光强度差异无显著性意义(P>0.05)。不同浓度BDNF与10μmol/L Aβ1-42共孵育24h,致伤原代海马神经细胞Nm的荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.01),BDNF低、中、高剂量组荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,BDNF低剂量组神经细胞Nm的荧光强度差异无显著性意义(P>0.05),BDNF中、高剂量组荧光强度明显增强(P<0.01)。见表2,图4~11。

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

(免疫荧光SABC-FITC,×400)

*与正常对照组比较,P<0.05;**与正常对照组比较,P<0.01;#与空白对照组比较,P<0.01。

3 讨论

NSE鉴定发现,培养的海马神经元胞浆内见棕黄色阳性颗粒,阴性对照组无相应的免疫反应,培养神经元纯度均在90%以上。由于AD时产生较多的Aβ1-42,且Aβ各亚型中Aβ1-42毒性最强,对AD的发生及发展起着重要作用。所以本实验采用Aβ1-42制备模型。发现10μmol/L Aβ1-42可致伤海马神经细胞,导致细胞凋亡,海马神经细胞突触缩短、数目减少。因此,本实验将10μmol/L确定为Aβ1-42致伤海马神经元的较佳浓度。在影响突触结构和功能的诸多因素中,BDNF在神经元突触形成和学习记忆中起重要作用。BDNF通过调节突触的数量,促进轴突更多地分叉,增加突触可分布的领域,来提高神经元环路结构和功能上的复杂性[1];BDNF还可以调节突触囊泡的数量,通过BDNF分泌增加参与了神经前体细胞突触形成[2]。同时BDNF对多种神经元的发育、存活、分化和轴突再生中发挥的重要作用亦是由激活不同的信号转导通路完成的。神经颗粒素(Neurogranin,Ng)是一种神经元特异性蛋白。主要存在于大脑皮层、海马和嗅球,Ng分布于成熟神经元的胞体、核周、树突和树突棘,同时,少量Ng和突触后膜的致密斑有疏松联系,且多数Ng仍积聚于树突的胞质内,可作为一种中枢神经系统病变树突受损的一种标记物[3]。Ng与学习、记忆相关的海马、神经递质及其受体、蛋白激酶等物质基础,突触可塑性、尤其是LTP等神经机制的关系密切,是海马CA1区神经元与LTD及LTD的重要调节因子[4]。作为一种与细胞及组织整体发育有关的蛋白,生长相关蛋白-43(Growth Associated Protein-43,GAP-43)广泛存在于神经元细胞,是特异性分布于突触前膜上的一种磷酸蛋白,也称神经调节素(Neuromodulin,Nm)。在生长和分化及再生轴突的末端其含量最多,对神经的生长、发育、再生和突触功能维持及递质的释放均发挥着重要的作用。研究发现AD患者海马腔隙分子层中Nm的表达升高,且升高程度与AD认知功能障碍的严重程度正相关[5],推测在AD的发病机制中,神经退行性改变与神经突触可塑性的异常共存,二者处于一种危险的平衡,在AD记忆损害的进展中发挥同等重要的作用[6]。与非AD的其它神经系统退行性疾病和正常认知组比较,AD患者海马和额叶皮层Nm的表达显著下降,且分布存在区域特异性[7~9]。目前Nm已成为神经生长发育、损伤修复等神经可塑性研究的首选分子探针[10]。检测Ng、Nm这两种指标,能良好的反映出神经系统对损伤反应的可塑性。

研究发现,Aβ致伤后,细胞较少,胞体较小,突起变短或消失。不同浓度BDNF与10μmol/L Aβ1-42共孵育24h,与0ng/m L相比,BDNF5ng/m L、20ng/m L、100ng/m L浓度组随着浓度增高,神经细胞存活状态有所恢复,有较多的圆形细胞,多数细胞突起较少且较短。致伤原代海马神经细胞Ng的荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.01),BDNF低、中、高剂量组荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,BDNF低剂量组神经细胞Ng的荧光强度差异无显著性意义(P>0.05),BDNF中、高剂量组荧光强度明显增强(P<0.01)。同时,不同浓度BDNF与10μmol/L Aβ1-42共孵育24h,致伤原代海马神经细胞Nm的荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.01),BDNF低、中、高剂量组荧光强度较正常对照组明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,BDNF低剂量组神经细胞Nm的荧光强度差异无显著性意义(P>0.05),BDNF中、高剂量组荧光强度明显增强(P<0.01)。说明10μmol/L Aβ1-42可导致海马神经元Ng、Nm表达降低,BDNF一定程度上可逆转损伤神经元Ng、Nm表达的降低,提高神经细胞内Ng、Nm浓度。提示BDNF可通过促进神经元的分化、轴突再生,影响突触可塑性,发挥神经损伤的修复作用。

参考文献

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a-突触核蛋白 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与动物

PC12细胞 (ATCC No.CRL-1721) :来源于大鼠嗜铬细胞瘤克隆。新西兰家兔, 雄性, 体重 (1.5±0.2) kg, 购自广东省医学实验动物中心, 经1周的适应性饲养之后进行实验。

1.1.2 药品及试剂

天然脑活素:深圳市中西医结合临床研究所提供。Aβ1-40、L-谷氨酰胺、MTT、多聚赖氨酸:美国Sigma公司产品。马血清、胎牛血清、Ham's F12k培养基、Hepes:美国Gibco公司。MAP2抗体:美国Santa cruz公司。鼠源性神经生长因子 (7s-NGF) :美国CHEMICON公司产品。

1.1.3 主要仪器

BIO-RAD Model-680型酶联免疫检测仪:USA。Leica DM16000B型图象分析系统:Germany。 SANYO MCO-15AC型二氧化碳培养箱:Japan。LABCONCO/WaterPro超纯水工作站:USA。SW-CJ-2FD超净工作台:中国苏净。HETTICH Mikro-22R型高速冷冻离心机:Germany。

1.2 方法

1.2.1 实验含药血清的制备

同前文。

1.2.2 细胞培养

PC12细胞常规采用含加入双抗 (青、链霉素) 的10%马血清 (horse serum) 和5%胎牛血清 (FBS) 的Ham's F12K培养液培养。在饱和湿度、37℃、5% CO2 常规培养条件下培养, 常规传代培养;贴壁生长时, 当细胞融合度约80%～90%时, 按照1:3或1:4传代。

1.2.3 AD细胞模型建立

采用Aβ1-40诱导PC12细胞损伤建立AD细胞模型。将Aβ1-40溶于1ml高压灭菌后的生理盐水, 配成250μmol/L溶液, 置于37℃恒温箱内孵育4～7天, 进行老化处理。然后4℃贮存备用, 用时稀释至相应浓度。将Aβ1-40 PC12细胞以含5%FBS的F12K培养液在37℃, 10%CO2培养箱中培养于多聚赖氨酸包被的培养皿/板中1天, 待细胞贴壁后, 加入终浓度为500nmol/L, 37℃预老化处理的Aβ1-40片段, 继续培养7天, 即建立AD细胞模型。

1.2.4 实验分组及干预处理

本实验共分5组:空白对照组, AD细胞模型组, 天然脑活素低剂量组、天然脑活素中剂量组、天然脑活素高剂量组;空白对照组和AD细胞模型组以含10%正常空白血清的F12K培养, 天然脑活素低、中、高剂量组分别以含2.5%、5%、10%天然脑活素含药血清的F12K培养液培养, 血清含量不足10%的采用正常空白血清补充。各组细胞常规加入终浓度为100ng/ml 的NGF以维持细胞的神经元特性。AD细胞模型组及天然脑活素低、中、高剂量组仍加入上述浓度的Aβ1-40片段以维持细胞AD病理模型。

1.2.5 细胞计数及细胞形态学检查

各组细胞, 按照1.0×104/ml的细胞密度接种于经多聚赖氨酸包被的培养板, 随机分为空白对照组、NGF组、AD模型组、天然脑活素低、中、高剂量组, 待细胞贴壁后更换不同培养液, 经相应处理4天后直接使用倒置相差显微镜随时观察细胞形态及神经元的突起生长并计数, 并用数码相机随机拍照导入计算机, 进行突起长度的分析。在突起长度的分析试验中, 对于每个样品组, 每孔上、下、左、右、中5个视野各拍片1张, 然后在照片上测量细胞轴突长度及超过细胞直径的细胞的比率 (当细胞突起长度超过细胞的直径1.5倍时为突起阳性细胞) ;计算培养板各组细胞突起阳性细胞率。测量使用ImageJ软件进行。

1.2.6 细胞增殖活性

MTT法检测。

将各组细胞以每孔2.0×104/ml的密度接种于预先经多聚赖氨酸处理包被的96孔板, 200μl/孔, 常规培养24小时, 待细胞贴壁后, 更换不同含药血清培养液200μl/孔, 分别于培养24、48小时后, 加入0.5% MTT溶液50μl, 置37℃, 5%CO2条件下4小时, 出现蓝色结晶后, 弃上清, PBS洗1～2次, 加入DMSO 150μl/孔, 室温轻柔震摇2～3分钟以充分溶解结晶, 酶标仪于490nm波长测定各组OD值。

1.2.7 细胞内微管相关蛋白检测

荧光免疫细胞化学方法。按照5.0×104/ml的细胞密度接种于经多聚赖氨酸包被的洁净载玻片上随机分组制备贴壁细胞片, 各组细胞经相应条件培养液干预处理48小时后, 各组待测细胞用预冷的中性PBS洗涤3次, 4%多聚甲醛固定, PBS洗3次, 入湿盒, 加细胞内微管相关蛋白抗体, 4℃过夜, PBS洗3次, 加FIFC标记的抗IgG抗体, 室温, 湿盒中静置45分钟, PBS洗3次, Leica DM16000B型荧光显微镜观察照相, 相应图像分析系统进行数据分析。

1.2.8 统计学处理

实验结果以数据和图表格式表示, 测定值以均数±标准差undefined表示, 多组间均数比较用单因素方差分析, 两组比较采用student t检验, 所有数据均采用SPSS13.0软件包分析。

2 结果

2.1 天然脑活素对PC12细胞形态及轴突生长的影响

观察发现, 不含NGF的PC12细胞贴壁生长后, 细胞形态呈圆形, 椭圆型, 未见明显的突起。加入NGF处理后, 细胞突起明显, 一些成熟的神经元细胞的突起长度可达到100μm以上, 有些甚至已经达到200μm, 阳性细胞率96.58%。添加Aβ1-40处理后, 部分细胞死亡, 细胞碎片增多, 细胞形态多样呈圆形、椭圆型、三角形、锥形或多角形, 可见l～3个短小突起;同时分别采用低、中、高剂量天然脑活素作用后, 细胞突起明显增多增长, 中、高剂量组细胞轴突交织成网状, 有些细胞突起达100μm以上, 阳性细胞率及细胞平均突起长度显著高于模型组 (P<0.05 或 P<0.01) , 见表1。

与AD细胞模型组比较*P<0.05, **P<0.01

2.2 天然脑活素对Aβ1-40诱导的AD模型细胞增殖的影响

见表2。

与AD细胞模型组比较*P<0.05, **P<0.01

2.3 天然脑活素对PC12细胞内微管相关蛋白 (MAP-2) 表达的影响

MAP-2是神经脑组织中主要的微管相关蛋白, 荧光免疫染色阳性细胞胞浆表达绿色荧光。空白对照组细胞胞浆可见强绿色荧光, Aβ1-40诱导的AD细胞模型组胞浆绿色荧光显著减弱, MAP-2蛋白表达显著下调 (与空白对照组比较P<0.01) ;经不同剂量的天然脑活素作用后, 细胞MAP-2蛋白表达明显增强 (与AD细胞模型组比较P<0.05) , 且表现为一定程度的剂量依赖性。见表3。

与模型组比较*P<0.05, **P<0.01

3 讨论

Aβ是一种含40～43个氨基酸的肽, 为β-淀粉样前体蛋白的分解片段, 它是AD患者大脑中老年斑的主要成分, 并对培养的神经元具有细胞毒性。P12细胞具有嗜铬细胞瘤和肾上腺嗜铬细胞相关的表型, 可以合成儿茶酚胺, 在有NGF的作用下细胞停止增殖, 生长出神经突起, 具有电兴奋性并有许多与神经细胞分化有关组分改变等特点, 故常用作有关神经细胞分化和功能研究的模型。本文采用Aβ1-40诱导PC12细胞损伤制备AD细胞病理模型, 实验发现, 培养的PC12细胞经Aβ1-40处理后, 部分细胞凋亡/死亡, 细胞碎片增多, 细胞形态多样, 细胞突起少见而且短小, 细胞增殖活度明显降低;而分别采用不同剂量天然脑活素作用后, 细胞生长增殖旺盛, 细胞突起明显增多增长, 中、高剂量组细胞轴突交织成网状, 突起阳性细胞率及细胞平均突起长度显著高于AD细胞病理模型组 (P<0.05或P<0.01) 。结果表明, Aβ1～40对PC12细胞具有明显的细胞毒性, 而天然脑活素对该毒性具有显著的改善作用, 可促进细胞增殖及细胞突起生长并向神经样细胞分化。

神经元丢失和轴突/细胞骨架损害 (突触离断和失养轴突的增加) 是AD中主要与痴呆有关的病理变化[8]。许多微管相关蛋白 (mcrotube-associated proteins, MAPs) 组成的多聚体, 是细胞骨架的重要成分之一。目前已发现至少10种不同的MAPs, 而MAPs在α-微管蛋白及β-微管蛋白聚合形成二聚体、维持微管动力学稳定等方面均发挥重要作用。微管相关蛋白2 (MAP-2) 作为MAPs的主要成员之一, 是一种调节微管蛋白组装及动力学的重要调节因子, 在脑的发育过程中发生明显的组成变化。本研究发现, Aβ1-40处理的PC12细胞中MAP-2的表达受到明显抑制 (P<0.01) , 而经天然脑活素孵育后MAP-2表达上升 (P<0.05) 。表明天然脑活素可明显提高Aβ1-40损伤的PC12细胞中MAP-2的表达水平, 对细胞微管的组装形成具有一定的促进作用。

总之, 本实验结果表明, 天然脑活素对老年性痴呆的关键病理产物β-AP所致神经毒性有显著拮抗作用, 对Aβ1-40所致细胞损伤有显著的改善作用;其机理可能与其促轴突生长及细胞骨架蛋白的表达、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用密切相关。

摘要：目的:探讨天然脑活素对Aβ1-40致阿尔茨海默氏病 (AD) 细胞模型的神经毒性的保护作用及其可能的分子机制。方法:采用Aβ1-40处理PC12细胞复制AD细胞模型, 不同剂量的天然脑活素孵育AD模型细胞, 镜下观察细胞形态学变化及细胞突起生长情况, 计数阳性细胞率;MTT法检测细胞增殖活度 (AMTT值) , 免疫荧光染色观察细胞内微管相关蛋白MAP-2的表达。结果:天然脑活素处理组细胞突起生长明显, 细胞增殖活度、胞内微管相关蛋白MAP-2的表达显著高于AD模型组细胞 (P<0.05或P<0.01) 。结论:天然脑活素对Aβ1-40致AD细胞模型的神经毒性具有明显的拮抗和改善作用, 其机制可能与其在一定程度上促进细胞增殖、上调胞内微管相关蛋白的表达等有关。

关键词：阿尔茨海默病/中医药疗法,@天然脑活素/治疗应用,血清药理学,兔

参考文献

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a-突触核蛋白 篇6

1 材料与方法

1.1 材料 动物:5月龄健康雄性Wistar大鼠40只,体重(350±20)g,由山西医科大学生理教研室提供。药品及主要试剂:红景天颗粒;喜得镇;AlCl3;D-半乳糖;PSD-95、shank-1免疫组化试剂盒。主要仪器:MT-200 Morris 水迷宫视频跟踪分析系统;电子天平;低温冰箱;荧光照相显微镜;Olympus照相显微镜等。

1.2 试验方法 模型制备:药物造模组以腹腔注射D-半乳糖50 mg/(kg·d)和灌胃AlCl3 2 mL/d,每日一次,持续6周。行为学测试前10 min对药物造模组以2 mg/kg 腹腔注射东莨菪碱制作AD 大鼠复合模型[2],空白组给予相同剂量的生理盐水腹腔注射和灌胃。分组及给药:动物适应性饲养1周后,40只雄性Wistar大鼠经水迷宫测试去掉不符合条件者。将39只大鼠按随机数字表法分成空白对照组(9只)和药物造模组(30只)。造模6周后进行水迷宫测试做出模型评价。模型评价标准:以空白组大鼠逃避潜伏期的均值为参考值,计算每只大鼠的平均逃避潜伏期值与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比值,该值>20%则表示造模成功。将造模成功的大鼠(26只)分为模型组(8只)、中药组(9只)和西药组(9只)。第7周开始同时给药干预:中药组用红景天按生药5 g/(kg·d)灌胃,西药组用喜得镇以1 mg/(kg·d)灌胃,空白对照组以10mL/(kg·d)蒸馏水灌胃,持续4周。水迷宫行为学测试: 参照 Morris 水迷宫(Morris water maze, MWM)实验方法测定大鼠空间识别能力(包括定位航行实验和空间搜索实验)[3]。

1.3 标本制备及指标检测 水迷宫测试 24 h后,采取心脏灌注法处死大鼠,用10%中性缓冲液甲醛固定4 h以上,石蜡包埋切片。采用免疫组化法根据说明书检测PSD-95、shank1蛋白含量。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件,计量资料用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,各组间差异采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1 水迷宫测试结果

2.1.1 定位航行试验(见表1)

随着训练时间的推移,训练次数的增多,各组大鼠寻找平台的时间缩短。模型组大鼠潜伏期

1) 为山西省教育厅基金资助项目(No.20101147)

较空白组明显延长(P<0.01),中药组、西药组大鼠潜伏期较模型组明显缩短(P<0.01),而中药组与西药组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.1.2 空间搜索实验结果比较(见表2)

与模型组相比,其他各组目的象限停留时间、有效区停留时间、平台停留时间明显延长(P<0.01),中药组与西药组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组大鼠海马区免疫组化结果比较(见表3)

与空白组相比,模型组大鼠PSD-95、shank-1蛋白表达均显著降低(P<0.01);与模型组相比,中药组与西药组PSD-95、shank-1蛋白表达显著提高(P<0.01), 中药组、西药组间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

本研究采用复合型AD大鼠模型,集衰老、铝中毒、胆碱能损伤为一体,可以更好地模拟出AD患者的病理生理及行为学表现。红景天具有益气活血、通脉平喘等功效,《本草纲目》记载“红景天,本经上品,祛邪恶气,补诸不足”是“已知补益药中所罕见”,临床及实验研究初步研究表明,红景天具有抗缺氧、抗疲劳、 抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等作用,显示出红景天对痴呆治疗有广阔的应用前景。本研究采用Morris水迷宫方法检测AD大鼠行为学能力变化,结果显示,模型组认知能力较空白组明显下降,经治疗后,中药组、西药组与模型组相比认知能力明显改善,表明红景天在一定程度上改善了AD大鼠的学习记忆功能障碍。

学习和记忆障碍为AD早期的突出表现,其程度与突触数目的丢失及突触功能的丧失密切相关[4]。神经元的动态特征即突触可塑性,是学习记忆形成的一个重要形态学和功能学基础,其主要表现形式是长时程增强和长时程抑制。突触后致密物质(postsynaptic density,PSD)是化学性突触的一种超微结构,接受和整合突触信号并将其传导给突触后细胞,在突触可塑性中起重要作用。其中PSD-95是细胞支架蛋白,能影响突触及神经元的可塑性,神经递质以及其他神经营养因子的合成,调控神经元对神经传导信号的免疫应答,在突触发育和再塑中具有重要的作用。目前研究表明, PSD-95参与了学习记忆的调节过程,对学习记忆的形成和巩固有着重要意义[5]。shank是一种表达在PSD区域的多结构域的骨架蛋白,在突触信号转导中起重要作用。多项研究表明,shank-1可将突触后膜上的3种谷氨酸受体串联起来,结合于NMDA信号复合体中调节长时程增强和长时程抑制。此外,shank-1蛋白连接了突触后的谷氨酸、磷酸肌醇、生长抑素等多型受体、多种蛋白和细胞骨架。因此,在介导各种受体间的信号传导和维持突触正常功能方面有重要作用[6,7]。本研究结果提示,模型组PSD-95和shank-1蛋白的表达明显下降,经治疗后中、西药组PSD-95和shank-1蛋白表达明显上调,表明红景天可以增加PSD-95和shank-1蛋白表达。中、西药组之间比较差别无统计学意义,表明红景天治疗AD与喜得镇等效。

红景天对AD大鼠脑神经细胞的保护作用可能是通过上调 PSD-95和shank-1蛋白的表达,从而影响突触及神经元的可塑性、神经递质以及其他神经营养因子的合成、调控神经元对神经传导信号的免疫应答,进而改善AD大鼠的学习记忆能力,对AD的防治具有现实意义,但具体机制有待于进一步研究。

参考文献

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[2]宋玉娟,张力,徐会深,等.电针治疗阿尔茨海默病的实验研究[J].中医药学报,2005,33(3),39-40.

[3]胡镜清,温泽淮,赖世隆,等.Morris水迷宫检测的记忆属性与方法学初探[J].广州中医药大学学报,2000,17(2):117-120.

[4]Coleman PD,Yao PJ.Synaptic slaughter in Alzheimer’s disease[J].Neurobiol Aging,2003,24(8):1023-1027.

[5]Liaw WJ,Zhang B,Tao F,et al.Knockdown of spinal cord posts-ynaptic density protein-95prevents the development of morphinetolerance in rats[J].Neurosci,2004,123(1):11-15.

[6]Sheng M,Kim E.The Shank family of scaffold proteins[J].CellSci,2000,113(pt11):1851-1856.